Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании бактериальной рибосомы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании бактериальной рибосомы"
На правах рукописи
КОРЕПАНОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ОТДЕЛЬНЫХ РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ В ФОРМИРОВАНИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РИБОСОМЫ
03.00.03. - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2006
Работа выполнена в Институте белка РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Гарбер Мария Борисовна
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор
Донцова Ольга Анатольевна
доктор биологических наук
Железная Людмила Алексеевна
Ведущая организация: Филиал Института биоорганической
химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
Защита состоится " кс-г^рз 2006 года в часов на заседании
диссертационного совета Д 501.(Л) 1.76. при Московском Государственном Университете им М. В. Ломоносова по адресу:
119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова
Автореферат разослан " 2- в " о чгп?Эу=> у»_2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук --Н. О. Калинина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. С тех пор, как в конце 50-х годов XX века было обнаружено, что рибосомы ответственны за включение аминокислот в белковую цепь, и по сей день исследования структуры и функции рибосом остаются приоритетным направлением молекулярной биологии. Являясь неотъемлемым компонентом всех живых клеток, рибосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, который состоит из двух компонентов — белков и рибонуклеиновых кислот (РНК). В настоящее время общепринято, что едва ли не все функции рибосомы, связанные с синтезом белка, осуществляются рибосомной РНК (рРНК). В то же время, известно, что лишенная белков рРНК, сама по себе, не способна осуществлять ни одну из функций рибосомы. Таким образом, роль рибосомных белков в функционировании рибосомы представляется не менее значимой, чем роль рРНК. В настоящее время прогресс в молекулярной генетике позволяет осуществить целенаправленный нокаут хромосомных генов рибосомных белков для получения информации о необходимости этих белков для жизни клетки и об их роли в трансляции in vivo. Эти результаты позволяют скорректировать имеющуюся информацию такого рода, полученную in vitro, что может обеспечить лучшее понимание таких фундаментальных процессов как самосборка рибосомных субчастиц.
Цели работы. Проверка необходимости рибосомных белков платформы малой рибосомной субчастицы, а также белков 5S рРНК-белкового комплекса для выживания клеток и формирования in vivo рибосомы Escherichia coli. Изучение особенностей взаимодействия белков семейства СТС с рибосомной 5S рРНК.
Основные задачи работы.
• Осуществить нокаут хромосомных генов К coli, кодирующих рибосомные белки Sil, S21,L5,L18hL25.
• Охарактеризовать штаммы Е. coli, в которых отсутствуют отдельные рибосомные белки «платформы» 30S субчастицы и 5S рРНК-белкового комплекса.
• Проанализировать белковый состав и функциональные свойства рибосом данных штаммов.
• Исследовать роль образующих водородные связи с 5S рРНК аминокислотных остатков рибосомного белка TL5 Thermits thermophilic в узнавании РНК и в образовании стабильного комплекса TL5-5S рРНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Установлено, что белки Sil, S21, L5 и LI8 являются жизненно важными для Е. coli, тогда как белок L25 не требуется для выживания клеток. Показано, что 30S рибосомная субчастица может формироваться in vivo без участия белков S15 и S6. Отсутствие сердцевинного рибосомного белка S15 приводит к ослаблению ассоциации рибосомных субчастиц. При помощи направленного мутагенеза обнаружены пять аминокислотных остатков белка TL5 Т. thermophilic, которые являются ключевыми для узнавания этим белком 5S рРНК.
Результаты работы имеют фундаментальный характер. Полученные в ходе работы штаммы Е. coli и генетические конструкции могут использоваться для дальнейших детальных исследований аппарата трансляции этой бактерии. Методические разработки, касающиеся очистки белков и нуклеиновых кислот, а также введения замен в участки аминокислотной последовательности белков могут быть использованы в институтах Российской Академии Наук и других учреждениях биологического профиля, как в нашей стране, так и за рубежом.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют рисунков и / 2- таблиц. Общий объем диссертации
I2S страниц. Библиография включает I7*" названий.
Апробация работы и публикации. По материалам работы опубликованы 3 статьи. Результаты диссертации докладывались на Российских и международных конференциях. Обзор литературы посвящен роли рибосомных белков Е. coli в сборке рибосомных субчастиц, функционировании рибосом и выживании клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Использование метода «Recombineermg» при определении необходимости отдельных рибосомных белков для высеивания клеток Е, coli
Метод «Recombineering» (Ellis, Н. М., et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 6742-6746) основан на использовании гомологичной рекомбинации по коротким (40-50 н.) участкам гомологии одноцепочечных и двухцепочечных ДНК-субстратов с хромосомной или плазмидной ДНК в Е. coli, которую осуществляют белки фага X, Ехо, Bet и Gam.
Процесс рекомбинации осуществляется в клетках штамма Е. coli DY330, в хромосоме которого находится дефектный профаг X, обеспечивающий термоиндуцибельный синтез фаговых белков Ехо, Bet и Gam. Компетентные клетки DY330 трансформируются ПЦР-фрагментом (Рис.1), который содержит маркерную открытую рамку считывания (ОРС; в нашем случае — ОРС гена устойчивости к
ate стоп _ ,
=|///Л хромосомный ген \///Л= хромосома Рис. 1. Схема нокаута хромосомных генов с
Ж рекомбинация X использованием метода «Recombineering».
Vf(f\ саг стои^ ПЦР-фрагмент Гомологичные участки ДНК, необходимые
° + для рекомбинации показаны штриховкой. atg_ стоп
=v///i cat у//а= хромосома Стрелками отмечено положение участков
хромосомный ген заменен хромосомной ДНК комплементарных
на маркерный ген
проверочным праймерам.
хлорамфениколу, cat), а также необходимые для рекомбинации дополнительные 5'- и 3'- последовательности (40-50 н.). Данные участки идентичны по последовательности участкам хромосомной ДНК, которые фланкируют ген-мишень с 5'- и З'-концов,
соответственно. В результате рекомбинации происходит замещение ОРС гена-мишени на ОРС маркерного гена так, что в хромосоме сохраняются все регуляторные элементы. Таким образом, влияние на экспрессию соседних генов оказывается минимальным. Использование cai-кассеты в качестве маркера дает возможность прямой селекции рекомбинантов на хлорамфеникол-содержащей агаризованной среде. Замена гена-мишени на маркер проверяется при помощи ПЦР-амплификации соостветствующего участка хромосомы. Проверочные праймеры комплементарны участкам хромосомной ДНК, отстоящим на некотором удалении от гена-мишени. Ген, который не является необходимым для выживания клеток, замещается с высокой частотой 104 рекомбинантов /108 выживших клеток) (Рис. 2а).
Рис. 2. Возможные результаты рекомбинации. В том случае, когда ген не является необходимым для выживания клеток, наблюдаемая частота рекомбинации составляет ~104 рекомбинантов /108 выживших клеток (а), рекомбинанты имеют генотип генОкассета. Если ген необходим для жизни клетки, то наблюдаемая частота рекомбинации составляет ~ 10/108 и рекомбинанты имеют генотип генОкассета/ген*.
В случае, когда ген является необходимым для жизнедеятельности клеток, наблюдаемая частота рекомбинации значительно ниже: ~10 рекомбинантов /108 выживших клеток (Рис. 26). Рекомбинация в этом случае возможна благодаря тому, что в популяции присутствует порядка 1% клеток, содержащих дупликацию гена-мишени. То есть, когда одна копия изучаемого гена элиминирована в такой клетке, вторая копия продолжает функционировать. В результате ПЦР-анализа таких клонов мы наблюдаем одновременное присутствие в хромосоме как са/-кассеты, так и гена-мишени. Таким образом, в качестве критериев необходимости данного гена для выживания клеток использовались частота рекомбинации и наличие интактного гена-мишени: zen<>cat либо ген<>cat/ген* в выживших рекомбинантах (здесь и далее замена гена при помощи «Recombineering» будет обозначаться значком "<>"). С использованием данного подхода была определена необходимость генов рибосомных белков Sil, S21, L5, L18 и L25 для выживания Е. coli, при помощи замены этих генов в хромосоме на ген устойчивости к хлорамфениколу.
2. Нокаут генов рибосомных белков «платформы» 30Sрибосомной субчастицы.
Рибосомные белки S6, Sil, S15, S18 и S21, а также белок S8 Е. coli вместе с центральным доменом 16S рРНК формируют «платформу» малой рибосомной субчастицы (Рис. ЗА). Сборка «платформы» in vitro осуществляется в строго иерархической манере, так же как и сборка рибосомных субчастиц в целом. Первым с
3
С хромосомный ген
'Х^Х
ПЦР-кассета ,
V чб
хромосомный ген
генОкассета 1 1
генОкассета
~104/108 -10/1 о8 "
16S рРНК связывается рибосомный белок S15, один из так называемых первично-связывающихся или сердцевинных белков 30S субчастицы (Рис. ЗБ). В экспериментах in vitro встраивание белка S15 оказалось необходимым для связывания белков S6*S18, которые стимулируют связывание друг друга с 16S рРНК и, возможно, существуют в
растворе в виде гетеродимера. Образующийся комплекс трех белков с 16S рРНК стимулирует встраивание в рибосомную субчастицу белков Sil и S21. Таким образом, исходя из предполагаемой роли отдельных рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, кажется очевидным, что удаление белков, которые связываются с 16S рРНК на ранних этапах сборки «платформы», должно иметь наиболее драматические последствия для сборки и функционирования рибосомы. В то же время, с помощью метода «Recombineering» было показано, что белки S15 и S6 не являются необходимыми для выживания, а белок S18 необходим для жизнедеятельности Е. coli. M. Бубуненко любезно предоставил нам соответствующие штаммы: NB147 rpsFokan (AS6) и NB497 rpsOokan (AS15) (кап — ген устойчивости к антибиотику канамицину) для исследований.
При попытке заменить гены rpsK (Sil) и rpsU (S21) на cat наблюдаемая эффективность рекомбинации составляла ~10 рекомбинантов /108 выживших клеток (Табл. 1). В обоих случаях выжившие рекомбинанты имели конфигурацию генОсайген , то есть имели в хромосоме интактную копию гена в дополнение к замещенному гену (Рис. 4, дорожки 1 и 4). Таким образом, впервые получены доказательства того, что гены рибосомных белков Sil и S21 необходимы для выживания клеток Е. coli.
В качестве дополнительного контроля нокаут был осуществлен в клетках DY330, трансформированных плазмидами pCR/rpsK или pCRJrpsU, которые обеспечивают конститутивную in trans экспрессию генов белков Sil и S21, соответственно, за счет «текущего» промотора Plac. Эффективность рекомбинации в обоих случаях была как
I . . "rnnrina'
16S рРНК
Рис. 3. (А) Расположение белков «платформы» в 30S субчастице Е. coli. 16S рРНК показана серым цветом. Вид со стороны, обращенной в раствор в 70S субчастице. (Б) Схема сборки «платформы» 30S субчастицы.
минимум на порядок выше (~102/108 выживших клеток). Большинство рекомбинантов не содержали в хромосоме генов гряК или (Рис. 4, дорожки 2 и 5).
Табл. 1. Эффективность рекомбинации и генотип клеток при нокауте генов гръК и гр$и
Ген-мишень Плаз мида Эффекта вность рекомбинации * Генотип
rpsK{ SU) -10 rpsKocat/rpsK+
pCR/rpsK -102 rpsKocat
rpsU (S21) -10 rps U< >cat/rps U *
rpsU (S21) pCRIrpsU —102 rpsUocat
* Число рекомбинантов в пересчете на 108 выживших клеток.
Рис. 4. Анализ нокаута генов rpsK (Sil) и
rpsU (S21) Е. coli: M - маркер молекулярной +
массы, 1 - rpsKocat/rpsK , 2 - rpsKocat в присутствии плазмиды pCRJrpsK, 3 - rpsK, 4 - rpsU<>caí/rpsU , 5 - rpsU<>cat в присутствии плазмиды pCR/rpsU, 6 - rpsU.
Эти данные ясно демонстрируют, что невозможность осуществления нокаута генов белков Sil и S21 обусловлена строгой необходимостью данных белков для жизнедеятельности Е. coli, а не полярными эффектами, которые могли быть вызваны влиянием са/-вставки на экспрессию соседних генов.
Полученные результаты согласуются с опубликованными данными по реконструкции малой рибосомной субчастицы in vitro из изолированных белков и 16S рРНК (Held, W. А. & Nomura, M., 1975, J. Biol. Chem., 250, 3179-3184). В этой работе показано, что белки Sil и S21 нужны для эффективной трансляции. Белок S18, по-видимому, способствует встраиванию белков Sil и S21 в рибосому, и по этой причине нокаут его гена летален для К coli. Таким образом, очевидно, что именно белки, встраивающиеся на последних этапах формирования «платформы» in vitro, оказываются необходимыми для выживания клеток Е. coli.
В связи с полученными данными, на первый план выходит вопрос о том, каким образом выживают штаммы Е. coli, лишенные рибосомных белков S15 и S6. Из ранних in vitro экспериментов известно, что эти белки необходимы для встраивания белков S18, Sil и S21, которые, в свою очередь необходимы для работы рибосомы in vitro (и, по-видимому, in vivo). Для разрешения этого видимого противоречия штаммы NB497 (AS 15) и NB147 (AS6) были изучены более детально. В таблице 2 представлены скорости роста штамма дикого типа, а также штаммов NB497 и NB147 в оптимальных условиях. Время удвоения составило - 60 мин для штамма NB147, ~ 90 мин для штамма NB497 и ~ 30 мин для родительского штамма W3110.
п.н.
1 2 3 4 5
1000-500—I
— cat
— rpsK
— rpsU
Штамм Характеристика Время Табл 2. Скорость роста штаммов W3110
---удвоения, мин NB497 (д815) и NB147 (ASÓ). Клетки
W3110 w. t. 33
NB147 rpsFoccit 61 культивировались при 37°С в среде LB с
NB497 rpsQocat_87 интенсивным пеоемешиванием (200 об/мин-).
Таким образом, клетки Е. coli, лишенные белка S6 или S15, будучи жизнеспособными, существенно проигрывают родительскому штамму в скорости удвоения. Кроме того, штамм NB497 обладает холодочувствительным фенотипом (не способен расти при температуре ниже 25°С), что может указывать на дефект в биогенезе рибосом.
Анализ белкового состава рибосом этих штаммов (Рис. 5) показывает, что, несмотря на отсутствие белка S15, все белки «платформы» 30S субчастицы
US9/11 ï -¿S18 S15 "♦•aS21
NB497(AS15^
: ♦.SI8 i
A \
S15
NB147(AS6)
À *
S15 ^
iS21
W3110(w.t.)
Рис. 5. Электрофоретический анализ белкового состава рибосом исходного штамма (W3110), а также штаммов NB497 (AS 15) и NB147 (AS6). За исключением белков S15 или S6, гены которых были удалены из хромосомы соответствующих штаммов, все белки «платформы» 30S субчастицы присутствуют в рибосомах мутантных штаммов в эквимолярных количествах.
присутствуют в рибосоме в приблизительно (специально этот вопрос не изучался) эквимолярных количествах.
То же самое справедливо в отношении рибосом штамма NB147. Необходимо отметить, что визуально количество белков S18 и S21 в рибосомах NB147 варьировало от выделения к выделению рибосом, кроме того, при ужесточении условий выделения (повышение концентрации соли) эти белки могли не детектироваться. Это может свидетельствовать о том, что в отсутствие белка S6 взаимодействие белка S18 (и, соответственно, S21) с рибосомой ослаблено, что соответствует ранее полученным in vitro данным. В применяемой системе электрофореза пятна белков S9 и Sil не разрешаются, однако, опираясь на интенсивность суммарного пятна, можно предположить, что белок Sil также присутствует в рибосомах AS6 и AS 15 мутантов.
SSO-лизаты AS 15 и AS6 штаммов были проанализированы центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Рибосомы AS6 штамма по степени ассоциации субчастиц и их седиментационным характеристикам, фактически, не отличались от рибосом W3110. В то же время, рибосомы AS 15 штамма были полностью диссоциированы на субчастицы при концентрации 10 мМ MgCl2 в растворе (Рис. 6).
В бактериальной 70S рибосоме белок S15 принимает участие в образовании межсубъединичного «мостика» В4 между 30S и 50S субчастицами (Yusupov, M., et al., 2001, Science, 292:883-896). Хотя данный «мостик» является одним из двенадцати, это один из всего двух примеров, когда контакт с 50S субчастицей осуществляется за счет белков малой рибосомной субчастицы. Другой пример - это белок S13, который участвует в образовании «мостика» В1. Согласно недавно опубликованным данным, удаление белка S13 из рибосомы также приводило к дестабилизации 70S рибосом (Cukras, А. & Green, R., 2005, J. Mol. Biol., 349:47-59). Таким образом, удаление любого из двух белков 30S субчастицы, принимающих участие в формировании «мостиков» с 50S субчастицей, может существенно ослабить ассоциацию рибосомных субчастиц.
На основании данных по химической модификации 16S рРНК можно заключить, что удаление белка S15 не приводит к существенным структурным перестройкам в 30S субчастице, так как изменяется доступность для модификации лишь нескольких «локальных» нуклеотидов (Bubunenko, M., et al., 2006, RNA, 12:1229-1239). Таким образом, весьма вероятно, что именно контакты самого белка S15 с 50S рибосомной субчастицей существенно стабилизируют 70S рибосому.
Рис. 6. Сравнение профилей седиментациии рибосом
штаммов \V3110 (А) и N13497 (Б). Фракционирование лизата БЗО центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
Анализ рибосом AS6 и AS 15 штаммов в поли-У зависимом синтезе поли-Фен показывает, что AS6 рибосомы синтезируют поли-Фен с той же эффективностью, что и рибосомы дикого типа. Рибосомы, лишенные белка S15, очевидно, дефектны в стандартных условиях синтеза in vitro по сравнению с контрольными рибосомами (Рис. 7А).
Рис. 7. (А) Поли-У зависимый синтез поли-Фен рибосомами контрольного штамма (W3110) и штамма NB497 (AS 15); (Б) Способность рибосом штамма NB497 синтезировать поли-Фен в зависимости от концентрации ионов Mg**, показаны значения в точке 30 мин от начала синтеза.
W3110
Измерение активности рибосом в синтезе поли-Фен в зависимости от концентрации Mg (при неизменной концентрации одновалентных катионов) показало,
что максимальная активность AS 15 рибосом достигается при концентрациях Mg -15 мМ, в то
время как в случае контрольных рибосом эта цифра ++
составляет — 10 мМ Mg (Рис. 7Б). Известно, что присутствие в среде ионов Mg++ необходимо для ассоциации рибосомных субчастиц in vitro. По-видимому, в отсутствие белка S15 в 30S субчастице повышение концентрации Mg необходимо для стабилизации 70S рибосом. В то же время концентрация Mg выше 17 мМ становится токсичной как для контрольных рибосом, так и для рибосом мутантного штамма.
При помощи стандартного (3-галактозидазного теста было показано, что штамм NB497 обладает
10 20 30 40 50 время, мин
Рис. 8. Синтез белка in vivo
AS 15 штаммом. Активность (3-
галактозидазы представлена в
миллеровских единицах.
выраженным дефектом в синтезе полипептида ш vivo по сравнению с родительским штаммом W3110. (Рис. 8). Таким образом, можно заключить, что биосинтез белка на AS 15 рибосомах нарушен вследствие ослабленной ассоциации рибосомных субчастиц, что и является причиной медленного роста соответствующего штамма.
• д. ,-v-r-tv>v_ / Д,-
3. Нокаут генов 5SрРНК-связывающих рибосомных белков L5, L18 и L25.
Белки L5, L18 и L25 в комплексе с 5S рРНК (5S рРНК-белковый комплекс) принимают участие в образовании «центрального протуберанца» большой рибосом ной субчастицы (Рис. 9).
В экспериментах in vitro было показано, что удаление 5S рРНК-белкового комплекса из рибосомы приводит к невозможности синтеза полипептида. Однако конкретная роль данного комплекса и его компонентов в функционировании рибосомы до сих пор остается неизвестной, несмотря на большое количество накопленных данных. В нашей работе, для установления роли 5S рРНК-связывающих белков L5, L18 и L25 в выживании клетки и биосинтезе белка их хромосомные гены были
инактивированы при помощи метода «Recombineering» (см. п. 1. и 2.). При замене генов rplE (L5), rplR (LI8) и rplY (L25) на cat наблюдаемая частота рекомбинации составляла ~10, ~10 и ~104 рекомбинантов/108 выживших клеток, соответственно (Табл. 3). При этом в случае rplE и rplR все рекомбинанты обладали генотипом ген<>са^ген+, что типично для нокаута жизненно важных генов. Ген rplY с высокой частотой заменяется на cat, а рекомбинанты имеют rplY<>cat генотип. Эти данные свидетельствуют о том, что как сам ген, так и кодируемый им рибосомный белок L25 не нужны для выживания клеток Е. coli. Так как 5'-концевая часть цистрона rplE образует шпильку, необходимую для регуляции генов ¿рс-оперона (Рис. 10А), необходимо удостовериться, что наблюдаемая необходимость гена rplE для выживания клеток Е. coli не связана с удалением этого элемента из хромосомы.
Для контроля ген rplE был инактивирован путем замещения его З'-концевой части (начиная с 34 кодона) на cat. Таким образом, в хромосоме формировался гибридный ген rplE-cat и сохранялся участок, кодирующий регуляторную шпильку (Рис. 10Б). Однако,
Рис. 9. Расположение 5S рРНК-белкового комплекса в 50S субчастице Е. coli. Показана поверхность, обращенная к 30S субчастице в составе 70S рибосомы.
в этом случае также наблюдалась картина, характерная для нокаута жизненно важного гена.
Табл. 3. Эффективность рекомбинации и генотип клеток при нокауте генов rplE (L5), rplR (LI8)
и rplY (L25) _
Ген-мишень Плазмида Эффективность рекомбинации* Генотип
rplE (L5) -10 rplE<>cat/rplE+
rplE{ L5)** -10 rplE34<>cat/rplE+
rplE (L5) pCRJrplE ~102 rplEocat
rplE (L5)** pCRIrplE -102 rplE34ocat
rplR (LI 8) -10 rplR<>cat/rplR +
rplR (LI8) pCR/rplR -10 rplR<>cat/rplR*
rplR(U%) pCRIrplH- —102*** rplRocat
rplR-rpsE
rplY (L25) -104 rplYocat
■"Количество рекомбинантов/108 выживших клеток. ** Замещение З'-концевой части гена rplE (начиная с 34 кодона) на cat для получения в хромосоме гибридного гена rplE33-cat (дающего клеткам RplE- фенотип) с сохранением в хромосоме участка, кодирующего шпильку, необходимую для регуляции spc оперона. *** Нокаут осуществлялся с помощью Р1-переноса rplRocat аллеля из rplR<>cat!rplR+ штамма в штамм W3110.
А V
Рис. 10. (А) Схема расположения генов в spc опероне Е. coli, показана локализация участка, кодирующего шпильку,
необходимую для регуляции экспрессии генов оперона.
(Б) Схема нокаута гена rplE с заменой всей ОРС, или ее З'-концевой части на cat. В обоих случаях выжившие рекомбинанты имели генотип rplE<>cat/rplE+. В присутствии плазмиды, кодирующей rplE Е. coli, хромосомный ген rplE может быть заменен на cat независимо от сохранения или вырезания регуляторной шпильки.
Нокаут хромосомного гена rplE удается осуществить только в присутствии плазмиды pCRJrplE (Рис. 10Б), которая обеспечивает конститутивную in trans экспрессию данного гена в клетке.
В этом случае эффективность рекомбинации составляет ~ 102/108(Табл. 3), причем независимо от сохранения или вырезания регуляторной шпильки. Таким образом, очевидно, что рибосомный белок L5 необходим для выживания клеток Е. coli, в то
]Щ
I II \ШШ\ II II II II 1111 II ттг
rplN rplE rpsll rplR rpmD seqY rplX rpsN rplF rpsE rplO rpmj
atg
• V 34 стоп
4th WA rplE
ш
cat
ШШ.
Ш
rplEocat
рекомбинация в присутствии плазмиды pCR/rplE
время как регуляторная шпилька spc опероиа не является критичной для выживания клеток.
Осуществить нокаут гена rplR не удалось также в присутствии плазмиды pCRlrplR, которая должна обеспечивать конститутивную экспрессию этого гена. В данном случае эффективность рекомбинации также была низкой (Табл. 3), и рекомбинанты имели характерный диплоидный генотип rplR<>cat/rplR+. При этом не удалось подтвердить экспрессию rplR с плазмиды даже при добавлении индуктора (ИПТГ, так как rplR находится в плазмиде под контролем Plac промотора). Возможно, причина в том, что сам белок L18 в свободном состоянии или его цистрон вне spc мРНК являются нестабильными. По этой причине в pCR вектор была клонирована часть spc оперона, содержащая три гена, rplF (L6), prlR (LI 8) и rpsE (S5) (Рис. 10A). Данная конструкция обеспечивает легко обнаруживаемую продукцию белков L6 и S5, гены которых окружают rplR с 5'- и З'-концов, однако продукцию белка L18 также обнаружить не удается. По-видимому, причина кроется в нестабильности белка L18, тем не менее, экспрессия его гена, очевидно, имеет место.
В присутствии данной плазмиды применение «Recombineering» невозможно, так как са^-кассета встроится в плазмиду, которая при большей копийности содержит аналогичные хромосомным участки гомологии. По этой причине rplE<>cat аллель был перенесен из DY330 rplRocatlrplR в W3110 при помощи общей трансдукции бактериофагом Р1. Таким образом, аллель rplROcat был перенесен в клетки W3110 (условный дикий тип), а также клетки W3110, трансформированные плазмидами pCR/rplR или pCRJrplF-rplR-rpsE. Здесь эффективность рекомбинации на несколько порядков ниже, чем в случае «Recombineering». В то же время, благодаря низкой эффективности переноса, фактически все выжившие рекомбинанты должны иметь генотип rplROcat, так как частота дупликации rplR в реципиентном штамме не должна превышать 1%. Было получено порядка ~102 клонов W3110 с генотипом rplROcat в присутствии плазмиды pCRIrplF-rplR-rpsE. В случае штамма W3110, трансформированного pCRIrplR, а также контрольного W3110, не было получено ни одного выжившего клона. Эти данные свидетельствуют о том, что белок L18 является жизненно важным для Е. coli.
Известно, что гомологи рибосомных белков L5 и L18 обнаружены не только в бактериях, но также в археях и эукариотах. Таким образом, присутствие этих белков во всех доменах жизни хорошо соотносится с их необходимостью для жизнедеятельности клеток Е coli.
Белок L25 принадлежит к семейству белков СТС, представители которого обнаружены только в бактериях. Данное семейство получило название по первому описанному представителю — основному стрессовому белку СТС Bacillus subtilis. Среди представителей семейства СТС есть рибосомные белки (такие как L25 Е. coli, TL5 Thermus thermophilics, СТС Deinococcus radiodurans), а также стрессовые белки (СТС В. subtilis и Listeria monocytogenes), которые синтезируются в клетках только в ответ на действие стрессовых факторов (тепловой шок, осмотический шок, голодание и т.д.).
Существование белков СТС в большинстве бактерий показано только на уровне открытых рамок считывания в расшифрованных геномах. В геномах некоторых бактерий гены, кодирующие белки СТС, не обнаружены. Таким образом, факультативность белков этого семейства хорошо соотносится с тем, что белок L25 не критичен для выживания клеток Е. coli.
Для получения пригодного к дальнейшим исследованиям штамма Е. coli, лишенного рибосомного белка L25, rplY<>cat аллель был перемещен в штамм W3110. Конечный штамм, KNB800, представляет собой AL25 мутант в условно диком генетическом окружении. Не будучи существенным для выживания, L25 тем не менее нужен клеткам Е. coli для нормального роста (Табл. 4).
Штамм Плазмида Время
удвоения, мин
W3110 32
KNB800 72
W3110 pCR 39
KNB800 pCR 120
KNB800 pCRIrplY 46
KNB800 pCR/c/c 54
KNB800 pCR/Nfr-ctc 54
Табл. 4. Скорость роста KNB800 (AL25) в присутствии плазмид, несущих гены rplY Е. coli и ctc В. subtilis либо его 5'- концевую часть (Nfr-ctc), кодирующую N-домен (1-94 остатки) белка. Клетки инкубировались в среде LB при температуре 37°С с перемешиванием (200 об/мин). Среда содержала 50 мкг/мл канамицина, если клетки содержали плазмиды.
Штамм KNB800 растет значительно хуже исходного штамма в диапазоне температур (от 20 до 42°С). При этом не наблюдается ростовых дефектов, таких как холодочувствительность, температурочувствительность или ауксотрофия. Рост KNB800 может быть значительно ускорен за счет in trans экспрессии гена белка L25, а также основного стрессового белка СТС В. subtilis и его N-концевого домена, который гомологичен по последовательности и соразмерен L25. Таким образом, показано, что замедленный рост KNB800 вызван отсутствием в клетке белка L25. Кроме того, показано, что основной стрессовый белок СТС В. subtilis (конкретно, его N-концевой домен) является функциональным аналогом рибосомного белка L25.
В результате фракционирования S30 лизата KNB800 при помощи центрифугирования в градиенте плотности сахарозы выяснилось, что рибосомы этого штамма сохраняют компактность сравнимую с контрольными рибосомами. 50S субчастицы KNB800 нормально ассоциируют с 30S субчастицами и формируют 70S рибосомы. Белковый состав рибосом KNB800, проанализированный при помощи двумерного гель-электрофореза, за исключением отсутствия белка L25, не отличается от состава контрольных рибосом. Таким образом, рибосомы AL25 штамма нормальны по физическим параметрам и составу. Это означает, что L25 не требуется для сборки 50S субчастиц и образования 70S рибосом.
Рибосомы AL25 штамма способны синтезировать поли-Фен с такой же эффективностью, что и контрольные рибосомы. Эти данные говорят о том, что
пептидил-трансферазная активность, фактор-зависимое связывание тРНК, а также рибосом-зависимая ГТФ-азная реакция не нарушены в отсутствие L25, так как скорость элонгации не изменяется.
В бесклеточной системе трансляции природных мРНК люциферазы Photinus pyralis и зеленого флуоресцирующего белка (GFP) Aequorea victoria полноразмерные белки продуцировались за одинаковое время в системах, содержащих мутантные и контрольные рибосомы (Рис. 11; сравн. время появления активности белков).
W3110
GFP
О 10 20 30 40 50 60 70 80
время, мин
15 20 25 30 35 40 время, мин
Рис. 11. Синтез GFP Aequorea victoria (А) и люциферазы Photinus pyralis (Б) в бесклеточной системе трансляции рибосомами штаммов KNB800 (Ж) и W3110 (•). В случае GFP система содержала [14С]Лей, через 30 минут после начала реакции из системы отбиралась аликвота для анализа при помощи гель-электрофореза с последующей авторадиографией (правая часть секции А).
Это означает, что для осуществления полного цикла трансляции природной мРНК (включающего в себя инициацию, элонгацию и терминацию) мутантным и контрольным рибосомам требуется одинаковое время. Однако в системе с рибосомами
KNB800 в обоих случаях синтезировалось в 1.5-2 раза меньше белка по сравнению с контролем. Эти данные соотносятся с данными, полученными in vivo с помощью (3-галактозидазного теста (Рис. 12).
Таким образом, отсутствие белка L25 приводит к снижению белок-синтезирующей активности клеток Е. coli, что, по-видимому, и является причиной медленного роста штамма KNB800. Наиболее вероятными причинами низкой эффективности трансляции в случае рибосом KNB00 могут быть ошибки трансляции, приводящие к накоплению неактивного белка или абортивных
20 30 40 50 время, мин
Рис. 12. Способность штаммов KNB800 (Ж) и W3110 (•) синтезировать полипептид in vivo. Активность р-галактозидазы представлена в миллеровских единицах.
пептидов, либо нарушения на пост-терминационном этапе (т. е. после высвобождения синтезированного белка из рибосомы), что должно снижать эффективность реинициации рибосомами синтеза белка на новой мРНК.
Отношение количества активного GFP (определенного по флуоресценции) к количеству включенного [14С]Лей не изменялось во время линейного синтеза (6-30 мин от начала реакции) этого белка in vitro и было примерно одинаковым в системах с AL25 и контрольными рибосомами. Эти данные указывают на то, что рибосомы мутантного штамма синтезируют белок, обладающий той же удельной активностью, что и контрольные рибосомы. Это означает, что меньший выход белкового продукта в бесклеточной системе трансляции с рибосомами, лишенными белка L25, связан не с накоплением неактивных полипептидов, а именно с уменьшением общего количества синтезированного продукта (Рис. 11 А, справа). Это дает нам основания предполагать, что наиболее вероятной причиной снижения эффективности белкового синтеза рибосомами, лишенными белка L25, является нарушение пост-терминационного этапа трансляции. Интересно, что данные, сходные с нашими, были получены Каджи и сотрудниками (Hirokawa, G., et al., 2004, Mol. Microbiol., 54:1011-1021). Авторы показали, что при инактивации фактора рециклинга рибосом (RRF) в клетках Е. coli синтез белка in vivo был угнетен, и in vitro трансляция природной мРНК рибосомами соответствующего штамма происходила мене эффективно по сравнению с контролем. В то же время, не было выявлено отличий в трансляции поли-У, поскольку этот процесс не требует рециклинга.
Анализ структурных и биохимических данных указывает на то, что ни 5 S рРНК, ни белок L25, по-видимому, не контактируют напрямую с факторами трансляции на рибосоме. Однако 5S рРНК образует контакты с 23S рРНК. Так, кроме белка L25, с
петлей Е 5 S рРНК контактирует только спираль Н38 23S рРНК (А-сайтовый палец, ASF) (Рис. 13). ASF участвует в образовании межсубъединичного мостика В 1а в 70S рибосоме. Эта спираль изменяет свою конформацию во время функционирования на рибосоме RRF. По всей видимости, изменение конформации спирали Н38 является одним из этапов сложного преобразования, приводящего к диссоциации рибосомных субчастиц после терминации синтеза полипептида. Можно предположить, что если в отсутствие белка L25 контакт спирали Н38 с петлей Е 5 S рРНК будет нарушен, то это могло бы привести к изменению конформации спирали Н38, что в свою очередь, могло
5S рРНК
спираль H38 23S
петля Е 5S рРНК
Рис. 13. Взаимное расположение спирали Н38 23S рРНК и 5S рРНК-белкового комплекса в рибосоме Е. coli.
бы затруднить функционирование RRF.
Необходимо отметить, что белки СТС найдены только в бактериях. Фактор рециклинга рибосом необходим для выживания бактериальных клеток. Похожий по последовательности белок был найден также в дрожжах, но он не является жизненно важным для этих организмов. Структура петли Е в 5S рРНК, с которой взаимодействуют белки СТС, также уникальна для бактериальных 5S рРНК. На основании изложенных фактов, гипотеза о необходимости белка L25 для осуществления эффективного рециклинга рибосом Е. coli кажется нам весьма вероятным объяснением медленного роста клеток AL25 штамма.
4. Изучение механизма взаимодействия белков семейства СТС с 5S рРНК.
Как уже упоминалось, семейство белков СТС включает как истинно рибосомные (т.е. выделенные из рибосом), так и ассоциирующие с рибосомой шоковые белки. Все известные рибосомные белки СТС связываются с 5S рРНК. Шоковый белок СТС В. subtilis также обнаруживается в рибосомной фракции клеток при стрессовых условиях. Данных о локализации в клетках прочих белков семейства СТС нет. Белки семейства СТС могут состоять из одного (L25 Е. coli и др.), двух (TL5 Т. thermophilus и др.) и даже трех (СТС D. radiodurans) доменов. При всем разнообразии, характерной чертой всех белков СТС является наличие домена, который соразмерен и гомологичен по последовательности рибосомному белку L25 Е. coli. В случае трех только что перечисленных белков этот домен отвечает за связывание с уникальной (по структуре) для бактерий петлей Е 5S рРНК (Рис. 14А).
А
G-C70 105G-C А о G U ° А G U A G G G* А о U G о А *C-G* G о U 80 95U - G*
Рис. 14. А, Схема вторичной структуры 5S рРНК Е. coli в районе петли Е. Звездочками обозначены неконсервативные нуклеотиды (<80% в бактериальных 5S рРНК). Б, Сравнение пространственных структур рибосомных белков TL5 (серый цвет) и L25 (черный цвет) в комплексе с фрагментом 5S рРНК. Положение пяти консервативных остатков показано сферами. В, совмещение 5S рРНК-узнающих модулей белков L25 (черный цвет) и TL5 (серый цвет). Нумерация по белку TL5.
Сравнение пространственных структур комплексов рибосомных белков, TL5 и L25 с фрагментом 5S рРНК, содержащим петлю Е, показывает, что, несмотря на низкую гомологию белков по последовательности, их трехмерные структуры и способ взаимодействия с РНК весьма схожи (Рис. 14Б). Из более десятка аминокислотных остатков, которые формируют водородные связи с 5S рРНК, лишь пять являются строго консервативными. В белках TL5 и L25 эти остатки идентичны — Arg 10, Arg 19, Tyr29, His85 и Asp87 (нумерация по белку TL5).
Пространственное положение данных остатков в обоих белках практически совпадает (Рис. 14В), также совпадают водородные связи с 5S рРНК, сформированные этими остатками. На основании изложенных фактов была выдвинута гипотеза о том, что мишенью всех белков СТС (как рибосомных, так и шоковых), имеющих состоящий из 5 консервативных аминокислотных остатков «СТС-мотив», может являться 5S рРНК. Сами же эти остатки могут формировать «5S рРНК-узнающий модуль» на поверхности СТС белков.
Для проверки данной гипотезы шоковый белок СТС В. subtilis был выделен из суперпродуцентного штамма Е. coli. Данный белок содержит СТС-мотив RRYHD, и, в полном соответствии с нашей гипотезой, способен специфически связываться с 5S рРНК разных бактерий (Рис. 15).
Рис. 15. РНК-связывающие свойства белка СТС В. subtilis. Электрофорез в неденатурирующих условиях (12% ПААГ). 1,3,5 — 5S рРНК Е. coli, Bacillus stearothermophilus и Т. thermophilics, соответственно; 2,4,6 - как 1,2,3 + BsuCTC; 7 - суммарная тРНК Е. coli\ 8 - тРНК + BsuCTC.
Для более детального изучения механизма узнавания 5S рРНК белками СТС, на примере белка TL5 был исследован вклад различных аминокислотных остатков, образующих водородные связи с 5S рРНК в стабилизацию РНК-белкового комплекса. Для облегчения постановки экспериментов, вместо полноразмерного белка TL5 мы использовали его N-концевой домен (NfrTL5, остатки 1-91), который связывается с 5S рРНК с таким же сродством, как и интактный белок.
Пять строго консервативных и несколько неконсервативных остатков белка TL5, которые участвуют в связывании 5S рРНК, при помощи направленного мутагенеза были заменены на аланин и/или на иные аминокислотные остатки. NfrTL5 и его мутантные формы были выделены из суперпродуцентных штаммов Е. coli. РНК-связывающие свойства этих белков были изучены при помощи гель-шифта (изменения подвижности РНК при связывании с белком при гель-электрофорезе в неденатурирующих условиях) и сорбции РНК-белковых комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах. Результаты, полученные обоими методами, хорошо согласуются друг с другом (Табл. 5).
Наши данные показывают, что при замене на аланин одного или даже двух неконсервативных (К 14, S16, R20) остатков белка TL5, образующих в исходном
1 2 3 4 5 6 7 8 pPHK-W^Ww* тРНК—
комплексе водородные связи с РНК, мутантные белки сохраняют РНК-связывающую способность, причем стабильность образующихся комплексов сравнима с контролем.
Табл. 5. 5S рРНК-связывающие свойства NfrTL5 дикого типа и его мутантных форм.
а Связывание оценивалось с помощью гель-шифта. Знак «+» означает, что белок при умеренном (2-3-кратном) молярном избытке образует комплекс с 5S РНК, однако в геле виден шлейф свободной РНК, что может свидетельствовать о частичной диссоциации комплекса во время электрофореза. Знак «+/-» означает, что даже при семикратном избытке белка не удалось добиться полного связывания 5S рРНК с белком.
Кажущаяся константа диссоциации Kd определялась методом сорбции комплекса на нитроцеллюлозных фильтрах как концентрация белка в точке полунасыщения кривой титрования. Каждая цифра является средней величиной из 23 независимых экспериментов (стандартное отклонение не превышало 20%). ° Белок NfrTL5 дикого типа.
Связывание не обнаруживалось при концентрациях белка до 5 JJ.M.
В то же время, любые замены одного из 5 строго консервативных остатков (R10, R19, Y29, Н85 и D87) приводят дестабилизации или даже к невозможности образования комплекса NfrTL5-5S рРНК. Так, замены одного из остатков RIO, R19 или Н85 приводят к увеличению константы диссоциации соответствующих комплексов как минимум в 10 раз, что свидетельствует о резком снижении их стабильности. Наиболее сильный эффект давали замены консервативных Y29 и D87. За исключением замены D87E, любые замены этих остатков приводили к разрушению комплекса NfrTL5-5S рРНК. Замена D87E не разрушает комплекс, но существенно его дестабилизирует.
Сравнительный анализ комплексов белков L25 и TL5 с 5S рРНК показывает, что в обоих комплексах неконсервативные остатки расположены по периферии поверхности контакта (Рис. 16). Водородные связи, которые образуют с РНК эти остатки, доступны растворителю, в то время как консервативные остатки и их Н-связи скрыты от растворителя. Таким образом, водородные связи неконсервативных остатков с их партнерами в РНК могут разрываться и компенсироваться за счет образования связей с молекулами воды. При этом не происходит дегидратации полярных атомов в РНК-белковом интерфейсе комплекса и общая энергия системы фактически не меняется. Поэтому замены соответствующих неконсервативных остатков на аланин не оказывают серьезного влияния на образование и стабильность комплексов мутантных белков с РНК (Табл. 5).
Замена Связывание
5SрРНК3 цМ
w.t.c ++ 0.09
К14А ++ 0.13
S16A ++ 0.12
R20A ++ 0.15
■S16A ++ 0.15
■R20A
R10A + 1.40
R19A + 1.25
Y29S - H.c.d
Y29F - н.с.
Y29R - н.с.
Н85А + 1.20
Н85Т + 1.00
H85N + 1.00
H85F - н.с.
D87S - н.с.
D87N - н.с.
D87E +/- 2.50
Боковые цепи взаимодействующих с РНК консервативных остатков, напротив, частично или полностью недоступны растворителю. Замены этих остатков приводят к потере Н-связей, которые не могут быть скомпенсированы новыми связями с молекулами воды. Кроме того, изменение взаимного расположения донора и акцептора Н-связи даже на 1А должно приводить к ослаблению или разрыву связи. Это объясняет, почему любая замена одного из остатков, Y29 или Э87 приводит к разрушению
комплекса №гТЬ5-РНК. Помимо межмолекулярных связей аминокислотные остатки У29 и Б87 образуют одну водородную связь друг с другом. Эта связь, вероятно, стабилизирует конформацию боковых цепей данных остатков на поверхности белка. Стереохимический анализ показывает, что при любых заменах этих остатков (за исключением замены Э87Е) нарушаются не только межмолекулярные РНК-белковые связи, но и связь У29-Б87. В случае замены Б87Е, глютаминовая кислота способна сформировать водородную связь с тирозином, однако, в силу большего размера, может препятствовать формированию плотного контакта РНК-ТЬ5. Замена одного из этих остатков должна дестабилизировать конформацию боковой цепи второго остатка. Таким образом, происходит потеря не 1, а сразу 2 недоступных растворителю межмолекулярных Н-связей. Мы видим, что в результате таких замен комплекс ТЬ5-58 рРНК не образуется (Табл. 5).
На основании представленных данных можно заключить, что именно закрытые от растворителя РНК-белковые водородные связи «заякоривают» комплекс, а формирующие эти связи консервативные остатки белка ТЬ5 (СТС-мотив "РИУНО") образуют 5Б рРНК-узнающий модуль на поверхности белка. Исходя из строгой консервативности СТС-мотива, можно заключить, что механизм узнавания 5 Б рРНК белками семейства СТС сходен для всех этих белков.
Рис. 16. Вид поверхности белка ТЬ5 со стороны, контактирующей с 5Б рРНК. Поверхность контакта отмечена светлосерым. Отмечены аминокислотные остатки, контактирующие с РНК. Консервативные остатки отмечены прямоугольными рамками, неконсервативные — овальными рамками.
выводы
1. Показано, что нокаут генов рибосомных белков Sil, S21, L5 и L18 в хромосоме Е. coli можно осуществить только в присутствии плазмид, обеспечивающих конститутивную экспрессию соответствующих генов. Следовательно, без этих белков клетки Е. coli неспособны выжить.
2. Показано, что сборка 30S рибосомной субчастицы Е. coli может осуществляться in vivo в отсутствие белка S15. Ухудшение работы рибосом, лишенных белка S15, может быть связано с нарушением ассоциации рибосомных субчастиц в клетках AS 15 штамма Е. coli.
3. Показано, что встраивание белка S18 в 30S субчастицу in vivo может происходить без участия белка S6.
4. Показано, что клетки Е. coli, лишенные гена белка L25, выживают, но растут вдвое медленнее родительских. Восстановление исходной скорости роста таких клеток достигается in trans экспрессией гена белка L25 с плазмиды.
5. Показано, что ни один из пяти консервативных образующих недоступные растворителю водородные связи с 5S рРНК аминокислотных остатков в рибосомном белке TL5 T. thermophilus не может быть заменен без существенного ухудшения или полной утраты этим белком способности связывать 5S рРНК. Следовательно, эти аминокислотные остатки играют ключевую роль в узнавании РНК и формировании стабильного комплекса TL5-5S рРНК.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Корепанов, А. П., Гонгадзе, Г. М., Гарбер, М. Б. (2004). Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5S РНК. Биохимия 69, 749-754.
2. Gongadze, G. М., Korepanov, А. P., Stolboushkina, Е. A., Zelinskaya, N. V., Korobeinikova, А. V., Ruzanov, М. V., Eliseev, В. D., Nikonov, О. S., Nikonov, S. V., Garber, M. В., Lim, V. I. (2005). The crucial role of conserved intermolecular H-bonds inaccessible to the solvent in formation and stabilization of the TL5-5 SrRNA complex. J. Biol. Chem. 280, 16151-16156.
3. Bubunenko, M., Korepanov, A., Court, D. L., Jagannathan, I., Dickinson, D., Chaudhuri, B. R., Garber, M. В., Culver, G. M. (2006). 30S ribosomal subunits can be assembled in vivo without primary binding ribosomal protein S15. RNA 12, 1229-1239.
4. Korepanov, A. P., Gongadze, G. M., Garber, M. B. (2001) General stress protein Ctc of Bacillus subtilis specifically binds to 5S rRNA. "Protein Synthesis", International Conference, Pushchino, Moscow Region, Russia. Abstracts, p. 65.
5. Корепанов, А. П., Гонгадзе, Г. M., Столбоушкина, Е. А., Зелинская, Н. В., Рузанов, М. В., Коробейникова, А. В., Елисеев, Б. Д., Никонов, О. С., Никонов, С. В., Гарбер, М. Б. (2004). Диада консервативных остатков в белке TL5 Thermus thermophilus играет ключевую роль в узнавании этим белком 5S рРНК. 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов, стр. 17.
6. Korepanov, А. P., Gongadze, G. М., Bazhenova, M.V., Garber, М. В., Court, D. L., and Bubunenko, М. G. (2006). Role of 5S rRNA-binding ribosomal protein L25 of Escherichia coli in cell viability and translation. "RNA-protein interactions", the 8th International Engelgardt Conference on Molecular Biology, Buran Conference Center, Moscow Region, Russia. Abstracts, p. 68.
7. Korobeinikova, A. V., Eliseev, B. D., Korepanov, A. P., Gongadze, G. M., and Garber, M. B. (2006). Specific interactions of ribosome associated CTC family proteins with 5S rRNA. "RNA-protein interactions", the 8th International Engelgardt Conference on Molecular Biology, Buran Conference Center, Moscow Region, Russia Abstracts, p. 69.
Заказ № 203/10/06 Подписано в печать 23.10.2006 Тираж 80 экз. Усл. пл. 1,25
^ " ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 О www.cfr.ru ; е-таИ: info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корепанов, Алексей Петрович
ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Исследования роли рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, трансляции и жизнедеятельности клеток Escherichia coll
1. Введение.
2. Морфология бактериальной рибосомы, элонгационный цикл, функционально-важные участки рибосомы.
3. Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомных субчастиц Е. coli.
3.1. Формирование малой рибосомной субчастицы Е. coli.
3.2. Участие рибосомных белков в формировании функциональных сайтов
30S рибосомной субчастицы.
3.2.1. Специфическое связывание тРНК в А-сайте 30S субчастицы.
3.2.2. Связывание тРНК в Р-сайте. Роль белков S9 и S13.
3.2.3. Роль белка S1 в связывании мРНК.
3.3. Сборка большой рибосомной субчастицы Е. coli.
3.4. Участие рибосомных белков в формировании функционально-важных участков 50S субчастицы.
3.4.1. Пептидилтрансферазный центр.
3.4.2. ГТФазный центр, роль белков L7/L12 и LI 1 в трансляции.
3.4.3. L1-выступ 50S субчастицы.
4. Дополнительные функции рибосомных белков.
4.1. Рибосомные белки, регулирующие экспрессию генов.
4.2. Внерибосомные функции рибосомных белков Е. coli.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли отдельных рибосомных белков в формировании бактериальной рибосомы"
С тех пор, как в конце 50-х годов XX века было установлено, что рибосомы ответственны за включение аминокислот в белковую цепь, и по сей день исследования структуры и функции рибосом остаются приоритетным направлением молекулярной биологии. Являясь неотъемлемым компонентом всех живых клеток, рибосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, который состоит из двух компонентов - белков и рибонуклеиновых кислот (РНК). В настоящее время общепринято, что едва ли не все функции рибосомы, связанные с синтезом белка, осуществляются рибосомной РНК (рРНК). В то же время, известно, что лишенная белков рРНК, сама по себе, не способна осуществлять ни одну из функций рибосомы. Таким образом, роль рибосомных белков в функционировании рибосомы представляется не менее значимой, чем роль рРНК.
Основной подход к изучению роли рибосомных белков в трансляции -получение рибосом, лишенных отдельных белков, и определение активности этих рибосом. Такие рибосомы могут быть получены двумя способами:
1. Реконструкция рибосомных субчастиц in vitro из изолированных РНК и белков, исключая изучаемый белок.
2. Получение бактериальных штаммов, не имеющих гена определенного рибосомного белка, либо имеющих существенные мутации в генах изучаемых рибосомных белков, и выделение рибосом из таких штаммов.
Первый подход позволил получить обширную информацию о ступенчатой сборке рибосомы и изучить влияние связывания с рРНК одних белков на связывание других белков. Однако, информация, полученная в экспериментах in vitro, не может полностью осветить то, что происходит в клетке.
Второй подход не только позволяет получать дефицитные по определенным белкам рибосомы, собранные в клетке, но также позволяет проверить, как отсутствие того или иного рибосомного белка отражается на жизнедеятельности клеток. В 80-х годах прошлого века было получено полтора десятка штаммов Escherichia coli, лишенных некоторых рибосомных белков (см. обзор [1]). Однако в те годы методы направленного мутагенеза не были развиты, изучались спонтанные или индуцированные различными реагентами мутации. Информация о роли рибосомных белков в выживании клеток и в сборке рибосомных субчастиц, полученная из этих исследований, была довольно ограниченной. В настоящее время прогресс в молекулярной генетике позволяет осуществлять направленный нокаут хромосомных генов, что существенно облегчает получение дефицитных по рибосомным белкам бактериальных штаммов. Используя современные подходы, можно изучить роль всех рибосомных белков в выживании клеток. А для тех белков, отсутствие которых не является летальным для клетки, можно получить подробную информацию об их влиянии на сборку рибосомных субчастиц и функционирование рибосом.
Первая часть диссертационной работы посвящена изучению необходимости рибосомных белков «платформы» малой рибосомной субчастицы, а также белков 5S рРНК-белкового комплекса для выживания клеток и формирования in vivo рибосомы Е. coli. Для этого мы осуществили нокаут генов рибосомных белков SI 1, S21, L5, L18 и L25. Нокаут первых четырех генов оказался летальным для клеток Е. coli. Были изучены ростовые характеристики штамма Е. coli, лишенного белка L25, и охарактеризованы функциональные свойства ДЬ25 рибосом. Кроме того, нами исследовались лишенные белков S15 и S6 рибосомы из жизнеспособных штаммов Е. coli, дефицитных по этим белкам.
Во второй части данной работы изучались особенности взаимодействия рибосомного белка TL5 Thermus thermophilus (TthTL5), который гомологичен рибосомному белку L25 Е. coli (EcoL25), с рибосомной 5S рРНК. Рибосомные белки TthTL5 и EcoL25 относятся к семейству СТС, которое получило свое название от основного стрессового белка СТС Bacillus subtilis (BsuCTC). Анализ расшифрованных за последние годы геномов показал наличие генов, кодирующих белки этого семейства, в подавляющем большинстве бактерий. Белок BsuCTC продуцируется клетками В. subtilis в ответ на действие различных видов стресса и обнаруживается в рибосомной фракции клеток. Мы показали, что этот белок способен специфически связываться с тем же участком 5S рРНК, с которым связываются EcoL25 и TthTL5, а также DraCTC (белок, найденный в 50S рибосомной субчастице Deinococcus radiodurans). В данной диссертационной работе при помощи направленного мутагенеза были найдены пять аминокислотных остатков, которые играют ключевую роль в узнавании 5S рРНК рибосомным белком TthTL5. Эти остатки являются строго консервативными в белках СТС. Анализ пространственных структур комплексов EcoL25-5S рРНК, TthTL5-5S рРНК и структуры 50S рибосомной субчастицы D. radiodurans показывает, что эти пять строго консервативных аминокислотных остатков вовлечены в связывание 5S рРНК соответствующими белками. Полученные результаты позволяют предположить, что мишенью всех белков семейства СТС (как рибосомных, так и шоковых) является 5S рРНК.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Исследования роли рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, трансляции и жизнедеятельности клеток Escherichia coli.
1. Введение.
Рибонуклеопротеидная природа рибосомы породила множество дискуссий о том, какие из её компонентов, белки или РНК, играют ключевую роль в сборке субчастиц и в их функционировании. В своё время доминировала точка зрения, что рибосомная РНК играет лишь роль каркаса для размещения рибосомных белков, затем появились данные, что РНК сама способна осуществлять энзиматическую функцию. Возникла точка зрения, что именно рибосомная РНК «правит бал» в процессе трансляции. В настоящее время накоплено множество данных, которые указывают на очевидную необходимость обоих компонентов, белков и РНК для нормального функционирования рибосомы.
Представленный обзор литературных данных имеет своей целью собрать воедино биохимические, структурные и генетические данные о роли ряда рибосомных белков в сборке рибосомных субчастиц, формировании активных центров рибосомы и выживании бактериальных клеток. В обзор включены данные по рибосомным белкам Escherichia coli, так как рибосомы этого организма наиболее подробно изучены с биохимической и генетической точек зрения.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Корепанов, Алексей Петрович
выводы
1. Показано, что нокаут генов рибосомных белков Sll, S21, L5 и L18 в хромосоме Е. coli можно осуществить только в присутствии плазмид, обеспечивающих конститутивную экспрессию соответствующих генов. Следовательно, без этих белков клетки Е. coli неспособны выжить.
2. Показано, что сборка 30S рибосомной субчастицы Е. coli может осуществляться in vivo в отсутствие белка S15. Ухудшение работы рибосом, лишенных белка S15, может быть связано с нарушением ассоциации рибосомных субчастиц в клетках AS 15 штамма Е. coli.
3. Показано, что встраивание белка S18 в 30S субчастицу in vivo может происходить без участия белка S6.
4. Показано, что клетки Е. coli, лишенные гена белка L25, выживают, но растут вдвое медленнее родительских. Восстановление исходной скорости роста таких клеток достигается in trans экспрессией гена белка L25 с плазмиды.
5. Показано, что ни один из пяти консервативных образующих недоступные растворителю водородные связи с 5S рРНК аминокислотных остатков в рибосомном белке TL5 Т. thermophilics не может быть заменен без существенного ухудшения или полной утраты этим белком способности связывать 5S рРНК. Следовательно, эти аминокислотные остатки играют ключевую роль в узнавании РНК и формировании стабильного комплекса TL5-5S рРНК.
БЛАГОДАРНОСТИ
Сердечно благодарю моего научного руководителя Марию Борисовну Гарбер за внимание, которое она уделила моей работе, за критические отзывы и ценные советы.
Говорю спасибо моему наставнику Георгию Михайловичу Гонгадзе, научившему меня многому из того, что я умею. Спасибо за помощь в выполнении работы и анализе ее результатов.
Благодарю Михаила Геннадиевича Бубуненко за предоставленные штаммы и за помощь в планировании и осуществлении нокаута хромосомных генов.
Выражаю благодарность моим коллегам, совместно с которыми выполнена часть данной работы, Максиму Рузанову, Елене Столбоушкиной, Анне Коробейниковой, Борису Елисееву и Наталье Зелинской.
Спасибо Олегу Никонову за помощь в оформлении работы.
Всех сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции благодарю за поддержку, ценные замечания, а также за создание рабочей обстановки и просто приятную компанию.
Спасибо сотрудникам Института белка, оказавшим помощь при выполнении работы.
Нижайший поклон моим родителям Петру Алексеевичу и Маргарите Алексеевне, а также жене Марине и сынуле Никите за любовь, поддержку и понимание.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корепанов, Алексей Петрович, Москва
1. Dabbs, Е. R. (1991). Mutants lacking individual ribosomal proteins as a tool toinvestigate ribosomal properties. Biochimie 73, 639-645.
2. Спирин, A. C. (1986). Структура рибосомы и биосинтез белка (под ред.
3. Пенкиной М. М.), М.: Высшая школа, 303 с.
4. Girshovich, A. S., Bochkareva, Е. S. & Vasiliev, V. D. (1986). Localization ofelongation factor Tu on the ribosome. FEBSLett. 197, 192-198.
5. Girshovich, A. S., Kurtskhalia, Т. V., Ovchinnikov Yu, A. & Vasiliev, V. D.1981). Localization of the elongation factor G on Escherichia coli ribosome. FEBS Lett. 130, 54-59.
6. Agrawal, R. K., Penczek, P., Grassucci, R. A. & Frank, J. (1998). Visualization ofelongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Set USA 95, 6134-6138.
7. Stark, H., Rodnina, M. V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W. &van Heel, M. (1997). Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389, 403-406.
8. Monro, R. E. (1967). Catalysis of peptide bond formation by 50 S ribosomal subunitsfrom Escherichia coli. J. Mol. Biol. 26, 147-151.
9. Osswald, M., Doring, T. & Brimacombe, R. (1995). The ribosomal neighbourhoodof the central fold of tRNA: cross-links from position 47 of tRNA located at the A, P or E site. Nucleic Acids Res. 23, 4635-4641.
10. Moazed, D. & Noller, H. F. (1991). Sites of interaction of the CCA end ofpeptidyltRNA with 23S rRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3725-3728.
11. Noller, H. F., Moazed, D., Stern, S., Powers, Т., Allen, P. N., Robertson, J. M.,
12. Moazed, D. & Noller, H. F. (1989). Interaction of tRNA with 23S rRNA in theribosomal A, P, and E sites. Cell 57, 585-597.
13. Garrett, R. A. & Rodriguez-Fonesca, C. (1996). In Ribosomal RNA: Structure,
14. Evolution, Processing and Function in Protein Biosynthesis (Zimmermann, R. A. & Dahlberg, A. E., eds.), pp. 327-355. CRC Press Boca Raton.
15. Schuwirth, B. S., Borovinskaya, M. A., Hau, C. W., Zhang, W., Vila-Sanjurjo,
16. A., Holton, J. M. & Cate, J. H. (2005). Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310, 827-834.
17. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. & Steitz, T. A. (2000). The completeatomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905-920.
18. Yusupov, M. M., Yusupova, G. Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T. N.,
19. Cate, J. H. & Noller, H. F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292, 883-896.
20. Schlunzen, F., Zarivach, R., Harms, J., Bashan, A., Tocilj, A., Albrecht, R.,
21. Yonath, A. & Franceschi, F. (2001). Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature 413, 814-821.
22. Kaltschmidt, E. & Wittmann, H. G. (1970). Ribosomal proteins. XII. Number ofproteins in small and large ribosomal subunits of Escherichia coli as determined by two-dimensional gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67, 12761282.
23. Hosokawa, K., Fujimura, R. K. & Nomura, M. (1966). Reconstitution offunctionally active ribosomes from inactive subparticles and proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55, 198-204.
24. Traub, P. & Nomura, M. (1968). Structure and function of E. coli ribosomes. V.
25. Reconstitution of functionally active 30S ribosomal particles from RNA and proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 777-784.
26. Held, W. A., Mizushima, S. & Nomura, M. (1973). Reconstitution of Escherichiacoli 30 S ribosomal subunits from purified molecular components. J. Biol. Chem. 248, 5720-5730.
27. Culver, G. M. & Noller, H. F. (1999). Efficient reconstitution of functional
28. Escherichia coli 30S ribosomal subunits from a complete set of recombinant small subunit ribosomal proteins. RNA 5, 832-843.
29. Held, W. A., Ballou, В., Mizushima, S. & Nomura, M. (1974). Assembly mappingof 30 S ribosomal proteins from Escherichia coli. Further studies. J. Biol. Chem. 249,3103-3111.
30. Mizushima, S. & Nomura, M. (1970). Assembly mapping of 30S ribosomal proteinsfrom E. coli. Nature 226, 1214.
31. Talkington, M. W., Siuzdak, G. & Williamson, J. R. (2005). An assemblylandscape for the 30S ribosomal subunit. Nature 438, 628-632.
32. Stern, S., Changchien, L. M., Craven, G. R. & Noller, H. F. (1988). Interaction ofproteins S16, S17 and S20 with 16 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 200, 291-299.
33. Svensson, P., Changchien, L. M., Craven, G. R. & Noller, H. F. (1988).1.teraction of ribosomal proteins, S6, S8, S15 and S18 with the central domain of 16 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 200, 301-308.
34. Powers, Т., Changchien, L. M., Craven, G. R. & Noller, H. F. (1988). Probing theassembly of the 3' major domain of 16 S ribosomal RNA. Quaternary interactions involving ribosomal proteins S7, S9 and S19. J. Mol. Biol 200, 309-319.
35. Gutell, R. R., Weiser, В., Woese, C. R. & Noller, H. F. (1985). Comparativeanatomy of 16-S-like ribosomal RNA. Prog. Nucleic Acid Res. Mol Biol. 32, 155216.
36. Agalarov, S. C., Selivanova, О. M., Zheleznyakova, E. N., Zheleznaya, L. A.,
37. Matvienko, N. I. & Spirin, A. S. (1999). Independent in vitro assembly of all three major morphological parts of the 30S ribosomal subunit of Thermus thermophilus. Eur. J. Biochem. 266, 533-537.
38. Agalarov, S. C., Zheleznyakova, E. N., Selivanova, О. M., Zheleznaya, L. A.,
39. Matvienko, N. I., Vasiliev, V. D. & Spirin, A. S. (1998). In vitro assembly of a ribonucleoprotein particle corresponding to the platform domain of the 30S ribosomal subunit. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 999-1003.
40. Samaha, R. R., O'Brien, В., O'Brien, T. W. & Noller, H. F. (1994). Independent invitro assembly of a ribonucleoprotein particle containing the 3' domain of 16S rRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7884-7888.
41. Holmes, K. L. & Culver, G. M. (2005). Analysis of conformational changes in 16 SrRNA during the course of 30 S subunit assembly. J. Mol Biol. 354, 340-357.
42. Brodersen, D. E., Clemons, W. M., Jr., Carter, A. P., Wimberly, В. T. &
43. Ramakrishnan, V. (2002). Crystal structure of the 30 S ribosomal subunit from Thermus thermophilus: structure of the proteins and their interactions with 16 S RNA. J. Mol. Biol, 316, 725-768.
44. Mandiyan, V., Tumminia, S., Wall, J. S., Hainfeld, J. F. & Boublik, M. (1989).
45. Protein-induced conformational changes in 16 S ribosomal RNA during the initial assembly steps of the Escherichia coli 30 S ribosomal subunit. J. Mol. Biol. 210, 323-336.
46. Mandiyan, V., Tumminia, S. J., Wall, J. S., Hainfeld, J. F. & Boublik, M. (1991).
47. Assembly of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit reveals protein-dependent folding of the 16S rRNA domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8174-8178.
48. Held, W. A. & Nomura, M. (1973). Rate determining step in the reconstitution of
49. Escherichia coli 30S ribosomal subunits. Biochemistry 12, 3273-3281.
50. Powers, Т., Daubresse, G. & Noller, H. F. (1993). Dynamics of in vitro assembly of
51. S rRNA into 30 S ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 232, 362-374.
52. Vasiliev, V. D., Selivanova, О. M. & Koteliansky, V. E. (1978). Specificselfpacking of the ribosomal 16 S RNA. FEBS Lett. 95, 273-276.
53. Held, W. A. & Nomura, M. (1975). Escherichia coli 30 S ribosomal proteinsuniquely required for assembly. J. Biol. Chem. 250, 3179-3184.
54. Bubunenko, M., Korepanov, A., Court, D. L., Jagannathan, I., Dickinson, D.,
55. Chaudhuri, B. R., Garber, M. B. & Culver, G. M. (2006). 30S ribosomal subunits can be assembled in vivo without primary binding ribosomal protein SI5. RNA 12, 1229-1239.
56. Yano, R. & Yura, T. (1989). Suppression of the Escherichia coli rpoH opal mutationby ribosomes lacking S15 protein. J. Bacteriol. 171, 1712-1717.
57. Powers, T. & Noller, H. F. (1995). Hydroxyl radical footprinting of ribosomalproteins on 16S rRNA. RNA 1, 194-209.
58. Chang, C. & Craven, G. R. (1977). Identification of several proteins involved in themessenger RNA binding site of the 30 S ribosome by inactivation with 2-methoxy-5-nitrotropone. J. Mol Biol 117,401-418.
59. Fanning, Т. G., Cantrell, M., Shih, C. Y. & Craven, G. R. (1978). Evidence thatproteins SI, Sll and S21 directly participates in the binding of transfer RNA to the 30S ribosome. Nucleic Acids Res. 5, 933-950.
60. Wild, D. G. (1988). Reversion from erythromycin dependence in Escherichia coli:strains altered in ribosomal sub-unit association and ribosome assembly. J. Gen. Microbiol. 134, 1251-1263.
61. Gotz, F., Fleischer, С., Pon, C. L. & Gualerzi, С. O. (1989). Subunit associationdefects in Escherichia coli ribosome mutants lacking proteins S20 and Lll. Eur. J. Biochem. 183, 19-24.
62. Gorini, L. & Kataja, E. (1964). Streptomycin-Induced Oversuppression in E. coli.
63. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 995-1001.
64. Davies, J., Gilbert, W. & Gorini, L. (1964). Streptomycin, Suppression, and the
65. Code. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 883-890.
66. Ozaki, M., Mizushima, S. & Nomura, M. (1969). Identification and functionalcharacterization of the protein controlled by the streptomycin-resistant locus in E. coli. Nature 222,333-339.
67. Chakrabarti, S. & Gorini, L. (1975). Growth of bacteriophages MS2 and T7 onstreptomycin-resistant mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 121, 670-674.
68. Bouadloun, F., Donner, D. & Kurland, C. G. (1983). Codon-specific missenseerrors in vivo. Embo J. 2,1351-1356.
69. Brownstein, B. L. & Lewandowski, L. J. (1967). A mutation suppressingstreptomycin dependence. I. An effect on ribosome function. J. Mol. Biol. 25, 99109.
70. Rosset, R. & Gorini, L. (1969). A ribosomal ambiguity mutation. J. Mol. Biol. 39,95.112.
71. Zimmermann, R. A., Garvin, R. T. & Gorini, L. (1971). Alteration of a 30Sribosomal protein accompanying the ram mutation in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sc.i USA 68, 2263-2267.
72. Hasenbank, R., Guthrie, C., Stoffler, G., Wittmann, H. G., Rosen, L. & Apirion,
73. D. (1973). Electrophoretic and immunological studies on ribosomal proteins of 100 Escherichia coli revertants from streptomycin dependence. Mol. Gen. Genet. 127, 1-18.
74. Piepersberg, W., Bock, A. & Wittmann, H. G. (1975). Effect of different mutationsin ribosomal protein S5 of Escherichia coli on translational fidelity. Mol. Gen. Genet. 140, 91-100.
75. Ogle, J. M., Murphy, F. V., Tarry, M. J. & Ramakrishnan, V. (2002). Selection oftRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 111,721-732.
76. Ogle, J. M., Brodersen, D. E., demons, W. M., Jr., Tarry, M. J., Carter, A. P. &
77. Ramakrishnan, V. (2001). Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292, 897-902.
78. Ogle, J. M., Carter, A. P. & Ramakrishnan, V. (2003). Insights into the decodingmechanism from recent ribosome structures. Trends Biochem. Sci. 28, 259-266.63. demons, W. M., Jr., May, J. L., Wimberly, В. Т., McCutcheon, J. P., Capel, M.
79. S. & Ramakrishnan, V. (1999). Structure of a bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 A resolution. Nature 400, 833-840.
80. Agafonov, D. E., Kolb, V. A. & Spirin, A. S. (1997). Proteins on ribosome surface:measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12892-12897.
81. Wimberly, В. Т., Brodersen, D. E., Clemons, W. M., Jr., Morgan-Warren, R. J.,
82. Carter, A. P., Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. (2000). Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407, 327-339.
83. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels,
84. H., Franceschi, F. & Yonath, A. (2001). High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107, 679-688.
85. Hoang, L., Fredrick, K. & Noller, H. F. (2004). Creating ribosomes with an all
86. RNA 30S subunit P site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12439-12443.
87. Cukras, A. R. & Green, R. (2005). Multiple effects of S13 in modulating thestrength of intersubunit interactions in the ribosome during translation. J. Mol. Biol. 349, 47-59.
88. Cukras, A. R., Southworth, D. R., Brunelle, J. L., Culver, G. M. & Green, R.2003). Ribosomal proteins S12 and S13 function as control elements for translocation of the mRNA:tRNA complex. Mol. Cell. 12, 321-328.
89. Boni, I. V., Zlatkin, I. V. & Budowsky, E. I. (1982). Ribosomal protein SIassociates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions. Eur. J. Biochem. 121, 371-376.
90. S ribosomal subunit of Escherichia coli. 3. Requirement of protein SI for translation. J. Mol. Biol. 84, 185-195.
91. Suryanarayana, T. & Subramanian, A. R. (1983). An essential function ofribosomal protein SI in messenger ribonucleic acid translation. Biochemistry 22, 2715-2719.
92. Boni, I. V., Isaeva, D. M., Musychenko, M. L. & Tzareva, N. V. (1991).
93. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res. 19, 155-162.
94. Subramanian, A. R. (1983). Structure and functions of ribosomal protein SI. Prog.
95. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 28, 101-142. 16. Roberts, M. W. & Rabinowitz, J. C. (1989). The effect of Escherichia coli ribosomal protein SI on the translational specificity of bacterial ribosomes. J. Biol. Chem. 264, 2228-2235.
96. Farwell, M. A., Roberts, M. W. & Rabinowitz, J. C. (1992). The effect ofribosomal protein SI from Escherichia coli and Micrococcus luteus on protein synthesis in vitro by E. coli and Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 6, 3375-3383.
97. Tzareva, N. V., Makhno, V. I. & Boni, I. V. (1994). Ribosome-messengerrecognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett. 337, 189-194.
98. Komarova, A. V., Tchufistova, L. S., Supina, E. V. & Boni, I. V. (2002). Protein
99. SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNA 8, 1137-1147.
100. Tedin, K., Resch, A. & Blasi, U. (1997). Requirements for ribosomal protein SI fortranslation initiation of mRNAs with and without a 5' leader sequence. Mol. Microbiol. 25, 189-199.
101. Bear, D. G., Ng, R., Van Derveer, D., Johnson, N. P., Thomas, G., Schleich, T. &
102. Noller, H. F. (1976). Alteration of polynucleotide secondary structure by ribosomal protein SI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1824-1828.
103. Jenner, L., Romby, P., Rees, В., Schulze-Briese, C., Springer, M., Ehresmann,
104. C., Ehresmann, В., Moras, D., Yusupova, G. & Yusupov, M. (2005). Translational operator of mRNA on the ribosome: how repressor proteins exclude ribosome binding. Science 308, 120-123.
105. Sorensen, M. A., Fricke, J. & Pedersen, S. (1998). Ribosomal protein SI is requiredfor translation of most, if not all, natural mRNAs in Escherichia coli in vivo. J, Mol. Biol. 280, 561-569.
106. Kitakawa, M. & Isono, K. (1982). An amber mutation in the gene rpsA forribosomal protein SI in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 185,445-447.
107. Stanley, W. M., Jr. & Bock, R. M. (1965). Isolation and physical properties of theribosomal ribonucleic acid of Escherichia coli. Biochemistry 4,1302-1311.
108. Serdyuk, I. N. & Grenader, A. K. (1977). On the distribution and packing of RNAand protein ribosomes. Eur. J. Biochem. 79, 495-504.
109. Boublik, M., Spiess, E., Roth, H. E., Hellmann, W. & Jenkins, F. (1978). Structureof LiCl core particles of 50 S ribosomal subunits from Escherichia coli by electron microscopy. Cytobiologie 18, 309-319.
110. Sander, G., Marsh, R. C., Voigt, J. & Parmeggiani, A. (1975). A comparativestudy of the 50S ribosomal subunit and several 50S subparticles in EF-T-and EF-G-dependent activities. Biochemistry 14, 1805-1814.
111. Nierhaus, К. H. & Dohme, F. (1974). Total reconstitution of functionally active 50Sribosomal subunits from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 47134717.
112. Hampl, H., Schulze, H. & Nierhaus, К. H. (1981). Ribosomal components from
113. Escherichia coli 50 S subunits involved in the reconstitution of peptidyltransferase activity. J. Biol. Chem. 256, 2284-2288.
114. Garret, R. A., Muller, S., Spierer, P. & Zimmermann, R. A. (1974). Binding of 50
115. S ribosomal subunit proteins to 23 S RNA of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 88, 553-557.
116. Herold, M. & Nierhaus, К. H. (1987). Incorporation of six additional proteins tocomplete the assembly map of the 50 S subunit from Escherichia coli ribosomes. J. Biol. Chem. 262, 8826-8833.
117. Rohl, R. & Nierhaus, К. H. (1982). Assembly map of the large subunit (50S) of
118. Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 729-733.
119. Butler, P. D. & Wild, D. G. (1984). Ribosomal protein synthesis by a mutant of
120. Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 144, 649-654.
121. Maguire, B. A. & Wild, D. G. (1997). The roles of proteins L28 and L33 in theassembly and function of Escherichia coli ribosomes in vivo. Mol. Microbiol. 23, 237-245.
122. Nowotny, V. & Nierhaus, К. H. (1982). Initiator proteins for the assembly of the50S subunit from Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7238-7242.
123. Marvaldi, J., Pichon, J. & Marchis-Mouren, G. (1979). On the control ofribosomal protein biosynthesis in E. coli. IV.Studies on a temperature-sensitive mutant defective in the assembly of 50S subunits. Mol. Gen. Genet. 171, 317-325.
124. Dabbs, E. R. (1982). A spontaneous mutant of Escherichia coli with protein L24lacking from the ribosome. Mol. Gen. Genet. 187, 453-458.
125. Nishi, K., Dabbs, E. R. & Schnier, J. (1985). DNA sequence and complementationanalysis of a mutation in the rplX gene from Escherichia coli leading to loss of ribosomal protein L24. J. Bacteriol. 163, 890-894.
126. Spillmann, S., Dohme, F. & Nierhaus, К. H. (1977). Assembly in vitro of the 50 Ssubunit from Escherichia coli ribosomes: proteins essential for the first heat-dependent conformational change. J. Mol. Biol. 115, 513-523.
127. Franceschi, F. J. & Nierhaus, К. H. (1988). Ribosomal protein L20 can replace theassembly-initiator protein L24 at low temperatures. Biochemistry 27, 7056-7059.
128. Nowotny, V. & Nierhaus, К. H. (1980). Protein L20 from the large subunit of
129. Escherichia coli ribosomes is an assembly protein. J. Mol. Biol. 137, 391-399.
130. Guillier, M., Allemand, F., Graffe, M., Raibaud, S., Dardel, F., Springer, M. &
131. Chiaruttini, C. (2005). The N-terminal extension of Escherichia coli ribosomal protein L20 is important for ribosome assembly, but dispensable for translational feedback control. RNA 11, 728-738.
132. Maden, В. E., Traut, R. R. & Monro, R. E. (1968). Ribosome-catalysed peptidyltransfer: the polyphenylalanine system. J. Mol. Biol. 35, 333-345.
133. Khaitovich, P., Tenson, Т., Mankin, A. S. & Green, R. (1999). Peptidyltransferase activity catalyzed by protein-free 23 S ribosomal RNA remains elusive. RNA 5, 605-608.
134. Teraoka, H. & Nierhaus, К. H. (1978). Protein L16 induces a conformationalchange when incorporated into a L16-deficient core derived from Escherichia coli ribosomes. FEBSLett. 88, 223-226.
135. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P. B. & Steitz, T. A. (2000). Thestructural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289, 920930.
136. Barta, A., Steiner, G., Brosius, J., Noller, H. F. & Kuechler, E. (1984).1.entification of a site on 23 S ribosomal RNA located at the peptidyl transferase center. Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 3607-3611.
137. Kirillov, S. V., Wower, J., Hixson, S. S. & Zimmermann, R. A. (2002). Transit oftRNA through the Escherichia coli ribosome: cross-linking of the 3' end of tRNA to ribosomal proteins at the P and E sites. FEBS Lett. 514, 60-66.
138. Wower, I. K., Wower, J. & Zimmermann, R. A. (1998). Ribosomal protein L27participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. J. Biol Chem. 273, 19847-19852.
139. Maguire, B. A., Beniaminov, A. D., Ramu, H., Mankin, A. S. & Zimmermann,
140. R. A. (2005). A protein component at the heart of an RNA machine: the importance of protein L27 for the function of the bacterial ribosome. Mol Cell 20, 427-435.
141. Moazed, D., Robertson, J. M. & Noller, H. F. (1988). Interaction of elongationfactors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature 334, 362-364.
142. Gudkov, А. Т., Tumanova, L. G., Gongadze, G. M. & Bushuev, V. N. (1980).
143. Role of different regions of ribosomal proteins L7 and L10 in their complex formation and in the interaction with the ribosomal 50 S subunit. FEBS Lett. 109, 34-38.
144. Beauclerk, A. A., Cundliffe, E. & Dijk, J. (1984). The binding site for ribosomalprotein complex L8 within 23 s ribosomal RNA of Escherichia coli. J. Biol Chem. 259, 6559-6563.
145. Hamel, E., Кока, M. & Nakamoto, T. (1972). Requirement of an Escherichia coli
146. S ribosomal protein component for effective interaction of the ribosome with T and G factors and with guanosine triphosphate. J. Biol. Chem. 247, 805-814.
147. Hamel, E. & Nakamoto, T. (1972). Studies on the role of an Escherichia coli 50 Sribosomal component in polypeptide chain elongation. J. Biol Chem. 247, 68106817.
148. Koteliansky, V. E., Domogatsky, S. P., Gudkov, A. T. & Spirin, A. S. (1977).
149. Elongation factor-dependent reactions of ribosomes deprived of proteins L7 and LI2. FEBSLett. 73, 6-11.
150. Highland, J. H., Bodley, J. W., Gordon, J., Hasenbank, R. & Stoffler, G. (1973).1.entity of the ribosomal proteins involved in the interaction with elongation factor G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70,147-150.
151. Schrier, P. I. & Moller, W. (1975). The involvement of 50S ribosomal protein Lllin the EF-G dependent GTP hydrolysis of E. coli ribosomes. FEBS Lett. 54, 130134.
152. Schmidt, F. J., Thompson, J., Lee, K., Dijk, J. & Cundliffe, E. (1981). Thebinding site for ribosomal protein LI 1 within 23 S ribosomal RNA of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 256, 12301-12305.
153. Stoffler, G., Cundliffe, E., Stoffler-Meilicke, M. & Dabbs, E. R. (1980). Mutantsof Escherichia coli lacking ribosomal protein Lll. J. Biol. Chem. 255, 1051710522.
154. Subramanian, A. R. & Dabbs, E. R. (1980). Functional studies on ribosomeslacking protein LI from mutant Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 112, 425-430.
155. Dabbs, E. R., Hasenbank, R., Kastner, В., Rak, К. H., Wartusch, B. & Stoffler,
156. G. (1983). Immunological studies of Escherichia coli mutants lacking one or two ribosomal proteins. Mol. Gen. Genet. 192,301-308.
157. Dabbs, E. R. (1980). The ribosomal components responsible for kasugamycindependence, and its suppression, in a mutant of Escherichia coli. Mol Gen. Genet. Ill, 271-276.
158. Sander, G. (1983). Ribosomal protein LI from Escherichia coli. Its role in thebinding of tRNA to the ribosome and in elongation factor G-dependent GTP hydrolysis. J. Biol. Chem. 258, 10098-10103.
159. Agrawal, R. K., Spahn, С. M., Penczek, P., Grassucci, R. A., Nierhaus, К. H. &
160. Frank, J. (2000). Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle. J. Cell. Biol. 150, 447-460.
161. Nomura, M., Yates, J. L., Dean, D. & Post, L. E. (1980). Feedback regulation ofribosomal protein gene expression in Escherichia coli: structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11, 7084-7088.
162. Deckman, I. С., Draper, D. E. & Thomas, M. S. (1987). S4-alpha mRNAtranslation repression complex. I. Thermodynamics of formation. J. Mol. Biol. 196,313-322.
163. Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L. & Nomura, M. (1988).
164. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. J. Mol. Biol. 204, 309-329.
165. Gregory, R. J., Cahill, P. В., Thurlow, D. L. & Zimmermann, R. A. (1988).1.teraction of Escherichia coli ribosomal protein S8 with its binding sites in ribosomal RNA and messenger RNA. J. Mol. Biol. 204, 295-307.
166. Dean, D. & Nomura, M. (1980). Feedback regulation of ribosomal protein geneexpression in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3590-3594.
167. Lindahl, L., Archer, R. & Zengel, J. M. (1983). Transcription of the S10ribosomal protein operon is regulated by an attenuator in the leader. Cell 33, 241248.
168. Baughman, G. & Nomura, M. (1984). Translational regulation of the Lllribosomal protein operon of Escherichia coli: analysis of the mRNA target site using oligonucleotide-directed mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 53895393.
169. Skouv, J., Schnier, J., Rasmussen, M. D., Subramanian, A. R. & Pedersen, S.1990). Ribosomal protein SI of Escherichia coli is the effector for the regulation of its own synthesis. J. Biol. Chem. 265, 17044-17049.
170. Lesage, P., Truong, H. N., Graffe, M., Dondon, J. & Springer, M. (1990).
171. Translated translational operator in Escherichia coli. Auto-regulation in the infC-rpml-rplToperon. J. Mol. Biol. 213, 465-475.
172. Johnsen, M., Christensen, Т., Dennis, P. P. & Fiil, N. P. (1982). Autogenouscontrol: ribosomal protein L10-L12 complex binds to the leader sequence of its mRNA. EMBO J. 1, 999-1004.
173. Wirth, R. & Bock, A. (1980). Regulation of synthesis of ribosomal protein S20 invitro. Mol. Gen. Genet. 178, 479-481.
174. Portier, C., Dondon, L. & Grunberg-Manago, M. (1990). Translational autocontrol of the Escherichia coli ribosomal protein SI 5. J. Mol. Biol. 211, 407414.
175. Yates, J. L. & Nomura, M. (1980). E. coli ribosomal protein L4 is a feedbackregulatory protein. Cell 21, 517-522.
176. Takebe, Y., Miura, A., Bedwell, D. M., Tarn, M. & Nomura, M. (1985).1.creased expression of ribosomal genes during inhibition of ribosome assembly in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 184, 23-30.
177. Torres, M., Condon, C., Balada, J. M., Squires, C. & Squires, C. L. (2001).
178. Ribosomal protein S4 is a transcription factor with properties remarkably similar to NusA, a protein involved in both non-ribosomal and ribosomal RNA antitermination. Embo J. 20, 3811-3820.
179. Woodgate, R., Rajagopalan, M., Lu, C. & Echols, H. (1989). UmuC mutagenesisprotein of Escherichia coli: purification and interaction with UmuD and UmuD'. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7301-7305.
180. Yancey, J. E. & Matson, S. W. (1991). The DNA unwinding reaction catalyzed by
181. Rep protein is facilitated by an RHSP-DNA interaction. Nucleic Acids Res. 19, 3943-3951.
182. Kamen, R., Kondo, M., Romer, W. & Weissmann, C. (1972). Reconstitution of Qreplicase lacking subunit with protein-synthesis-interference factor I. Eur. J. Biochem. 31, 44-51.
183. Blumenthal, T. & Hill, D. (1980). Roles of the host polypeptides in Q(3 RNAreplication. Host factor and ribosomal protein SI allow initiation at reduced GTP concentration./. Biol. Chem. 255, 11713-11716.
184. Friedman, D. I., Schauer, А. Т., Baumann, M. R., Baron, L. S. & Adhya, S. L.1981). Evidence that ribosomal protein S10 participates in control of transcription termination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1115-1118.
185. Coetzee, Т., Herschlag, D. & Belfort, M. (1994). Escherichia coli proteins,including ribosomal protein S12, facilitate in vitro splicing of phage T4 introns by acting as RNA chaperones. Genes Dev. 8, 1575-1588.
186. Semrad, K., Green, R. & Schroeder, R. (2004). RNA chaperone activity of largeribosomal subunit proteins from Escherichia coli. RNA 10, 1855-1860.
187. Bachmann, B. J. (1972). Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K
188. Bacteriol. Rev. 36, 525-557.
189. Yu, D., Ellis, H. M., Lee, E. C., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. & Court, D. L.2000). An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5978-5983.
190. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. & Dubendorff, J. W. (1990). Useof T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89.
191. Kolb, V. A., Makeyev, E. V. & Spirin, A. S. (2000). Co-translational folding of aneukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem. 275, 16597-16601.
192. Agafonov, D. E., Kolb, V. A. & Spirin, A. S. (2001). Ribosome-associated proteinthat inhibits translation at the aminoacyl-tRNA binding stage. EMBO Rep. 2, 399402.
193. Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of
194. Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.
195. Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure forscreening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523.
196. Мещеряков, В. А., Грязнова, О. И., Давыдова, Н. JL, Мудрик, Е. С.,
197. Передерина, А. А., Василенко, К. С., Гонгадзе, Г. М. & Гарбер, М. Б. (1997). РНК-связывающие свойства необычного рибосомного белка TL5 из Thermus thermophilus. Биохимия 62, 629-634.
198. Thomason, L. С., Bubunenko, М., Costantino, N., Wilson, H., Oppenheim, A.,
199. Datta, S. & Court, D. L. (2005). Recombineering: genetic engineering in bacteria using homologous recombination. In Current Protocols in Molecular Biology, pp. 1.16.11-11.16.21. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.
200. Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J. P. & Stewart, A. F. (1998). A new logic for
201. DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123128.
202. Knowlton, J. R., Bubunenko, M., Andrykovitch, M., Guo, W., Routzahn, К. M.,
203. Waugh, D. S., Court, D. L. & Ji, X. (2003). A spring-loaded state of NusG in its functional cycle is suggested by X-ray crystallography and supported by site-directed mutants. Biochemistry 42, 2275-2281.
204. Lupski, J. R., Roth, J. R. & Weinstock, G. M. (1996). Chromosomal duplicationsin bacteria, fruit flies, and humans. Am. J. Hum. Genet. 58, 21-27.
205. Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor1.boratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
206. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
207. Hardy, S. J., Kurland, C. G., Voynow, P. & Mora, G. (1969). The ribosomalproteins of Escherichia coli. I. Purification of the 30S ribosomal proteins. Biochemistry 8, 2897-2905.
208. Madjar, J. J., Michel, S., Cozzone, A. J. & Reboud, J. P. (1979). A method toidentify individual proteins in four different two-dimensional gel electrophoresis systems: application to Escherichia coli ribosomal proteins. Anal. Biochem. 92, 174-182.
209. Staehelin, Т., Maglott, D. M. & Monro, R. E. (1969). On the catalytic center ofpeptidyl transfer: a part of the 50 S ribosome structure. Cold Spring Harb. Syrnp. Quant. Biol. 34, 39-48.
210. Гаврилова, JI. П. & Смолянинов, В. В. (1971). Изучение механизма транслокации в рибосомах. 1. Синтез полифенилаланина в рибосомах Escherichia coli без участия гуанозин-5'-трифосфата и белковых факторов трансляции. Молекулярная биология 5, 883-891.
211. Богатырева, С. А., Трифонов, А. С. & Спирин, А. С. (1970). Зависимостьбесклеточной системы синтеза полифенилаланина от соотношений двувалентных и одновалентных катионов. Докл. АН СССР 195, 213-216.
212. Crameri, A., Whitehorn, Е. A., Tate, Е. & Stemmer, W. Р. (1996). Improvedgreen fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat. Biotechnol. 14, 315-319.
213. Gurevich, V. V., Pokrovskaya, I. D., Obukhova, T. A. & Zozulya, S. A. (1991).
214. Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. Anal. Biochem. 195, 207-213.
215. Nierhaus, К. H. & Dohme, F. (1979). Total reconstitution of 50 S subunits from
216. Escherichia coli ribosomes. Methods Enzymol. 59,443-449.
217. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: Alaboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
218. Serganov, A. A., Masquida, В., Westhof, E., Cachia, C., Portier, C., Garber, M.,
219. Ehresmann, B. & Ehresmann, C. (1996). The 16S rRNA binding site of Thermus thermophilus ribosomal protein S15: comparison with Escherichia coli S15, minimum site and structure. RNA 2, 1124-1138.
220. Barciszewska, M. Z., Erdmann, V. A. & Barciszewski, J. (1996). Ribosomal 5S
221. RNA: tertiary structure and interactions with proteins. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 71, 1-25.
222. Home, J. R. & Erdmann, V. A. (1972). Isolation and characterization of 5S RNAprotein complexes from Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli ribosomes. Mol. Gen. Genet. 119, 337-344.
223. Chen-Schmeisser, U. & Garrett, R. A. (1977). A new method for the isolation of a
224. S RNA complex with proteins L5, LI8 and L25 from Escherichia coli ribosomes. FEBS Letters 74, 287-291.
225. McDougall, J. & Wittmann-Liebold, B. (1994). Comparative analysis of theprotein components from 5S rRNA.protein complexes of halophilic archaebacteria. Eur. J. Biochem. 221, 779-785.
226. Tang, B. Z. & Nazar, R. N. (1991). Structure of the yeast ribosomal 5 S RNAbinding protein YL3. J. Biol. Chem. 266, 6120-6123.
227. Jahn, O., Hartmann, R. K., Boeckh, T. & Erdmann, V. A. (1991). Comparativeanalysis of ribosomal protein L5 sequences from bacteria of the genus Thermus. Biochimie 73, 669-678.
228. Dohme, F. & Nierhaus, К. H. (1976). Role of 5S RNA in assembly and function ofthe 50S subunit from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2221-2225.
229. Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Dokudovskaya, S. S. & Lavrik, I. N. (1995).
230. Structure and function of 5S rRNA in the ribosome. Biochem. Cell. Biol. 13, 869876.
231. Szymanski, M., Barciszewska, M. Z., Erdmann, V. A. & Barciszewski, J.2003). 5 S rRNA: structure and interactions. Biochem. J. 371, 641-651.
232. Туманова, JI. Г. (1982). Физико-химические исследования белков из 50Sсубчастицы рибосом Escherichia coli. Материалы диссертации, Институт белка РАН, г. Пущино.
233. Volker, U., Engelmann, S., Maul, В., Riethdorf, S., Volker, A., Schmid, R.,
234. Mach, H. & Hecker, M. (1994). Analysis of the induction of general stress proteins of Bacillus subtilis. Microbiology 140 (Pt 4), 741-752.
235. Hirokawa, G., Inokuchi, H., Kaji, H., Igarashi, K. & Kaji, A. (2004). In vivoeffect of inactivation of ribosome recycling factor fate of ribosomes after unscheduled translation downstream of open reading frame. Mol. Microbiol. 54, 1011-1021.
236. Gao, N., Zavialov, A. V., Li, W., Sengupta, J., Valle, M., Gursky, R. P.,
237. Ehrenberg, M. & Frank, J. (2005). Mechanism for the disassembly of the posttermination complex inferred from cryo-EM studies. Mol. Cell. 18, 663-674.
238. Lancaster, L., Kiel, M. C., Kaji, A. & Noller, H. F. (2002). Orientation ofribosome recycling factor in the ribosome from directed hydroxyl radical probing. Cell 111, 129-140.
239. Kaji, A., Teyssier, E. & Hirokawa, G. (1998). Disassembly of the post-terminationcomplex and reduction of translational error by ribosome recycling factor (RRF)-A possible new target for antibacterial agents. Biochem. Biophys. Res. Communis, 1-4.
240. Lu, M. & Steitz, T. A. (2000). Structure of Escherichia coli ribosomal protein L25complexed with a 5S rRNA fragment at 1.8-Л resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2023-2028.
241. Fedorov, R., Meshcheryakov, V., Gongadze, G., Fomenkova, N., Nevskaya, N.,
242. Douthwaite, S., Garrett, R. A., Wagner, R. & Feunteun, J. (1979). Aribonuclease-resistant region of 5S RNA and its relation to the RNA binding sites of proteins L18 and L25. Nucl. Acids Res. 6, 2453-2470.
243. Gongadze, G. M., Tishchenko, S. V., Sedelnikova, S. E. & Garber, M. B. (1993).
244. Ribosomal proteins, TL4 and TL5, from Thermus thermophilus form hybrid complexes with 5 S ribosomal RNA from different microorganisms. FEBS Letters 330, 46-48.
245. Gongadze, G. M., Meshcheryakov, V. A., Serganov, A. A., Fomenkova, N. P.,
246. Gryaznova, О. I., Davydova, N. L., Gongadze, G. M., Jonsson, В. H., Garber,
247. M. B. & Liljas, A. (1996). A ribosomal protein from Thermus thermophilus is homologous to a general shock protein. Biochimie 78, 915-919.
248. Schmalisch, M., Langbein, I. & Stulke, J. (2002). The general stress protein Ctc of
249. Bacillus subtilis is a ribosomal protein. J. Mol. Microbiol. Biotechnol 4, 495-501.
250. Douthwaite, S. & Garrett, R. A. (1981). Secondary structure of prokaryotic 5Sribosomal ribonucleic acids: a study with ribonucleases. Biochemistry 20, 73017307.
-
Корепанов, Алексей Петрович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.03
- Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы
- Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы
- Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства
- Изучение роли шаперонов DnaK и DnaJ в формировании активных белков IN VIVO и IN VITRO
- Эволюция копийности белка L12 в рибосомах бактерий и органелл эукариот
