Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фактора элонгации Tu из ESHERICHIA COLI и его тройственного комплекса с GTP и аминоацил-тРНК методом тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование фактора элонгации Tu из ESHERICHIA COLI и его тройственного комплекса с GTP и аминоацил-тРНК методом тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

РУБЛЕВСКАЯ Инна Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ TU ИЗ ESHERICHIA COLI И ЕГО ТРОЙСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА С GTP И анйноаЦИЛ-тРНК МЕТОДОМ ТРОЙНОГО ИЗОТОПИЧЕСКОГО ЗАМЕЩЕНИЯ В РАССЕЯНИИ НЕЙТРОНОВ.

оз.оо.оз - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических йаук

Киев - 1991

работа выполнена в лаборатории физики нуклеопротеидов Института белка АН СССР.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор И. 11. Сердюк

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор Л. А. Фейгин

gOKTOi биологических наук

О.СтаРоауб

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А. В. Палладина АН УССР.

¿¿s&JtjJ^J^ 1991 г. в J^JL/часов

Защита состоится "От" rtx,jC£.//u/} 1991 г. в на заседании специализированного Совета Д 01G. 11.01 Института Молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу-

232627, Киев-143, ул. Забонотного, 150.

С диссертацией ножно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

.у. и

Автореферат разослан " J? " "^•^ъ-У/ t^j 1991

Ученый секретарь И) ¿¡дА'1";/

специализированного совета, 11 Ьч

доктор медицинских наук, профессор ^ Т. И. Бужиевскан,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теми. Выяснение молекулярных, основ механизма биосинтеза белка является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии. Решение этой проблемы невозможно без изучения компонентов, участвующих в биосинтезе белка и, в частности, белковых факторов трансляции, катализирующих определённые стадии этого процесса.

На сегодняшний день факторы элонгации из E.ooli изучены достаточно хорошо по сравнению с другими белками аппарата трансляции. Определены первичные структуры всех трех белковых факторов (ер-Tu, EP-Ts, EF-a), близится к окончанию расшифровка' с высоким пространственным разрешением структуры EP-Tu и EF-G. Получено общее представление о роли факторов элонгации в процессе трансляции.

Фактор элонгации EF-Tu, катализирующий кодон-зависимое связывание амшаацил-тРНК с акцепторным участком . (А-сайтом) рибосомы, является одним из ключевых белков аппарата трансляции.

Разнообразие лигандов (gdf/gtp, ва-тРНК, ер-тв, рибосома), с которыми связывается ep-tu, и их взаимозависимость при взаимодействии с фактором, предполагает, что EP-Tu является аллостерическим белком. В этой сзязи' особый интерес представляют конформационные изменения в EP-Tu, происходящие при взаимодействии с лигандами и, в частности, при образовании тройственного комплекса ep-tu•gtp•аа-тРНК.

Состояние вопроса, цель и задачи исследования. Комплексы ep-Tu с различными лигандами исследовались рядом физических методов, однако, только с помощью методов рентгеновского рассеяния и нейтронного рассеяния можно получить информацию об изменении формы и размеров макромолекулы. При исследовании биологических макромолекул нейтронным рассеянием обычна использовался стандартный подход, когда контраст варьируется помещением частицы в смеси h0q-d2q. При этом один из компонентов комплекса становится "невидимым" если его плотность амплитуд рассеяния уравнена плотностью амплитуд рассеяния растворителя. Тагам образом, изучая разностную кривую рассеяния между раствором и растворителем при разной доле d2o, мокно получить информацию о компактности того или иного компонента в комплексе. Применение'этого метода к исследованию комплекса EP-Tu-ОТР'аа-тРНК •выявило целый ряд трудностей, который принципиальна нельзя обойти в

этом методе. Так, тенденция ЕР-Ти к агрегации, необходимость присутствия в растворе пируваткиназы и избытка тРНК затрудняет строгую интерпретацию разностной кривой. Кроме того, соотношение между плотностями амплитуд рассеяния ЕР-Ти, тРНК и растворителем таково, что ни одна из вышеперечисленных молекул не может быть сделана невидимой в Н20. Поэтому вопрос об изменении компактности ЕР-Ти при образовании тройственного комплекса остается открытым.

Все это предопределило наш интерес к новой схеме нейтронного рассеяния- схеме тройного изотопического замещения. Главное ее отличие состоит в том, что из рассеяния раствора I, содержащего смесь структурно идентичных частиц двух типов (протонированше и полностью дейтерированные), вычитается рассеяние не растворителя, а раствора II, содержащего частицы третьего типа, дейтерированные в промежуточной степени. В рамкгх этой схемы любой компонент тройственного комплекса будет невидимым в рассеянии, если он будет взят в протонированной либо дейтерированной форме. Изотопный состав растворителя при этом роли не играет, а аффект агрегации существенно подавляется.

Целью настоящей работы было изучение компактности ЕР-Ти с йтр И аа-тРНК методом тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов. Соответственно, основными задачами были:

- подбор условий культивирования Е.ооН на средах, содержащих заданный процент дейтерия;

- получение препаратов ЕР-Ти трех степеней дейтерированности,

- экспериментальная, проверка основных следствий теории метода тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов;

- исследование компактности ЕР-Ти в составе тройственного комплекса

ЕР-Ти• СТР •аа-тРНК.

Научная, новизна. Впервые отработана мэтодика крупномасштабного выращивания бактерий Е.ооН мне боо на частично дейтерированных и полностью дейтерированных Средах. На примере ЕР-Ти экспериментально проверены' основные следствия схемы тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов. Применение нового метода тройного изотопического замещения к исследованию конформации ЕР-Ти е составе комплексов, позволило установить, что ЕР-Ти практически не претерпевает значительных конформационных изменений при образовании комплекса ер-ти-стр-аа-тРНК.

Практическая ценность работы. Метод тройного изотопического замещения существенно расширяет возможности применения нейтронов в практика биохимического эксперимента. Так, оказывается возможным исследовать конформацию макромолекулы в смешанных растворителях, стабилизирующих ее структуру; использовать частично очищенные препараты, в качестве компонентов исследуемых комплексов. Это значительно упрощает проведение экспериментов по рассеянию нейтронов, поскольку огромная доля работы в подготовке и проведении таких экспериментов связана с получением биологически активных препаратов в количествах, достаточных для исследований; проводить исследования одного из выделенных компонентов многокомпонентной частицы, используя в качестве растворителя легкую воду.

Апробация. Основные результаты диссертации доложены на Международном симпозиуме по химии макромолекул (Прага, ЧССР, 1988), Ежегодной научной конференции Института белка АН СССР, (Пущино, 1989), 13-м Международном симпозиуме по тРНК (Ванкувер, Канада, 1989), Конференции по рибосомам американского общества микробиологов (Монтана, США, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура диссертации. Диссер* ация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение экспериментальных результатов и обсуждения, выводов. Работа содержит 103 страниц машинописного текста, 3 таблицы, 20 рисунков. Список литературы включает 156 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I■ Выращивание бактерий. На Рис.1 представлены типичные кривые роста штамма E.coli MRE600 в Н2о, ls%dsq, 100Я>20- средах.

Время генерации, рассчитываемое из кривой роста культуры на протонироввнной среде составляло 30 мин. Сбор биомассы проводили при оптической плотности 1.6 -1.8 o.e., выход сырой массы равнялся 3 -3.5 г/л. Время генерации клеток при росте на 7э% DgQ в 'среднем равно 60 мин. Выход сырой биомассы равен Зге литра среды. При использовании полностью дейтерированной среды время генерации в среднем равнялось 220 мин. Сбор биомассы проводили в конце экспоненциальной фазы роста, выход составлял 2.4Г/Л.

Рис.1 Кривые роста штамма E.ooli MRE600 на различных средах:

а).М9 + 0.4* Н-гликоза + Н2о;

б).119 + 0.4* И-ГЛВКОЗа + 79% DgO;

в).м9 + 0.59&-в-сукцющт +■ 100» dgo.

g.Выделение и характеристика фактора вдонгации Tu. Метод Leberman et al., (1980) с небольшими изменениями был взят за основу выполнения нашей работы. Изменения в методике связаны, в основном, с условиями разрушения клеток. Так, Leberman et al., (1980) предлагают проводить клеточный лизис с помощью лизоцима.Мы разрушали клетки с помощью Frenoh-npecca в буфере: 65мМ трис- ни, рН7.4, юмМ MgCl2, о.5мМ ют, юмкМ PMSP. все операции проводили на холоду. Для того, чтобы увеличить—выход фактора в- форме kp-tu-gdf, а не в форме ef-tu'ts мы добавляли в буфер QDP, в конечной концентрации ЮмкМ.

Дальнейшее .фракционирование клеточного экстракта проводили с. помощью высокоскоростного центрифугирования. При этом рибосомы осаждались в виде плотных осадков, а все йолишптидныэ факторы элонгации оставались в супернатантной фракции. Супернатант наносили на колонку с DEAE-сефарозой сь-6в. Белки элшровали в градиенте концентрации Nací (О- О.ЗМ). После хроматографии на ЬЕАВ-сефарозо

оъ-ьв во фракциях проверял! наличие сшр~связываодей активности. Выход оелка из 200г клеточной массы Е.оо11 после первого этапа очистки составляет около 45Смг. Фракции, обогащенные ЕР-Тц-осР осаадали сульфатом аммония 70% насыщения и подвергали гольфильтрации на ультрогеле АоА-44. После этой стадии чистота препарата составляет 90- 95% (судя по данным алвктрофэреза в полиакршшмидном геле в присутствии додецилсулъфата натрия). Выход белка равен 95- 100 мг. При необходимости, проводили дополнительную очистку фактора на ВЕАЕ-тоуореаг1 б5им в градиенте концентрации Ка01 (О- 0.1М). Активность полученных препаратов Ег-ти^ОЕР анализировали по связыванию о -орр. Удельная активность всех препаратов ЕР-Ти• сшр равняется 21-2? нмоль[14с]'ОБР на 1мг белка. Чистоту препаратов оценивали электрофоретически. Как показано на Рис.2 препараты ЕР-Гц'ОВР трех степеней дейтерированности мигрировали как единичный компонент в полиакршшмидном геле.

№)-Ти (НВ)-Ти (Н)-Ти 123 4 5 б 7 89

«л* ^ до ^ «ьти

1,4,7- 9ат,0 буфер; 2,5,8- 75№20 буфер; 3,6,9- 03И)20 буфер. Рис.2. Электрофореграмма препаратов ЕР-Ти'ОВР трех степеней дейтерированности. Чистота препаратов составляет 95-97$.

3. Проверка основных предсказаний теории метода тройного

изотопического замещения. . 3.1. определение точек компенсации.

На Рис.3 представлены зависимости плотностей амплитуд . рассеяния (Н)-ти, (НО)-Ти и (О-Ти от доли 1>2о в смеси н20-020.

- в -

Точки компенсации для (H)-Tu), (HD)-Tu и (D)-Tu равны 40®20, 87%D20 и I24%DgO, соответственно. Буфер, в котором проводили измерения содержал 50мМ hepes, рн 7.6, IDmM Mgci2, 40мМ Kci, 40мМ hh.cl, imm dm, iomkm qdp.

Рис.Э Зависимости плотностей амплитуд рассеяния ЕР-ти от доли йго в смеси н^о-ъ^а.

3.2. Определение величины доли дейтерированных молекул при смешении протонированных и дейтерированных молекул.

Ключевым техническим вопросом метода является выоор велич1шы 0-доли (й)-Ти в растворе I. Для решения этого вопроса достаточно определить точки компенсации (Н)-Ти, (НВ)-Ти и №)-ти и найти б из соотношения:

(1-в>7н + ОТ,, - Тт

где 7Н, 70 и. 7НВ- точки компенсации (Н)-Ти, 'О)~Ти и (Ш))-Ти, соответственно.

Доля дейтерированных частиц О в растворе I, вычисленная из уравнения (I) равна 0.56.

3.3. Влияние изотошого состава растворителя на разностную кривую рассеяния.

Экспериментальные значения интенсивностей. рассеяния для трех типов молекул ЕР-ти при различных контрастах, а также результаты экспериментов со смешением растворов представлены в таблице а. Как

- ? -

видно из таолицы 3, (см. предпоследнюю строну) значение разностной интенсивности, экстраполированное в нулевой угол рассеяния и нормированное на концентрацию не изменяется в пределах экспериментальной погрешности (±БЖ) при трех контрастах: Но0, ЬЭХdgo, 81 в тоже время, значение интенсивности рассеяния для каждой индивидуальной частицы сильно зависит и от контраста, и от степени дейтерировашюсти частицы.

3.4. Мыжчастичная интерференция (ассоциация частиц) не вносит вклад в разностную кривую рассеяния ef-tu.

Для проверки этого предсказания теории тройного изотопического замещения измерения проводили в растворе, содержащем высокую концентрацию ef-Tu (24 мг/мл), q2% dgo, при низкой ионной силе (4UMM HKPES, ЮмМ MgOlg, ImM dtt, ЮмкМ GDP, pH7.8). Как видно из кривых рассеяния в координатах Гинье , представленных на Рис.4 фактор элонгации " Ти трех степеней дейтерировашюсти имеет склонность к агрегации. В то же время, разностная кривая рассеяния, соответствует рассеянию для мономерной формы EF-Tu.

ТаОл.З. Экспериментальные значения интенсивностей рассеяш1я при трех контрастах.

Интенсивность при нулевом угле в абсолютной шкале

(Оарн/г)_

~ь9%DgO

ai%o2o

JHD

"(H+D)

1(h+v)~1w

81ЖВ20

6=0.55 3=0.56

fl-0.54

5=0.58

^(ЭКСГ

(теор)

48.H0.8 191.7±1.4 387.5±1.7 ¿33.2±1.4

ai.i±o.3 11.4±0.3 77.0±0.a 50.5i0.5

45.9±0.7 3.4*0.2 55.7±0.3 44.9*1.0

45.9*0.7 3.4*0.2 55.7*0.3 43.Si1.2

1Ь7.1*4.3 1bO.5*2.0 1bb.8*0.9 165.2*0.9

159.3 159.3

159.3

159.3

- а -

о'(А")

Рис.4 Кривые рассеяния (Н)-Ти, (Ш))-Ти и (С)-Ти. Разностная кривая получена методом тройного изотопического замещения.

3.5.Влияние "посторонних" молекул (глицерин, пируваткиназа ) на разностную кривую рассеяния №-Ти.

Для доказательства теоретической предпосылки, согласно которой, "малые" и "большие" молекула на вносят вклад в разностную кривую рассеяния, было сделано два эксперимента. В первом случае в растворы I и II был добавлен глицерин в конечной концентрации 10% (Рис.5, Рис.6), во втором случае в оба раствора были добавлены молекулы белка с большим молекулярным, весом (лируваткинаэа , Мв=240 кД, щ«> аок), в конечной концентрации 1мг/мл (концентрация ЕР-ти составляла 4 мг/мл; Рис.7, • Рис.8). Как видно из экспериментальных данных, добавление глицерина и пируваткиназы не влияет ни на значение интенсивности рассеяния, ни на величину радиуса инерции ЕР-Ти.

3.6. Определение плотности амплитуд рассеяния ЕР-Ти из разностной кривой рассеяния.

По теории, разностная кривая рассеяния относится к частице, у которой плотность амплитуд рассеяния равна разности плотностей

1п1

1 0,5

Т

1 ^

•»А-,,

РЧ = 23,1±0,5Д I* тт

1_Йк

1(0)= 159+4 борн/г

0.001 0.002 0.003 0.004

Рис.б Разностная кривая рассеяния 1н+щ-1н1) для ЕР-ти-ОБР.

п I [{

1 -I

1

0,5 -

т -

^'•ч-а

К0)=157±4 барн/г Яд = 23,2±0,4 Д

0.001 0.002 0.003 0.004

О2 (А2)

Рис.6 Разностная кривая рассеяния 1н+0+гН11 для ЕР-Ти-сжР + глицерин.

- ы -

амплитуд рассеяния дейтерированной и протонированной частицы.

Доказательство этого предсказания заключается в сравнении экспериментального значения разностной кривой при нулевом угле рассеяния с теоретически рассчитанным значением 1р(0). (См. таолицу

3, последняя строка). Значение 1р(0) рассчитывается исходя из знания точек компенсации (Н)-Ти и (Б)-Ти и аминокислотного состава для мономеров ЕУ-Ти, используя уравнение:

ш'г _ о

1г(0)=и^ьк- — йзо1)-(тс-7н^ТнГ (3),

т А

где у=о.72см /г- парциальный удельный ооъем ЕВ'-Ти, Яд- число Авогадро, Еакьк~ сумма рассеивающих амплитуд всех атомов (Н)-Ти, Ы«г= 43кг/моль, аво1- плотность рассеянггя Н2о.

Как видно из данных, (Табл. 3), экспериментальные и теоретически рассчитанные значения 1у(0) совпадают в пределах экспериментальной ошиоки. бетонированный компонент в двухкомпонентной частице Судет "невидим" в рассеянии нейтронов.

3.7. Исследование компактности ет-Ти в составе комплексов ЕР-Ти-СРР и ЕР-Ти• отр• аа~тРЖ. .

Экспериментальная проверка предсказаний теории показала, что все вышеперечисленные свойства метода позволяют сравнить компактность ЕР-Ти в составе комплексов ЕР-Ти-ОБР и ЕР-Ти• ОТР• аа-тРНК в н2о (аа-тРНК . была в протонированной форме). Разностная кривая рассеяния между раствором 1 и раствором II <1н+1Г1нв>/а<1-а> для ТРЗХ типов ЕР-Ти'ОйР в Н2С была получена в соответствии с правилом смешения схемы тройного изотопического замещения (Рис.9). Затем в кюветы с растворами X и II были добавлены компоненты, необходимые для образования тройственного комплекса Ер-ти-отр-аа-тРНК. Образование комплекса проводили, согласно процедуре, описанной в работе (АгИюпазоп еЬ а1., 19вы. Препарат Ьеи-тРНК1,ец (50% чистоты) вносили в трехкратном молярном избытке по отношению к ЕР-Ти. Точки экспериментальной кривой (Хн+в-1щ|)/б(1~б) для ЕР-Ги + 1еи-тРНКЪеи представлены на Рис.10.

- л -

Iп (I)

1 0,5

т

ЬЙН.

м.

I (0) = 51,7± 1,3 борн/г 23,34*0,69 А

1 I I I

1

_1_I_и

_1_I_1_

0,001 0,003 0,005 0,007 (}2

Рис.7 Разностная кривая рассеяния 1н+1)+Хш;) для ЕР-Ти^Р.

1п(1)

1 0.5

т

1(0 = 49,3*1,4 борн/г 1^=23,8*0,вД

-1-1_1_

0,001 0,003 0,005 0,007 д2 О2 (А2)

Рис.8 'Разностная кривая рассеяния 1н+Г)-1[11) для ЕР-Ти + пируват-киназа.

I

I_I

- lz -

Аналогичные эксперименты оыли также проведены по исследованию комплекса EE1-Tu-GTP-l>he-TfHK'Pile. На РисЛ1 представлена разностная кривая для трех типов EP-Tu-GDP в н2о. На Рис .12 представлена разностная кривая <IH+irIfffi)/'ei1~Q) Я^я в

составе тройственного комплекса EF-Tu-GTP'Ptie-TPHKPhe.

Сравнение графиков Гинье (Рис.9, РисЛО, Рис.II, Рис.12) позволяет придти к следующим выводам.

Во-первых, в■этих экспериментах нормализованные интенсивности рассеяния в нулевом угле рассеяния совпадают в пределах экспериментальной ошибки (tb%): i(0)=I67.I * 4.3 барн/г для EF-Tu•GDP "и I(0)=I73 ± 4.2 барн/г для комплекса EP-Tu-Gip.Leu-TPHKLeu, а также 1(0)=166.0 ± 3.3 Оарн/г для EF-Tu-GDP и 1(0) =170.4 ± 4.9 Оарн/Г для комплекса EF-Tu.GTP-Phe-TPKKphe, следовательно, в этих экспериментах схема тройного изотопического замещения позволяет выделять рассеяние только EF-Tu, несмотря на присутствие в последнем эксперименте "посторонних" молекул.

.Во-вторых, в обоих эксперимент нормализованные интенсивности рассеяния в нулевом угле рассеяния близки к величине интенсивности теоретически рассчитанной для мономерного ef-tu. Это указывает на то, что несмотря на имеющуюся тенденцию ef-Tu к агрегации, оонаруженную квк в нашей, так и в других работах (Osterberg et ai., 1981; Antonsson et al.t 198Ь), схема тройного изотопического замещения позволяет выделять рассеяние мономерного ef-Tu.

В-третьих, значение радиуса инерции ег-Tu в комплексе с gdf (Rg=a3.8± 0.4 JL) и в составе тройственного комплекса EF-Tu•GTP-Lsu-TPHKLeu (Rg=23.9± 0.7 А) (Рис.9, РисЛО), и значение радиуса инерции ef-Tu в комплексе с gdp (Rg=23.6±n.4 1) и в составе тройственного комплекса .ef-Tu•gtp• Phe-TPHKFhe (Rg=23.4±o.7 к) остается неизменным в пределах экспериментальной ошибки (±0.7 А). Это свидетельствует об отсутствии крупномасштабных изменений в пространственной структуре EF-Tu при образовании •тройственного комплекса.

Такой вывод следует;, признать наиболее . строга . экспериментально обоснованным, поскольку он базируется , на .использовании экспериментальной схемы, .которая наиболее подходит^для .исследования бинарных комплексов,1 когда один из . компонентов комплекса (в нашем случае тРНК) должен-оыть в избытке ,п Получаемая при этом разностная

1п{1)

1 0,5

т

i

ш

'-1л

1(01 = 167,1± 4,3 борн/г Ид= 23.8 ± 0.4 Д

1 « I ,

I ' '_

0,001

0,003

0,005 0,007

№0.9 Разностная кривая рассеяния 1]{+1)+1Ц11 для ЕР-Ти.йБР

1п(1)

1 0,5

Т

М|

Г«-«

110) »173,4*4,2 барн/г Яд=23.9±0.7Х

-_1_1_1_1_и.

..I

0,001 С,003 0,005 0,007

о2 (Г)

Рис .10 Разностная кривая рассеяния 1н+1)-1дд для ЕР-Ти в составе тройственного комплекса ЕР-ти■атр•Ьеи-тРНК

3.0

2.5

>1^1

(а)

X,

-1_I_I_I_и

0.001 0.003 0.005 0.007

Ог[Д2]

Рис.II Разностная кривая рассеяния 1н+1)-1нв для ЕВ'-Ти-сСР.

ыо

3.5 3.0 2.5

0.001

0.003

0.005 0.007

ог а-ч

Рис.12 Разностная кривая рассеяния для ЕР-Ти в

составе тройственного комплекса ЕР-Ти •0ТР-Р11е-тРНК™е.

кривая несет в сеое информацию только о тех частях макромолекулы, которые специфически мечены дейтерием. Оставшиеся же немеченые (протонированные) и меченые одинаково части макромолекулы остаются невидимыми в рассеянии нейтронов при любом изотопном составе растворителя, включая Н£о. Кроме того, незначительное увеличение радиуса терции тройственного комплекса ЕР-Ти-СТР-аа-тРНК (Р§=25.5 ± 0.4 I) по отнощонш) к ЗКЭТ5ШЮ радиуса инерции ЕР-Ти (11^=23.8 ± 0.4 А) может свидетельствовать о компактной упаковке'ЕР-Ти и аа-тРНК в составе комплекса, что было ранее показано рядом других исследований.

ВЫВОДЫ.

1. На примере ЕР-Ти экспериментальна проверены основные теоретические предсказания новой схемы тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов. Показано, что:

а) разностная кривая рассеяния ЕР-Ти не зависит от изотопного состава растворителя;

0) несмотря на тенденцию' ЕР-Ти к агрегации разностная кривая рассеяния соответствует рассеянию мономерного ЕР-Ти;

в) добавление "малых" (глицерин) и "больших" (пируваткиназа ) молекул, не вносит вклад в разностную кривую рассеяния; .

г) разностная кривая рассеяния, измеренная при высокой концентрации ЕР-Ти (24 мг/мл), соответствует рассеянию от одной молекулы, что означает отсутствие вклада межмолекулярной интерференции.

2. Матод тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов применен для сравнения конформации ЕР-Ти в составе двух комплексов: ЕР-Ти'СЮР и ЕР-Ти • СТР • аа-тРНК в Н-^О. Показано, что:

а) интенсивность рассеяния комплекса ЕР-Ти•отр•аа-тРНК совпадает с таковой для ЕР-Ти, следовательно, молекула тРНК (протонированная) может быть сделана "невидимой" в 1^0;

б) практическое совпадение радиусов инерции (в пределах экспериментальной ошибки ±0.7 А) для ЕР-Ти-ОБР и ЕР-Ти в составе

( тройственного комплекса позволяет утверждать об о»сутствий крупномасштабных изменений в ЕР-Ти при образовании комплекса.

в) сравнение значений радиусов инерции ЕР-Ти-ОйР (11^23.8 А) Й ЕР-Ти-йТР^аа-тРШ (В£=25.5 А) позволяет утвервдать о компактной упаковке молекул ЕР-Ти и аа-тРНК в составе тройственного комплекса.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. I.N.Serdyuk, M.Yu.Pavlov, I.N.Rublevskaya, G.Zaooai. A method of triple isotopic substitutes in SAHS. Theory and. first ezpsrissntsl resultB.-Fhysioa B, 1989, v.15Ь &157, p.461-463.

2. ' I.N.Serdyuk, M.Yu.Pavlov, l.K.miulsvslcaya, GrZaccai, R.Leberman, Yu.M.Ostanevioh. New possibilities for neutron scattering in the study of RNA- Protein interactions.-In: The Riboeome; Struoture, Function.and Evolution {Hill W.E. et al.), Washington: ASM,1990, Chapter 13, p.194-202.

3. M.Yu.Pavlov, I.N.Rublevskaya, I.N.Serdyuk, G.Zaooai, R.Lebennan, Yu.U.Ostanevioh. Experimental verification of the triple iBotopio substitution method in small angle neutron scattering. J.Appl.Cryst., 1991, v.24, p.243-254.

4.И.Н.Сердюк, М.Ю.Павлов, И.H.Рублевская, Д.Заккаи, Р.Леберман, Ю.Ы.Останевич. Метод тройного изотопического замещения в рассеянии нейтронов. Труды VI шцолы по нейтронной физике , 1990.