Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рибосомные белки THERMUS THEMOPHILIUS, выделение, физико-химические свойства и кристаллизация

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рибосомные белки THERMUS THEMOPHILIUS, выделение, физико-химические свойства и кристаллизация"

.8 п 9 Г

и

ВСЕСОЮЗНЫЙ- НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

СЩЕЛЬНМКОВА Светлана Эртельевна

УДК 577.963.3

РИБОСОМНЫЕ БЕЛКИ ТНЕШЗ ТНЕШОРИНПБ ВЫДЕЛЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

/ /

Работа выполнена в Институте белка АН СССР Научный руководитель: кандидат биологических наук, М.Б.ГарСер

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, В.Р.Мелик-Адамян кандидат Сиологических наук Е.К.Давыдова

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгарда АН СССР

Защита состоится окт^Трь 1991 г. в _час

на заседании Специализированного ученого совета Д.098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 112545, Москва, 1-й Дорожный пр., д.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь Совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

Отдел кцавртаций

-1-

Общая характеристика работы

Акт^альность_пдоОлвш. Изучение молекулярного механизма образования пептидной связи в рибосоме является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Для понимания молекулярных механизмов работы рибосомы необходимо изучить ее структуру не только на молекулярном, но и на атомном уровне. Такой уровень знания может обеспечить только рентгеноструктурный анализ. За последние годы наметился прогресс в применении этого метода к изучению структуры рибосомы. Это стало возможным после получения кристаллов рибосом и их субчастиц из термофильных и галофильных микроорганизмов ( Bacullus stearothermophllus, Thermus thermophilus, Halobacterium morismortui). В настоящее время наиболее перспективными для рентгенографических исследований являются рибосомы экстремального термофила Th. thermophilus. Получены кристаллы 30S и 5QS субчастиц-и целой. 70S рибосомы из этого микроорганизма. Многокомпонентная, несимметричная рибосома, состоящая из трех различных молекул РНК. и примерно пятидесяти молекул различных белков, с общей молекулярной массой около

рентгеноструктурного анализа. Поэтому важно параллельно с исследованием кристаллов рибосом и оубчастиц проводить рентгеноструктурные исследования отдельных компонентов рибосом, в том числе и рибосомных белков. Полученные для них рентгенографические данные высокого разрешения позволят в даль^-нейшем уточнить данные, полученные, для субчастиц и 70S рибосом.

ШМь_Е§боты - выделение, физико-химическая характеристика и кристаллизация рибосомных белков из Thermus thermophllus.

Научная_новизна_и_практическая_цещос . Данная

работа посвящена созданию биохимической базы для дальнейших структурных исследований рибосомных белков из Thermus thermophllus. Она содержит ряд оригинальных методик для работы с рибосомами из этого микроорганизма, в том числе методики очистки рибосом и разделения их на субчастицы, методику выделения ряда рибосомных белков из 50S субчастиц без применения денатурирующих агентов, методику получения пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов белка TS9(S6) из малых субчастиц рибосом. _ В

2,6-106Д

является

очень

сложным объектом для

результате впервые получены в препаративных количествах 11 белков из 5СБ субчастиц рибосом ТЬегша ШегторКИиэ. Для ряда этих белков получены физико-химические характеристики - определены молекулярные массы, аминокислотный состав, коэффициент экстинкции. Два из них (ТЬ5 и ТЬ7) получены в кристаллической форме. Впервые были выращены кристаллы белка ГБЭ (Эб), пригодные для рентгеноструктурного анализа.

П2б^!тащи_и_апробация_2аботы. По теме диссертации опубликовано 10 работ. Материаллы диссертации представлялись на Международном Симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Третьей и Четвертой Международной Конференции "Кристаллизация биологических макромолекул" (Вашингтон, 1989, Фрайбург, 1991), на конкурсах научных работ Института белка (1987, 1989, 1991).

Стр2ктхра^и_объем_ваботы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной частй,, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (140 ссылок). Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 41 рисунок и 14 таблиц.

Основное содерзание работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ посвящен структурным исследованиям рибосомных белков. В историческом плане обозревается развитие этих исследований, приводятся данные по выделению и очистке индивидуальных, рибосомных белков, по первичной, вторичной и пространственной структуре .этих белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ представлены в шести главах.

Глава I. Очистка рибосом ТЬеппиа ШегторШ.1из и их разделение на субчастицы.

Количество и качество препаратов рибосом являются фундаментом для всех дальнейших процедур в наших исследованиях. Так как нам необходимо получать препараты рибосомных белков в больших количествах (десятки мюышЕраммов), мы стремимся получить препараты рибосом И субчастиц С максимальные гатпдпи и длгчвдмдт-чистые.Для очистки рибосом и их разделения на субчастицы мы

отработали методики, основанные на применении колоночной гидрофобной хроматографии на носителе В1^у1-Тоуореаг1 ббОБ. Эти методики примерйо в десять раз эффективнее применявшихся ранее методик с использыванием ультрацентрифугирования и зонального центрифугирования. На рис.1 приведен профиль разделения субчастиц и указаны условия, хроматографии на колонке с аиу1-Тоуореаг1 6503.

(BH^JjjSO,

Рис.1.Профиль элюции рибосомннх субчастиц Тй. ^епюрШдм с колонки с Вигу1-Тоуореаг1 650Э. Рибосомы (3,5 г) нанесены на колонку объемом 350 мл в растворе, содержащем

im

nh4cl

(NH4)2S04, 0,05М MgCL2, и, 15М

0.05М трис-HCL pH 7,5. Затем колонка промыта раствором,содержащим IN (Ш4)304,0.002М MgCL2

0,4-М HaCL, pH.5,0.Субчастицы элю-ировались в 1,4л градиента концентрации (HH4)2S04 от 0,7 до 0.I5M

в растворе, содержащем О,4M УаСЬ

0,002MMjCl^pH 5,5.

Глава 2. Выделение рибосомннх белков из 50S субчастиц рибосом Thermus thermophllus.

Наиболее эффективные из известных методик выделения рибосомннх белков предусматривают применение денатурирующих агентов как для отделения белков от рнк, так и в процессе их последующего хроматографического разделения. Для кристаллизации необходимо получать препараты белков в возможно более нативном виде, поэтому мы отработали методику выделения группы белков из 50S субчастиц без использнвания денатурирующих агентов.

а) Экстракция белков из 50S субчастиц рибосом Th. thermophilus

В основе предложенной нами методики экстракции группы белков из 50S субчастиц - обработка субчастиц 50% этанолом при. нагревании в присутствии одновалентных солей. При этом от 50S, субчастиц достаточно селективно отделяется группа из 9 белков (TI2, TL4-TL8, TL11*. TL12, ТЫ 4) (Рис.2).

í't ЛГ » It-)

® "isas,-

a. СЛ W««

Рис.2. Двумерные элентрофореграммы белков из 3QS субчастиц (а) и 50S субчастиц (о) рибосом Th.thermophilus

Были испытаны различные условия экстракции белков этой группы из 5 СБ субчастиц в присутствии 50% этанола. Было показано,что варьируя вид соли (NH^CL, LICL, NaCL), ее концентрацию и температуру обработки, от 50S субчастиц можно отделить группы белков, приведенные в таблице I.

Таблица I. Группы белков, экстрагирующиеся из 50S субчастиц рибосом Ih.themophilus при различных условиях экстракции смесью этанол-соль

Состав группы белков ! Условия экстракции

I) ТЫ 1* 0,5 Ы Ш4СЬ, 55°С, 50% EtOH

2) TL11 *, TL7, миноры TL2, TL5, TL8 1,2 М L1CL, 35°С, 50% EtOH

3) TL11 *, 412., ТЫ 4 TL5-TL8, ТЪ12, 1,5 М LiCb, 45°С, 50% EtOH

4) ТЫ 1 *, TI2, TL4-TL8, TL12, 1 м NH4CL, 60°С, 50% EtOH

TL14 0,5 М NH4CL, 60°С, 505& EtOH

5) 112, TL4-T16, Tb8-TL10,TL12, ТЫ 4, ТЫ 7, TL19, TL21, TI24, ТХ25, И27/28, TL29 1 ,8 М L1CL, 45°С, 50% EtOH после экстракции группы 2) 1,? м тлг.т., sra RtOH

Покавано, что по "экстрагирующей способности" использованные соли можно распологять в ряд NH4CL< NaCL< LiCL. Повышение температуры экстракции при прочих равных условиях приводит к увеличению числа экстрагируема белков и к повышению их выхода.

Группа белков, наиболее прочно связанных с 23S РНК, включает в себя белки ТЫ, TL3, 11,9, ТЫ О, ТЫЗ, ТЫ 5, TL16, TL18, TL20 и может быть удалена с РНК 6 М раствором ЫСХ.

б) Разделение смесей рибосомных белков; экстрагирующихся из 50S субчастиц рибосом Th.thermophllus смесью этанол-соль

Для хроматографического разделения полученных фракций использывались колонки с CM-Sepharose CL6B, CM-Sepharose Fast Plow, CM-Toyopearl 650S, SP-Toyopearl 650S. Наилучшее разделение девяти белков достигается на колонне с CM-Sepharose CL6B (Рис.З).

Рис.3. Разделение белков,

экстрагированных из 50S субчастиц 50%-ным EtOH в присутствии 0,5М НН^СЬ

при 60°С, на колоше с CM-Sepharose СЬбВ. Объем колонки - 30мл,количество белка 200мг,скорость элюции II мл/час, объём фракции 5,8мл. Элюция градиентом концентрации NaCL от 0,04 до 0,44М в 0,6л раствора, содержащего D.05M На-Ас рН 5,6 0,005М р-мэркаптоэтанола

в) Разделение фракции рибосомных белков, остающихся на РНК после обработки БОБ субчастиц смесью этанол-соль

Белки, наиболее прочно связывающиеся с 23Б РНК, были разделены на колонке с СМ-Тоуореаг1 650Б. Бри этом в чистом виде были получены белки ТЫ и ТЫЗ.

Итак, предложенная наш методика позволяет получать без применения денатурирующих агентов следующие белки из БОБ субчастиц рибосом №ДЬегторМ1ив: ТЫ, ТЬ2, ИД. ТЬ5, ТЬб, Н.7,

ТХ8, TL11*, ТЫ3 в препаративных количествах (5-20 мг белка из 2 г 50S субчастид или из -,700 г биомассы). Белки TL12 и ТЫ 4 были получены в количестве 1-2 мг.'Этих количеств достаточно для подбора.условий кристаллизации этих белков.

Глзза 3. Некоторые физико-химические характеристики индивидуальных белков из 50S субчастиц рибосом Thermus thermophilus

а) Молекулярная масса

Молекулярная масса индивидуальных белков из 50S субчастиц была оценена с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Применение этого метода не гарантирует точного определения молекулярной массы из-за аномального связывания додецилсульфат ионов некоторыми белками. В частности, для рибосомных белков из E.coll истинная молекулярная масса оказалась на 10-15% ниже, чем определенная методом SDS-элекгрофореза. Поэтому мы использывали в качестве маркеров молекулярной массы не только стандартные смеси белков (фирмы "'Serva"), но и имевшиеся у нас белки из 30S субчастиц рибосом Е.coll.Калибровочный график, построенный по этим белкам прошел на 10% шике и параллельно графику,полученному для стандартных белков S таблице 2 приведены два значения молекулярной массы для каждого белка, определенние по каждому из двух калибровочных графиков.

б) Спектры поглощения в ультрафиолетовой области и коэффициенты экстинкции

Рибосомные белки - небольшие белки, содержащие небольшое количество ароматических остатков в составе молекулы, поэтому их спектры поглощения в ультрафиолетовой области весьма характеристичны, для многих из них эти спектры могут применяться для быстрой идентификации. Для некоторых белков были определены коэффициенты экстинкции (Таблица 3).

в) Аминокислотный состав

Для белков TL1, TL2, TL5, VI,6, TL7, TL13, ТЫ 1*,был определен аминокислотный состав. Опредедшша—нрвввдата Б ЕГ~ _1юааорнеетж;—ЩГОтёин т~

Таблица 2. Молекулярная масса ряда индивидуальных рибосомных белков из ТЬ-.ШеггаорЬПш (по данным БОБ-электрофореза)

1 1 I Молекулярная масса (к!) I Число

Белок 1 ( 1 1 по рибоссмжм белкам-маркерам 1 по стандартным ! белкам-маркерам ] определений

ТЫ 27,1 30,0 1

т 23,8+0,7 26,2+0,8 3

Т14 20,3+1,0 22,3+1,1 3

ТЬ5 21,8+0,5 24,0+0,6 4

ТЬ6 14,8+0,8 16,3+0,9 3

ТЬ7 21 ,4+0,5 23,5+0,6 3

8 15,5+0,2 17,0+0,3 2

ТЫ 1* 18,5; 13,5* 1

ТЫ 2 16,0+0,5 17,6+0,7 3

ТЫ 3 15,7+0,2 17,1+0,2 2

ТЫ 4 15,1+0,2 16,6+0,3 3

^Комплекс TI.11* содермт два вида голилептидов с массой молекулы, определенной как 18,5 кД для большего и 13,5 кД для меньшего.

Таблица 3. Коэффициенты экстинкции для ряда индивидуальных белков из 50Э субчастиц рибосом Tti.th.ermoph.ilus

Белок ! ^ макс: ! нм Коэффициент экстинкции ПРИ \iaKa.

ТЫ 279 1,23+0,08

ТЬ2 276 0,46+0,02

115 275 0,43+0,02

Т16 281 0,64+0,03

ГЬ7 277 0,47+0,03

ТЫЗ 278 1,14+0,09

Глава 4. Кристаллизация индивидуальных: белков из 50S субчастиц рибосом Tbermus therraophilus

Некоторые из полученных рибосомных белков были использованы в опытах по кристаллизации. Применялся метод диффузии паров в 'Висящей капле. Белки TL5 и ТХ7 были получены в кристаллической форме. Образование микрокристаллов белка TL5 наблюдалось при использывании сульфата аммония в качестве осадителя. Кристаллы белка TL7 в виде гексогональных палочек с соотношением диаметра к длине 1:5 были получены в присутствии сульфата аммония при pH 6,1. Максимальные размеры кристаллов составляли 0,07 мм в диаметре и 0,35 мм в длину (Рис.'4). Эти кристаллы слишком малы для их рентгеноструктурного анализа. Продолжается работа по получению более крупных кристаллов.

Глава 5. Пентамерный комплекс ТЫ 1 * ( аналог комплекса (Х7/Ы2)2Ы0 из Е.coli ) и белок TL11 ( аналог белка L7/L12 из E.coll)

Пентамерный комплекс, образуемый в рибосомах E.coll четырьмя молекулами белка L7/LI2 (белок 17 - ацетшгарованная по Н-концево-му остатку форма белка LI2 ) и одной молекулой белка LIO или их аналогами из других организмов,является одним из самых интересных компонентов рибосомы. Функционально он связан с-прохождением ГТФ-зависимых реакций на рибосоме. Интересна структура комплекса. Белок L7/L12 из E.coll существует в растворе в виде димера. Предложены модели его структуры. В пентамерном комплексе два димера L7/L12 взаимодействуют с белком LIO.Окончательный ответ на вопрос о структуре этого комплекса, может дать только рентгеноструктур-ный анализ. К настоящему времени с высоким разрешением получена структура глпЯ^цшртодаа-Д-квн^иш'и нишгня полка i://í,V¿. Получены кристаллы комплекса из B.stearotherraopbllus.HO они оказались не-