Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и определение последовательности нуклеотидов генов rps12, rps7 и fus из Thermus thermophilus НВ8, кодирующих рибосомные белки S12, S7 и фактор элонгации EF-G

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и определение последовательности нуклеотидов генов rps12, rps7 и fus из Thermus thermophilus НВ8, кодирующих рибосомные белки S12, S7 и фактор элонгации EF-G"

о.

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯОРЬСКОИ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИИ. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЯХНИН Александр Викторович

УЖ: 577.113.5

КЛОНИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛИШЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ ГЕНОВ грз 12, грз7 и fus из Пгетыиз thermophllua НВ8, КОДИРУЮЩИХ РИБОСОМНЫВ ВЕЖИ S12, S7 И ФАКТОР ЭЛОНГАЦИИ EP-G.

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте белка АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических, наук

Н.й. Матвиенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ст.н.с.

Института биофизики АН СССР С.Г. Камзолова

кандидат биологических наук, вед.н.с. НИИ Центра психического здоровья

АМН СССР Е.И. Рогаев

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР

Защита состоится "_"_199 г. в _час. на

заседании Специализированного ученого совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета КРУ.

Автореферат разослан

199 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

as? i 1 ~

Зтдел í I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

сртдцмй i

Актуальность теш. Изучение компонентов аппарата трансляции вакно для понимания механизма работы белоксинтезирующего аппарата клетки. Фактор элонгации G (EF-G) у бактерий катализирует транслокацию, одну из ключевых стадий в процессе элонгации полипептидной цепи. Транслокация - это GTP-зависимое перемещение пептидам тРНК из акцепторного участка на рибосоме в донорный, происходит в результате образования тройственного комплекса прэтранслокационная рибосома*EF-G*GTP. EF-G имеет не менее двух участков связывания: для GTP и рибосомы, обладает также зависимым от рибосомы каталитическим центром, гидролизуюцим GTP.

Как объект для изучения трансляции ТПегтиз thermophílus имеет особый интерес. Во-первых, по организация аппарата трансляции эта грамотрицагельная бактерия похожа на хорошо изученную E.aoli. Во-вторых, все компоненты системы трансляции Т.thermophílus термостабильны, хорошо функционируют при 60 °С, обладают повышенной устойчивостью к протеолитическим ферментам и денатурирующим веществам. Такая стабильность существенно облегчает исследование системы трансляции T.thermophilua. В настоящее время получены кристаллы рибосом, факторов элонгации EF-Tu и EF-G из T.thermophilua. В Институте белка АН СССР проводится их ренгеноструктурный анализ. Эти работы вместе с определением первичной структуры компонентов аппарата трансляции могут дать тонкую молекулярную картину синтеза белка на рибосоме. Цель работы - определение полной первичной структуры рибосомных белков S12 и S7 и фактора элонгации EF-G из T.thermophilua НВ8.

Основные задачи исследования: Клонирование кодирующего EP-G гена fuá из T.themophlltts НВ8. Определение последовательности зуклеотидов гена fus и соседних генов из atr оперона. Анализ эсобенностей первичных структур генов str оперона и кодируемых ям белков у T.thermophltU3.

Научная новизна: Определена полная последовательность нук-пеотидов генов грз 12, граТ и /из, входящих в atr оперон T.ther-nophtlua. В примыкающем к гену грв12 5'-нетранслируемом районе гайден вероятный промотор atr оперона. Обнаружено типичное для термофильных бактерий преимущественное использование в atr шероне Т.thermophílus кодонов с G или С в третьем положении.

- г -

Проведено сравнение первичных структур кодируемых этими генами рибосомных белков S12, ST и фактора элонгации EF-G с аналогичными белками из других оганизмов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из трех основных частей: обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, она завершается выводами и списком цитируемой литературы (115 ссылок). Работу иллюстрируют 17 рисунков и 10 таблиц, общий объем диссертации - 124 страницы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Апробация работы. Результаты диссертации докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (ТОилисси, 1990) и на научной конференции Института белка АН СССР (Пущино, 1990). В банк последовательностей нуклеотидов EMBL (г. Гейдельберг) помещены первичные структуры гена fua, accession no. Х16278; 5'-нетранс-лируемого района и генов грз12 и rpsî, accession no. Х52165.

Обзор литературы состоит из двух частей. В первой части проанализирована информация об организации и экспрессии генов air огоронов из различных бактерий и хлоропластов растений, а также о первичных структурах кодируемых этими генами белков. Во второй части обобщены метода генной инженерии по клонированию и сэквенированию генов, основное внимание уделено стратегиям системного секвестрования.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы, методы и результаты исследования.

В работе применялись стандартные метода генной инженерии: трансформация компетентных клеток, выделение плазмидной и фаговой ДНК, гидролиз ДНК рестриктазами, мечение ДНК, электрофорез в агарозном геле, гибридизация In situ и по Саузерну. Последовательность нуклеотидов определяли методом Сангера, используя набор реактивов и рекомендации фирмы Amersham (Англия). Электрофорез в секвенирувдем полиакриламидном геле проводили на приборе "Макрофор" фирмы Pharmacia-LKB (Швеция).

Анализ последовательностей нуклеотидов и аминокислот на персональном компьютере IBM PC/AT выполнена с пакетом программ "MlcroGenie" (Beckman, США).

1. Стратегия изучения первичной структуры EF-G.

Опубликованы работы с определением первичной структуры фрагмента генома T.thermophllud, содержащего ген tuf А (поледний ген atr оперона) и З'-конец гена /из 11,2). Были синтезированы комплементарные гену fus два олигонуклеотида-зонда. Создана библиотека генов T.tîiermophtlus в плазмидв pBR 322. Гибридизацией с олигонуклвотидом идентифицирован несущий sir оперон T.thermo-phllua клон. Уточнена карта рестрикции клонированного фрагмента ДНК. Двумя независимыми методами получены субгеномные библиотеки фрагмента. Последовательность нуклеотидов коротких, перекрывающихся друг с другом участков определена по обеим цепям ДНК.

2. Олигонуклеоады - зонды для гена /из.

Синтезированы комплементарные 3'- концевой части гена fus T.thermophllus [1,2] олигонуклеотвды I и II длиной 19 и 1Т нук-леотидов. Первичная структура этих зондов следующая: I. 5' TCCTTCGTCATGITCTTTG II. 5' ÏAGTGGTCMAGAACAT

Олигонуклеотвды I и II комплементарны разным цепям ДНК аномально А+Т богатого участка гена fus (в целом геном T.thermophilua имеет высокий G+C состав - 66,3%). Олигонуклеоти-да I и II частично комплементарны друг другу. Рассчитанные по формуле температуры плавления гибрида.зонд-ген fya составляют 52 °С для олиго-нуклеотида I и 46 °G для олигояук-леотида II.

Фрагменты расщепления ДНК хромосомы T.thermophtlu3 рестриктазами Bgl II и BamH I фракционировали электрофорезом в агарозном геле. Затем гель сушили и гибридизовали с меченым олигонуклеотадом I. Фрагменты размером 6,6 тон дают пояснительный ответ (рис.1). Как известно из '-литературы, во фрагменте Bgl II длиной 6,6 тпн содержится целиком 3tr оперон T. thermophllitë [21.

Рис. 1. А. Электрофорез в 0,7% геле агарозы. Б. Картина гибридизации геля А с олигонукл. I. 1- маркеры молекулярного веса, размеры в тпн. 2 и 3 - расщепленная Bgl II и ВатЙ1 ДНК хромосомы ТЛТюгторПИиз.

3. Создание библиотеки генов T. tftermophllw.

Библиотека генов была создана в плазмиде pBR 322 (по сайту BamH I) из расщепленной Bgl II ДНК хромосомы Т.thermophilua. Использовали штамм-хозяин E.coli KS02, селекцию вели на фенотип APrTcs.

4. Идентификация несущего ген /иэ клона.

Рекомбинантные клоны переносили на бумажные фильтры Watman 541 и гибрядизовали in situ с меченым олигонуклеотвдом I. Клоны pis 2 и pis 3 дали четкий положительный ответ. Оба эти клона содержали вставки термофильной ДНК размером около б,б тпн. Картина рестрикции pLS3 совцадала с описанной в литературе для air оперона T.thermophtlua 121. pis 3 взят для дальнейшей работы.

Клоны pl£ 2 и pLS 3 не давали мезсду собой перекрестной гибридизации. При гибридизации расщепленной BamH I ДНК хромосомы T.thermophtlua с фрагментом гена /из из pLS 3 положительный сигнал дает только фрагмент размером 6,6 тпн без каких-либо минорных зон гибридизации, как с олигонуклеотидом I (рис. 1). Таким образом, у T.thermophilna подобно E.coli имеется единственный ген /из.

5. Карта рестрикции клонированного фрагмента и переклонирование гена /из.

Была составлена более подробная, чем в работе 121, карта рестрикции клонированного фрагмента. Перед началом air оперона найден уникальный сайт для рестриктазы Mlu I. Картирован уникальный сайт для рестриктазйТта II и 3 из 5 сайтов для рестриктазы Xîio I (рис.3). Оставшиеся яекартированными 2 сайта Xho I расположены перед началом atr оперона, близко к сайту Mlu I.

pLS 3 для секвенирования не пригодна, так как исходный вектор pBR 322 не содержит сайтов гибридизации с праймерами. Рестриктазами Mlu I и Kpn I из pis 3 вырезан фрагмент термофильной ДНК размером 5,5 тпн и клонирован в фагмиде pTZ 18R. Этот фрагмент содержит целиком гены rpal2, грэТ и /из. Из двух возможных при клонировании фрагмента ориентации получена лишь одна - pïG 121. Противоположную, чем в pTG 121, ориентацию фрагмента' ДНК T.fhsrüiopMlna получили реверсией большого фрагмента гидролиза pTG 121 рестриктазой Pyu.II (клон pZG 54).

6. Получение однонаправленных делеций в гене /иа.

Использовали стратегию системного секвенирования, осно-заннув на линеаризации рекомбинантной плазмида нуклеазой . Стратегия оставляет фрагменты гена в составе исходного вектора. зТС 121 и pZG 54 линеаризовали нуклеазой 31. Линейную форму не эчищали от минорной примеси недорасщепленных кольцевых форм (суперспираль и релаксированное кольцо). Затем гидролизовали эестриктазами по уникальным сайтам. Линейные молекулы расщеплялись при этом на два фрагмента. Линеаризация нуклеазой шла геравномерно по длине ДНК плазмид. Полученные гидролизаты обра-5отали ДНК-лигазой фага Т4 для внутримолекулярной циркуляриза-даи. Лигазные смеси расщепили рестриктазами для.селекции против гюходных рТи 121 и ргв 54, эта стадия заменяет очистку после эбработки нуклеазой Б1 линейных форм плазмид от сохранившихся кольцевых форм. Затем ДНК фракционировали электрофорезом в геле пегкоплавкой агарозы. Дорожки из геля разрезали на зоны, содер-кащие ДНК различного размера. Алликвотами фракций трансформиро-зали компетентные клетки Е.соИ (рис.2).

Идентифицировано много различных субклонов. Размер делений з субклонах определяли гидролизом ресгриктазой Рто II. При золучении делеций фланкирующие клонированную последовательность зайты Рто II сохраняются.

Рис.2. Стратегия получения однонаправленных делеций линеаризацией нуклеазой S1.

! и б - расщепленная iind III ДНК фага к; И - то же плюс pSP 64; г, 3 - линеаризованные яуклеазой S1 плазмида ?TG 121 и pZG 54; 4 - это 2 после гидролиза EcoR I; 5-3 после гидролиза Pat I; 1 и 8 - это 4 и 5 после

I 23456? 8 9 10 II

Г-"................JIM.

~ »

за EcoR I;

3 после

госле гидролиза Sal I

X»} kucl haul tool UbidlJI S»»J XDel £■>]

I_I _I _I il I il

-, , I , , -----,-, j-,-, ,-, J » ' 1 1

-0,4 -О.» 0 O.i 0,4 0,6 О, в 1.0 1.2 1.4 1.6 t.* 2.0 î g,I t.t 2,

- ry»12 (Slî) — Г$вТ 1ST)

Рис. 3. Стратегия секвенирования гэнов rps12, грзТ и /из из Т.thermophllua. Стрелками показаны направление и длина секвени-рования индивидуальных клонов. Длина указана в тыс. пар нуклео-тидов, точка отсчета - кодон инициации гана грз12 (см. рис. 4). Показаны расположение генов, промотора atr оперона и использованных для секвешювания сайтов рестрикции (обозначены не все сайты для рестриктаз Асс I, Sac I и Sma I).

7. Субклонирование фрагментов гена fus.

Большинство использованных для секвенирования гена /из ре-комбинантных клонов создано субклонировашем фрагментов рестрикции гена в векторах М13 шр18 и п>р19,а также получением делеций в гене по сайтам рестрикции- Были использованы' картированные в гене /из сайты для рестриктаз Xho I, ВшвН I, Hind III, Sma I и Sac I (рис.3). Полученных по этим сайтам суСклонов не достаточно для секвенирования гена /из. Гены грэ12, грз7 и /из удалось полностью перекрыть только комбинируя созданные с применением рестриктаз и нуклеазы Si субклоны. Таким образом, в работе две независимые стратегии секвенирования дополняли друг друга.

8. Определение последовательности нуклеотидов гена fus.

Одноцепочечные ДНК клонированных в векторе М13 фрагментов получены заражением штамма E.colt XI 1 соответствующими фагами. Одноцепочечные ДНК клонированных в фагмиде pTZ 18R фрагментов получены заражением соответствующих субклонов фагом-помощником R 408. На рис.3 показана стратегия секвенирования генов грз12, rpsR и lus. Плазмиду pTG 121 секвенировали в виде денатурированной двухдепочечной ДНК с олигонуклеотидом II в качестве праймера. Остальные субклоны секвенировали используя одноцепочечные ДНК-матрицы. Полученные из И13 векторов и плазмиды pZG 54 субклоны секвенировали с универсальным праймером, полученные

Г »

-п

4L

ГШ ft?-Cl

-337 otcgasgggoccgaaggcctoBtccaggaagcgggoggcggcotccaggccotocag

-гео gtcococgagggggactcccggcggaogsaggcctocaggtccttgaggatctoggggaggogggcttcc

-210 atccagcgaaggotttooatggcccooaîtatggcasggcctogcottggsaggtatt^&aaggaaggg

-i40 ttttgccîgt|iSçta^gcagtîga^gctotcagggocagococtggocctgagggtgggooccgtgt

- то gg^satflacggagggcgttoocctcoggg^gaîctîga^acaagggggoaagtccaagaagaa^gga

s12 30 60

GIG CTG GCA CTG CCG ACG АТС AAT CAG CTO GTC CGA AAG GGC CGC GAG AAG GTC CGC AAA Val Ala Leu Pro Thr Ile Asn Gin Leu Val Arg Lys Gly Arg Glu Lys Val Arg Lys

90 120

AAG AGO AAG GTT CCG GCG TIG AAG GGG GC5 CCC TTC CGC CGG GGG GTG TGG ACC GTG GTG Lys Бег Lys Val Pro Ala Leu Lys Gly Ala Pro Kie Arg Arg Gly Val Cys Tür Val Val

i so 1 во

CGC ACO GTC ACC CCC AAG AAG CCC AAC TCG GCG СТО CGT AAG GTG GCC AAG GTG CGC СТО Arg Ihr Val Thr Pro Lys Lys Pro Asn Ser Ala Leu Arg Lys Val Ala Ьуз Val Arg Leu

210 240

ACC TCC GGC TAC GAG GTG ACO G ОС -ГАС АТС CCC GGC GAG GGG CAO AAC СТГ CAG GAG CAO Thr Ser Gly Tyr Glu Val Thr Ala Туг Ile Pro Gly Glu Gly His Asn Leu Gin Glu His

270 300

TCG GTG GTC GTC АТС CGG GGC GGC CGT GTG AAG GAO CTG CCG GGC GTG CGC TAC CAO АТС Ser Val Val Leu Ile Arg Gly Gly Arg Val Lys Asp Leu Pro Gly Val Arg Тут His Ile

330 360

GTG CGC GGG GTC TAC GAG GCC GCC GGG GTG AAG CAC CCG AAG AAG AGC CGC TCO AAG TAC Val Arg Gly Val Tyr Asp Ala Ala Gly Val Lys Asp Arg Lys Lys Ser Arg Ser Lys Туг

390 S7

GCG ACC AAG AAG CCC AAG GAG GCG GCC AAG ACC GCG GCG AAG AAG tag gtgagct ATG GCA Gly TJît lys Lys Pro Lys Glu Ala Ala Lys Tbr Ala Ala Lys lys * Ala

¿30 460

CGG AGA AGG AGA GCA GAG GTG CGT CAG CTO CAG CCC GAC CTG GTC TAC GCG GAC GTG CTG Arg Arg Arg Arg Ala Glu Val Arg Gin Leu Gin Pro Asp Leu Val Tyr Gly Aap Val Leu

<190 520

GTC ACG GCC TTG AÎC AAO AAG АТС АТС CGG GAC GGG AAG AAG AAC CTG GCC GCC CGC АТС Val Thr Ala Phe Ile Asn lys Ile Met Arg Asp Gly lys lys Asn Leu Ala Ala Arg Ile

sso seo

TTC TAC GAC GCC TGC AAG АТС АТС CAG GAG AAG ACC GGC CAG GAG CCC СИ AAG GTC TIC Phe Тут Asp Ala Cya Lys Ile Ile Gin Glu Lys Thr Gly Gin Glu Pro Leu Lys Val Phe

610 6Л0

AAG CAG GCG GTG GAG AAG GÎC AAG CCC CGG ATG GAG GTC CGI TCC CGC CGC GTG GGC GGC Lys Gin Ala Val Glu Asn Val Lys Pro Arg Met Glu Val Arg Ser Arg Arg Val Gly Gly

670 700

GCC AAC TAC CAG GTC CCC ATG GAG GTO TCC CCG AGG CGC CAG CAG TCC CTG GCC TTG AGG Ala Asn Tyr Gin Val Pro Met Glu Val Ser Pro Arg Arg Gin Gin Ser Leu Ala Leu Arg

T30 760

TGG СТО GTT CAG GCG GCC AAC CAD CGC CCC GAG CGG CGC GCG GCG GTG CGG АТС GCC CAC Trp Leu Val Gin Ala Ala Азл Gin Arg Pro Glu Arg Arg Ala Ala Val Arg Ile Ala His

790 его

GAG CTG ATG GAC GCC GCC GAA GGT AAG GGC GGG GCG G'i'G AAG AAG AAG GAG GAC GTG GAG Glu Leu Ket Asp Ala Ala Glu Gly Lys Gly Gly Ala Val Lys Lys Lys Glu Asp Val Glu

S50 830 i—» EPS 900

CGG ATG GCC GAG GCG AAC CGG GCC TAC GCC CAC TAC CGG TGG tga gt ÀTG GCG GIC AAG Arg Set Ala Glu Ala Asn Arg Ala Тут Ala His Тут Arg Trp * Ala Val Lys

930 960

СТА GAG TAC GAC СТО AAG CGG CTC CGG AAC АТС GGC АТС GCC GCC CAC ATT GAC GCG GGC Val Glu Tyr Asp Leu Lys Arg Leu Arg Asn Ile Gly He Ala Ala His Ile Aap Ala Gly

990 1 ого

MG АСС AGO АСС АСС GAG CGC ATO CTC TAC TAC ACG GGC CGG АТС CAG AAG ATO GGC GAG Lys Thr Thr Thr Thr Glu Arg Ile Leu Туг Туг Thr Gly Arg Ile His Lys Ile Gly Glu

1050 1080

GTC CAO GAG GGC GOG GCC ACG ATG GAC TTC ATG GAG GAG GAG CGG GAG CGG GGC АТС АСС Val His Glu Gly Ala Ala Thr Met Asp Phe Met Glu Gin Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr

1110 1 ыо

АТС АСС GCC GCC СТО АСС АСС TGC TTC TGG AAG GAC CAO CGC АТС AAC AÏC АТС GAC ACC Ile Thr Ala Ala Val Thr Thr Cys Phe Trp Lys Asp His Arg Ile Asn Ile Ile Asp Thr

1170 1200

CCG GGC CAC GTG GAG TTC ACC ATT GAG GTG GAG CGC ICC ATG GGG GTC CTG GAC GGG GCC Pro Gly Hia Tal Asp Phe Thr Ile Glu Val Glu Arg Ser Met Arg Val leu Asp Gly Ala

1230 1260

АТС GTG GTC ITT GAC TCC AGC CAG GGG GTG GAG CCC OAG TCG GAG ACO GTC TGG CGC CAG lie Val Val Hie Asp Ser Ser Gin Gly Val Glu Pro Gln Ser Glu Thr Val Trp Arg Gin

1290 1320

GCG GAG AAG TAC AAG GTC GCC CGC АТС GCC TTC GCC AAC AAG ATG GAC AAG ACC GGG GCC Ala Glu lya Туг lys Val Pro Arg lie Ala Phe Ala Asn Lys Met Asp lys Thr Gly Ala

1350' 13S0

GAC CTG TGG CTO GTG АТС CGC ACC ATG CAG GAG CGC CTG GCG GCG CGC CCG GTG GIG ATG Asp Leu Trp Leu Val Ile Arg Тйг Met Gin Glu Arg Leu Gly Ala Arg Pro Уа1 Val Met

NI О 1 iAO

CAG CTC CCC АТС GGC CGG GAG GAG AGC TTC TCG GGG АТС ATT GAC GTG CÎC CGG ATG AAG Gln Leu Pro lie Gly Arg Glu Asp Thr Ftie Ser Gly Ile lie Asp Val Leu Arg Ket Lys

1470 1500

GCC TAC ACC TAC GGC AAC GAG CTG GGC AGG GAC ATO CGC GAG АТС CCC АТС CCC GAG GAG Ala Туг Thr Туг Gly Asn Asp Leu Gly Ihr Asp Ile Arg Glu Ile Pro Ile Pro Glu Glu

1530 1660

TAC CTG GAC CAG GCC CGC GAG TAC CAC GAG AAG CTC GTG GAG GTG GCG GCC GAC TTT GAO Тут Leu Asp Gln Ala Arg Glu Туг His Glu Lys Leu Val Glu Val Ala Ala Asp Phe Asp

1590 1620

GAG AAC АТС ATG CTG AAG TAC CTG GAG GGC GAG GAG CCG ACC GAG GAA GAG CTG GTG GCC Glu Asn Ile »et Leu Lya Туг Leu Glu Gly Glu Glu Pro Thr Glu Glu Glu Leu Val Ala

1650 1680

GCC ATG CGC AAG GGC ACC ATT GAC CTC AAG АТС ACO CCC GTG TTC CTG GGC ТСС GCC CTG Ala Ile Arg Lys Gly Thr Ile Aap Leu lys Ile Thr Pro Val Phe Leu Gly Ser Ala Leu

1710 1740

AAG AAC AAG GGC GTC CAG CTC CTC CTG GAC GCG GTG GTG GAC TAC CTG CCC TCC CCC TTG Lys Asn Lys Gly Val Gln Leu Leu Leu Aap Ala Val Val Asp Туг Leu Pro Ser Pro Leu

1TTO 1SOO

GAC АТС CCC CCC АТС AAG GGC ACO ACC CCT GAG GGC GAG GTG GTG GAG АТС CAC CCC GAC Asp Ile Pro Pro Ile Lys Gly Ihr Thr Pro Glu Gly Glu Val val Glu Ile His Pro Asp

1830 1660

CCC AAT GGC CCC TTG GCG GCC TTG GCC TTC AAG АТС ATG GCC GAC CCC TAC GTG GGC CGC Pro Asn Gly Pro leu Ala Ala Leu Ala Phe Lys Ile Met Ala Asp Pro Тут Val Gly Arg

1890 1920

CTC ACC TTC АТС CGC GTC TAC TCG GGC ACC CTC ACG TCG GGC TCC TAC GTC TAC AAC ACC Leu Ihr Phe Ile Arg Val Туг Ser Gly Thr leu Thr Ser Gly Ser Туг Val Туг Asn Thr

1950 1 seo

ACC AAG CGC CGC AAG GAA CGG GTG GCC CGC CTC CTC CGC ATG CAO GCG AAC CAO CGG GAG Ihr Lys Gly Arg lys Glu Arg Val Ala Arg Leu Leu Arg Met His Ala Asn His Arg Glu

гою го«

GAG GTG GAG GAG CTC AAG GCG GGC GAG CTG GGC GCC GTG GTG GGG CTC AAG GAG ACG АТС Glu Val Glu Glu Leu lys Ala Gly Asp Leu Gly Ala Val Val Gly Leu Lys Glu Thr Ile

2070 г 100

АСС CGC GAC ACC CTG CTG GGC GAG GAC GCG CCC CGG GTG АТС CTG GAG TCC ATT GAG GTG Thr Gly Asp Thr Leu Val Gly Glu Азр Ala Pro Arg Val Ile Leu Glu Ser Ile Glu Val

ai3o 2160

CCC GAG CCC GTG ATT GAC GTG GCC ATT GAG CCC AAG ADC AAG GCC GAC OAG GAG AAG CTT Pro Glu Pro Val Ile Asp Val Ala Ile Glu Pro Lys Thr Lys Ala Asp Gin Glu Lys Leu

2190 2220

TCC CAG GCC CTG GCC CGC CTG GCG GAG GAG GAC CCC ACC TTC CGC GTC ТСС АСС CAC CCC Ser Gin Ala Leu Ala Arg Leu Ala Glu Glu Asp Pro Thr Phe Arg Val Ser Thr Hls Pro

2250 2280

GAG ACC GCC CAG АСС АТС АТС AGT GGG ATG GGC GAG CTC CAC CTG GAG АТС АТС GTG GAC Glu Thr Gly Gin Thr Ile Ile ser Gly Met Gly Glu Leu Hls Leu Glu Ile Ile Val Asp

2310 2340

CGG CTC AAG CGG GAG TTC AAG GTG GAC GCC AAC GTG GGC AAG CCC CAG GTG GCG TAC CGG Arg Leu Lys Arg Glu Phe Lys Val Asp Ala Asn Val Gly Lys Pro Gin Val Ala Tyr Arg

2370 2400

GAG ACC АТС ACC AAG CCG GTG GAC GTG GAG GGC AAG TTC АТС CGC CAG ACC GGC GGC CGC Glu Thr Ile Thr Lys Pro Val Asp Val Glv Gly lys Phe Ile Arg Gin Thr Gly Gly Arg

2 430 2460

GGC CAG TAC GGC CAO GTG AAG АТС AAG GTG GAG CCC CTC CCC CGG GGC TCG GGC TTT GAG Gly Gin Тут Gly Hls Val Lys Ile Lys Val Glu Pro Leu Pro Arg Gly Ser Gly Phe Glu

2490 2520

TTC GTC AAC GCC АТС GTG GGC GGG GTG АГС CCC AAG GAG TAC АТС CCC GCC GTG CAG AAG Phe Val Asn Ala Ile Val Gly Gly Val Ile Pro Lys Glu Tyr Ile ïro Ala Val Gin Lys'

2550 2580

GGG АТС GAG GAG GCC ATG CAG TCC GGG CCC CTT АТС GGC TTC CCC GTG GTG GAC АТС AAG Gly Ile Glu Glu Ala Met Gin Ser Gly Pro Leu Ile Gly Phe Pro Val Val Asp Ile Lys

2610 2640

GTC ACC CTT TAC GAC GGC TCC TAC CAC GAG GTG GAC TCC TCC GAG ATG GCC TTT AAG АТС Val Thr Leu Тут Asp Gly Ser Тут Hls Glu Val Asp Ser Ser Glu Met Ala Phe Lys Ile

2670 2700

GCC GGC TCC ATG GCC АТС AAG GAG GCG GTG CAG AAG GGG GAC CCG GTG АТС CTC GAG CCC Ala Gly Ser Met Ala Ile Lys Glu Ala Val Gin Lys Gly Asp Pro Val Ile Leu Glu Pro

2730 2760

АТС ATG CGG GTG GAG GTC ACC ACC CCC GAG GAG TAC ATG GGG GAC GTC АТС GGC GAC CTG Ile Met Arg Val Glu Val Thr Thr Pro Glu Glu Тут Met Gly Asp Val Ile Gly Asp Leu

2790 2820

AAC GCC CGG CGG GGG CAG АГС CTG GGG ATG GAG CCC CGG GGC AAC GCC CAG GTG АТС CGG Asn Ala Arg Arg Gly Gin Ile Leu Gly Met Glu Pro Arg Gly Asn Ala Gin Val Ile Arg

2850 2880

GCC TTC GTG CCC TTC GCG GAG ATG TTC GGC TAC GCC ACG GAC CTG CGC TCC AAG ACC CAG Ala PKe Val Pro Leu Ala Glu Met Phe Gly Тут Ala Thr Asp Leu Arg Ser Lys Thr Gin

29Ю 2940

GGG CGA GGC TCC TTC GTC ATG TTC TTT GAC CAC TAC CAG GAG GTG CCC AAG CAG GTC CAG Gly ±rg Gly Ser Phe Val Met Phe Phe Asp Hls Тут Gin Glu Val Pro Lys Gin Val Gin

2970

GAG AAG CTC АТС AAG GGT CAA tag Glu Lys Leu Ile Lys Gly Gin *

Рис. 4. Последовательность нуклеотидов начала atr оперона T.thermo-phllits. 3 открытые рамки считывания (позиции 1 - 405, 416 - 883, 889 - 2961) соответствуют генам грэ12, грзТ и fus. Они кодируют риСосом-ные белки S12 и S7 и фактор элонгации EF-G; состоящие из 134, 155 и 690 аминокислот соответственно. Перед геном грз12 имеется последовательность, похожая на типичный промотор E.ooll (подчеркнута).

из pTG 121 - с обратным праймером. В случае расхождения данных по секвенированию различных цепей ДНК какого-либо участка гена проводили повторное секвенирование этого участка.

Полученная первичная структура не содержала непрерывных рамок считывания. Гомологичные S12, S7 и EF-G из E.coll последовательности аминокислот кодировались фрагментарно по всем трем потенциальным рамкам считывания. Проведено повторное секвенирование участков смены рамок. В результате найдены ошибки и восстановлены непрерывные рамки считывания, которые являются генами rpa\Z, rpal и /из. Определена также 5'- концевая нетран-слируемая часть str оперона с промотором (рис.4).

III. Обсуждение результатов.

1. Особенности генов str оперона Т.ttiermophilus и кодируемых ими белков.

На расстоянии около 150 нуклеотидов перед первым геном 3tr оперона Т.thermophllus (ген грз12) находится последовательность нуклеотидов, похожая на среднестатистический промотор E.colt:

-35 * спейсер -10 +1

среднестатистический промотор E.coll TTGA.Ca 17 ± 1 ТА-tAAT CAT

промотор 3tr оперона Т.thermophllus TTGCCA 17 ТАСАСТ CAG

Рис. 5. Сравнение среднестатистического промотора E.coll с промотором atr оперона ТЛЬвшоргНиа. Для промотора E.coll величина букв отражает вероятность нахождения данного нуклеотида в этом месте промотора, длина спейсера указана в нуклеотидах.

Интересным отличием от atr оперона E.coll является почти полное отсутствие межцисгронных участков с последовательностью Шайна-Дальгарно мевду грз12 и г pal, и особенно между грэ! и /из генами T.thermophllua. Вероятно, в этом случае не происходит внутренней инициации трансляции на полицистронной матрице; после терминации синтеза предыдущего белка рибосомы не успевают диссоциировать и инициируют синтез на следующем гене, как это имеет место в случав многих других опвронов E.colt с генами рибосомальшх белков.

Деред геном грз7 не найдено сайта, близкого по структуре к участку связывания бежа S7 с 16S рРНК Т.thermophllus.

Для генома T.thermoptiilvs характерен высокий G+C состав -66,3%. G+C состав гена /из - 66% , генов грз12 и грз7 - 67%. В третьем положении кодонов процент G+C еще выше: в гене /из -96,5% , в генах грз12 и грз7 - 94%. В гене /из чаще других нуклеотидов в третьем положении кодонов встречается С - 55,7% (табл. б). В генах грз12 и грэТ G и С встречаются с примерно одинаковой частотой, а в гене tufA преобладает G [1,2] в третьем положении кодонов.

Более высокий G+C состав в третьем положении кодонов существует из-за предпочтения у T.thermoptiilua кодонов с G или С в третьем положении. Особенно избегается употреблехяе кодонов с А в третьем положении из кодонов-синонимов. Вероятно, это служит для повышения температуры плавления геномной ДНК.

Таблица 1. Сравнение аминокислотных составов рибосомных белков S12 и S7 и факторов элонгации EF-G из Т.thermopMlua (Tt) и E.coli (Ее) (по количеству аминокислотных остатков).

S12 ST EF- -G S12 S7 EF -G

Tt Ее Tt ЕС n Ec Tt Ec Tt Ec Tt Eo

А1а 12 9 21 19 50 67 Leu 8 8 9 12 49 43

Arg 14 15 21 17 42 36 bys 21 13 12 13 42 44

Asn • 3 5 6 б 13 27 Met 0 о • 5 4 19 22

Asp 3 з 6 5 40 42 Phe ' 1 1 3 4 22 24

Суз 1 4 1 0 1 3 Pro 8 7 6 6 38 33

Gin 2 4 10 3 24 24 Ser 6 6 3 10 22 29

GlU 5 4 12 14 66 62 Ihr 8 8 2 5 44 38

Gly 12 11 8 8 59 59 Trp 0 0 2 1 3 6

His з 3 2 2 14 15 Tyr 5 4 5 3 22 19

Ile 4 3 6 5 55 50 Val 18 15 15 16 64 60

Кислые (Азр + Glu) 8 7 18 19 106 104

Основные (Arg + Ьуз) 35 28 33 30 84 80

Ароматические (Phe + Тгр +■ lyr). ■ 6 5 10 8 47 49

Гидрофобные Ароматические + Ile +

+ Leu + Met + Val) 36 31 45 45 235 224

Всего 134 23 155 153 690 703

Молекулярный вес (Мг) 14753 13607 17886 17132 76756 77458

Изоэлвктрическая точка pI) - - - - 6,09 6,05

Аминокислотный состав белков aír оперона из T.thermophílua и E.oolt очень похож (табл. 1). Исключения составляют Oys и Тгр для EF-G; Oys, Lys и Gin для S12; Gin, Ser и Thr для ST. В белках EF-G и S12 T.thermophílua имеется тенденция.к замене Суа и Тгр на другие аминокислотные остатки по сравнению с аналогичными белками E.coli. По количеству остатков Gin в белках S12 и S7 T.therrnophtlua противоположные тенденции: в S12 их в 2 раза меньше, а в S7 в 3 раза больше чем в аналогичных белках E.coli. В белке ST T.thermophilus значительно реже встречаются содержащие гидроксильные группы остатки Ser и Ihr, чем в S7 из E.colí. в белке S12 T.thermophílua существенно больше остатков lys, чем в S12 из E.coli. По данным компьютера все белки aír оперона T.thermophilua более основные, чем их аналоги из E.oolt. Вероятно, это связано с различной температурой обитания бактерий (70 и 37 °С соответственно).

2. Гомология белков S12, S7 и EF-G T.thermophílua с аналогичными белками из других организмов.

Гомология белков str оперона T.thermophílua с аналогичными белками других прокариот максимальна для рибосомного белка S12,

Таблица 2. Гомология (в процентах) рибосомных белков S12 и S7 и фактора элонгации EF-G из Thermua thermophilua с аналогичными белками из других организмов: E.coli, цианобактерий S.platenaia и A.nidulons, хлоропластов растений, грамполокительных бактерий M.luteus и Bacillus atearothermophilus,архебактерий M.varmléill и H.halobium,-крысы,

S12 S7 EP-G

Escherichia coli 68,9 52,3 59,5

Spirulina plateriaia 71,6 48,7 64,0

Jnocyatis nidulona 72,4 51 ,0 62,9

табак, хлоропласт 68,7 46,2 —

маршанция, хлоропласт 67,2 43,6 —

эвглена, хлоропласт 64,2 42,6 —

Hicrococcua luteua 64,4 51,3 59,6

Bacillus atearothermophilus 68,7 56,8 —

äethanocoacua vannielit — — 34,2

Halöbaaterlm halobium 30,6 14,7 32,6

печень крысы — — 29,2

минимальна для белка ST. Для фактора элонгации EF-G T.thermophllua величины гомологии имеют промежуточное значение между величинами для рибосомных белков S12 и ST (табл. 2).

По фактору элонгации EF-G и рибосомному белку S12 T.thermo-phllua ближе к цианобактериям, чем к E.coll и M.luteua. Минимальная гомология у Т.thermopMlua по белку S12 среди эубактерий - с M.luteua и хлоропластом эвглены. По рибосомному белку ST T.thermophllua ближе к E.colt и грамположителышм бактериям, чем к цианобактериям. Белок S7 T.thermopMlua имеет максимальную гомологию с S7 из B.atearothernophtlua, это может быть связано с термофильностью обеих бактерий.

Для всех белков Т.thermophllus гомология в 2 - 4 раза выше с аналогичными белками эубактерий и хлоропластов по сравнению с архебактериями. Это однозначно подтверждает принадлежность T.thermophilus к царству эубактерий. Более точно таксономическое положение T.thermophllua, даяе принадлежность к группе грамотрицательннх бактерий, невозможно определить по степени гомологии белков air оперона.

3. Функциональные сайты в EF-G (EF-2).

Про функциональные сайты рибосомных белков S12 и Sí ничего не известно. Как и у всех других эу- и архебактерий, в рибосом-ном белке S12 T.tfiermophilua имеется консервативный остаток Asp, посттрансляционная модификация которого In vivo у E.colt приводит к чувствительности к стрептомицину.

Для GTP-связыващих белков характерны три специфических консервативных сайга со среднестатистической последовательностью A/G-X-X-X-X-G-K, D-X-X-G и N-K-X-D. У факторов элонгации EP-G присутствуют все эти сайта: A-H-I-D-A-G, D-T/N-P-G-H и N-K-M-D-R/K. Они соответствуют сайтам Pi (Gi), Рг (Сг), Gu (Gs) на рис. 6. Сайты Pi и Рг участвуют в связывани фосфорилов, сайт Gu - в связывании гуанинового основания GTP.

У термофила T.thermophilus EF-G связывает GTP более прочно, чем у мезофила E.colt. Однако GTP-связывающие сайты в EF-G этих бактерий идентичны. Вероятно, более крепкое связывание GTP у ИМЗ'из T.thermophilus достигается другим механизмом, как это имеет место в случае термофильного EF-Tu.

У факторов элонгации SP-G (ЕР-2) и EF-Tu. (ZP-1 а) между GTP-связыващими сайтами Pi и Рг находится характерный эффекторный

Tth

ECO Spl MlU Hha rat

Tth

Eco Spl

Mlu Hha. rat

Tth

Eoo Spl Mlu Hha rat

Tth

Eoo Spl Mlu Hha rat

Tth

Eco Spl Mlu Hha rat

Tth

Eoo Spl Mlu Hha rat

Tth

Eoo Spl Mlu Hha rat

ao

—AVK-VE-----YBLK-RL !

---AH-------TIPIA-.Y

---AR-------TIP.E-.V

------------LT..H-KV

GRffi.I..QCERLM.HPEQI —VKFT.CQIEAIM.K.AKI

Pi

.....s ........ .Р...ТО.......I).....

...... .F.S.YY..M......Т. VT

и ...... .......H •F..-TH..X..T.D.G. -Г

...А.. ..V.H. ___L.DNX • AGA.M.SEDTAGQQX.—.

..MSVI . .V.H. •S.L.DSX VCKA.I.ASARAG-.TR-FT

tRNA

Gl

52 50 50 48 59 57

94

BFlfEQERERCITI—T-A-

80

100

Pa

1E0

•W____Q. • • « « — .s.-

•W.A____ . « * » . —

•W____К. • « • • . —.s.

•TE.B.Q. ..... —D-.

.TEKD.Q. .0... KS.-.J

-A-V-TS—CFW----KD---HRDUIDTPGHTOPTIEV

—.---..—A..SGKA.QY И?..

—.-A-IS—TS.----L.---..

—.N.SM.-HEYEG---D.---.L.

te.-.IS LPYEISENDLN.IKQS-..G SGFL.

• N

• V.

GGE SSQ

GM.

Ga

ЫО 160 ■ I 180

ERSMRYIDGAIWFDSSQGV EPQSETVWRQASKYKVPRIA FANKBDKTGADbWIr-VIRTM

99 ..........VU.YOAVG.

92 90 105 115

153 158 151 149 163 175

198 205 197

199 180 232

239 245 242

240 216 239

275 281 278

276 251 349

Q.....

Q.....

CV.T..

____к........

.....R.Q......I

----D. .D____С .Y

V...LREG.KPÎX Л L...1AERIKPVX MM

..ВМ..ШК-.VNQI

R____PFK-.rGQI

.X...Pïî-TVDЛ tolSE.QEGPEE— RAXIE.Q.EPEELY

.Y.

..К.....V.A..C.VG..

...L......YA...GKE..

T.A..AV...1..V.ATE.A TAAL. .T...b..V.OVS..

G3 200 G4 220 05 240

Q—ERLCARPWHQXPIG-R ÏDTFSG-1 - ID-VLRKKAÏT YC---NDLG-T—DI-RE—

К—T____M..PL..A..-A .EH.T.-V-V.-XVK...IN WSD—A.Q.V.— FE-Y.—

.SD.H.-X-V.-LYA. .Ï.X .1__________..QVS—

.ND.Y.-V-V.-LIS. ..FY WP.DA.GIV-.MGASY-.—

.ÎÎQ.IVENVH.ïisTY.EG '.SGPM.iLB.'.p! .GTVGF- GS.LHGWÀï-.XKQFA-.MY

260 ESO 300

----IPIPEEYXDQA-R----EYHEKXVKVAABI'B-Eii-I MLK---YXEG----EEP-TE

-----D..ADMVEL.-N----.W.QS.I.S..EAS-.E-L .E.---..G.----..L-..

----DE____YQ.X7-A----..R...1.AV. ET.-.А-Г .E.---...QXECG. AL-..

----.E.EQLQEKAE-E----..UNE...AV.ETS-.E-X .E.___________. .X-.V

-----GUT..KD.---1----.DWTVS..-DGFVA-ÏG-S A.----.CT.Y---SM.-S-

VAKFAAKG.GQ.GA.E.AKX V.EMM.KLWGDEY..PA.GK FS.SANSPD.K---KL.R.F

R—D..R.HA.PX.V.V.-.

V—К......X.......-A

320 3.40

EEL-------V-AAI—RK -GTIDL-KITPVTLGSALK- NKGYQXEL-

A.I-------K-G.L---.Q -RVXM-E .Ib.TC..

.. I-------E-HSL---. Q -.. .KG-X. V..1С..SF.-

..I-------Q-.CV---.Q -I.VHA-ÏAY...C...P.-

KQ-------RT-GMD---FC -ODI___-ERSDKRKEXHEQ-

CQ.imPEFK.FD. .МИГ.. EB.AK.IEKLDIK.D.ED.D

.....AM.----------

•R...R..----------

•R...PM.----------

ÎPLADW,----------

. E. KP.. KAVMRRiïLPAG

360 —DA

330

----WDYLPSPXD-IPPIK

----.1......V.-V.A.N

..........A.TE-V____

----..A...N...-AG.V.

---M.AEHF.NЛ.AQ.RRI

LLQMITIH____VÎAQKYRC

40a 420

G-TTPEG—EW-EI-----HPDPNGPLAALAPKIMADPY

■ -IXDD.KDTPA-.-----R .ASDDE.FS......AT. .F

.-VL.D.— .HJ-V-----H YA.KDA..S.....V.....

.ШШГОЕ—.. -L.-----R EVSKEA.FS......ATH.F

P-.YTOÎ.-DADS-. .AASMR LV.ED.EWXMVTE.GV. .H E-XLY..-PPDE-.AAMGIK SC..K...MMYIS.MVPTSD

Рис.6. Сравнение N-концэвых районов EF-G из Therme themopMlus (Tth), Kscherlohla coli (Eco), Spirullm platensia (Spl), Micrococcus Intens (Mlu); EF-2 из Halöbaaterim halöbltm <Hha), печени крысы (rat). Рамкой выделены характерные для GTP-связываюшх белков сайты по работе (13: Pi и Рг - фосфат-связывакщие сайты, tRNA - tRNA-связывавдий сайт, Gu - гуаниновое основание связывающий сайг. Подчеркнуты функциональные районы: жирной чертой -GTP-связывающие районы Gi, Ga, G3, G4 и Gs; пунктирной чертой -зффекторный район Е.

сайг, на рис. б обозначенный Е (tRNA). Этот сайт с последовательностью R-G/C-I-T-I участвует в связывании аминоацил-тРНК (или пептидил-тРНК). Про сайты связывания с рибосомой факторов элонгации достоверных данных нет.

В эффекторном районе EF-G T.thermophilua находится гиперчувствительный к трипсину сайг. У T.thermophllU9 происходит гидролиз пептидной связи Arg60 - Gly61 (рис. 4, 6). Наличие этого сайта можно объяснить предсказанной компьютером вторичной структурой данного участка полипептидной цепи. Arg60- это последняя аминокислота из образованной остатками 44-60 a-спирали. С-кон-цевая половина этой a-спирали сильно гидрофильна и, вероятно, экспонирована на поверхность молекулы EF-G. Gly61 находится уже за пределами этой a-спирали, в перетяжке. Такое расположение остатков должно способствовать трипсинолизу преимущественно по данному аргинину.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. В банке генов T.thermophilua в пдазмиде рВЕ 322 идентифицирован клон, содержащий целиком str оперон T.thermophilua.

2. Составлена карта рестрикции клонированного фрагмента ДНК.

3. Для определения последовательности нуклеотидов успешно использовано комбинирование двух независимых подходов: стратегия системного секвенирования и субклонирования фрагментов рестрикции.

4. Определена последовательность длиной около 3000 нуклеотидов, перекрывающаяся с опубликованной ранее для 3*-концевой части гена fuá 11,21. Установлена полная первичная структура генов грз 12, грзТ и /из; кодируемых ими рибосомньгх белков S12, ST и фатора элонгации EF-G из T.thermophtlu3.

5. Сравнение используемых для кодирования белков S12, 37 и EF-G кодонов у T.thermophilua и E.coli показало типичное для термофильных организмов предпочтение у Т.thermophilua кодонов с С или G в третьем положении из кодонов-синонимов .

6. Сравнение рибосомных белков S12, S7 и фактора элонгации EF-G из T.thermophilua и E.coli показало очень близкий аминокислотный состав этих белков.

7. По аминокислотной последовательности рибосомные белки S12, S7 и фактор элонгации EF-G из Т .themopMlua имеют значительно более высокую гомологию с аналогичными белками других

эубактерий, чем с белками эукариот и архебактерий. 8. GTP-связывающие и эфЗэекторные сайты у EF-G эубактерий и ЕР-2 архебактерий и эукариот идентичны или очень близки.

ЛИТЕРАТУРА.

[1] Kushro A., Sfilmlzu Ы., Tomita К. Molecular cloning and sequence determination of the tuj gene coding ior the elongation factor Tu of Thermus thermophilic HB 8. -Eur.J.Blochem., 19BT, v. 170, J6 1, p.93 - 98. 12] Seldler L., Peter M., Melssner P.,Sprinsl M. Sequence and Identification of the nucleotide binding site for the elongation factor Tu from Thernua thermophilic HB 8. -Nucl.Acids Res., 1987, v.15, № 22, p.9263 - 9277.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Yakhnin A.Y., Yoroslieyklna D.P., Matvienko N.I. Nucleotide sequence of ttie Thermus thermophilua HB8 gene coding for the elongation factor G. -

Nucl.Acids Res., 1989, v.17, №21, p. 8863.

2. Яхнин А.В., Ворожейкина Д.П. Первичная структура фактора элонгации G из Thermus thermophilus. - Всесоюзный симпозиум "Химия белков", Тбилиси, 21-26 мая 1990 г., стр. 123.

3. Yakimin A.V., Vorosheykina D.P., Matvienko N.I. Nucleotide sequence of the Thermm thermophilua НБ8 rpa12 and грэ7 genes coding for the ribosomal proteins S12 and S7. -

Nucl.Acids Rea., 1990, v.18, Jfe 12, p. 3659.

4. Яхнин А.В., Ворожейкина Д.П., Матвиенко Н.И. Клонирование и последовательность нуклеотидов гена fu3, кодирующего фактор элонгации G Thermus thermophilus НВ8. - Биохимия, 1990, Т.55, вып.9, с. 1539 - 1552.

В банк последовательностей нуклеотидов (The EMBL Data

Library, Heidelberg, West Germany) помещены первичные структуры

гена /its, accession no. XI6278; генов грз12 и грзТ, accession no. Х52165.