Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства"

На правах рукописи

САРСКИХ АЛЕНА ВИТАЛЬЕВНА

Структура полноразмерного Ы-выступа бактериальной рибосомы. Влияние

изменений поверхности контакта рибосомпого белка 1Л ТИегтиъ (ИегторУгПиъ с РНК на его РНК-связывающие свойства

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат дпссертацнн на соискание ученой стененн кандидата биологических наук

Iг Г'П 2014

Пущино-2014

005549132

005549132

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка Российской академии наук (ИБ РАН), лаборатории структурных исследований аппарата трансляции

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН), заведующая лабораторией структурных исследований аппарата трансляции

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,

Российской академии наук (ИБХ РАН),

заведующий лабораторией инженерии белка

кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН), заведующий лабораторией молекулярной микробиологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), лаборатория химических основ биокатализа

Защита диссертации состоится «19» июня 2014 года в 14 ч. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН. г. Пущино Московская область, ул. Институтская 3.

Автореферат разослан « » апреля 2014 года Ученый секретарь Диссертационного совета

/;

1 / ш /V / кандидат биологических наук ' у / ' \s\s v Смолихина Татьяна Ивановна

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ы -выступ (Ы-протуберанец) большой субчастицы рибосомы, содержащий белок 1Л и спирали Н76, Н77 и Н78 23Э рРНК, является одним из наиболее подвижных элементов рибосомы, он способствует высвобождению деацилированной тРНК из Е-сайта в процессе трансляции. В течение долгого времени именно подвижность Ы-выступа затрудняла определение его детальной трехмерной структуры в составе интактной рибосомы. Рибосомный белок 1Л также интересен тем, что выполняет в клетке и внерибосомную функцию - является регулятором экспрессии генов своего оперона.

В лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН были определены кристаллические структуры рибосомного белка 1.1 из бактерий и архей, их комплексов с матричной РНК, а также структура гибридного комплекса архейного рибосомного белка Ы из 5и1/о1оЬт асМосаМапиз (БасЫ) с фрагментом 238 рРНК ТИегтш гИегторИНш, содержащим спирали Н76 и Н77. Данная структура комплекса 1Л с укороченным фрагментом рРНК более 10 лет использовалась при построении моделей как бактериальной, так и архейной рибосом. Однако отсутствие структурных данных для полноразмерного Ы-выступа не давало возможности проанализировать РНК-белковые взаимодействия, приводящие к удалению деацилированной тРНК из Е-сайта рибосомы.

В данной работе впервые с высоким разрешением (2,0 А) определена структура полноразмерного бактериального Ы-выступа Т. ЛегторИИиз, проведён детальный сравнительный структурно-кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий белка-регулятора Ы в рибосомном комплексе и в его комплексе с матричной РНК. В рамках диссертационной работы исследовано влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка Ы Т лЬегторЬИш с РНК на его РНК-связывающие свойства

Цель работы

Целью данной работы является определение структуры полноразмерного изолированного Ы-выступа бактериальной рибосомы Т. ЖегторИНия с атомным разрешением, углубленное исследование РНК-белковых взаимодействий и изучение роли отдельных структурных элементов рибосомного белка Ы во взаимодействии с РНК, определение структурной основы регуляторных свойств рибосомного белка 1Л. Основные экспериментальные задачи:

Получение 80-нуклеотидного специфического фрагмента 23Б рРНК Ткегтиь ЛегторИИш, содержащего спирали Н76, Н77 и Н78, для структурных и кинетических исследований.

Получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов рибосомного белка Ы Т. ЛегторИНиз (ТЧЬЫ) и его мутантных форм в комплексе с данным специфическим фрагментом рРНК.

^ Кинетический анализ взаимодействия "ПИЫ и его мутантных форм со специфическим фрагментом рРНК Т. IИегторИИиз.

Исследование влияния электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка Ы с РНК.

Научная новизна и научно-практическая значимость

В рамках данной работы были получены кристаллы и определена с высоким разрешением (2,0 А) структура полноразмерного изолированного И-выступа из термофильной бактерии Т. ЛегторЫ1иБ.

Показано наличие в рибосомном комплексе, по сравнению с комплексом Т[ЬЬ1-мРНК, двух дополнительных участков РНК-белкового взаимодействия. Один участок образован аминокислотными остатками спирали а1 домена I "ПЫЛ, а второй — петлями а5-рб домена II белка.

Структурные элементы, образующие дополнительные участки Ы -связывания на рРНК (спираль Н78 и петля В), отсутствуют в структуре мРНК, что обусловливает меньшее сродство рибосомного белка 1Л к мРНК и, соответственно, регуляторные свойства белка.

Для детального исследования РНК-белковых взаимодействий в Ы-РНК комплексе были получены кристаллы и определены структуры нескольких мутантных форм белка НЫЛ как в изолированном состоянии, так и в комплексе с тем же самым фрагментом 235 рРНК Т. ЛегторкИш, что использовался при кристаллизации комплекса с белком дикого типа.

Показано, что, несмотря на изменения в структуре белков ТЧЫЛ с мутациями в участке связывания с РНК, комплементарность поверхностей РНК и белка, а также их взаимное расположение в комплексе полностью сохраняется.

Полученные в данной работе результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структурной организации рибосомы и дают возможность выявить детали и принципы специфического РНК-белкового взаимодействия.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах, в том числе в 3 статьях.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 33 рисунка и 16 таблиц. Общий объем диссертации 117 страниц. Библиография включает 133 названия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В большинстве моделей 50S рибосомных субчастиц и целых рибосом для построения Ll-выступа использовалась структура комплекса белка SacLl и минимального специфического фрагмента 23S рРНК Т. thermophilus длиной 55 нуклеотидов (Рис. 1Б), которая была определена в нашем институте (Nikulin et ai, 2003). В этом фрагменте 23S рРНК практически полностью отсутствовала спираль Н78, исследование взаимодействий которой с белком L1 и, возможно, с тРНК было необходимо для понимания функционирования рибосомы.

Рис. 1. Специфические фрагменты 235 рРНК Т. (ИегторИИт, которые

использовались при

кристаллизации комплексов с рибосомным белком Ы. А. 80-нуклеотидный фрагмент,

содержащий полную спираль Н78. Б. Минимальный фрагмент рРНК, необходимый для связывания белком Ы. Нуклеотиды, образующие с белком Ы консервативные контакты, выделены рамочкой.

Н76 ' G-

Фрагмент 23S рРНК Т. thermophilus, использованный в данной работе для получения комплекса TthLl-pPHK, показан на рисунке 1А. Он содержит спирали рРНК, участвующие в формировании Ll-выступа. Нам удалось получить кристаллы комплекса этого фрагмента рРНК с белком TthLl, которые отражали рентгеновские лучи с высоким разрешением, детально исследовать структуру комплекса, а также выявить роль спирали Н78 в увеличении сродства фрагмента рРНК к рибосомному белку L1 и в функционировании Ll-выступа.

Получение и кристаллизация комплекса TthLl-pPHK

Ююнирование гена 80-нуклеотидного специфического фрагмента 23SрРНК

Фрагмент гена 23S рРНК Т. thermophilus был клонирован в вектор pUCI8, а затем наработан в препаративных количествах методом транскрипции in vitro. Транскрипцию проводили с использованием Т7 РНК-полимеразы с линеаризованного вектора, содержащего вставку гена фрагмента рРНК. Затем фрагмент РНК очищали от побочных продуктов реакции транскрипции, а также от компонентов транскрипционной смеси методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующей хроматографией на ДЕАЕ-sepharose.

Выделение и очисткарибосомного белка TthLl

Ген рибосомного белка TthLl экспрессировали в системе Штудиера (Studier et а/., 1990). Выделение белка LI и его мутантных форм из биомассы штамма-суперпродуцента проводили согласно методике, представленной на рисунке (Рис. 2А). В том случае, если после хроматографии на смоле CM-sepharose препарат белка Е. coli содержал примесь нуклеиновых кислот, мы освобождались от них, используя хроматографию на смоле Heparin-sepharose. Использование такой методики позволяет получить препарат белка с чистотой, пригодной для кристаллизации (Рис. 2Б).

б;

кДа

Рис. 2. А. Схема выделения белка Т1ЬЬ1. Б. Электрофоретический анализ чистоты препарата белка ТШЫ на различных этапах очистки (12% ПААГ в присутствии ДСН). М. Маркеры молекулярного веса. 1. Разрушенная биомасса. 2. Дебрис. 3. Супернатант. 4. Супернатант после прогрева при 70°С в течение 20 минут. 5. Осадок после прогрева при 70°С. 6. Препарат белка после хроматографии на СМ^ерЬагозе.

Конформационную гомогенность препарата белка тестировали методом электрофореза в неденатурирующих условиях.

Электрофоретический анализ комплекса Т1ЬЫ с фрагментом рРНК

Для исследования методом электрофореза в неденатурирующих условиях («гель-шифта») взаимодействия ТгЬЬ 1 со специфическим фрагментом рРНК препараты белка и РНК смешивали в эквимолярном соотношении. Показано, что фрагмент рРНК длиной 80 нуклеотидов образует прочный комплекс с белком ТйЫ (Рис. 3).

Рис. 3. Электрофоретический анализ комплекса TthLl с фрагментом рРНК. 1. 80-нуклеотидный фрагмент рРНК. 2. Комплекс TthLl-pPHK

(1:1).

Кристаллизация полноразмерного Ы -выступа

Эксперименты по кристаллизации проводили при комнатной температуре методом диффузии паров в висящей капле (все кристаллы, использованные в дальнейшей работе, были получены с использованием этого метода).

Кристаллы (Рис. 4) появлялись на 3-4 сутки и вырастали до максимального размера 0,1x0,2x0,6 мм за 1-2 недели. Структура изолированного Ы-выступа рибосомы была определена с разрешением 2,0 А методом молекулярного замещения. Определение структуры полноразмерного изолированного Ы-выступа, мутантных форм рибосомного белка Ы, а также их комплексов со специфическим фрагментом рРНК было выполнено А. Габдулхаковым (группа структурных исследований рибосомных белков Института белка).

Рис. 4. Кристалл изолированного полноразмерного Ы-выступа рибосомы.

Анализ структуры комплекса ТЧЫЛ-рРНК

Описание структуры комплекса

Структура комплекса ТЛЫ-рРНК представлена на рисунке 5А. В данной структуре, так же как в структуре комплекса БасЫ с 55-нуклеотидным фрагментом рРНК (№киНп ег а/., 2003), рибосомный белок ТЧЫЛ находится в открытой конформации (Рис. 5Б) и связывается с малым желобком рРНК. Сравнение структуры комплекса ТЧЫЛ-рРНК со структурой комплекса Т^Ы-мРНК (^зИсЬепко е/ а1., 2006) показало, что структура доменов консервативна, тогда как во взаимном положении доменов имеется незначительный (около 10°) поворот.

Фрагмент 235 рРНК, который мы использовали для кристаллизации полноразмерного Ы выступа рибосомы, включает в себя полные спирали Н77 и Н78, а также укороченный вариант спирали Н76, петли А и В на концах спирали Н77 и петлю С, замыкающую спираль Н78 (Рис. 5В, Г).

Трехмерная структура спирали Н78 состоит из двух перпендикулярных частей, объединенных изгибом в области фосфатной группы нуклеотида Ш132, чье основание в значительной степени открыто. Этот изгиб стабилизируют стэкинг взаимодействия и сеть водородных связей. Короткая часть Н78 состоит из трех канонических пар оснований (02127-С2161, С2128-02160, С2129-02159) и завершается нуклеотидом Ш130 (Рис 1А, 5В). Длинная часть спирали Н78 начинается с трех неканонических пар, где основания 02133 и А2158 образуют взаимный стэкинг в спирали.

Рис. 5. Структура комплекса TthLl-pPHK. А. Общий вид. Белок покатан пурпурным (домен I) и голубым (домен II) цветами, фосфатный остов рРНК показан золотистым цветом. Б. Структура белка TthLI. a-спирали (красные) и р-тяжи (синие) пронумерованы. В. Диаграмма стэкинг-взаимодействий во фрагменте рРНК. Г. Структура специфического фрагмента 23S рРНК. Элементы вторичной структуры обозначены в соответствии с Рис. 5В.

Взаимное расположение петель А и В. а также петли С. замыкающей спираль Н78. стабилизировано большим количеством контактов. Петля С находится вблизи средней части спиралей Н76-Н77. Фосфатные группы U2109 и G2110 проникают в малый желобок спирали Н78 и формируют прямые, а также опосредованные (через молекулу воды) водородные связи с основаниями и остатками рибозы в спирали Н78.

В целом, этот фрагмент 23S рРНК представляет собой очень компактную структуру близкую по форме к сфере. Наложение модели данной структуры на модель структуры L1-выступа 70S рибосомы низкого разрешения (3,6 Á) (Gao et al., 2009) показало, что среднее квадратичное отклонение составляет 1.02 Á для всех атомов фосфора рРНК. и 0.92 Á для всех Са атомов молекулы белка. Из этого следует, что структура комплекса белка TtliLl с фрагментом 23S рРНК может быть использована для детального анализа РНК-белковых взаимодействий в L1-выступе рибосомы.

A21S8

У'; ■"1

: .-•'•. ■ ]

- - . I

■::■.••-• I

[G21S4| i G2153|

С217-»!

[^Щ D _/

jc^écl ■ [Ш77|]—|A?iTy I

luaieT | — | | • [с,2-1г>|

163 l»jA2119 I - | А2114 I f |*2'го | | иг i: .i | 4 I-V2-.5" I | G211

■ ■ '"I

| U21221 [ G2121 j ...' . ~)

| G21 iO 1 [ U2109 | AÍÍ08 | 1 GíHrf] | G210C |

1A21/6| . 1 C2178| | C2179]

•- -;-■. i

- - : "|

U2150|

G?14l|

.'■ -Л

G2M8|

U2'Bl\

i?10b\

■ • -I

Взаимодействия белка Ни рРНК в полноразмерном Н выступе рибосомы

В формировании комплекса ТЛИ-РНК принимает участие 1450 А2 поверхности белка и 1483 А2 поверхности РНК. Со стороны белка поверхность контакта сформирована спиралью а1, петлей а2-р1, стрендом р1 и петлями (57-Р8 и р9-рЮ (Рис. 5Б). Со стороны рРНК в контакте участвует практически вся спираль Н77, нуклеотиды 2169-2173 петли В

Домен II ТЛЫ контактирует с петлей В рРНК, причем площадь контакта этого домена в ТМтЫ-рРНК комплексе значительно меньше, чем в васЫ-рРНК комплексе. Спираль Н78 23Б рРНК взаимодействует с Ы-концевой частью спирали а 1 белка ТЧЫЛ, формируя несколько межмолекулярных водородных связей, большинство которых доступно для растворителя. Тем не менее отсутствие этой спирали оказывает значительное влияние на сродство белка и рРНК (№копоу е1 а!., 1996).

Основная и наиболее консервативная часть РНК-белкового интерфейса сформирована р-листом ТШЫ с принадлежащими ему петлями и спиралью Н77 23в рРНК. В этой части интерфейса комплекс стабилизирован восемью недоступными для растворителя межмолекулярными водородными связями, три из которых образованы основаниями нуклеотидов (Табл. 1) и, по-видимому, зависят от последовательности нуклеотидов рРНК. Все эти связи присутствуют в ЭасЫ-рРНК комплексе (№киПп е1 а1.,

и нуклеотиды 2127-2132 спирали Н78 (Рис. 6).

2003).

с с

U G С —G C-G

2140 G •

С — G 2150

Н78

С — G С — G С —G С —G

А

А

G

G

G САи

i А

? К Г' —:. '3 —К

Г и • и ! А-и Н76 С- с i G -С

G

НИ- R с

шшштш ö s

Ц , , и G

fr 1 "1 SL~ 11

0Ч............f..............

"iiso Н77

LG-C

Рис. 6. Вторичная структура фрагмента 23S рРНК Т. thermophilus. Нуклеотидная последовательность пронумерована в соответствии с нумерацией 23S рРНК Е. coli. Нуклеотиды, взаимодействующие с белком TthLl, помещены в рамку.

Табл. 1. Консервативные ТЛЫ-рРНК водородные связи (жирным шрифтом показаны связи, образованные основаниями нуклеотидов).

L1-PHK водородная связь Длина связи (А)

Glu42 OE1-N2 G2123 3,09

Glu42 0Е2-02' G2124 2,68

Aspl66 OD2-N2 G2121 2,92

Thr217 0G1-02' G2124 2,77

Thr217 0-N2 G2124 3,13

Thr217 0-02' C2175 3,28

Met218 SD-02' C2174 3,21

Gly219 0-02' C2175 2,64

Анализ таблицы 1 показывает, что более половины консервативных водородных связей образовано строго консервативной триадой ТЬг217-МеС 18-01у219 с преобладающим вкладом ТЬг217. Данные результаты были использованы нами в дальнейшем при исследовании вклада этого аминокислотного остатка в РНК-белковое узнавание и стабильность комплекса.

Вероятная роль спирали Н78 23ЯрРНК и домена IIрибосомного белка Ы в функционировании рибосомы

Наложение структуры определённого нами комплекса на структуру Ы-выступа рибосомы в закрытом положении показывает, что «локтевой» изгиб тРНК проникает в междоменную полость белка Ь1 и взаимодействует с петлёй домена II "ПЫЛ а5-рб, в которой находится Рго133, и спиралью Н76 рРНК. Эти контакты найдены и в полузакрытом состоянии Ы-выступа. Таким образом, домен II существенен для удаления тРНК из рибосомы. Моделирование открытой конформации Ы -выступа с использованием структуры рибосомы без тРНК в Е-сайте, структуры комплекса, определённой нами, и структуры рибосомного белка Ь9 показало, что малый желобок спирали Н78 расположен вблизи С-концевого домена белка 1.9 и может с ним взаимодействовать. Возможно, взаимодействие спирали Н78 и белка Ь9 также способствует удалению тРНК из рибосомы.

Влияние неконсервативных взаимодействий на сродство белка LI к РНК

Структура РНК-белкового интерфейса, формируемого ß-листом белка TthLl, идентична как в комплексах этого белка с рРНК (Nikulin et al., 2003; Tishchenko et а!., 2012), так и в комплексах с мРНК (Nevskaya et а!., 2005; Tishchenko et al., 2006). Однако на белок TthLl имеет разное сродство к фрагментам рРНК и мРНК.

Для количественного исследования этих взаимодействий мы применили метод поверхностного резонанса плазмонов (ППР) с использованием системы ProteOn XPR36 (Bio-Rad, USA). Данный метод позволяет наблюдать кинетику взаимодействия молекул в реальном времени. Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

Табл. 2. Кинетические константы взаимодействия белка TthLl со специфическими фрагментами мРНК и рРНК

РНК Константа Константа Равновесная

скорости скорости константа

ассоциации ка диссоциации диссоциации KD

(1 х 104 1/Ms) kd(lxl0"4 1/s) (нМ)

80 нт 23 S рРНК 56,400 0,012 0,002

55 HT23S рРНК 20,300 0,180 0,090

мРНК 0,600 5,190 85,000

Анализ полученных результатов позволяет оценить роль спирали Н78 в связывании белка ЛЫЛ и фрагмента рРНК. Отсутствие этой спирали уменьшает сродство белка к рРНК в 50 раз. Во фрагменте мРНК, который специфически связывается белком Ь1, отсутствуют элементы, соответствующие спирали Н78 и петле В рРНК, при этом сродство падает почти на 3 порядка по сравнению с комплексом Ll-pPHK длиной 55 нуклеотидов. (Табл. 2). Важно отметить, что петля В рРНК взаимодействует с доменом II и формирует вторую область контакта, которая отделена от основного места L1-PHK взаимодействия. Можно предположить, что наличие этой области связывания необходимо для правильной взаимной ориентации молекул и РНК-белкового узнавания.

Структурно-кинетические исследования влияния замен консервативного ТЬг217 в белке ТЧЫЛ на РНК-связывающие свойства белка и его структуру, как в свободном состоянии, так и в комплексе с рРНК

Возвращаясь к данным таблицы 1, мы видим, что строго консервативная триада ТЬг217-Ме1218-С1у219, являющаяся частью петли Р9-РЮ домена I белка Ы, имеет большое значение для формирования L1-PHK комплексов. Анализ структуры комплекса показывает, что, несмотря на небольшую площадь контакта (не более 11% от общей площади интерфейса) на долю этих трёх аминокислотных остатков приходится около 20% контактов с РНК и более 30% всех недоступных растворителю межмолекулярных водородных связей.

Треонин в положении 217 формирует около 40% всех контактов с РНК, образуемых триадой. Для того чтобы исследовать роль этого важного аминокислотного остатка во

взаимодействии с рРНК мы провели структурно-кинетический анализ комплексов мутантных форм ТЛЫ ТЬг217\'а1 и ТЛ1Л ТЬг217А1а с РНК.

Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм белка ТЛЫ со специфическим фрагментом рРНК

Как было показано ранее, со специфическим фрагментом мРНК взаимодействие ТШЫ ТЬг217Уа1 не детектировалось, а НМЛ Т11г217А1а образовывал очень нестабильный комплекс с К0 = 14 мкМ. Однако полученные нами в ходе кинетических экспериментов результаты показали, что сродство данных мутантных форм белка к полноразмерному фрагменту 238 рРНК, хотя и значительно уменьшается, тем не менее, остаётся достаточно высоким (Табл. 3).

Табл. 3. Кинетические константы взаимодействия белка ТШЫ и его мутантных форм со специфическим фрагментом рРНК.

Белок Константа Константа Равновесная

ТШЫ скорости скорости константа

ассоциации ка диссоциации ка диссоциации

(1х104 1/Мб) {1х104 1/5) Кп(нМ)

Дикий тип 56,400 0,012 0,002

ТЬг217А1а 26,400 0,380 0,144

ТЬг217Уа1 28,200 2,800 0,994

Константа скорости ассоциации комплексов, образованных мутантными белками, меняется незначительно, тогда как их стабильность уменьшается более чем на порядок по сравнению с комплексом белка дикого типа. В результате равновесная константа диссоциации комплексов увеличивается в 70 и 500 раз для ТЬг217А1а и ТЬг217Уа], соответственно.

Поскольку данные мутантные формы Т1Ь1Л образовывали достаточно стабильные комплексы с 80-нуклеотидным фрагментом рРНК, мы начали эксперименты по их кристаллизации.

Кристаллизация белка ТгкЫ с заменой ТИг217Уа1 и его комплекса с рРНК

Кристаллы мутантной формы белка Ы с заменой ТЬг217Уа! в свободном состоянии, а также в комплексе с 80-нуклеотидным фрагментом рРНК были получены при комнатной температуре (Рис. 7). Кристаллы изолированного белка появлялись через два дня и вырастали до максимальных размеров 0,2x0,2x0,4 мм в течение недели. Кристаллы комплекса появлялись на 3-5 сутки и достигали максимального размера 0,05x0,15x0,3 мм в течение одной недели.

Структуры ПЫЛ ТЬг217Уа1 и "ПЫЛ ТЬг217Уа1-рРНК были определены с разрешением 1,35 А и 2,1 А соответственно.

Рис. 7. А. Кристаллы ТШЫ с заменой Т11г217Уа1. Б. Кристаллы комплекса "ПЫЛ ТЬг217Уа| с 80-нуклеотидным фрагментом рРНК.

Анализ структур ПНИ ГИг217Уа/ и ШИ ТИг217Га1-рРНК

Анализ структуры изолированного белка показал, что замена ТЬг217Уа1 деформирует участок поверхности, который контактирует с рРНК. Замена гидроксильной группы треонина на метальную группу валина приводит к потере водородной связи, образованной атомом 001 Т11Г217 и атомом N главной цепи остатка Т1тг40. В результате петля р9-(310 сдвигается относительно своего положения в белке дикого типа, формируя выступ на поверхности высотой порядка 1,0 А. Такие же изменения были найдены при замене Т11г217Уа1 в изолированном домене I этого белка (Коэ1аге\'а е! а/., 2010).

Тем не менее, структурные изменения, обнаруженные в свободном ТЙ1Ь1 Т11г217Уа1, отсутствуют в белке, связанном с рРНК. Петли а2-|31 и (39-Р10 занимают точно такое же положение, что и в РНК-белковом комплексе, образованном ТШЫ дикого типа.

Выступ на поверхности мутантного белка, обнаруженный в его свободном состоянии, в комплексе с РНК отсутствует. В результате, в комплексе ТЛЫ Т11г217Уа1-рРНК имеет место потеря одной водородной связи (ТЬг217 001-02' 02124) и незначительный сдвиг атомов белка и рРНК (менее 0,3 А) в месте мутации вследствие замены гироксильной группы треонина на метальную группу валина. Возникшие напряжения и потеря водородной связи приводят к значительному уменьшению стабильности комплекса.

Кристаллизация Т1ИЫ с заменой ТИг217А1а в комплексе с РНК

Нами также были получены кристаллы комплекса белка ТМЫ Т)1г217А1а со специфическим фрагментом рРНК, длиной 80 нуклеотидов (Рис. 8). Кристаллы появлялись на 3-4 сутки и достигали максимальных размеров 0,1x0,2x0,4 мм в течение 1-2 недель. Структура комплекса была определена с разрешением 1,9 А.

Рис. 8. Кристалл ТШЫ с заменой ТЬг217А1а в комплексе 80-нуклеотидным фрагментом рРНК.

Анализ структуры ТИг217А1а Т/ИЫ -рРНК

Анализ полученной структуры показал, что в мутантной форме ТЛЫ ТЬг217А1а контактирующая с РНК область в изолированном белке (Никонова и др., 2007) и в его РНК-связанной форме также значительно отличается.

В изолированной мутантной форме отсутствующие атомы боковой цепи треонина замещаются молекулами воды, что создает небольшой выступ на поверхности белка в зоне мутации.

В РНК-связанной форме в ТЧЫЛ ТЬг217А1а молекулы воды отсутствуют, и на месте атомов боковой цепи треонина появляется небольшое углубление на ровной поверхности белка, сформированной РЬе37, ТЬг40, С1и42 и Мй218. Как и в мутантной форме белка НЫЛ ТЬг217Уа1, упомянутой выше, РНК-связывающая область белка ТШЫ ТЬг217А1а имеет такую же конформацию, как комплексе РНК-ТЛЫ дикого типа.

В комплексе, образованном данной мутантной формой, также как и в комплексе ТЙ11Л ТЬг217Уа1-РНК, отсутствует одна консервативная закрытая от растворителя водородная связь, тем не менее, сродство ТШЫ ТЬг217А1а к рРНК почти на порядок выше, поскольку не наблюдается такого локального напряжения в структуре белка как в комплексе ТШ1Л ТЬг217Уа1 - РНК.

Роль ^концевой спирали о1 во взаимодействии белка "ПЫЛ с РНК и регуляции трансляции

Регуляция биосинтеза белков Ы оперона в бактериях происходит за счет конкуренции между мРНК и рРНК за место связывания на поверхности белка Ы. Области связывания на обеих РНК имеют общий структурно подобный консервативный участок, однако остальная часть интерфейса различна (Рис. 9). Такие различия наблюдаются, в частности, в области связывания спирали а1.

Ы-концевая спираль а1 является консервативным структурным элементом семейства бактериальных рибосомных белков Ы. Эта спираль очень подвижна и не видна в структуре изолированного белка ПИИ (№копоу е( а1, 1996).

Чтобы определить роль 1Ч-концевых аминокислотных остатков во взаимодействии с РНК, ранее Никоновой Е. были получены мутантная форма ТИчЫ, лишённая восьми К-концевых аминокислотных остатков (Т1ЬЫ_А8Ы) и аналогичная мутантная форма домена I ПЫЛ (И_ТЛП_Д8М).

Спираль а1 взаимодействует как с мРНК (№узкауа г/ а/., 2006), так и с 80-нуклеотидным фрагментом рРНК. Однако в последнем случае, во взаимодействиях задействованы дополнительные аминокислотные остатки этой спирали, контактирующие со спиралью Н78 238 рРНК (Рис 9).

Мы провели кинетические исследования взаимодействия мутантных форм ТЙ1Ы_Д8К и И_Т1ЫЛ_Д8Ы со специфическими фрагментами мРНК и 23Б рРНК, результаты экспериментов представлены в таблице 4.

МРНК

Рис. 9. Специфические фрагменты рРНК и мРНК. Нуклеотиды РНК, с которыми взаимодействуют аминокислотные остатки N-концевой спирали al TthLl, показаны красным и отмечены звездочкой, рамочкой выделены нуклеотиды, образующие структурно-консервативный мотив.

Кинетические эксперименты показали, что отсутствие спирали al уменьшает разницу в сродстве между рРНК и мРНК к белку TthLl примерно в 25 раз, что значительно ухудшает регуляторные свойства белка.

Табл. 4. Кинетические константы взаимодействия белка TthLl, его домена 1 и их мутантных форм мутантных форм (TthLl_A8N и ld_TthLl_A8N) со специфическими фрагментами мРНК и 23S рРНК.

Белок Константа скорости ассоциации ка(1х104 1/Ms) Константа скорости диссоциации kd (1 х 1 о"" 1/s) Равновесная константа диссоциации KD (нМ)

мРНК 23S рРНК мРНК 23S рРНК мРНК 23S рРНК

TthLl 5,900 56,400 1,000 0,012 1,800 0,002

TthLl_A8N 1,400 1,700 44,000 1,500 316,000 8,600

Id TthLl 18,000 163,000 15,000 0,079 8,400 0,005

ld_TthLl_A8N - 1,500 - 116,000 - 752,000

Если, наряду с частью Ы-концевой спирали отсутствует домен II Ь1. связывание с мРНК вообще теряется, а комплекс с рРНК становится очень нестабильным (Табл. 4). Так, скорость формирования комплекса уменьшается на 2 порядка, а время жизни — на 3 порядка.

Поскольку сродство мутантной формы ТЛЬ 1_Д81М к рРНК достаточно велико, мы провели опыты по кристаллизации ТЙ1Е1_Д8Ы в свободном виде и в комплексе специфическим фрагментом рРНК Т лИегторЫ1и$, длиной 80 нуклеотидов.

Были получены кристаллы белка и соответствующего комплекса с рРНК (Рис. 10), максимальный размер кристаллов составил 300x200x50 мкм для изолированного белка и

15

250x50x30 мкм для РНК-белкового комплекса. Были определены структуры ТЛИ_Д8Ы и комплекса ТЧЫЛ_Д8К с рРНК с разрешением 2,75 А и 2,7 А, соответственно. Показано, что никаких изменений в структуре мутантного белка и его комплекса с рРНК по сравнению со структурой белка дикого типа и его комплекса с рРНК не наблюдается.

Рис. 10. А. Кристаллы ИНЫ_А8Ы. Б. Кристаллы комплекса ТЙ1Ы_А8Ы с рРНК.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что наличие спирали а1 в белке "ПЫЛ увеличивает дискриминацию между мРНК и рРНК, обеспечивая надежную регуляцию трансляции белков Ы оперона.

Ы-концевая часть ЛЬЫ спирали а1 содержат значительный положительный заряд. Для выявления влияния положительно заряженных остатков на сродство белка и РНК мы воспользовались определенной ранее структурой рибосомного белка из Ы археи МеЛапососсиз ]аппа$сЫ1 (М]аЫ), так как в белках семейства 1Л Ы- и С-концы пространственно сближены.

Влияние С-концевых положительно заряженных аминокислотных остатков архейного белка 1Л на взаимодействие белка с РНК

В отличие от других бактериальных и архейных рибосомных белков Ы на С-конце аминокислотной последовательности белка из Ы археи МеМапососсю ]аппазсЫ1 (М]аЫ) имеется неконсервативный кластер, содержащий 6 аминокислотных остатков лизина. Ь/ЦаЫ имеет высокую скорость взаимодействия и образует очень стабильный комплекс с РНК. Данный С-концевой участок в свободном белке М]аЫ СЫеуэкауа е/ а/., 2000) и в комплексе 1УУа1Л-мРНК неупорядочен и не виден на карте электронной плотности (ЫеУБкауа е1 а/., 2006). Была создана мутантная форма белка М]аИ (М]а1Л_Д8С), лишённая восьми С-концевых аминокислотных остатков (ККЕКАККК), плазмида предоставлена Никоновой Е. Белок выделен и очищен по стандартной методике. Кинетические исследования взаимодействия М]аЫ_Д8С с мРНК показали, что отсутствие 6 аминокислотных остатков лизина не влияет на взаимодействие М]аЫ_Д8С с РНК. Стабильность комплексов М)аЫ_Д8С-мРНК не изменилась, а константа скорости ассоциации уменьшилась всего в 2 раза (Табл. 5).

Табл. 5. Кинетические данные взаимодействия MjaLl и его мутантной формы MjaLI-8C со специфическим фрагментом мРНК.

Белок Константа скорости ассоциации ка (1 х 104 I/Ms) Константа скорости диссоциации к,| (1 х 10"1 1/S) Равновесная константа диссоциации Kd(HM)

MjaLl 278,0 12,0 0,4

Mja L1 _Д8С 151.0 12,2 0,8

Были получены кристаллы и определена структура мутантного белка MjaLIASC с разрешением 1.75 А. Никаких изменений в структуре мутантной формы по сравнению со структурой белка дикого типа обнаружено не было.

Исходя из вышеуказанных данных, можно утверждать, что влияние спирали al TthLl на сродство белка к рРНК определяется дополнительными водородными связями со спиралью Н78 рРНК. а не положительным зарядом данной спирали белка.

Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК

Многие РНК-связывающие белки заряжены положительно, можно предположить, что важную роль в образовании и стабильности их комплексов с РНК играют электростатические взаимодействия между аминокислотными остатками лизина, гистидина и аргинина и сахарофосфатным остовом РНК. Для изучения вклада электростатических взаимодействий в стабильность и формирование комплекса TthLl-мРНК мы провели кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий, как в условиях с различными значениями рН (от 6.5 до 8.5). так и при увеличении ионной силы (от 150 мМ до 1 М NaCl).

Кинетические эксперименты показали, что при изменении концентрации NaCl от 150 мМ до I М константа скорости ассоциации уменьшается в 206 раз. а константа скорости диссоциации увеличивается всего в 5 раз.

Рибосомный белок TthLl. как и большинство других рибосомных белков, имеет изоэлектрическую точку в щелочной области рН (pl=9.4). Чем выше ионная сила раствора, тем больше ионное окружение молекул РНК и белка. Взаимодействие белка с молекулой РНК приводит к вытеснению этих ионов в окружающий раствор. Таким образом, увеличение концентрации соли должно препятствовать связыванию белка, значительно уменьшая скорость ассоциации молекул, как при специфическом, так и неспецифическом взаимодействии.

Для изучения влияния рН раствора на формирование и стабильность комплекса белка Ll-мРНК мы варьировали значения рН от 6.5 до 8.5. Показано, что изменение значения рН влияет в равной степени, как на константу ассоциации, так и на константу диссоциации. Данное влияние может быть связано с изменением заряда боковых групп аминокислотных остатков, расположенных на участке взаимодействия с РНК. В исследованном диапазоне рН от 6,5 до 8.5 могут изменять заряд только боковые группы аминокислотных остатков гистидина (Рис. 1 1).

-----я

—.....V Рис. 11. Кривые титрования

-0 Е аминокислотных остатков, находящихся

на поверхности контакта белка "ПЫЛ и мРНК. Отмечен диапазон рН, в котором были проведены кинетические исследования.

При сравнении изменения заряда гистидина и констант скорости ассоциации и диссоциации видно, что они изменяются синхронно. При рН 8,0 и 8,5 заряд гистидина практически не изменяется, так же как не меняются значения констант скоростей ассоциации и диссоциации комплекса белка Ы с мРНК (Рис. 12).

Рис. 12. Зависимость константы скорости ассоциации (А) и константы скорости диссоциации (Б) "ПЫЛ-мРНК комплекса от заряда боковых групп аминокислотных остатков гистидина.

Во взаимодействии с РНК участвуют Н1эЗ, №з44 и Н1э172. На основании полученных результатов можно заключить, что основной причиной изменения скорости образования и стабильности комплекса в данном диапазоне значений рН может являться изменение зарядов аминокислотных остатков ШбЗ, Н1з44 и Шз172.

Депротонирование боковых групп аминокислотных остатков гистидинов (при повышении значения рН), вероятно, приводит к изменениям в электростатических взаимодействиях между аминокислотными остатками гистидина и сахарофосфатным остовом мРНК, что увеличивает время ассоциации комплекса Ы и мРНК и уменьшает его стабильность.

ВЫВОДЫ:

1. Определена структура полноразмерного Ы-выступа бактериальной рибосомы с высоким разрешением и проведён детальный анализ взаимодействий рибосомного белка "ПЫЛ с 23Б рРНК. Показано, что наличие спирали Н78 в структуре рРНК увеличивает сродство РНК к белку. Кроме того, спираль Н78 вероятно участвует в удалении деацилированной тРНК с рибосомы.

2. Структурно-кинетический анализ РНК-белковых взаимодействий мутантных форм ПЫЛ с заменами треонина в консервативном участке связывания показал, что в структурах комплексов мутантных белков взаимное положение белка и рРНК остается неизменным, несмотря на изменения в структуре РНК-связывающей поверхности мутантных белков в свободном состоянии, а также уменьшение их сродства к РНК.

3. Наличие Ы-концевой спирали а1 в белке ПЫЛ примерно в 25 раз увеличивает дискриминацию между рРНК и мРНК за связывание с белком, повышая его регуляторные свойства.

4. Показано, что, в отличие от положительно заряженных ]Ч-концевых аминокислотных остатков ПЫЛ, образующих сеть водородных связей с РНК, С-концевые положительно заряженные аминокислотные остатки М]аЫ не влияют на его взаимодействие с РНК.

5. Неспецифические электростатические взаимодействия (ионное окружение) оказывают влияние лишь на скорость формирования комплекса ПЬЫ с РНК и практически не влияют на его стабильность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Nevskaya N., Sarskikh A.. Kostareva О., Nikonova Е., Sycheva A., Moshkovskii S., Garber M., Nikonov S. High-resolution crystal structure of the isolated ribosomal LI stalk//Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. - 2012,- V. 68. -P. 1051-1057.

2. Сапских A.B.. Костарева O.C., Балобанов B.A., Тищенко C.B. Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка LI с РНК//Вест. УДГУ. Биология. Науки о земле. - 2013. -Т. 6. -С. 90-95.

3. Сарских A.B.. Габдулхаков А.Г., Костарева О.С., Шкляева A.A., Тищенко C.B. Кристаллическая структура мутантной формы рибосомного белка LI из археи Melhanococcusуапиал/шУ/Кристаллография. —2014, —Т. 3(59).— С. 429-433.

Тезисы на конференциях:

1. Сапских A.B.. Костарева О.С., Михайлина А.О., Никонова Е.Ю. Получение, кристаллизация и определение структуры полноразмерного LI-выступа бактериальных рибосом.// XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». - Сборник тезисов — Секция биология - 11-15 апреля 2011 - С. 196.

2. Сарских A.B.. Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Габдулхаков А.Г., Сычева A.M., Тищенко C.B., Невская H.A., Никонов C.B., Гарбер М.Б. Структурно-кинетические исследования взаимодействия мутантной формы рибосомного белка LI со специфическим фрагментом рРНК.// 15 Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Сборник тезисов -18-22 апреля 2011 - С. 52.

3. Невская H.A., Сарских A.B.. Костарева О.С., Никонова Е.Ю., Габдулхаков А.Г., Тищенко C.B., Гарбер М.Б., Никонов C.B. Кристаллическая структура LI-выступа рибосомы с разрешением 2.0 Â. // V Российский симпозиум «Белки и пептиды». -Сборник тезисов - 8-12 августа 2011 - С. 201.

Отпечатано: типография «Пятый формат» - ИП Бецев С.Н.

Серпухов, ул. Водонапорная, д.36, офис 217 Тел.: 8(4967) 75-52-45; 8(916) 648-21-98; 8(925) 370-37-49 Формат А5, заказ № 50, 2014г. Тираж ЮОэкз.