Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биотехнологии получения препарата пектиназ на основе селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии получения препарата пектиназ на основе селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K"

СОКОЛОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПЕКТИНАЗ НА ОСНОВЕ СЕЛЕКЦИОНИРОВАННОГО ШТАММА ASPERGILLUS FOETIDUS 379-К

Специальность 03.00.23- Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2008

003170990

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии)

Научный руководитель Доктор технических наук, профессор

Римарева Любовь Вячеславовна Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна Доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна Ведущая организация Московский государственный университет прикладной

биотехнологии (МГУПБ)

Защита состоится «20» июня 2008г. в 10°° час на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском институте биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос Биокомбината, ВНЮ ИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП Россельхозакадемии

Автореферат разослан «20» мая 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фролов 10 Д

1 Общая характеристика работы

Лктуальиостъ темы. В настоящее время большое внимание уделяется пектиновым веществам, деполимеризация которых осуществляется ферментами, входящими в иекголитический комплекс пектингидролазами и пектинлиазами Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии при получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин, для получеши пищевых красителей и ташшиов, при обработке текстильных волокон Потребность в этих ферментах стабильно растет

Эффективность расщепления пектинсодержащих веществ зависит не только от применения биоггрепаратов-исгочников активных пектолитических ферментов, но и от соотношения пектиназ различной специфичности и механизма действия в составе пектолитического комплекса, что обусловлено физиологическими и культуральными особенностями штамма-продуцента Одним из основных источников получения пектолитических ферментов являются микромицеты, которые обладают характерной особенностью синтезировать широкий спектр внеклеточных пектиназ

Работы многих исследователей посвящены созданию активных штаммов-продуцентов пектиназ и технологиям производства и применения ФП пектолитического действия (Бравова Г Б, 1981, Михайлова Р В , 1992, Сапунова Л И, 1992, Barras F, 1994, Cavalito S F, 1996, Семенова M В, 2003, Синицьш АП.2003, Римарева JIВ , 2004, Бутова С Н, 2004, Курбатова Е И , 2004 и др)

Ранее широкое применение в сокоморсовой промышленности и виноделии имел ФП отечественного производства Пектофоетидин П10Х В биотехнологии Пектофоетидина использовали гриб Aspergillus foetidus, культивируемый твердофазным методом Однако в настоящее время предприятия, основанные на поверхностном культивировании продуцентов-ферментов, отсутствуют

IIa современном этапе перспективным направлением науки является создание с использованием генетических и селекционных методов нового высокоэффективного штамма-продуцента пгктолитическнх ферментов для глубинного культивирования, с целью разработки научных основ ферментных технологий для перерабатывающих отраслей АПК Применение отечественных биокатализаторов позволит не только интенсифицировать существующие биотехнологические процессы в пищевой

промышленности и создать конкурентоспособную продукцию нового поколения с заданными свойствами, но и произвести импортозамещение, так как высокая цена биопрепаратов ограничивает их широкое применение в России

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы заключалась в скрининге активного штамма - продуцента внеклеточных пектиназ, подборе оптимальных условий его глубинного культивирования для получения комплексного ферментного препарата пектолитического действия

Дня достижения поставленной цели решались следующие задачи

- скрининг и селекция штаммов- продуцентов внеклеточных пектиназ,

- мутагенез селекционированного штамма для повышения его биосинтетической способности,

- изучение физиолого-морфологических и биохимических особенностей

отобранного продуцента,

- подбор оптимальных условий для получения ферментного препарата и исследование его биохимической характеристики,

- оценка эффективности применения препаратов для биокатализа полисахаридов растительного сырья

Научная новизиа работы. Впервые методами селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового штамма Aspergillus foetidus 379-К - продуцента комплекса пектолитических ферментов и исследованы его культуральные и морфолого-биохимические признаки На основе установленных физиологических особенностей селекционированного штамма подобраны условия глубинного культивирования, позволяющие продуцировать ферментативный комплекс с доминирующими ферментами пектолитического действия и сопутствующими -ксиланазой, целлюлазой, р-глюканазой, хитиназой, маннаназой Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов-продуцентов пектиназ Получены новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса, продуцируемого A foetidus 379-К Показана возможность регуляции биосинтеза отдельных ферментов комплекса штаммом A foetidus 379-К путем изменения условий культивирования (рН, температура, время культивирования) Получен новый ферментный препарат Пектофоетидин методом глубинного культивирования и исследована его биохимическая характеристика

Практическая значимость работы В результате изучения свойств селекционированного штамма разработана и экспериментально обоснована новая технология ФП Пектофоетидин Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером F-962 Разработаны паспорт на штамм Aspergillus foetidus 379-К, методика по ведению и хранению продуцента пектолитических ферментов, ТУ на ферментный препарат Пектофоетидин Г10Х и ТИ по получению ФП Пектофоетидин Г10Х

Проведены производственные испытания по получению нового ФП во ВНИТИБП - ЗАО «Биопрогресс» и по применению на ОАО «Уржумский спирто-водочный завод» в технологии получения спиртованных соков с применением ферментативной обработки плодово-ягодного сырья

Апробация работы Основные положешш представлены на следующих симпозиумах и конференциях Международных симпозиумах «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2004); «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференция «Проблемы создания продуктов здорового питания Наука и техночогии» (Углич,2006), 4-м Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях», Москва, 2008

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей-3

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего источника, из них /^/¡f отечественных, ^¿¿^ иностранных Работа изложена страницах машинописного текста, включает/^ таблиц ц^/{зисунков

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Селекционированный штамм Aspergillus foetidus 379-К -продуцент комплекса пектолитических ферментов,

2 Разработанный новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов-продуцентов пектиназ с применением индикатора,

3 Условия регулирования биосинтеза отдельных ферментов пекголитического комплекса при изменении условий выращивания в процессе роста культуры,

4 Разработанные условия глубинного культивирования Aspergillus foetidus 379-К, включающие подбор оптимальной питательной среды, длительность выращивания, температурный режим,

5 Разработанная нормативно-техническая документация на производство ферментного препарата Пектофоетидин Г10Х и Технические условия на ферментный препарат Пектофоетидин Г10 X

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Исследования проводили в лабораторных условиях на базе отдела биотехнологии ферментных препаратов ГНУ ВНИИПБТ, кафедры химической энзимологии МГУ им Ломоносова в опытно-промышленных условиях ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП г Щелково и ОАО «Уржумский спирто-водочный завод»

Объектами исследований служили штаммы микромицетов из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИПБТ, Института микробиологии РАН, ОАО «ГосНИИсинтезбелок» и МГУ им Ломоносова В работе использовали общепринятые микробиологические и биохимические методы исследований, а также хроматографические методы разделения ферментного препарата по фракциям

Определите общей пекголитической, эпдополигалактуроназной и пектинэстеразной активности проводили по ГОСТ 20264.3-84 За единицу пектолитической активности принимали такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком, при проведении гидролиза в течение 1ч при температуре 30°С, величине рН реакционной среды 4,0

За единицу эндополигалактуроназной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина со снижением вязкости раствора на 30% за 1 мин при 30°С

За единицу активности пектинэстеразы принимали такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мюкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30°С Определяемая величина пектинэстеразной активности находится в непосредственной зависимости от степени этерификации пектина Содержание растворимого белка определяли методом Лоури

Статистичсскую обработку результатов проводили по программе Exccl 2.2 Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1 Изучение биохимической характеристики микромицетов -продуцентов пектолитических ферментов. Отбор наиболее активного штамма

Проведена сравнительная характеристика 14 штаммов— продуцентов пектолитических ферментов рода Aspergillus (А), Rhizopus (R), Pemcillum (Р) Наибольшая псктолитическая активность ферментов отмечена при культивировании штамма Aspergillus foelidus 37 (табл 1)

Таблица 1 - Сравнительные исследования микромицетов — продуцентов нектотитнческих ферментов при глубинных условиях выращивания

Штаммы - продуценты Активность ПкС, ел/см"

A usami 3758-248 0,03

A usami 45-332 0

Amgern-310 0,04

A furaigatus 349 0

A oryzae 387 0

A foelidus 37 0,40

A foetidus 51 0,10

A aviamon ВУДТ-2 0,002

A foetidus 29 0,034

A foetidus 17 0,15

A foetidus 491 М 0,05

Rhizopus delcmar 385 0,02

Rhizopus tonkinensis 27 0,015

Pemcillum citro-viride 367 0,001

2.2.2 Селекция штамма A.foetidus 37 с целью повышения его биосинтетической способности

На I этапе провели селекцию отобранного штамма и скрининг наиболее активного варианта, синтезирующего комплекс пектолитических ферментов. В качестве исходного штамма использовали Aspergillus foetidus 37.

Для получения более стабильного и высокопродуктивного штамма была проведена многоступенчатая селекция с применением методов эффективных методов мутагенеза.

В селекционных исследованиях применен разработанный нами ускоренный микробиологический метод скрининга, позволяющий по окрашенным зонам гидролиза субстрата, образующимся вокруг гигантских колоний, отбирать активные варианты.

В результате селекции было выделено более 500 популяций культуры Aspergillus foetidus 37. Из них отобрало 8 активных клонов.

Рисунок 1 - Отбор активного варианта-продуцента псктиназ

Наибольшей способностью к синтезу пектиназ обладал штамм Aspergillus foetidus - 37-4, который секретировал внеклеточную пектиназу с активностью 1,0-1,2 ед/см3 (рис. Г).

Культивирование продуцентов осуществляли в кспбах Эрченмейера в течение 4-х суток при температуре 28-30° С на подобранной нами питательной среде следующего состава (%) неосветленное свекловичное волокно-3,0, (N114)2804 - 0,3, КН2Р04 - 0,1, !^504-0,1 В качестве посевного материала применяли культуру, выращенную в течение 10 суток на сусло-агаре

Исследовали влияние различных источников азота в качестве компонентов питательной среды на активность внеклеточных пектиназ, секретнру емых глубинной культурой отобранного варианта А ГоеМиэ 37-4 При этом варьировали концентрацией аммонийных солей (табл 3)

Таблица 3 - Влияние концентрации аммонийных солей на биосинтез пектнназы

А^оеМиз 37-4

Источник неорганического азота Концентрация, % рН Пектолитическая активность, %

(ЫН4)25 04 0,3 Контроль 3,1 100

0,5 3,3 125,0

0,6 3,2 117,0

0,7 3,5 125,0

0,8 3,3 108,0

(ЫИ4)Н2Р04 0,5 3,4 109,0

0,6 3,5 111,0

0,7 3,4 109,0

0,8 3,2 102,0

Как видно из представленных в таблице 3 данных, наиболее высокая пектолитическая активность отмечена в вариантах, выращенных на среде, содержащей в качестве источника азота сернокислый аммоний Оптимальной концентрацией для увеличения образования фермента является 0,5% (N114)2804-

Выявлено влияние различных источников азота на биохимическую активность отобранного продуцента (табл 3,4)

В качестве источников органического азота можно выделить пшеничные

отруби в концентрации 0,5% Их использование позволило увеличить уровень активности фермента в к ж на 30,7% (табл 4)

Таблица 4 - Влияние органических источников азота на синтез внеклеточной

пектипазы

Л» п/п Состав питательной среды pH % повышения активности

1. Контроль (К) 2,7 —

2 К+ 0,5% глютена 3,5 11,7

3 К+0,5% пшеничных отрубей 2,8 30,7

4 К+0,5% солодовых ростков 3,2 14,4

5 К+ 0,5% сухой барды 3,3 18,5

6 К+ 0,5% кукурузного экстракта 3,9 5,8

7 К+ 0,5% дрожжевого экстракта 3,6

В результате проведенных исследований была подобрана питательная среда, содержащая неосветленное свекловичное волокно - 3,0%, пшеничные отруби -0,5%, (NH4)2S04 - 0,5%, КН2Р04-0,1%, MgS04-0,l%

Использование эффективных методов селекции и оптимизация питательной среды позволила повысить активность внекле!очной пектиназы на 1 этапе с 0,4 до 1,6 ед/см3 к ж

2.2.3 Селекция и мутагенез продуцента пектииаз Aspergillus foetidus 37-4

Для повышения эффективности производства и применеши пектолитических ферментов в различных отраслях АПК для гидролиза растительного сырья необходимо получение нового штамма, обладающего более высокой продуктивностью по отношению к пектиназам В качестве родительского использовали штамм A foetidus 37-4

Мутагенез проводили по следующей схеме

Родительский штамм -*■ приготовление суспензии спор -»-облучение ультрафиолетом —► рассев облученной суспензии на селективную агаризованную среду ->• отбор мутантов по окрашенным зонам гидролиза_».пересев отобранных

вариантов иа скошенный сусло-агар —*■ проверка мутантов по пектолитической активности при глубинном культивировании.

В качестве мутагенной обработки использовали облучение спор ультрафиолетом с различной длительностью экспозиции. После выращивания колоний на агаризованных средах, содержащих солодовое сусло или цитрусовый пектин с различной степенью метоксилирования, осуществляли отбор мутантов по окрашенной зоне гидролиза субстрата среды, после чего отсевали отобранные мутанты на скошенный сусло-агар и определяли активности пектолитических ферментов методом глубинного культивирования продуцентов на подобранной питательной среде для синтеза зкзопектиназ.

В результате 1-ой ступени мутагенеза выделено 100 вариантов, из них наибольшая зона гидролиза наблюдалась у 6 клонов (рис.2).

37-4 37-4-25 37-4-47 37-4-62 37-4-80 37-4-91 37-4-12

Варианты

Рисунок 2 - Отбор активного варианта по зоне гидролиза субстрата

При сравнительных исследованиях биосинтетической способности отобранных 6 клонов был выявлен наиболее активный штамм АЛ'оеиёив 37-4-12, полученный при облучении в течение 7 минут. Уровень активности пектолитических ферментов селекционированного штамма превосходил активность родительского штамма А.йэейёиз 37-4. Особенно это наблюдалось при выращивании на среде, содержащей высокометоксилированный цитрусовый пектин:

- по общей пектолитической - на 10 %;

- по эндополигалактуроназной - на 88 %;

- по пектинэстеразной - на 93 %

Для дальнейшего повышения физиологической активности отобранного

штамма была проведена 2-ая ступень мутагенеза Отсев мутантов проводили на агарнзованные среды, содержащие солодовое сусло и высокометоксилированный цитрусовый пектин Длительность облучения составила 6-8 минут Уровень активности варианта, полученного после 2 ступени облучения превысила уровень активности варианта после 1 ступени

- по общей пектолитической - на 4,5 %,

- по эндополигалактуроназной - на 8 %,

- по пектинэстеразной - на 17 % (табл 5)

Таблица 5 - Ферментативная активность отобранных вариантов А.ГоеМиэ

Варианты селективных агаризованных сред Режим УФ, мин Разведе -ние споровой суспензии Активность ферментов пектолитического комплекса

ПкС Эндо-ПгС ПэС

ед/см"* % ед/см* % ед/см'' %

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 ступень

Солодовое сусло (род штамм) 1,60 100,0 0,5 100,0 0,43 100,0

Цитрусовый пектин высокометоксилированный 5' 10"4 0,91 76,0 0,62 124,0 0,23 53,4

7' Ю-4 1,77 110,6 0,94 188,0 0,71 165,0

Цитрусовый пектин низкометоксшш-рованный 5' 10"4 1,46 91,3 0,58 116,0 0,83 193,0

Т Ю"4 1,39 86,9 0,52 104,0 0,47 109,3

Солодовое сусло 5' КГ" 1,53 95,6 0,74 148,0 0 0

7; 10"4 1,43 89,4 0,69 138,0 0,71 165,0

2 ступень

Солодовое сусло (род штамм) 1,60 100,0 0,5 100,0 0,43 100,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

6' 10"5 1,85 104,5 1,02 108,5 0,83 116,9

7 10 1,79 101,1 0,98 104,2 0,75 105,6

8' 10 5 1,74 98,3 0,96 102,2 0,69 97,0

Цитрусовый высокометоксилир ованный 6' ю-5 1,55 96,9 0,86 91,0 0,55 77 4

7' ю-5 1,49 84,2 0,82 87,2 0,48 67,6

8' 10"3 1,4 79,0 0,76 80,8 0,22 30,9

3 ступень

Солодовое сусло (род штамм) 1,85 100,0 1,02 100,0 0,83 100,0

Солодовое сусло 1 Ю-1 1,67 90,2 0,72 70,5 0,77 92,7

9' 10-> 1,48 80,0 0,81 79,4 0,52 62,6

Цтрусовьш высокоме- токсилированный 7' Ю-5 1,88 101,6 0,97 95,0 0,87 104,8

9' Ю-5 2,02 109,2 1,35 132,4 0,95 114,5

После 3-ой ступени облучения получили штамм, превосходящий по аюивности вариант, полученный после 2-ой ступени

- по общей пектолитической - на 9%, -эндополигалактуроназной - на 32%,

- нектинэстеразной - на 14% (табл 5)

Таким образом, в результате многоступенчатой селекции был получен штамм A.foetidus 379- К, который превышал уровень активности родительского штамма Л foetidus 37-4

- по общей пектолитической-на 24%

- но эндополигалактуроназной - на 128%,

- по пектинэстеразной - на 124%

2.2.4 Культурдльно - морфоло! пческая характеристика отобранного штамма

Asp foetidus 379-К

Потученный вариант отличался от исходной культуры не только высокой биохимической активностью, но и некоторой морфологической гетерогенностью при

рассевах на твердых агаризованных питательных средах

Размер 4-5-ти суточных гигантских колоний гриба А Гоеййиз 379 - К составил 3,0-4,5см в диаметре, а у родительского А ¡оеискк 37-4 - 2,8-3,5см Цвет колоний темно-коричневый, почти черный у родительского штамма, а у мутантного - из-за обильного образования воздушного мицелия колонии имеют более серый оттенок. Колонии более выпуклые с небольшой возвышенностью в центре Поверхность колонии более складчатая, чем у родительского штамма Обратная сторона колонии светло-коричневая Край колонии ровный, слегка складчатый На агаризованной среде вокруг колонии наблюдается светлая зона - зона гидролиза субстрата ферментом На среде, содержащей индикатор метилрот, она наиболее ярко выражена

2.2.5 Исследование процессов биосинтеза экзопектиназ и состава ферментативного комплекса, продуцируемого грибом A foetidus 379-К

Исследование регуляторных механизмов ферментообразования является необходимым условием целенаправленного использования биосинтетического аппарата микроорганизмов

На следующем этапе работы исследовали процессы биосинтеза экзопектиназ, а также компонентный состав ферментного комплекса, синтезируемого мутантным штаммом Aspergillus foetidus 379-К

В ходе проведения работы изучена динамика накопления пектолитических ферментов в процессе роста культуры A foetidus 379-К (рис 3)

Время,час

Рисунок 3- Динамика накопления пектолитических ферментов в процессе роста культуры A foetidus 379-К

Полученные данные подтверждают взаимосвязь биосинтетических и физико-химических процессов, происходящих в период роста и развития микроорганизмов Показано, что в начальный период в стационарной фазе роста культуры гриба Aspergillus foetidus 379-К происходят изменения рН культуральной жидкости в сторону более кислых значений, связанные, по-видимому, с накоплением органических кислот (рис 4) В это же период отмечена наибольшая скорость синтеза экзогидролаз (рис 3) Так, на 24ч роста гриба рН с 5,5 понижался до 4,0 и начинался синтез пектолитических ферментов Через 48ч выращивания рН среды снижался до 2,9 и активность эндополигалактуроназы достигала максимума -1,37ед/см3 После 72ч роста рН среды повышался, а через 96ч достигал значения 4,3

0 20 40 _ 60 80 100 120

Время выращивания, час

Рисунок 4- Динамика накопления белка и изменения pH в культуральной жидкости гриба A foetidus 379-К

Можно предположить, что изменение концентрации ионов 1Г при культивировании i риба Aspergillus foetidus 379-К носит приспособительный характер При этом микроорганизмы, развиваясь и ассимилируя питательные вещества, выделяют в среду продукты обмена, в тч пектиназы, создавая условия для сохранения их активности на оптимальном уровне В фазе затухания происходит

снижение потребности микроорганизма в питании и торможение синтеза пектолитических ферментов, а далее - их инактивация, связанная с автолизом клеток.

Таким образом, в результате многоступенчатой селекции и мутагенеза исходного штамма АЛ'оеГнкк 37 был получен новый активный мутантный штамм А.Гое^ив 379-К, продуктивность которого по отношению к пектиназам была увеличена в 4 раза. На основе установленных закономерностей синтеза пектолитических ферментов и условий культивирования штамма уровень активности ферментов была увеличена еще на 30% (рис.5).

апкс

ESIIrC

A.f-37

A.f-37-4 A.f. 37-4-12 A,f.379-K

Рисунок 5- Результаты селекции и мутагенеза микромицета A.foetidus 379-К 2.2.6 Получение комплексного ФП Пектофоетидин Г10Х и Г18Х

2.2.6.1 Изучение условий получения Ф11 Пектофоетидин Г10Х и Г18Х и их биохимическая характеристика

С целью получения концентрированного ФП Пектофоетидин из глубинной культуры Aspergillus foetidus 379-К были проведены исследования по получению препарата методом осаждения активного белка этанолом из культуральной жидкости. При этом варьировали соотношением спирта и к.ж. (табл.6).

Табшца б- Выход ФП Нсктофостндин Г 10 X в различных вариациях кошчества к.ж. и спирта

Соотношение к ж спирт Активность пектолитического комплекса ферментов, %

ПкС Эндо-ПгС ПэС

12,5 84,2 63,6 81,3

1 3 100 100 100

1 3,5 71,7 45,2 76,2

1 4 17 31,9 47,5

1 4,5 14 17,4 52,9

В результате проведенных экспериментов были подобраны оптимальные условия потучеши ферментного препарата (соотношение к ж этанол = 1 3)

Изучена биохимическая характеристика полученного пектолитического препарата Пектофоетидин 1 10Х, которая приведена в таблице 7 Концентрация белка в препарате 194 мг/г

1 аблица 7- Характеристика спиртоосажаеиного препарата

Ферменты, входящие в Активность ферментов, ед/г Удельная активность, ед/мг

комплекс препарата белка

Общая пектиназа 397 2,0

Эндополигалактуроназа 245,5 1,22

Пектинэстераза 125,5 0,62

В-Глюканаза 395,0 1,02

Ксиланаза 89,7 0,46

Целлюлаза 165,5 0,85

Хитиназа 2,53 0,013

При совместной работе с лабораторией мембранных технологий ГНУ ВПИИПБТ был получен ФП в виде ультраконцентрата на мембране УПМ-20 При этом к ж удалось сконцентрировать в 8 раз и получить препарат со следующими активностями ферментов

-общая пектолитическая - 16,8 ед/см3,

- эидополигалактуроназная - 7,6 ед/см3,

- пектинэстеразная - 5,4 ед/см3

Концентрация белка в ультраконцентрате - 8,7 мг/см3

Проведенные хроматографические исследования биохимического состава ферментного препарата на кафедре энзимологии МГУ им Ломоносова подтвердили многокомпонентность ферментативной системы ФП Пектофоетидин Г10Х (рис 6) Результаты анализа показали, что препарат проявил высокую активность к полигалактуроновой кислоте, что обеспечивается присутствием полигалактуроназы, и высокую общую пектиназную вискозиметрическую активность (совместное действие полигалактуроназы и пектинэстеразы) Уровень пектинлиазной активности был достаточно низким, что способствует более эффективному действию пектолитического комплекса при получении и осветлении соков го плодово-ягодного сырья Кроме того, препарат содержал ряд ферментов гемицетлюлазного комплекса, что соответствует наличию активностей к ксилану, Р - глюкану, ксилоглюкану, арабинану, галактапу, галактоманнану Препарат обладал рядом гликозидазных активностей по отношению к пара-нитрофенильным производным Сахаров, а также в препарате была обнаружена протеаза, активная в « кислой» области рН (табл 8)

Таким образом, исследуемый ферментный комплекс препарата на основе гриба Asp foetidus 379-К является мультикомпонентным, с преимущественным содержанием пектииаз (в первую очередь, полигалактуроназ), а также с разнообразии составом гемицеллюлаз (ксиланаз, Р -глюканаз и т д )

Стадия 2 Mono Q pH 7 4 дтдоия 1 Mono Q pH 5 5

Рисунок 6 - Аналитическое фракционирование ферментного препарата Пектофоетидин Г20Х, полученного на основе Aspergillus foctidus 379-К

Таким образом, скрининг активного мутантного штамма и разработка условий культивирования и биосинтеза экзопектиназ позволили получить новый ФП Пектофоетидин ГТОХ, отличающийся от ранее известного Пектофоетидин П10Х (табл 8)

Полученный по разработанной технологии новый препарат Пектофоетидин Г10Х на основе мутантного штамма A foetidus 379-К, обладал более высокой эндополигалактуроназной активностью (в1,Зраза) и более низкой пектинэстеразной

Таблица 8- Сравнительная характеристика ФП Пектофоетидин Г10Х и ШОХ

Активности ферментов Пектофоетидин П10Х Пектофоетидин Г10Х

1 2 3

Общая пектолитичсская, ед ПкС/г 233,8 397,0

Эндополигалакгуроназная, ед Эндо-ПгС/г 187,0 245,5

Пекгинэстеразная, ед ПэС/г 238,2 125,5

1 2 3

В-Глюканазная, ед р-ГкС/г 618,1 395,0

Целлюлолитическая, ед ЦС/г 196,8 165,5

Ксиланазная, ед КС/г 146,8 89,7

Хитиназная, ед ХС/г 2,83 4,53

Полученные данные указывают на возможность более эффективного использования нового препарата пекгиназ в связи с его высокой активностью и сниженным содержанием пектинэстеразы, что позволяет интенсифицировать процесс гидролиза пектина и сократить при этом образование метанола

2.2.6 2 Изучение рН- и термостабилыюети препарата пектиназ, полученных из Aspergillus foetidus 379-К

Для использования ферментного препарата пектиназ необходимо знание его физико-химических свойств.

В связи с этим были проведены эксперименты по изучению влияния рН и температуры на стабильность ферментного препарата

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ферментный препарат стабилен в диапазоне рН от 4,0 до 5,0 (рис 10-13) и температуре до 50°С (рис 8,9)

Время,мин

Рисунок 7 - Влияние температуры и времени инкубирования на стабильность общей пектиназы

60 во

Время,мин

—•—30 с

—*—50 С -«-60С

Рисунок 8 - Влияние температуры и временит инкубирования на стабильность эндополигалакту роназы

120

-рН=3 -рН=4 -рН=5

Рисунок 9 - Влияние рН и времени инкубирования на стабильность общей псктиназы при температуре 30°С

1?0 -!

о X 100 I -н»-рН=3

о 80 • -*

9 60 ■ -•-рНМ

с 40

о ч X г» 20 0 -1-1-1-1-1- -*-рН=5

0 20 40 60 80 100 120

Время,мин

Рисунок 10- Влияние рН п времени инкубирования на стабильность эндополи!алакту роназы

Время,мин

-»-рН=3 -*-рН=4 -*-рН=5

Рисунок 11 - Влияние рН и длительности инкубирования на стабильность общей пектиназы при 50°С

40 60 ВО Время.мин

Рисунок 12-Влияние рН и длительности инкубирования на стабильность эндополигалактуроназы

2 2.7 Исследование эффективности действия ФП пектиназ на деструкцию клюквенного сырья при получении соков.

На следующем этапе работы был проведен ряд экспериментов, направленных на изучение влияния полученных препаратов на биоконверсию плодово-ягодного сырья (клюквы)

Таблица 10 - Результаты гидролиза клюквы ультракоицснтратом и спиртоосажденным препаратами, полученными из глубинной культуры А.ГоеЫиэ 379-К

Показатель Спиртоосаж-денный препарат Ультраконцентрат Контроль (без ФП)

% от контроля

Выход сока 120 110 100

Динамическая вязкость 49,5 49,8 100

Кисло гность в пересчете на лимонную 105,0 108,8 100

Содержание общих фенольных веществ 62,9 100 100

СВ 7,9 8,0 7,6

РВ 100 103,7 100

Содержание пектиновых вещее гв 81,8 82,6 100

Эффективное использование исследуемых пектолитических ферментных препаратов позволило (табл 10)

- увеличить выход сока-самотека на 10-20%,

- снизить вязкость соков на 45-50%,

- увеличить содержание органических кислот на 5-8%,

- увеличить содержание сухих веществ на 4-5%,

- улучшить органолептические показатели соков

Таким образом, показана возможность эффективного использования пектолишческих ферментных препаратов, выделенных из глубинной культуры А йеНЛ« 379-К, для гидролиза клюквы, при этом не только повышался выход сока, но и его качество

3 Выводы

1 Проведена сравнительная характеристика различных микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов и отобран в качестве исходного -

штамм Aspergillus foetidus -37. При селекции исходного штамма выделен активный штамм Aspergillus foetidus -37-4, биосинтетическая способность которого по отношению к экзопектиназам увеличена в 2 раза Исследованы физиолого-биохимические и морфологические признаки отобранного штамма, подобрана питательная среда, обеспечивающая повышение активности селекционированного штамма на 30%

2 Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов - продуцентов пектиназ

3 На основе многоступенчатой селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового мутантного штамма Aspergillus foetidus -379-К, биосинтетическая активность которого превышала исходный штамм на 200% Разработаны условия культивирования микромицета, обеспечивающие максимальный синтез полигалактуроназ (48 ч роста), пектинэстераз (96 ч роста) при оптимальной температуре роста 32°С, исходном рН среды 5,5

4 Исследованы физико-химические свойства ФП Пектофоетидин Г10Х и установлены оптимальные условия действия пектиназ (рН 4,0-5,0, температура 35-45°С) и условия обеспечивающие стабильность ферментных препаратов и сохранение уровня активности пектолитических ферментов в течение длительного времени (рН стабилыюсть-3,0-5,5, термостабильность 30-50°С)

5 Разработан способ и оптимальные параметры процесса получения концентрированных ферментных препаратов пектиназ Пектофоетидин Г10Х и Г18Х Установлено, что общая пектолитическая и полигалактуроназная активности препарата пектиназ Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе нового мутантного штамма в 1,3 раза превосходят активности известного препарата Пектофоетидин П10Х

6 Методом хроматографического фракционирования исследован ферментный комплекс, синтезируемый селекционированным микромицетом Показана его многокомпонентность и состав основных (полигалактуроназа, пектинэстераза, р-глюканазы) и минорных ферментов (ксиланаза, целлюлаза, кислая протеаза, псктинлиаза, арабиназа, галактоманнаназа,)

7 Проведены производственные испытания и показана эффективность полученного комплексного ферментного препарата пектиназ в производстве

соков н морсов

8 Экономическая эффективность от производства 1т ферментного препарата пектиназ по предложенной технологии составит до 1млн рублей в год

4 Практические предложения

На основании полученных в результате исследований материалов разработаны Технологическая инструкция по производству ферментного препарата Пектофоетидин Г10Х, а также Технические условия на ферментный препарат Пектофоетидин Г10Х (ТУ №9291-092-00334586-2008)

5 Список публикаций

1. Римарева Л В , Соколова Е.Н , Климачева Л М , [Двадцатова ЕА| Синтез пектиназы культурой А ГоеЫиэ МБ // Сб трудов научно-практической конференции «Наукоемкие и конкурентоспособные технологии продуктов питания со специальными свойствами» Углич ВНИИМС, 2003 г, с 389-390

2. Римарева Л В , Соколова Е.Н , Климачева Л М , [Двадцатова Е А | Изучение условий биосш1теза внеклеточной пектиназы в глубинной культуре А ГосМиэ И Хранение и переработка с/х сырья -2004г, №9, с 30-31

3 Соколова Е.Н, Римарева Л В Изучение физиологии питания микромицета А АэеМиз МБ, синтезирующего внеклеточную иектиназу // Храните и переработка с/х сырья - 2005г, №5 -с 39-40

4. Соколова Е Н , Климачева Л М , Двадцатова Е А ,1 Римарева Л В Разработка ускоренного микробиологического способа определения внеклеточной пектиназы, образуемой микромицетом А {ЪеШиз МБ // Хранение и переработка с/х сырья -2005г, №9, с 35-36

5 Соколова Е Н , Римарева Л В , [Двадцатова Е А [ Климачева ЛМ , Курбатова Е И, Семенова М В, Синицын А П Изучение физиолого-морфологических и биохимических свойств А АзеЫиз МБ-4 - продуцента пектолитических ферментов // Сб научных трудов под редакцией Полякова В А, Римаревой Л В « Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» М ВНИИПБТ, 2006г, с 6976

6. Соколова E.II, Курбатова ЕИ, Римарева JIB Исследование процесса биосинтеза пектолитических ферментов при глубинном культивировали A foetidus МБ-4 // Сб материалов XII Всероссийской научно-практическои конференции « Проблемы создания продуктов здорового питания Наука и технологии», Углич ВНИИМС, 2006г, с 241-242

1. Соколова Е Н, Римарева JIВ, Курбатова Е И Использование комплексного пектолитического ферментного препарата для деструкции плодово-ягодного сырья // Сб трудов Международной научно-практической конференции «Технологические и микробиологические проблемы консервирования и хранения плодов и овощей» к 100-летию В И Рогачева, ГНУ ВНИИКОП, 200 7г, с 276-279

8. Римарева JIВ, Курбатова Е И, Юскина О Н, Соколова Е Н , Климачева JIM Мультиэнзимная система для гидролиза биополимеров клеточной стенки дрожжей с целью получения белковых изолятов для пищевой промышленности // Сб материалов научно-практической конференции «Интеграция фундаментальных и прикладных исследований - основа развития современных аграрно-пищевых технологий», Углич, 2007г, с 287-290

9 Римарева JIВ , Соколова Е.Н , Климачева JI М, Курбатова Е И Селекция штаммов-продуцентов пектолитических ферментов для биотрансформации растительного сырья // Сб «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Материалы Международной научно-практической конференции 20-21 12 2007 Щелково-2007г,с 304-308

10 Римарева JIВ , Курбатова Е И, Юскина О Н, Соколова Е.Н , Климачева JI М Влияние различных ферментативных систем на процессы биокатализа полимеров клеточных стенок дрожжей с целью получения оптимальною мультиэнзимного комплекса для деструкции полимеров полимеров клеточных стенок // Сб научных трудов 4-го Международного научно-практического симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в пано- и биотехнологиях», Москва, 2008г, с 115-121

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация пектолитических ферментов

1.1.1 Пектинэстераза высших растений

1.1.2 Полигалактуроназа высших растений

1.2. Селекция и мутагенез микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов

1.3. Биосинтез пектолитических ферментов микроорганизмами

1.4. Продуценты пектолитических ферментов

1.5. Аспекты практического применения пектолитических ферментов

Глава П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы исследований 49 ^

2.1.1 Объекты исследований

2.1.2 Условия хранения посевного материала

2.1.3 Культивирование микроорганизмов

2.1.4 Влияние начального рН питательной среды

2.1.5 Влияние аэрации питательной среды на 50 активность пектолитических ферментов

2.1.6 Влияние возраста посевного материала

2.1.7 Получение концентрированных ферментных 51 препаратов

2.2. Методы определения активности ферментов

2.2.1 Определение общей пектолитической 51 активности

2.2.2 Определение эндо-полигалактуроназной 52 активности

2.2.3 Определение пектинэстеразной активности

2.2.4 Определение ксиланазной активности

2.2.5 Определение целлюлолитической активности

2.2.6 Определение (З-Глюканазной активности

2.2.7 Определение хитиназной активности

2.3 Методы биохимического анализа

2.3.1 Определение содержания растворимого белка по 54 методу Лоури

2.3.2 Определение термостабильности 54 пектолитических ферментов

2.3.3 Определение рН-стабильности пектолитических 55 ферментов

2.3.4 Структура исследований

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Сравнительная оценка микромицетов, ' синтезирующих пектолитические ферменты

3.1.2 Селекция штамма A.foetidus 37 с целью повышения его биосинтетической способности

3.1.2 Подбор условий для поддержания биохимической активности в посевной культуре

3.2. Разработка ускоренного микробиологического метода отбора активных вариантов

3.3. Физиолого - биохимическая характеристика отобранного варианта

3.3.1 Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пектолитичеких ферментов методом аддитивно-решетчатого описания объекта

3.4. Селекция и мутагенез родительского штамма

A.foetidus 37

3.4.1 Методика по ведению и хранению штамма

Aspergillus foetidus 379-K - продуцента пектолитических ферментов

3.4.1.1 Морфологическая характеристика продуцента 79 пектолитических ферментов

3.4.1.2 Описание процесса поддержания продуцента 80 пектолитических ферментов вактивном состоянии

3.4.1.3 Приготовление суспензии конидий Aspergillus 80 foetidus 379-K

3.4.1.4 Рассев суспензии конидий продуцента 81 пектолитических ферментов на агаризованную питательную среду в чашках Петри

3.4.1.5 Выращивание колоний микромицета Aspergillus 82 foetidus 379-К в чашках Петри и проверка активности в отобранных колониях

3.4.1.6 Рассев активных колоний на косяки с 82 агаризованной питательной средой и определение активности пектолитических ферментов в култьтуре микромицета Aspergillus foetidus 379-K

3.5. Исследование процессов биосинтеза экзопектиназ и состава ферментативного комплекса, продуцируемого грибом A.foetidus 379-К

3.5.1 Влияние начального рН на синтез 84 пектолитических ферментов

3.5.2 Влияние интенсивности аэрирования на 85 биосинтез пектиназ

3.5.3 Динамика накопления пектолитических 86 ферментов и изменение рН в процессе роста культуры

3.6. Получение комплексного ФП Пектофоетидин

Г10Х иГ18Х

3.6.1 Изучение условий получения ФП 90 Пектофоетидин Г10Х и Г18Х и их биохимичекая характеристика

3.6.2 Изучение фракционного состава ФП 92 Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе мутантного штамма Aspergillus foetidus 379-К

3.6.3 Сравнительная характеристика ФП 104 Пектофоетидин Г10Х и Пектофоетидин П10Х

3.6.4. Изучение рН и термостабильности ФП пектиназ

3.6.5. Исследование эффективности действия ФП 109 пектиназ на деструкцию клюквенного сырья при получении соков

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологии получения препарата пектиназ на основе селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K"

Актуальность темы. В настоящее время большое внимание уделяется пектиновым веществам, деполимеризация которых осуществляется ферментами, входящими в пектолитический комплекс: пектингидролазами и пектинлиазами. Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии: при; получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин; для получения пищевых красителей и таннинов; при обработке текстильных волокон; Потребность в этих ферментах стабильно растет.

Эффективность расщепления пектинсодержащих веществ зависит не только от применения биопрепаратов-источников активных пектолитических ферментов, но и от соотношения пектиназ различной специфичности и механизма действия в составе пектолитического комплекса; что: обусловлено физиологическими и культуральными особенностями; штамма-продуцента. Одним из основных источников получения пектолитических ферментов являются микромицеты, которые обладают характерной особенностью синтезировать широкий спектр активных внеклеточных пектиназ.

Работы многих исследователей посвящены созданию активных штаммов-продуцентов пектиназ и технологиям производства и применения ФП пектолитического действия (Бравова Г.Б.1981, Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. 1992, Синицын А.П., Семенова М.В.2003, Бутова С.Н.2004, Римарева Л.В., Курбатова Е.И.2004).

Ранее широкое применение в сокоморсовой? промышленности и виноделии имел ФП отечественного производства Пектофоетидин ПГОХ. В биотехнологии Пектофоетидина использовали гриб Aspergillus foetidus, культивируемый твердофазным методом. Однако, в настоящее время предприятия, основанные на поверхностном культивировании продуцентов-ферментов, отсутствуют.

На современном этапе перспективным направлением науки является создание с использованием генетических и селекционных методов нового высокоэффективного штамма-продуцента пектолитических ферментов для глубинного культивирования, с целью разработки научных основ ферментных технологий для перерабатывающих отраслей АПК. Применение отечественных биокатализаторов позволит не только интенсифицировать существующие биотехнологические процессы в пищевой промышленности и создать конкурентоспособную продукцию нового поколения с заданными свойствами, но и произвести импортозамещение, так как высокая цена биопрепаратов ограничивает их широкое применение в России.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы заключалась в скрининге активного штамма - продуцента внеклеточных пектиназ, подборе оптимальных условий его глубинного культивирования для получения ферментного комплексного препарата пектолитического действия.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- скрининг и селекция штаммов- продуцентов внеклеточных пектиназ;

- мутагенез селекционированного штамма для, повышения его биосинтетической способности; изучение физиолого-морфологических и биохимических особенностей отобранного продуцента;

- подбор оптимальных условий для получения ферментного препарата и исследование его биохимической характеристики; оценка эффективности применения препаратов для* биокатализа полисахаридов растительного сырья.

Научная новизна работы. Впервые методами селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового штамма Aspergillus foetidus 379-К -продуцента комплекса пектолитических ферментов и исследованы его культуральные и морфолого-биохимические признаки. На основе установленных физиологических особенностей селекционированного штамма подобраны условия, позволяющие продуцировать ферментативный комплекс с доминирующими ферментами пектолитического действия и сопутствующими — ксиланазой, целлюлазой, (3-глюканазой, хитиназой, маннаназой. Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов-продуцентов пектиназ. Получены, новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса, продуцируемого A.foetidus 379-К. Показана возможность регуляции биосинтеза отдельных ферментов комплекса штаммом A.foetidus 379-К путем изменения условий культивирования, (рН, температура, время культивирования). Получен новый ферментный препарат Пектофоетидин методом глубинного культивирования и исследована его биохимическая характеристика.

Практическая значимость работы. В результате изучения свойств, отселекционированного штамма разработана и экспериментально обоснована новая t технология ферментного препарата Пектофоетидин. Штамм ч ' г депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганимзмов под номером F-962. Разработаны паспорт на штамм Aspergillus foetidus 379-К, методика по ведению и хранению продуцента пектолитических ферментов, ТУ на ферментный препарат Пектофоетидин Г10Х и ТИ по получению ФП.

Проведены производственные испытания нового ФП на ОАО «Уржумский спирто-водочный завод» в технологии получения спиртованных соков.

Апробация работы. Основные положения представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Международных симпозиумах «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК (Москва, 2004); «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания. Наука и технологии» (Углич,2006);

Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях» (Москва,2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них статей- 7.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающегоисточника, из них /^/отечественных, JX иностранных. Работа изложена /SJ страницах машинописного текста, включает таблиц и j^/рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Соколова, Елена Николаевна

114 ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная характеристика различных микроорганизмов — продуцентов пектолитических ферментов и отобран в качестве исходного - штамм Aspergillus foetidus -37. При селекции исходного штамма выделен активный штамм Aspergillus foetidus -37-4, биосинтетическая способность которого по отношению к экзопектиназам увеличена в 2 раза. Исследованы физиолого-биохимические и морфологические признаки отобранного штамма, подобрана питательная среда, обеспечивающая повышение активности селекционированного штамма на 30%.

2. Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов — продуцентов пектиназ.

3. На основе многоступенчатой селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового мутантного штамма Aspergillus foetidus -379-К, биосинтетическая активность которого превышала исходный штамм на 200%. Разработаны условия культивирования микромицета, обеспечивающие максимальный синтез полигалактуроназ (48 ч роста), пектинэстераз (96 ч роста) при оптимальной температуре роста 32°С, исходном рН среды 5,5.

4. Исследованы физико-химические свойства ФП Пектофоетидин Г10Х и установлены оптимальные условия действия пектиназ (рН 4,0-5,0, температура 35-45°С) и условия обеспечивающие стабильность ферментных препаратов и сохранение уровня активности пектолитических ферментов в течение длительного времени (рН стабильность-3,0-5,5, термостабильность 30-50°С).

5. Разработан способ и оптимальные параметры процесса получения концентрированных ферментных препаратов пектиназ: Пектофоетидин Г10Х и Г18Х. Установлено, что общая пектолитическая и полигалактуроназная активности препарата пектиназ Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе нового мутантного штамма в 1,3 раза превосходят активности известного препарата Пектофоетидин П10Х.

6. Методом хроматографического фракционирования исследован ферментный комплекс, синтезируемый селекционированным микромицетом. Показана его многокомпонентность и состав основных (полигалактуроназа, пектинэстераза, р-глюканазы) и минорных ферментов (ксиланаза, целлюлаза, кислая протеаза, пектинлиаза, арабиназа, галактоманнаназа,).

7. Проведены производственные испытания и показана эффективность полученного комплексного ферментного препарата пектиназ в производстве соков и морсов.

8. Экономическая эффективность от производства 1т ферментного препарата пектиназ по предложенной технологии составит до 1млн.рублей в год.

116

3.7. Заключение

В результате проведенных исследований с применением методов селекции и мутагенеза был получен новый штамм - продуцент пектолитического комплекса ферментов Aspergillus foetidus 379-К.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-962.

На основе установленных закономерностей подобраны условия культивирования, обеспечивающие максимальный синтез пектолитических ферментов.

Разработаны оптимальные условия получения концентрированного ферментного препарата методом осаждения активного белка этанолом.

Анализ биохимического состава ферментного комплекса показал, что полученный препарат содержал помимо ферментов пектолитического комплекса, ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды, такие как целлюлаза, ксиланаза, хитиназа, р-глюканаза.

Сравнительные исследования биохимического состава препаратов Пектофоетидин П10Х и Пектофоетидин Г10Х показали преимущество нового ферментного препарата Пектофоетидин Г10Х.

Показана эффективность использования полученного ферментного препарата для деструкции клюквенного сырья.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Елена Николаевна, Москва

1. ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса

2. Алиханян С.И. Селекция промышленных микрорганизмов. // Издательство « Наука», Москва, 1968, 392с.

3. Айзенберг В.Л., Захарченко В.А., Сырчин С.А. и др. Отбор микромицетов по способности к образованию фермента пектинэстеразы. // Экспериментальная и клиническая медицина.- 1999, №2,- с.21-23.

4. Арасимович В.В., Балтага Н.П., Пономарева H.JI. Методы анализа пектиновых веществ, гемицеллюлаз и пектолитических ферментов в плодах. // Сб. Академии наук Молдавской ССР.- Кишинев.-1970 49с.

5. Астапович Н.И. Образование пектолитических ферментов грибом S.sclerotium и A.niger- 2 в условиях глубинного культивирования. // Автореферат диссертации кандидата биологических наук. 1970, - 21с.

6. Астапович Н.И., Кондратьева Л.В., Лобанок А.Г., Головнева Н.А., Маркина В.Л., Рябая Н.Е. Влияние глюкозы на образование эндометилполигалактуроназы у Aspergillus foetidus . // Прикладная биохимимя и микробиология.- 1981, XVII, выпуск 6, с.864-869.

7. Астапович Н.И. Рябая Н.Е. Полигалактуроназа Sacch.pastorianus: выделение и некоторые свойства. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997, - т.ЗЗ, № 3 - с. 287-291.

8. Астапович Н.И. Рябая Н.Е. Иннактивация полигалактуроназы в процессе роста дрожжей Sacch.pastorianus. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2000 г., т. 36, стр. 160-163.

9. Бабицкая В.Г., Грель М.В. Подбор питательной среды на основе молочной сыворотки для синтеза пектолититеских ферментов. // Москва.- 1987,с.321.

10. Бетяева Е.А. Пектин, его модификации и применение в пищевой промышленности. Обзорная информация. // Москва.-АгроНИИТЭИПП. 1992 г., 32с.11.«Биохимия растительного сырья», под редакцией В.Г.Щербакова, Москва, Колосс, 1999, 376с.

11. Блиева Р. К. Изучение биосинтеза пектинрасщепляющих ферментов при глубинном культивировании плесневых грибов из рода Aspergillus. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени канд. техн.наук. 1967 г., Алма-Ата.,25с.

12. Блиева Р.К. Белходжаева А.А. Преимущество культивирования иммобилизованной культуры Aspergillus awamori -16 по сравнению со свободным мицелием. //Биотехнология 1991 г. № 3, с. 62-65.

13. Бравова Г.Б., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н., Дуда В.И. и Купцова Г.Б. Технология культивирования анаэробных бактерий рода Clostridium продуцентов пектолитических ферментных препаратов. // Сб.трудов, вып. 2, 1974 г., с. 71- 77.

14. Бродская С.З. Влияние различных доз УФ на получение вариантов Aspergillus, образующих активные протеазы. // Сб.трудов института микробиологии АН СССР, вып. 10, 1961 г., с.14-17.

15. Буромский И.Д. Влияние Zn, Mg и К на обмен веществ у Asp.niger. // Микробиология, т.5, выпуск 6, 1936, с.800-811.

16. Бутова С.Н. Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья.// Москва, Издательство Россельхозакадемии, 2004, 319с.

17. Бутова С.Н. Разработка биотехнологических основ деградации отходов растительного сырья ферментами пектолитического комплекса. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биол.наук, Москва, 2005, 46с.

18. Бутова С.Н., Стребков В.Б., Лыско К.А. Использование дрожжевой полигалактуроназы при расщеплении пектина, полученного из отходоврастительного сырья. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2005, №5, с.3-4.

19. Васильева К.В. Гладких Г.А. Иванова JI.B. Давыдова М. А. и др. Пектолитические ферменты из Asp.niger. // «Биохимия хранения картофеля и овощей» Москва, Наука, 1990, с.77- 83.

20. Васильева К.В., Гладких Г.А., Умралина А.Р. Пектолитические ферменты фитопакогенных микроорганизмов: свойства и перспектива применения. // Сб. «Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции Кобулетти», 1986, с. 140.

21. Величко Б.А., Калунянц К.А., Чернова Г.А., Брунц И.А. Получение*препарата пектиназы различного комплекса при глубинном культивировании Aspergillus awamori -16. // Сб.трудов, Москва, 1974 с. 58-61.

22. Величко Б.А., Черкасова Г.В., Шутова JI.A., Полянская* Т.А. Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов. // Биотехнология, Москва, 1992,№-10.,с.22-25

23. Вербина Н.М., Цыцура О.И. Ускоренный метод отбора продуцентов пектолитических ферментов. // Микробиология, т. XXXVIII, № 2 , Москва, 1969,с. 372-375.

24. Вербина Н.М. Цыцура О.И. Пектолитическая активность некоторых грибов. // Микробиология, т. XXXVIII, № 1, Москва, 1969, с. 29-35.

25. Витол И.С. Кобелева И.Б., Траубенберг С.Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. // Москва, Издательский комплекс МГУПП, 2000, 36с.

26. Возняковская Ю.М. Аврова Н.П. Анроникашвили Е.Д. Размножение и синтез пектолитических ферментов Clostridium felsineum на средах с разными источниками углерода.// Микробиология, т.ХЫИ, вып. 6, Москва, 1974, с.423.

27. Галатенко О.А., Терехова Л.П., Булина Т.И. Метод быстрого поиска актиномицетов — продуцентов антибиотиков, и эффективных в отношении метициллинрезистентного штамма Staphylococcus arreus.// Биотехнология, № 4 ,Москва, 2004, с. 17-23.

28. Гладких Т.А., Васильева К.В., Метлицкий Г.В. // Прикладная биохимия и микробиология, т. XIV, № 6,1978, с. 833-848.

29. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. // Москва, ДеЛи принт, 2001, 123с.

30. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. // Москва, Издательство «Элевар» 2000, 512с.

31. Грачева И.М., Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Решстан Г.И., Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. // Москва, Издательство «Элевар», 2003, 534с.

32. Грачева И.М., Покровская С.С., Нгуен Ла Ай, Бутова С.Н. Изучение и оптимизация условий культивирования, обеспечивающих максимальный уровень биосинтеза полигалактуроназы дрожжами. // Москва, ВИНИТИ, 1994, Юс.

33. Гребешова Р.Н. Способы стабилизации ферментных препаратов. // Москва Прикладная биохимия и микробиология. 1994, № 2, с. 196-203.

34. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, р-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. // Диссертация на соискание степени канд.хим.наук, МГУ, Москва, 2004, 177с.

35. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьев Е.Г., Синицын А.П. Бискозиметрический метод определения общей эндополимеразной активности пектиназ. // Москва, Биохимия, 2002 т. 67 № 6 с. 815-822.

36. Дадашев М.Н., Вагидов Я.А., Шихнебиев Д.А., Балиева Ж.С. Перспективы производства и применения пектиновых веществ. // Хранение и переработка с/х сырья, №9,2000,с.46-50.

37. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. // Пер. с англ., Москва, 1982, т.1-3, 935с.

38. Донченко JI.B. Технология пектина и пектинопродуктов. // Москва,ДеЛи, 2000, 256с.

39. Ежова А.Ю.,Шишкова Э.А.,Бравова Г.Б.,Нестеренко Е.А. Свойства пектолитических лиаз Bacillus macerans. // Биотехнология, 2002,№2,с.20-29.

40. Ермолицкий В.Н. Кислая протеиназа Aspergillus foetidus, регуляция биосинтеза и свойства. // Автореферат диссертации на соискание уч.степени кандидата биологических наук, Минск, 1989,23с.

41. Имшенецкий А.А., Ульянова О.М. Биохимическая активность мутантов Fusarium moniliforme Scheld. //Микробиология ,31,вып.5,1962, с.832.

42. Калашникова Н.А., Гребешова Р.Н., Купцова Г.Б., Киселева JI.B. и др. Обработка плодово-ягодного сырья композициями ферментных препаратов. // Консервная и овощесушильная прмышленность, 1982,№8,с. 1 -3.

43. Калунянц К.А.,Величко Б.А.,Чернова Г.А. Получение пектолитическихк ,ферментных препаратов в опытно-промышленных условиях. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.270-278.

44. Калунянц К.А., Величко Б.А., Брунс И.А., Малей С.М. Получение препаратов пектиназы различного комплекса при глубинном культивировании Aspergillus awamori —16. // Сб.трудов, вып.2, Москва, 1974,с.62-64.

45. Капитонова JI.C., Родионова Н.А., Фениксова Р.В. Пектолитические ферменты Clostridium felsineum. // Прикладная биохимия и микробиология, т.VIII, вып.5,1972,с.539-546.

46. Касаткина И.Д., Желтова Е.Г. О методах отбора мутантов Aspergillus niger с измененной способностью синтезировать органические кислоты. //Микробиология,т.ХХХ1У,вып.З,1965,с.511-517.

47. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. // Москва, Мир, 1990, 350с.

48. Кислухина О.В: Ферменты в производстве пищи и кормов. // ДеЛи принт, Москва,2002,336с.

49. Коваленко А.В., Безусов А.Т. Новый пектолитический препарат. // Пищевая промышленность, 1996,№12,с.35-36.

50. Кречетникова А.Н. Разработка технологии ферментного препарата целлюлазно-пектиназного1 комплекса. // Автореферат на соисканиеь учхтепени кандидата технических наук. Москва, 1987, 24с.

51. Кувикова А.Ф. Применение пектолитических ферментных препаратов в винодельческой, промышленности. // Сборник материалов Всесоюзного совещания по- вопросам технологии и химии пектина. Москва, 1962,ГОСИНТИ, с.З.

52. Курбатова Е.И., Соколова* Е.Н., Римарева- Л.В. Использование препаратов, полученных из глубинной культуры A.foetidus МБ-4, для гидролиза клюквы. // Производство спирта и ликеро-водочных изделий, №3, 2005, с. 13-14.

53. Кюдулас И., Авиженис В. Новые ферментные препараты» для-, производства соков* и вин. // Сборник трудов II Международной-конференции « Качество,безопасность и экология пищевых продуктов' и производство», Ялта, 2001', с.202-203.

54. Лебедев BIB.', Астапович Н.И., Датунашвили Е.Н., Герхикова В.Г. Влияние различных источников азотного и фосфорного' питания нанакопление внеклеточной эндополигалактуроназы дрожжей Z.marxiana. // Вести АН, Москва, 1985, с.57-59.

55. Лисицын А.Б., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методы практической биотехнологии. // Москва, Издательство ВНИИМП, 2002, 408с.

56. Лифшиц Д.Б., Сергиенко М.Г., Кафтанова Л.Е., Равдина О.Ю. К вопросу вискозиметрического определения эндополигалактуроназной активности ферментных препаратов. // Сб.трудов, выпуск 2, Москва, 1974,с.29-39.

57. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Влияние компонентов птательной среды на конститутивный синтез пектолитических ферментов Penicillium digitatum. // Микология и фитопатология, т.13, выпуск 3,1979,с.213-216.

58. Лобанок А.Г., Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. Кинетика конститутивного синтеза полиметилгалактуроназ Penicillium digitatum в зависимости от источника углерода и рН. // Микробилогия , t.XVI, выпуск 5, с.920-925.

59. Лосякова Л.С., Мушникова Л.Н., Мишина З.Н. Исследование образования пектолитических ферментов при культивировании плесневого гриба A.awamori 16. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.75-87.

60. Лосякова Л.С., Руденко Т.П., Струнникова Т.Р., Синякина А.А. Изучение условий биосинтеза пектолитических ферментов плесневым грибом A.foetidus. // Сб.трудов « Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.88-93.

61. Лосякова Л.С., Струнникова Т.Р. Влияние различных источников азота на биосинтез пектолитических ферментов при культивировании плесневого гриба A.foetidus на твердых питательных средах. // Сб.трудов, выпуск 2, Москва, 1974, с.97-100.

62. Маркина М.Н., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома. // International Congress Biotechnology, Москва, 2002, 379с.

63. Маркина М.Н., Румянцева Г.Н., Птичкина Н.М. Использование отечественных ферментных препаратов для получения пектина из жома тыквы. // Хранение и переработка сельхозсырья, №6, 2002.С.48-52.

64. Мартисян Е.А., Жуков Н.А. Оптимизация стадии ферментативной обработки плодово-ягодного сырья при получении спиртованных соков.// Всероссийская научно-техническая конференция «Наука-производство-технология-экология» том 2, КФ, БФ, Киров, 2005,с.194

65. Махмуд С.А.З., Машхур В.А., Эль-Хаддад М.Е., Эль-Гаммал С.Е. Влияние состава среды и условий культивирования A.foetidus на биосинтез глюкоамилазы. // Микробиология, t.XLVII, выпуск 2, 1978, с.220-225.

66. Миндлин С.З. Роль индуцированных мутаций в селекции промышленных микроорганизмов. // Сб. « Генетика и селекция микроорганизмов», Москва, Наука, 1964, с.265.

67. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Образование внеклеточных пектинлиазных комплексов грибами рода Penicilium. // Микология и фитопатология, т.26, вып.4,1992,с.273-278.

68. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Биологические науки, №4, с. 107-113.

69. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Катаболитная репрессия конститутивного синтеза пектинтрансэлиминазы у Pen.digitatum. // Микробиология, т.52, вып.2,1983, с.197-201.

70. Михайлова Р.В. Закономерности биосинтеза пектолитических ферментов A.alliaceus и Pen.digitatum. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биологических наук, Минск, 1981, 23с.

71. Михайлова Р.В. Пектиндеполимеразы грибов: особенности регуляции биосинтеза, свойства и применение. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биологических наук, Минск, 1995, 35с.

72. Михайлова Р.В. Биотехнология микробных ферментов. // Наука и техника, Минск,1989,с.5-33.

73. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Получение пектингидролазного ферментного препарата из A.alliaceus. // Ферменты микроорганизмов, ч.1, Москва, 1989, с. 169-174.

74. Михайлова Р.В., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г. Регуляция образования ферментов пектингидролазного комплекса A.alliaceus. // Прикладная биохимия и микробиология, №2, 1992, с.249-255.

75. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И., Шиманец С.С., Селиванова Н.Ю. Конститутивный и индуцированный синтез экзогидролаз микромицетами. // Биологические науки, №4, 1990, с. 107113.

76. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И. Изучение полигалактуроназ, секретируемых грибом A.alliaceus в условиях репрессии синтеза. // Доклады АН БССР, т.35, №6, 1991, с. 545-548.

77. Моисеенко Н.В. Условия определения пектолитической активности ферментных препаратов. // Известия вузов. Пищевая технология, 1965, №4, с.150-153.

78. Морозова К.А. Разработка биотехнологии препаратов кислых протеаз на основе высокоактивного мутантного штамма Aspergillus oryzae 107 для использования в производстве спирта. // Автореферат на соискание уч.степени канд.техн.наук, Москва, 2006, 28с.

79. Мошкин А.Г.Современное состояние российского биотехнологического рынка, основные тенденции развития. // Биотехнология и бизнес. II Международная конференция, Москва, 2002, с.13-14.

80. Нгуен JIa Ань. Полигалактуроназа дрожжей и ее применение. // Автореферат на соискание уч.степени доктора биол.наук., Москва, МГАПП, 1992, 101с.

81. Павлова Н.М., Зуева Р.В., Шахова Т.В. Влияние состава питательной среды на биосинтез пектиназ мутантом A.foetidus — М-45. // ВНИИ биотехника, Москва, 1978.,с.45-48

82. Павлова Н.М. Физиолого-морфологические особенности A.foetidus -М-45 — продуцента пектолитических ферментов. // ВНИИ биотехника, Москва, 1980.,с.15-17.

83. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. // Справочник, Москва, ДеЛи принт, 2003, 372с.

84. Поляков В.А., Римарева JI.B. Перспективные ферментные препараты и особенности их применения в спиртовой промышленности. // Пиво и напитки, №2, 2000, с.52-55.

85. Пономарева Н.П. К определению пектиновых веществ на основе реакции галактуроновой кислоты с карбазолом. // Сб. Методы анализа пектиновых веществ, гемицеллюлаз и пектолитических ферментов в плодах, Кишинев, 1970, с. 109-112.

86. Растительный белок: новые перспективы. // Под ред. Е.Е.Браудо, Москва, Пищепромиздат, 2000, 179с.

87. Рейд В.В. Производство и применение ферментных препаратов в пищевой промышленности. // Сб. Пищепромиздат, Москва, 1963,с.35.

88. Родионова Н.А., Безбородов A.M. О локализации системферментов, катализирующих расщепление полисахаридоврастительных клеточных стенок у высших растений. Пектиназы.

89. Обзор. // Прикладная биохимия и микробиология, №5, 1997, с.467-487.k f

90. Рохленко С.Г., Калунянц К.А., Гребешова Р.Н., Кишковский З.Н.

91. Получение плодово-ягодных вин с помощью пектолитических ферментных препаратов. // Сб.трудов «Ферменты и применение в н/х», Москва, 1972, с.284-293.

92. Рухлядева' А.П., Корчагина Г.Т. Определение активности пектолитических ферментов. // Прикладная биохимия и микробиология, №6, 1973, с.922-927.

93. Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. // Легкая и пищевая промышленность, Москва, 1981, 288с.

94. Рябая Н.Е. Полигалактуроназа дрожжей Saccharomyces pactorianum: образование и свойства. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биол.наук., Институт микробиологии АН Белоруссии, Минск, 1994, 121с.

95. Салманова Л.С., Филонова Т.Л., Соболевская Т.Н. Применение ферментативного гидролиза в производстве плодово-ягодных, овощных соков и экстрактов из растительного сырья. // Хранение и переработка с/х сырья, №2, 1995, с.38-44.

96. Самылина В.А., Садовой В.В. Влияние технологических факторов на процесс гелеобразования комплекса альгинат/пектин. // Вестник РАСХН, №1, 2005, с.79-80.

97. Сапожникова Е.В. Пектиновые вещества и пектолитические ферменты. //Биологическая химия, 1970, №5, ВИНИТИ, Москва, с.8

98. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Изучение пектинлиазных комплексов Pen.adametzii, Pen.citrium, Pen.janthinellium. // Микология и фитопатология, т.28, 1994.С.122-126.

99. Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Михайлова Р.В. Условия синтеза пектиназ и протеаз грибом A.alliaceus и получение комплексного препарата мацерирующего действия. // Прикладная биохимия и микробиология, т.ЗЗ, №3, 1997, с.292-295.

100. Сапунова Л.И. Пектингидролазы A.alliaceus: биосинтез, свойства и применение. // Автореферат на соискание уч.степени кандидата биол.наук., Минск, 1990, 23с.

101. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Получение пектингидролазного ферментного препарата из A.alliaceus. // Ферменты микроорганизмов, ч.1, Москва, 1989, с. 169-174.

102. Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Казакевич И.О., Евтушенков А.Н. Чашечный метод скрининга микроорганизмов- продуцентов ксилозоизомеразы. // Микробиология, т.73, №1, 2004, с.126-132.

103. Саттарова Р.К., Ташпулатов Ж.И. и др. Образование целлюлолитических и пектолитических ферментов в зависимости от условий культивирования Xanthomonas malvacearum. // Микробиология, t.XLI, вып.6, 1972, с.413.

104. Семенова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба A.japonicus. // Биохимия, т.68, №5, 2003, с.686-697.

105. Сергеева Н.В., Десятник А.А. Влияние концентрации пектина на рост гриба Rhizopus arrhizus и образование пектолитических ферментов. // Кишинев, Штиница, 1975, с.22-27.

106. Сергиенко JI.T., Евтихов П.Н., Равдина О.Ю. Сравнение методов определения пектолитической активности ферментных препаратов и культур плесневых грибов. // Сб. трудов « Ферменты и применение в н/х», №1, 1972, с.48-52.

107. Силищенская О.М., Гендина С.Б. Селекция микроорганизмов спиртовой и ферментной промышленности. // Сб. трудов Всесоюзного научно-исследовательского института спиртовой и ферментной промышленности, вып. 18, Москва, Пищевая промышленность, 1967.с.32-35.

108. Силищенская О.М., Бумманова Н.Ф. Селекция плесневых грибов — активных продуцентов пектиназы. // Сб. трудов, вып.ХГХ, Москва, Пищевая промышленность, 1970.С.12-16.

109. Смирнов В.И., Шихмантер Э.Е., Чубова В.П. // Сб. Использование микроорганизмов в народном хозяйстве, вып.2,Кишинев, 1965,с.ЗЗ.

110. Снегирева С.Г. Влияние условий культивирования Sclerotinia sclerotiorum на биосинтез отдельных пектолитических ферментов. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени кандидата биол.наук, Минск, 1974, 20с.

111. Сонина Е.Г. Совершенствование технологии производства виноградного сока и виноматериалов на основе использования пектолитических ферментов дрожжей. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени кандидата техн.наук, Ялта, 1990, 23с.

112. Супонина Г.А., Кочнева С.В. и др. Получение порошкообразного пищевого красителя из выжимок черной смородины. // Известия вузов « Пищевая технология», №2,3, с.47-48.

113. Тананайко Т.М., Алексанян К.А., Ткачук JI.A. Использование новых ферментных препаратов в плодово-ягодном виноделии. // Сб. трудов « Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК», Москва, 2006,с.229-234.

114. Тищенко В.П., Сапожникова Е.В. Качественная характеристика пектиновых веществ разных растений. // Прикладная биохимия и микробиология, т.VIII, вып.5, 1972, с.586-591.

115. Траубенберг С.Е., Андреева М.А., Куликова JI.C., Величко Б.А. Зависимость синтеза пектолитического комплекса ферментов от предварительной тепловой обработки посевного материала. // Ферментная и спиртовая промышленность, №1, 1983, с.34-36.

116. Тюрина С.С. Исследование пектолитических ферментов-виноградной лозы. // Автореферат дисс. на; соискание уч.степени кандидата биол.наук, Ялта, 1997,25с.

117. Херсонова JI.A. Исследование процесса образования пектолитических ферментов при глубинном культивировании A.niger. // Автореферат дисс. на соискание уч.степени канд.техн.наук, Москва, 1965, 20с.

118. Adisa V.A. Pectic enzymes of Aspergillus aculeatus associated with post-harvest deterioration of citrus sinensis fruit. // J. Food Biochemical 13, 1989, p.243-252.

119. Antier P., Minjares A., Roussos S., Viniegra-Gonzales G. New approach for selecting pectinases producing mutants of Aspergillus niger well adapted to solid state fermentation. // Biotechnology Adv., 1993, 11, p.429-440.

120. Arguelles M.E.A., Rojas M.G., Gonzales G.V., Torres E.F. Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus nigerin submerged and solid-state fermentation. // Appl. Microbiol. Biotech.43, 1995, p.808-814.

121. Barras F., van Gysegem F., Chatterjee A.K. Extracellular enzymes and pathogenesis of soft rot Erwinia. // Annu Rev. Phytopathol., 1994, 32, p.221-234.

122. Cavalito S.F., Areas J.A., Hours R.A. Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. // Biotechnology Lett., 1996, 18, p.251-256.

123. Colangelo J., Licon V., Benen J., Visser J., Bergmann C., Orlando R. Characterization of the glycosilation of recombinant endopolygalacturonase I from Aspergillus niger. // Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, p.1448-1453.

124. Collmer A., Reid J. Assay methods for pectin enzymes. In: Purish D.L. Methods in engymology. // Academic Press, 1998, part B, p.329-355.

125. Draginja M., Antov M. Microbial polygalacturonases: a rewiew pectin. // Novi Swad. Fac. J. Technology, 1999, №30, p. 115-163.

126. El-Sawah., M.M.A. and T.S.M.Shady. Evaluation of Penicillum citrinum pectinase enzymes with special reference to production and characterization 2nd. // Int. Conf. Of Pest Control, Mansoura, Egypt, Sept., 1999, p.435-444.

127. Effect of additions on kinetic thermal stability of polygalacturonase from Aspergillus carbonarisis: mechanism of stabilization by sucrose. // J. Agr.Food Chem., 1998, vol. 46, № 9, p.3540-3545.

128. Fonseca, M.J.V. and S. Said. The pectinase produced by Tubercularia vulgaris in submerged culture using pectin or orange-pulp pellets as inducer. // Appl. Microbiol. Biotech. 42, 1994, p.32-35.

129. Gullion F., Thibault J.- F. Enzymatic hydrolysis of the "hairy" fragments of sugarbeet pectins. // Carbohydr.Res., 1989, 190, p.97-108.

130. Heinrichova K. Purification and practical characterization of endo- D-galacturonase from Aspergillus foetidus. // Biol., 1985, vol.4, № 12, p.l 1191120.

131. Kassem M.M., El-Sawah M.M.A., Selim A.E.I., Samia M.Bayoumy. Pectinolytic enzymes of Rhizoctonia solani. // J. Agric. Sci. Mansoura Univ. 17, 1992, p.502-508.

132. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of polygalacturonases produced by the hyphal fungus Aspergillus niger. // BiotechnoLAppl.Biochem., 1990, 12, p.150-160.

133. Kojima Y., Sakamoto Т., Kishida M., Sakai Т., Kawasaki H. Acidic conditioninducible polygalacturonase of Aspergillus kawachii. // J. of Mol.Catalysis B: Ensym.,1999, 6, p.351-357.

134. Maldonado M.C., de Saad A.M. Production of pectinesterase andpolygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentations. // J. Industrial Microbiologial Biotechnology., 1998, 20, p.34-38.

135. Marcovic O., Jarosova A., Machova E., Slezaric A. Effect of oligomeric and polymeric D-galacturonans on the activity of pectinesterase from tomato, Aspergillus foetidus and Trichoderma reesei. Biologia, Bratislava, 1996, 51, p.293-297.

136. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 1990, 2, p.415.

137. Naidu G.S.N., Panda T. Production of pectolytic enzymes a review. // Bioprocess Engineering, 1998, 19, p.355-361.

138. Parenicova L. Pectinases of Aspergillus niger: a molecular and biochemical characterization. PhD thesis, The Wageningen Agricultural University, Wageningen, 2000.

139. Pitt D.In: Punch D.L. Methods in enzymology. I I Academic Press, 1988,161, part B, p.353.

140. Pickersgill R., Smith D., Worboys K., Jenkins J. Crystal structure of polygalacturonase from Erwinia carotovora spp. Carotovora. // J. Biol.Chem., 1998, 273, p.24660-24664.

141. Rao M.N., Kembhavi A.A., Pant A. Implication of tryptofan and histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. // BBA, 1996, 1296, p.167-173.

142. Rexova-Benkova L., Mrackova M. Active groups of extracellular endo-D- polygalacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. //Biochem. Biophys. Acta, 1978, 523, p.162-169.

143. Sakai Т., Sakamoto Т., Hallaert J., Vandamme E.J. Pectin pectinases, and protopectinases: production, properties, and applications. // Adv. Appl.Microbiol., 1993, 39, p.213-294.

144. Shady T.S.M., Rabie M.M., Mansour S.M. Production of pectinoliticienzymes by Aspergillus foetidus in solid-state fermentation and its uses for apple juice clarification. // Annals Agric. Sci., Ain Shams Univ., Cairo, 46(1), 2001, p.35-50.

145. Schejter A., Marcus L. In: Purich D.L. Methods in enzymology. // Academic Press, 1988, 161, part B, p.366.

146. Versteeg C. Pectinesterases from the orange fruit their purification, general characteristics and juice cloud destabilizing properties. // PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, 1979.

147. Whitaker J.R. Microbial pectolytic enzymes. In: Fogarty W.M., Kelly C.T. Microbial Enzymes and Biotechnology. // Elsivier Applied Science, London & New York, 1991, p.133-175.

148. Will F., Baukhage K., Dietrich H. Apple pomance liguefication with pectinases and cellulases- analytical data of the corresponding juices. // Eur. Food Res. And Technol., 2000, 211, p.291-297.