Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ АЗОСПИРИЛЛ - СТРУКТУРА, УЧАСТИЕ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КОРНЯМИ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ АЗОСПИРИЛЛ - СТРУКТУРА, УЧАСТИЕ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КОРНЯМИ ПШЕНИЦЫ"



На правах рукописи

ФЕДОНЕ1ГКО Юлке Петровна

ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ АЗОСПИРИЛЛ - СТРУКТУРА, УЧАСТИЕ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КОРНЯМИ ПШЕНИЦЫ

03.00.07 - микробиология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2003

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Игнатов В.В.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Коиновя С.Л.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тараненко Т.М. кандидат биологических наук, доцент Мельников Г.В.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург

Защита состоится « 4 » июня 2001" вета Д002.146.01 при Институт* гангомов Российской академии

^ ч» заседании диса того со-

■ раы- шкроор->в, 13).

С диссертацией можно ознахоь* ОН.

Автореферат разослан « 3 » м.

Ученый секретарь диссертаг -га А

доктор биологических наук а В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активные исследования диазотрофных микроорганизмов AzospiriUum spp. были начаты в рамках прикладного направления микробиологии, посвященного поиску и использованию биологических агентов, способных положительно влиять на урожайность растений (Лукин с соавт., 1987). Азоспириллы относятся к группе ризобактерий, стимулирующих рост растений благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Okon and Vanderleyden, 1997).

Одной из ключевых задач в решении комплекса проблем, связанных с использованием азотфиксацни для повышения производительности сельскохозяйственно-значимых растений, остается выявление молекулярных основ контактных взаимодействий ассоциативных бактерий с растениями. При изучении механизма, определяющего такие взаимодействия, особое внимание привлекают данные, касающиеся структуры и функций компонентов клеточной поверхности микроорганизмов, которым отводится существенная роль в формировании ассоциаций.

Исследования экстраклеточных полисах ар идсодержащих биополимеров бактерий рода AzospiriUum ведутся достаточно активно (Del Gallo et al, 1989; Michiels et al, 1990; Konnova et al, 1994). Предполагают, что в адсорбции микроорганизмов на корнях растений принимают участие как белковые, так и полисахаридные компоненты бактериальной поверхности (Croes et al., 1993; Michiels et al, 1991; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Было показано, что различные изменения поверхности азоспирилл, в частности, связанные с возрастом культуры, а также удаление капсульных материалов, сказываются на способности микроорганизмов прикрепляться к корням тлен ицы (Егоренкоаа с соавт., 2000).

Морфологические изменения в растительной корневой системе при контакте с бактериями являются одним из признаков, характеризующих начальный этап бактериальной инфекции. Они могут реализоваться посредством различных. поверхностных соединений бактериальных клеток или веществ, экскретируемых бактериями в окружающую среду. Способность азоспирилл индуцировать различные деформации корневых волосков пшеницы (Jain and Patriquin, 1985) связывают с активной продукцией фитогормонов (Dobbelaere et al, 1999) и пектолшических ферментов (Tien et al., 1981). Также выявлено, что полисахар ид содержащие внеклеточные комплексы азоспирилл способны вызывать аналогичные изменения корневых волосков пшеницы (Коннова с соавт., 1995,1999).

Липополисахариды (ЛПС) играют важную роль в реализации снмбиошческих и патогенных взаимоотношений бактерий с растениями (Leroug and Vanderleyden, 2001; Newman étal., 2001). Данные об участии ЛПС в растительно-микробных ассоциациях, представленные в литературе, остаются достаточно разрозненными и ггрпгиипр^имкы^и с соавт., 1989;

Matora et ai., 1995). Основная ц^цг^^^д^едовани í ЛПС азоспирилл ведется

.научной литературы

Snœiïw

преимущественно иммунохимическими методами (Matera et al, 2001; Матора, Щеголев, 2002). Трудность исследований функций ЛПС обусловлена сложностью химической структуры данных биополимеров и достаточно сложной природой их воздействия на растения. Знание детального строения ЛПС, обуславливающего его свойства, делает возможным понимание индукции и развития биологического действия ЛПС и его функционирования на молекулярном уровне. Структура повторяющегося звена О-специфического полисахарида (О-ПС) определена только для одного штамма азоспирилл, принадлежащего к виду A, lipoferum (Chôma et al., 1992). Таким образом, выделение и изучение индивидуальных препаратов бактериальных 0-полисахарадов является актуальным как для таксономических исследований, так и для выяснения их роли в процессах взаимодействия с корнями растений.

Цель н задачи исследования. Основной целью настоящей работа было выявление участия липополисахаридов азоспирилл в процессах взаимодействия с корнями пшеницы и характеристика особенностей структуры ■ О-специфических полисахаридов внешней мембраны бактерий.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

■ Отработать методы выделения ЛПС из внешней мембраны бактерий А. brasiïense и A. irakense, получить очищенные препараты ЛПС и провести анализ их химического состава.

■ Исследовать активность ЛПС A. brasiïense в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы.

" Провести сравнительное исследование способности к адсорбции на корнях проростков пшеницы бактерий A. brasiïense Sp245 и КМ252 - омегон-Km мутанта этого штамма, дефектного по ЛПС. " Провести сравнительное исследование первичной структуры повторяющихся звеньев О-полисахаридов бактерий A. brasiïense Sp245, КМ018, КМ252.

" Выполнить анализ структуры повторяющегося звена О-специфических полисахаридов, полученных традиционным методом и методом прямой экстракции бескапсулъных клеток A. irakense КВС1.

Научная новизна работы. Продемонстрировано участие ЛПС в процессе колонизации азоспириллами корней ' пшеницы при исследовании адсорбционной способности бактерий штамма Л. brasiïense Sp245 и его омегон-Кт мутантов, дефектных по структуре ЛПС. Впервые показана активность ЛПС азоспирилл в отношении морфологии корневых волосков проростков пшеницы.

Впервые в ходе данной работы было установлено строение повторяющихся звеньев О-ПС A, irakense КВС1 и A. brasiïense Sp245. Показано, что О-ПС бактерий A. brasiïense Sp245, КМ018, КМ252 характеризуются регулярностью строения, имеют идентичную первичную структуру повторяющихся пенгасахаридных звеньев и являются гомополимерами D-рамнозы (Rha).

Научно-практичесюяя значимость. Исследование ЛПС бактерий Azospirillum spp. вносит существенный вклад в понимание процессов формирования растительно-микробных ассоциаций. Полученные нами

приоритетные данные о первичной структуре О-полишхаридов А. Ъгахйете и А. ¡гакете могут быть использованы для внутривидовых классификаций азоспирнлл в качестве хемоти пических признаков, а также при установлении филогенетического родства с другими бактериальными таксонами.

Адаптированная для азоспирнлл методика выделения О-ПС с поверхности целых клеток позволяет снизить трудоемкость и продолжительность процесса получения бактериальных О-ПС.

Были разработаны «Методические рекомендации по выделению гомогенных препаратов липополисахаридов из наружной мембраны грамотрщательных микроорганизмов», рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым Советом биологического факультета С ГУ (протокол № 4 от 21 декабря 2000). Кроме того, разработаны методические рекомендации «Получение бескапсульных клеток азоспирнлл», которые были одобрены Ученым Советом ИБФРМ РАН и утверждены директором института (протокол № 2 от 23 января 2002).

Полученные препараты ЛПС и О-ПС А. ЬгахПепяе применяются при проведении плановых.НИР сотрудниками лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории биохимии, лаборатории биохимии растительно-бактериальных симбиозов и лаборатории структурных методов исследований ИБФРМ РАН.

Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых ■ и дипломных работ студентами биологического а химического факультетов СГУ.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 9-м Международном конгрессе по растительно-микробным взаимодействиям (Амстердам, Голландия, 1999 г.), на 6-ом съезде общества физиологов растений России {Москва, Россия, 1999 г.), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, Россия, 2000 г.), на 4-й Европейской конференции по азотфиксации (Севилья, Испания, 2000 г.), на 13-й Интернациональной конференции по азотфиксации (Гамильтон, Канада, 2001 г.), на молодежной конференции «Стратегия,. взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2002 г.), на 2-й германско-польско-российской конференции «Бактериальные полисахариды» (Москва, Россия, 2002 г.). Доклад «Влияние изменений структуры ЛПС АгозртИит ЬгаяИете на биологическую активность в растктельно-микробных взаимодействиях», представленный на 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, Россия, 2002 г.), был удостоен диплома первой степени.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН 17 декабря 2002 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ в зарубежных и отечественных научных изданиях.

Основные положения диссертации, выносимые ва защиту. ■ Изменение структуры липополисахаридов у мутантных штаммов азоспирнлл

приводит к снижению биологической активности бактерий в отношении

корней проростков пшеницы. * Липополисахариды Azospirillum spp. способны вызывать изменения морфологии корневых волосков проростков пшеницы.

■ О-специфический полисахарид Azospirillum brasilense Sp245 является линейным D-рамнаном с пентасахаридным повторяющимся звеном.

■ О-специфическиЙ полисахарид A. irakense КВС1 является регулярным гетеро полимером с разветвленным гексасахаридным повторяющимся звеном, состоящим из остатков рамнозы, галактозы и маннозы.

■ ■ Адаптированный для азоспирилл метод прямой экстракции О-

специфических полисахаридов является более эффективным благодаря снижению трудоемкости процесса выделения и увеличению выхода полисахарида.

Объем и структура диссертации, Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 228 источников, в том числе - 189 зарубежных. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка и б таблиц.

Данная работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой НИР "Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов" (№ гос. per. 01890057691, научный руководитель — засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований в 2001 г. «Лкпополисахарид и О-специфический полисахарид бактерий Azospirillum , brasilense Sp245: их структура и активность во взаимодействии с корнями пшеницы» № 01-04-49237, в 2002-2003 гг. «Структура липополисахаридов и О-специфических полисахаридов бактерий рода -Azospirillum» № 02-04-48224, а также грантами РФФИ MAC № 02-0406956 в 2002 г. и № 03-04-06598 в 2003 г.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы н методы исследования

Бактериальные культуры. В работе были использованы бактерии А. brasilense Sp245, выделенные из поверхностно стерилизованных корней пшеницы (Baldani et ai,1983) и любезно предоставленные доктором Доберейнер {Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria, Rio de Janeiro, Бразилия). Мутанты этого штамма A. brasilense КМ252 и КМ018 с инсерцией омегон-Км в плазмиде 120-мДа были получены в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН Е.И. Кацы (Katzy et al, 1998). Бактерии А. irakeme КВС1 были выделены из прикорневой зоны риса в субтропическом поясе Ирака (Khammas et al., 1989).

Для препаративных целей исследуемые микроорганизмы выращивали в ферментере АНКУМ 2М (СССР) в жидкой синтетической среде,

представляющей собой модификацию предложенной Дэй и Доберейнер среды (Day and Dobereiner, 1976). Мутантные штаммы A. brasileme КМ018 и КМ252 выращивали на той же среде, но с добавлением сульфата канамицина (100 мкг/мл).

Культивирование проводили в термостатируемых условиях при 30 °С. Перемешивание вели со скоростью 200-250 об/мин. Интенсивность аэрации отвечала 60 % от насыщения среды кислородом. Микроорганизмы культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста. Осаждение бактериальных клеток осуществляли центрифугированием в течение 1 ч при 3000 об/мин. С поверхности клеток 6 сут отмывали капсульный материал в растворе N&C1 (0,15 М), ежедневно переосаждая клетки центрифугированием и заменяя отмывающий расвор. Полноту удаления капсулы контролировали по отсутствию реакции преципитации в тесте двойной иммунодиффузии между концентратом промывного буфера и антителами, полученными на целые клетки азоспирилл, обработанные глутаровым альдегидом.

Растения. В работе использовали зерновки мягкой яровой пшеницы Triticum aestivwn сорта Саратовская 29 репродукции 1996 г., полученные нами из ВНИИСХ Юго-Востока (г. Саратов). Для проведения экспериментов семена пшеницы подвергали поверхностной стерилизации (Большой практикум по физиологии растений, 197S), раскладывали в стерильные чашки Петри с 1,75 % мясопептонным агаром и проращивали в темноте в течение 32 ч при 25 °С. Проростки, не имеющие внешних признаков бактериального или грибного поражения, переносили на чашки Петри со стерильной водой и помешали в неосвещенный термостат при 25 °С на 16 ч. Среди двухсуточных проростков отбирали те, у которых длина главного корня достигала 10-15 мм.

Адсорбцию бактерий на корнях проростков пшеницы определяли, инокулируя растения бактериальной суспензией, с последующим подсчетом количества прикрепившихся к корням бактерий клеток методом посева гомогената корней на твердые питательные среды (Федоров, 1957).

Определение относительной гидрофобностн клеточной поверхности азоспирилл проводили. с использованием следующих тестов: солевой агрегации, распределения бактерий в двухфазных системах, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе (Dillon, 1996).

Выделение ЛИС проводили по стандартному методу Вестфаля с разделением водного и фенолышх слоев (Вестфаль, Янн, 1967). Водную фракцию экстракта диализовали через мембрану (предел исключения 12-14 кДа). Экстракт концентрировали и фракционировали методом гель-фильтрации, используя носитель Sepharose CL-4B («Phaimacia», Швеция). Детекцию материалов проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142 (LKB, Швеция). Дополнительно строили элюционные профили по углеводам (Dubois et я/., 1996) и по белкам, детектируя оптическую плотность фракций при 280 им. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, СССР).

После хроматотрафической очистки ЛПС концентрировали и лиофилизировали. Определение содержания в ЛПС 2-кето-З-дезоксиоктоновой

кислоты (КДО), белков, нуклеиновых кислот, фосфора проводили по традиционным методикам соответственно (Karkhanis et al., 1978; Скоупс, 1985; Спирин, 1958; Berenblum, 1938). Состав жирных кислот лнпидов А и моносахаридный состав ЛПС определяли методом газожидкостной хроматографии.

Влияние ЛПС на морфологию корневых волосков проростков пшеницы оценивали, используя модификацию слайдовой техники Фареуса (Fahraeus, 1957), описанную в работе (Коннова с соавт., 1995).

В каждый эксперимент брали по 18-20 растений. Исследуемые двухсуточные проростки пшеницы инкубировали 24 ч с ЛПС, а затем подсчитывали с использованием светового микроскопа количество деформированных корневых волосков на первом сантиметре зоны дифференциации корня.

Световую микроскопию деформаций корневых волосков проростков пшеницы проводили на поляр изационно-интерференционно м микроскопе Бшлар PI (Польша) с объективами х10, 20, 40 и окуляром х12. Наблюдаемую картину по отдельным образцам регистрировали на пленке Свема фото 64 при помощи фотоаппарата Зенит БТ.

Общая схема выделения О-ПС из наружних мембран азоспирилл представлена на рис. 1. О-ПС A. brasilense получали руганным методом гидролиза ЛПС 1 % CHjCOOH (Muller-Seitz et al, 1968). Для выделения О-ПС A. irakense дополнительно использовали еще один способ - гидролиз бактериальной массы 10 % СН3СООН (Kondo and Hisatsune, 1988). Выделенные препараты очищали хроматографически.

ИК-снектры образцов ЛПС и О-ПС, запрессованных в таблетках с КВг, получали на спектрофотометре IR-75 с приставкой для микрообразцов (Carl Zeiss, ГДР). Спектры ЯМР снимали на спектрометре Bruker DRX-500 (Германия), используя стандартное математическое обеспечение фирмы Bruker. Для сбора и обработки данных использовали программу XWINNMR 2.1.

Результаты всех экспериментов подвергали статистической обработке (Лахин, 1980). Доверительные интервалы определены для надежности 95 %.

Результаты исследований и их обсуждение

Макромолекулы, формирующие внешний слой клеточной поверхности грамотрицательиых бактерий, играют важную роль во взаимодействии с эукариотическими клетками хозяина (Rietschel et al., 1994). Настоящий раздел работы посвящен исследованию химического состава липидной и полисахаридной составляющих ЛПС азоспирилл и определению их роли в ассоциативном взаимодействии с поверхностью корней пшеницы.

1. Исследование адсорбционной способности A. brasilense Sp245 н КМ252

На' первом этапе нашей работы мы попытались определить участие ЛПС в начальных этапах взаимодействия азоспирилл с корнями растений, одним из ключевых моментов которых является колонизация корней бактериями (Bashan and Holguin, 1997). При исследовании функций отдельных структур бактериаль-

БАКТЕРИАЛЬНАЯ КУЛЬТУРА

| центрифугирование

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ БИОМАССА

I суспендирование в I 0,9 % ЫаЫ ■* 0,02 %

Г

Б ЕС КАПС УЛЪН Ы Е КЛЕТКИ КАПСУЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

обработка ацетоном )

АЦЕТОНОВЫЙ ПОРОШОК

Ю%СН,СООН центрифугирование

СУПЕРНАТАНТ

40НТХУ

центрифугирование

КЛЕТКИ

ОСАДОК

СУПЕРНАТАНТ

дшаиз

ОЕАЕ-Тоуореаг1650М диофияизация

экстракция по Ъестфаяю

ВОДНЫЙ СЛОЙ

диалю $ер/шгохе С1МВ лиофтюация

ЛПС

деградация 1 % СН,СООМ центрифугирование БерШех С-50

ФЕНОЛЬНЫЙ СЛОЙ

ЛИПИДА

О-ПС

ПС

ОЕАЕ-ТоуореаН 650М обработка КУ-2 в Н* форме яиофилизация

О-ПС

Рис. 1. Схема выделения и очисти! высокомолекулярных полисахаридсодержащих материалов из внешней мембраны азоспирнлл.

ной поверхности очень эффективным является использование мутантных штаммов, дефектных по синтезу интересующего компонента.

В качестве объектов исследования нами были выбраны штамм A. brasilense Sp245, для которого считается достоверно доказанной способность к образованию эндосимбиоза (Hartaann et al, 1995а), и полученные с помощью омегонового мутагенеза (с инсерцией в плазмиду 120 мДа) штаммы КМ252 и КМ018 (Katzy et al, 1998). Мутанты были отобраны на основе иммунохимических анализов, которые показали наличие двух "внешней и внутренней" полос преципитации в тесте двойной иммунодиффузии грубых экстрактов ЛПС A. brasilense Sp245, в то время как ЛПС-содержащие экстракты мутантов КМ252 и КМ018 обнаруживали либо только "внутреннюю", либо только "внешнюю" полосы преципитации, соответственно. Аналогичные различия между экстрактами ЛПС * исходного и мутантных штаммов были зафиксированы также методом электрофореза в псдиакриламидном геле. Авторы предположили, что мутация привела к нарушениям синтеза в каждом случае одного из двух О-ПС, что и отражали данные электрофореза (Katzy et al,, 1998).

Мы провели сравнительное изучение способности дикого A. brasilense Sp245 и мутантного КМ252 штаммов к адсорбции на корнях проростков пшеницы. A. brasilense КМ018 не исследовали в этой серии экспериментов, т.к. вследствие мутации бактерии утратили способность к движению, что, несомненно, сказалось бы на адсорбции микроорганизмов и усложнило трактовку полученных результатов. В экспериментах использовали трехсуточные проростки пшеницы и выращенные до окончания экспоненциальной фазы роста бактерии.

Наблюдения с помощью световой микроскопии показали, что микроорганизмы активно колонизировали корни проростков пшеницы и проявляли сходный характер распределения по корневой поверхности. Большее количество бактерий обнаруживалось на кончике корня, в зоне элонгации и в местах соединения корневых волосков с поверхностью корня. На корневых волосках бактериальные клетки встречались реже, иногда их поверхность была свободна от бактерий. Клетки располагались вдоль корневого волоска в беспорядке, без группирования предпочтительно в какой-либо его части. Характер распределения клеток A. brasilense Sp245 и КМ252 на корнях проростков пшеницы согласуется с данными по адсорбции других штаммов Azospirillum, представленными в работах, рада исследователей (Okon and Kapulnik, 1986; Bashan and Levanony, 1989; Yegorenkova et al, 2001).

Параллельно мы проводили количественную оценку адсорбции бактерий А. brasilense Sp245 и КМ252 в зависимости от длительности контакта микросимбионтов с корнями растений. Наблюдения охватывали период совместного инкубирования корней с бактериями от 0,25 до 48 ч. Результаты исследований отражены в таблице 1. Адсорбция бактерий на корне начиналась с первых минут контакта. Количество адсорбированных клеток A. brasilense Sp245 через 15 мин инкубации достигало значения 3,6x10s кл/см корня, при начальной концентрации клеток в инокуляте 6,5 x10s кл/мл, и быстро нарастало

с течением времени. После трех часов инкубирования бактерий с корнями растений оно достигало максимального числа и стабилизировалось. Дальнейшее увеличение времени контакта между бактериальной суспензией и корнями пшеницы не сказывалось на количестве прикрепившихся клеток. Подобный эффект был обнаружен также другими исследователями для нескольких штаммов A, brasilense (Bashan and Holgium, 1993; Zamudio and Bastarrachea, 1994; Егоренкова с соавт., 2000).

Таблица 1.

' Адсорбция бактерий A. brasilense Sp245 и A. brasilense КМ252 на корнях трехсуточных проростков пшеницы Саратовская 29

Время Количество адсорбированных бактериальных клеток

инкубации, ч на отрезке корня длиной 1 см *

A, brasilense Sp245 A, brasilense КМ252

0,25 (3,66 ± 1,24) х 10s (6,36 ± 1,71) xlO4

1 (8,18 ± 3,36) х 10s -

3 (2,63 ± 0,48) х 10а (3,35 ± 0,94) х 10s

24 (1,46 ± 0,41) хЮ6 (3,75±0,89)х105

48 (1,54±0,44)х 106 (3,89 ± 1,15) х 10s

Примечания: * Доверительные интервалы даны для надежности 95 %; концентрация клеток в инокуяяте 6,5 х 10s кл/мл.

Дня клеток мутантного штамма А. ЬгаьНете КМ252 была продемонстрирована сходная динамика адсорбции. Однако адсорбционная способность бактерий А. ЬгавИете 8р245 была в 4-8 раз вьппе, чем у клеток мутантного штамма на всем протяжении совместной инкубации бактерий с корнями. Многочисленность проведенных опытов (7 экспериментов с пятикратной повторностыо) и соответствующая статистическая обработка полученных результатов позволяют говорить о достоверности обнаруженных различий.

Таким образом, сравнительное исследование динамики адсорбции клеток А. ЬгазИете 8р245 и КМ252 показало, что изменения, произошедшие в результате мутации в составе внешней мембраны микроорганизмов, вызвали существенное снижение адсорбционной способности бактерий.

Известно, что в прикреплении бактерий к корням растений помимо специфических взаимодействий, которые на разных стадиях адсорбции опосредуются поверхностно локализованными белками или полисахаридами (МюЫек е* а1., 1991), также принимают участие неспецифическне механизмы, связанные с зарядом и гидрофобностью поверхности бактериальных клеток.

В связи с этим мы сравнили относительную гидрофобность бактериальной поверхности А. ЬгтИепзе Эр245 и его омегон-Кт мутантов КМ018 и КМ252. Проведенные эксперименты позволили выявить существенную редукцию относительной шдрофобности клеточной поверхности у мутантных штаммов азоспиршш.

Индекс гндрофобности бактериальной поверхности клеток А. ЬгаяЦете КМ252, определяемый в тесте солевой агрегации, был в 1,2, а для штамма

КМ018 в 1,5 раза выше, чем у бактерий штамма Sp245. Столь существенное снижение гидрофобности поверхности клеток Azospirillum не могло не сказаться на адсорбции микроорганизмов на корнях. По данным некоторых исследователей гидрофобностъ поверхности азоспирилл положительно коррелировала с увеличением концентрации поверхностных белков и адгезивностью микроорганизмов (Dufrene and Rouxhet, 1996). Таким образом, мы не можем трактовать снижение активности прикрепления мутантного штамма азоспирилл только как результат изменений, произошедших в составе ЛПС.

Поэтому для более корректного анализа биологической активности ЛПС в отношении растения-хозяина мы использовали слайдовую методику Фареуса (Fahraeus, 1957), при которой очищенные препараты исследуемого соединения, воздействуя на растение, в зависимости от своей активности, могут в той или иной степени вызывать изменения морфологии корневых волосков. Было показано, что выделяемые с поверхности A. brasilertse посредством смыва экзополисахаридные комплексы при воздействии на корни пшеницы вызывали морфологические изменения корневых волосков (Коннова с соавт., 1995). Данных о подобной активности ЛПС азоспирилл в отношении корневой системы пшеницы в литературе нами обнаружено не было. Для выполнения этой серии экспериментов нам было необходимо провести выделение, очистку и анализ ЛПС.

2. Сравнительна« характеристика липополисахаридов A. brasifense

ЛПС представляют собой уникальные для грамотрицательных бактерий биополимеры, являющиеся конструктивными элементами клеточной оболочки, чем и обусловлено пристальное внимание и постоянный интерес исследователей, проявляемые к ним. Зги макромолекулы играют ведущую роль в инфекционном процессе, поэтому их изучение может расширить наши представления о механизмах взаимоотношений растение-микроорганизм. Мы предприняли исследование ЛПС A. brasilertse Sp245, КМ018 и КМ252 для детального анализа изменений данных компонентов наружной мембраны у мутанта ых штаммов.

Известно, что факторы среды и продолжительность роста микроорганизмов оказывают влияние на состав полисах ар ид содержащих биополимеров поверхности бактерий вообще и ЛПС в частности (Бахолдина с соавт., 2001). При выращивании на жидких средах изменения рН и состава среды культивирования, а также объема инокулята влияют на содержание полярных заместителей вплоть до их полной потери (Bhagaya Lakshmi et al., 1989). Для A. brasilertse Sp245 было установлено, что добавление в среду культивирования бактерий трис(гидроксиметил)аминометана приводило к изменению антигенных свойств ЛПС (Бурыпщ с соавг., 2002).

Учитывая все вышесказанное, мы проводили стандартизацию условий наращивания биомассы бактерий. Бактерии выращивали до окончания экспоненциальной фазы роста в течение 18 ч на жидкой синтетической среде. При наращивании биомассы нами регулярно выполнялся контроль

гомогенности бактериальных культур в тесте иммунодиффузии с антителами на целые клетки азосгшрилл, обработанные глутаровым альдегидом (МаЮга е! а1, 1995).

С поверхности клеток удаляли зкзосолисахариды (ЭПС). Процедура удаления капсульных гликополимеров в нашем случае имела принципиальное значение, т.к. ЭПС, часто имеющие сходный с ЛПС основной моносахарияный состав, способны оказывать эффект маскировки ЛПС, что может привести к неточной трактовке полученных данных (Здоровенко, 1988; Жемеричкин с соавт., 1989).

Бескапсульные клетки высушивали ацетоном, тонко измельчали и подвергали экстракции по методу Вестфаля в соответствии с общей схемой, представленной на рис. 1, Практически весь ЛПС содержался в водной части, что говорит о достаточно высокой гидрофильности биополимеров. Экстракты характеризовались легкой опалесценцией, что свидетельствовало о присутствии незначительного количества белков и нуклеиновых кислот. ЛПС освобождали диализом от фенола, концентрировали и подвергали последовательной гель-хроматографии.

Для выделения гомогенных высокомолекулярных фракций ЛПС азоспирилл мы воспользовались гель-фильтрацией на ЗерЬагозе СЬ-4В. Элюционные характеристики ЛПС всех используемых в работе штаммов были практически идентичны. Выход высокомолекулярных ЛПС-содержащкх фракций с холостыми объемами колонок демонстрировал высокую степень их агрегированности. В раде экспериментов для получения ЛПС из экстрактов использовали осаждение ультрацентрифугированием (105000 g в течение 4 ч). В этом случае отбирали верхний слой осадка и лиофшшзировали. Препараты ЛПС, полученные как первым, так и вторым способом, не отличались по элюционным характеристикам (гель-фильтрация на колонке с ЗерЬагоэе СЬ-4В), а также имели сходный химический состав и электрофоретические профили. Однако ЛПС после хроматографической очистки содержали меньшее количество примесей, поэтому именно эти препараты использовались в наших дальнейших исследованиях.

Выход лиофильно высушенных препаратов ЛПС^л ЛПСкшм и ЛПСкмшз из поверхностных мембран бактерий А. ЬгшИете 8р245, КМ252 и КМ018, соответственно, составлял от 1,8 до 2,5 % в пересчете на вес сухой биомассы.

Были проведены анализы препаратов ЛПС методом двойной иммунодиффузии. Использование антител, полученных из сыворотки крови кролика, иммунизированного клетками штамма Эр245, обработанными глутаровым альдегидом, позволило выявить наличие 2-х полос преципитации -внешней и внутренней в препарате ЛПС штамма Зр245 и только по. одной полосе в препаратах ЛПС мутантных штаммов бактерий КМ252 и КМ018. Необходимо отметить термостабильность антигенных детерминант, присутствующих в ЛПС всех исследуемых штаммов. Кипячение в течение 0,5 ч не сказывалось на результатах преципитации по Оухтерлони. Таким образом, хромато графически очищенные ЛПС, выделенные методом экстракции по

Вестфалю, в тесте иммунодиффузии вели себя аналогично грубым экстрактам JITICQCatzyeta!., 1998).

Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях хроматографически очищенных препаратов JUlCsp245. ЛПСкшзз и JUICrmois показал, что они представляли собой смесь молекул, различающихся по длине О-специфических цепей (Giwercman et al, 1992). Причем высокая интенсивность окрашивания полос в верхней части геля свидетельствовала' о преобладании высокомолекулярной популяции ЛПС. Гетерогенность ЛПСзрз« по длине О-ПС была выше, чем у ЛПС мутантных штаммов. Электрофоретические профили ЛПС мутантных штаммов были более бедными по числу и интенсивности полос. Тем не менее, мажорные углеводные фракции ЛПСкмш и ЛПСкмо!8 обнаруживали совпадение с основными полосами, различающимися по заряду и/илй молекулярной массе, на фореграмме JinCsp245-

Простые в исполнении и чувствительные методы иммунодиффузии и электрофореза успешно используют для характеристики препаратов гликополимеров. Однако химическая природа наблюдаемой гетерогенности остается недостаточно ясной, так как она может быть вызвана как различиями в степени полимерности повторяющихся звеньев О-ПС, так и присутствием каких-либо полярных заместителей в самой цепи О-ПС или в олигосахариде кора. Однако для более корректного вывода об изменениях, произошедших в структуре ЛПС мутантных штаммов À. brasilense, необходимо было провести химический анализ индивидуальных препаратов ЛПС^мз.. ЛПСкш« и ЛПСШ018. Результаты анализа химического состава ЛПС представлены в таблице 2.

Низкое содержание бежа и нуклеиновых кислот в ЛПС указывало на высокую степень очистки препаратов. КДО - специфический компонент ЛПС -присутствовала во всех образцах, но содержание ее невелико - до 1 %. Низкое содержание КДО в препаратах ЛПС, исследованное для некоторых других штаммов A. brasilense и A. lipofertan, было отмечено в работе Хома с соавт. (Chôma et al, 1987). Авторы предположили, что это может быть вызвано высокой прочностью связи компонентов молекулы и, как следствие, плохим отделением липида А от полисахаридной части ЛПС. Такое предположение нам представляется оправданным, так как при кислотной деградации ЛПС исследуемых штаммов бактерий мы также столкнулись со сходной проблемой. При увеличении времени деградации ЛПС нам не удалось добиться формирования четко выраженного осадка липида А.

Для всех проанализированных ЛПС характерно достаточно высокое содержание углеводов, но в ЛПСкшя выявлено увеличение количества углеводов на 17 % по сравнению с ЛПС исходного штамма. Возможно, это вызвано убыванием общего количества липидов в ЛПС.

Важным структурным элементом липида А, определяющим его гидрофобность, являются жирные кислоты. Сравнительный анализ метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) методом ГЖХ показал, что основными но содержанию в ЛПСзР245> ЛПСкшк! и ЛПСкмои были 3-гидроксикарбоновые

кислоты: 3-гидрокситетрадекаиовая (ЗОН-14:0), З-гидроксигексздекановая (ЗОН-16:0). На их долю приходилось около 70 % от веса МЭЖК. По литературным данным гидроксикислоты являются обязательной составляющей липида А и, как правило, преобладают в лигщдах А (на их долю приходится 5075 % от общего содержания кислот) (Красикова с соавт., 1989). Определение профиля 3-шдроксиалкановых кислот часто используют для обнаружения эндотоксинов в различных биологических объектах (Maitra et al,, 1986) и почве (Parker et at., 1982), а также в качестве одного из хемотаксономических критериев бактерий (Wilkinson, 1996).

Таблица 2.

Химический состав препаратов липополисахаридов A. brasîtense Sp245 (ЛЛС^«), КМ252 (ЛПСкмигХ КМ018 (ЛПСкмш) и A. irakense КВС1 (ЛПСква)

Компоненты Препараты ЛПС

ЛПСя^, ЛПСкм152 jUlCiamis JlliC^n

Углеводы 65,8 ±2,1 82,8 ±2,5 67,9 ±1,8 68,4 ±2,7

Белки • 0,7 ±0,06 1,3 ±0,1 0,9 ± 0,05 0,9 ±0,05

Нуклеиновые кислоты 0,004 0,002 0,003 0,01

кдо 0,6 ± 0,02 0,4 ± 0,02 0,8 ± 0,05 0,7 ±0,02

* Общий фосфор 2,7 ±0,1 0,3 ±0,02 0,5 ±0,02

о 2 Глюкозамин 3,3 ±0,1 4,1 ±0,2 0,4 ± 0,05

и 3-гадрокситетрадекановая кислота (ЗОН-14:0) 42,0 ±0,6 14,0 ±0,7 45,0 ±1,5 43,1 ±0,8

* 3-гидроксигексадекановая кислота (ЗОН-16Ю) 22,0 ±0,9 17,8+1,1 28,3 ± 1,1 19,2 ±0,4

I É гексадекановая кислота (16:0) 29,2 ±13 12,8 ±0,3 5,0 ±0,3 8,4 ±0,3

о О S тетрадеценовая кислота (14:1) сл. сл. сл. 8,1 ±0,2

à? октадеценовая кислота (18:1) 6,8 ±0,2 33,0 ±1,3 22,7 ± 0,9 7,8 + 0,3

нанодекановая кислота (19:0) сл. 12,4 ±0,4 сл. сл.

Примечания: Доверительный интервал приведен для надежности 95 %;

* - в препарате выявлены МЭЖК 14:0,16:1,18:0 с содержанием менее 2 %; ** - определение не проводилось.

В ЛПСкм252 преобладали октадеценовая (18:1) и 3-гядроксигексадекановая (30H-16:0) кислоты. Т.е. препараты ЛПСкши и ЛПСкмои характеризовались более высоким содержанием непредельной октадеценовой кислоты (18:1), по сравнению с исходным штаммом. Небольшие различия между штаммами обнаружены также и по количеству гескадекановой кислоты (16:0).

В целом полученные нами результаты хорошо согласуются с немногочисленными исследованиями жирных кислот ЛПС азоспирилл, проведенными для других штаммов этого рода (Chôma et «/., 1984; 1987). Выявленные нами различия между ЛПС^«, ЛПСкмгя и j111 iCT к кю15 позволяют предположить, что у ЛПС мутантных штаммов произошли некоторые изменения количественного соотношения жирных кислот в составе липидов А,

что может сказываться на конформации молекул и оказывать существенное влияние на их биологическую активность.

Нами были выявлены значительные межшгаммовые различия в содержании общего фосфора в ЛЛС^«, ЛПСкмгя и ЛПСШ01в. Известно, что фосфатные группы, локализованные главным образом в липиде А и во внутренней части кора, являются высокоэффективными катионсвязывающими участками в молекуле ЛПС. Степень ионизации отрицательно заряженных групп определяет силу отталкивания между ними, гидратацию полярной части и образование водородных связей, что влияет в конечном итоге на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране.

Тонкослойной хроматографией в составе J h iCsp24s, JH1Ckm252 и ЛПСкмш было показано наличие Rha, глюкозы (Glc), глюкозами на (GlcN). Используя этот метод, мы не выявили различий в качественном моносахаридном составе ЛПС A. brasilense Sp245 и его омегон-Km мутантов. Причем, преобладающее содержание Rha и Glc в ЛПС было ранее отмечено для нескольких штаммов А. Hpoferum и A. brasilense (Chôma et al., 1987). Присутствие GlcN детектировали во всех образцах ЛПС. Однако для ЛПСкм<нз содержание GlcN было наименьшим, в то время как для ЛПСёр2« и ЛПСкмзя - на порядок выше.

Инфракрасная спектроскопия углеводсодержащих соединений применяется чаще всего для характеристики функциональных групп и их взаимного расположения в молекуле. ИК-спектры всех исследуемых образцов ЛПС обнаруживали подобие по общему профилю и положению основных характеристических полос. Среди последних следует отметить валентные колебания карбонила в сложнозфирной группе 1744 см"1 и свободном карбоксиле 1722 см"1, валентные колебания С-Н при 2924 см*1 или 2907 см"1. В области 3700-3100 см"1 в ИК-спектре наблюдали довольно интенсивные полосы поглощения с большой широтой и недостаточной четкостью, что характерно для валентных колебаний групп - ОН. Полосы поглощения при 1640 см*1 и 1560 см*1 позволили выявить присутствие в молекулах ЛПС N-ацнльных гексозаминных групп, из чего можно сделать вывод, что в лшщцных составляющих исследуемых ЛПС присутствуют N-ацилсвязанные жирные кислоты.

Таким образом, нами были выделены и хроматографически очищены ЛПС А. brasilense Sp245, КМ018, КМ252. Анализ препаратов ЛПС исходного и мутантных штаммов позволил выявить некоторые различия в биополимерном составе (общее содержание углеводов, фосфора, GlcN)- Были обнаружены небольшие отличия в количественном соотношении отдельных жирных кислот, входящих в состав липидных компонент ЛПС.

3. Исследование сродства ЛПС Л. brasilense к лектину пшеницы

Известно, что углеводсодержащие биополимеры, локализованные на клеточной поверхности, играют важную роль при передаче сигналов в межклеточных взаимодействиях (Kobata, 1992). Агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) экспонирован на всей поверхности зародышей пшеницы и кончиках корней взрослых растений (Mishkind et al.t 1983) и обладает

способностью специфично взаимодействовать с углеводами, входящими в состав гликозилированных молекул бактериальной поверхности (полисахариды, гликопротеины и т.д.) {Goldshtem et al, 1980). Известно, что сайты специфического связывания лектина пшеницы локализованы в капсульном материале азоспирилл (Yagoda-Shagam et al., 1988; Del Gallo and Haegi, 1990). ЛПС в составе бактериальной мембраны не участвовал во взаимодействии с АЗП, что было показано ранее (Det Gallo et al., 1989).

При помощи трансмиссионной электронной микроскопии мы наблюдали способность капсулированных и отмытых от капсулы клеток азоспирилл взаимодействовать с АЗП, меченым коллоидным золотом. Было показано, что в отличие от капсулированных, бескапсульные клетки A. brasilense Sp245 не взаимодействовали с комплексом АЗП - коллоидное золото (ИБФРМ РАН), что также подтвердило полноту отмывания капсульных полисахаридов с бактериальной поверхности.

В настоящее время большинство исследователей поддерживают предположение о том, что многие трамогрицательные бактерии, если не все, способны экскретировать эндотоксин в различных количествах в кулыуральную среду (Johnson et al„ 1975; Здоровенко, 1988). Причем, функции экзоцеляюлярного ЛПС сходны с таковыми мембранного ЛПС, но не идентичны им. Была отмечена высокая О-антигенная активность внеклеточного эндотоксина на уровне антигенной активности целой микробной клетки (Здоровенко, Скрипник, 1985). Возможно, у ЛПС, выделенного из внешней мембраны азоспирилл, сродство к АЗП становится более выраженным.

С целью разъяснения этого спорного вопроса нами были предприняты эксперименты по выявлению методом дот-анализа взаимодействия ЛПС А. brasilense всех используемых в работе штаммов с АЗП, меченым коллоидным золотом. Несмотря на использованный в работе широкий диапазон концентраций ЛПС (0,5 мг/мл - 0,01 мкг/мл), нам не удалось зафиксировать положительный результат ни у одного из тестируемых ЛПС. Получение данные служат косвенным доказательством того, что GlcN, выявляемый в t составе ЛПС, вероятнее всего, является компонентом липида А и, возможно, коровой части макромолекулы. Следовательно, ни ЛПС, встроенный во внешнюю бактериальную мембрану азоспирилл, ни препарат ЛПС, изолированный из высушенных ацетоном клеток, не обладал сродством к АЗП.

4. Влияние ЛПС бактерий A. brasilense Sp245 и его омегон-Km мутантов на морфологию корневых волосков проростков пшеницы

Одним из первых внешних, легко наблюдаемых результатов взаимодействия почвенных бактерий с корневой системой растений является деформация корневых волосков. Эти морфологические изменения корней под действием почвенных бактерий известны давно и достаточно подробно исследованы в бобово-ризобиальном симбиозе (Halverson and Stacey, 1986). Инокуляция нескольких сортов пшеницы, кукурузы, сорго рядом штаммов Azospirilhim привела к морфологическим изменениям корней; возрастало число корневых волосков, разветвлений и латеральных корней (Окоп and Kapulnik, 1986). На

корневых волосках проростков пшеницы показано, что частота деформаций "камертонового" типа зависит от применяемого штамма азоспирилл и убывает в ряду A. brasilense Sp245, Spl07, Sp7 и Sp242 (Patriquin et al., 1983). Уже известно, что эффект деформации индуцируется индолил-уксусной кислотой -ростовым гормоном, продуцируемым азо-спириллами (Jain and Patriquin, 1985), а также действием полисахарид-содержащих комплексов, локализованных в кап-сульном материале и поступающих в 0!фу-жающую среду в

процессе роста бактерий (Skvortsov et а}., 1995; Коннова с соавт., 1995).

Слайдовая техника Фареуса позволила визуализировать измене-ния в морфологии корневых волосков на корнях двухсуточных проростков пшеницы при воздействии ЛПС азоспирилл. Препараты ЛПСзрг«? ЛПСкшя и ЛПСшш в концеитра-ции 0,125 мкг/мл добавляли в минеральную среду, где выращивали проростки. Концентрация комплексов выбрана по аналогии с таковой,

использовавшейся в

Рис. 2. Примеры деформации корневых волосков трехсуточных проростков пшеницы Саратовская 29 еод действием ЛПС бактериальной мембраиы бактерий А, ЬгазНегхе Бр245 (*б70): а - разветвление; б—асимметричная вилочка.

3 30

25

| и 20

1> ш

10

¡з g

8

1

Рис, 3. Влияние ЛПС бактерий А. ЬгазИегке 5р245, а также мутактвых штаммов КМ252 и КМ018 на морфологию корневых волосков двухсуточных проростков пшеницы: 1 -количество деформаций на корнях в отсутствии ЛПС (контроль); 2, 3, 4 - количество деформаций в присутствия препаратов ЛПСзР245, ЛПСкмок и ЛПСкмги соответственно.

экспериментах с полисахарид-содержащими комплексами, входящими в состав капсульного материала бактерий (Коннова с соавт., 1995). Наблюдали деформации корневых волосков самых различных типов (образование вилочек с равными и неравными по величине разветвлениями, скручивание, утолщение и др.). На рис. 2 представлены микрофотографии некоторых из них. Результаты анализов показали (см. рис. 3), что препараты ЛПС способны индуцировать деформации корневых волосков проростков пшеницы. Однако эффект, вызванный ЛПСкмш и ЛПСш<пз

мутантных штаммов, был значительно слабее выражен, чем под действием ЛПСзрмз исходной культуры.

Механизм деформаций корневых волосков пока не выяснен. Однако ранее была показана корреляция процесса деформацни с активностью колонизации бактериями корней растений, а также участие лектнн-углеводных взаимодействий в процессах деформации, индуцированных внеклеточными полисахаридсодержащими материалами (Егоренкова с соавт^ 2000). Вопрос о связи обнаруженного снижения активности ЛПС мутантных штаммов с предполагаемой утратой каждым из них одной из двух субъединяц гетерогенных углеводных составляющих ЛПС, выявляемой иммунодиффузией, оставался открытым. Для его разъяснения нами было предпринято исследование первичной структуры повторяющегося звена О-специ фических цепей ЛПС3р2«, ЛПСкммг и ЛПСшои-

5. Идентичность структуры ОПС А. brasilense Sp245, КМ018 н КМ252

Иммунодоминантные компоненты ЛПС грамотрицательных микроорганизмов - О-полисахариды играют важную роль в функционировании бактериальной клетки и взаимодействии бактерий с другими биологическими системами. Хемотипирование и серотипирование на основе О-ПС и ЛПС широко используются при идентификации бактерий и установлении их ■ филогенетического родства. Однако первичные структуры О-ПС ассоциативных диазотрофных бактерий изучены довольно слабо (Chôma et al., 1992), поэтому актуальность их исследования не вызывает сомнения. .

Дня получения О-ПС мы воспользовались рутинным методом гидролиза ЛПС уксусной кислотой (рис, 1), при котором создаются условия для разрыва кислотолабилыюй связи между. липидом А и полисахаридной частью молекулы. Мягкую кислотную деградацию ЛПС исследуемых штаммов

проводили в течение 4 ч. После осаждения из реакционной смеси липида А, псшисахаридную часть, макромолекулы ЛПС, фракционировали на колонке с Sephadex G-50. Гель-фильтрация позволила очистить высокомолекулярную фракцию коро-вых олигосахаридов, замещенных О-специфическими полисакаридными цепями, от низкомолекулярных примесей. Элюционные профили углеводных частей исследуемых ЛПС свидетельствовали о том, что они относятся к S-форме. Фракции О-ПС всех штаммов злюировались одним Рис. 4. Профиль элююш О-ПС А. шовным симметричным пиком. На brasilense Sp245 при гель-фяльтрании на Хроматограммах отсутсвовали вторые колонке с Sephadex G-50 (детекция по пики (см. рис. 4), которые являются углеводам).

характерными для фракций олигосахаридов кора, что подвердило предположение о высокой степени его замещения полисахаридными цепями. Получаемая подобным способом полисахаридная фракция не содержала низкомолекулярных примесей. Таким образом, в исходных препаратах ЛПС, а, следовательно, и популяциях бактериальных клеток преобладали S-формы молекул. Можно также отметать, что элюцня фракции О-ПС с холостым объемом колонки свидетельствовала об их достаточно высокой молекулярной массе, превосходящей 20 кДа.

Ионообменная хроматография на колонке с DEAE-Toyopearl 650М углеводных составляющих JEICspi« выявила гетерогенность исследуемого образца О-ПС по заряду. Ступенчатая элюция, осуществляемая сначала буфером 0,01 M трис-HCl, а затем раствором NaCl в том же буфере в градиенте концентраций от 0,01 M до 1 М, позволила разделить О-ПС A. brasilense Sp245 на фракции условно «нейтрального» и «кислого» полисахаридов, обозначаемые в дальнейшем - 0-ПС23р2« н О-ПС! sP24î* В то же время в ЛПСкмок обнаруживался только кисяын 0-ПСкмо18? & в Jll îCh^2J2 ~ только нейтральный О-ПС КМ2Я- Фракцию О-ПС исходного штамма Sp245 также хроматографировали на аналитической колонке с DEAE-Trisacryl M. Во фракции «кислых» О-ПС, элюируемой 0,1 M буфером были зарегистрированы два пика, которые незначительно отличались по плотности отрицательного заряда, о чем свидетельствовала близость пиков на элюцновноЙ кривой.

Условно «кислые» полисахариды обессоливали на колонке с TSK-Gel HW-40 и концентрировали на роторном испарителе. Все препараты О-ПС яиофилизировали. Выход О-ПС составил 32 % в случае 0-ПС5рг«> О-ПСкшк, а для 0-ПСШ(Ш - 38 % от навески ЛПС.

При кислотном гидролизе 0-ПС15р245> 0-ПС25р245, О-ПСшо]« и О-ПСкшя образовался только 6-дезоксисахар - Rha, которая была идентифицирована методами хроматографии на бумаге и ГЖХ в виде ацетатов полиолов. Площадь пика Rha, судя по показаниям детектора, достигала 98 % от суммарной площади всех пиков ацетатов альдитов анализируемых препаратов.

Анализ абсолютной конфигурации Rha методом ГЖХ в виде ацетилированных гликозидов с оптически активным спиртом (Я)-2-октанолом показал, что моносахарид имеет D-форму. В отличие от гексоз, которые входят в состав ПС в основном в виде D-изомеров, дезоксигексозы чаще встречаются в виде L-изомеров. Так, именно L-Rha образует повторяющееся трисахаридное звено О-ПС бактерий A. Jipoferum SpBrl7 (Chôma et al, 1992). Однако О-ПС птгамма A. brasilense Sp245, как и О-ПС мутантных штаммов, состоят из Rha в D-конфигурации, что представляется достаточно редким явлением для О-ПС (Кочетков, 1996).

ИК-слектры 0-nC2sP245 и 0-ПС1$Р24), снятые в таблетках с КВг, практически не различимы и свидетельствуют о стуктурном родстве обоих полисахаридов. Сильная полоса при 2908 см'1 была вызвана валентными колебаниями метальных трупп в остатках Rha. В спектрах в низкочастотной области наблюдаются полосы средней интенсивности с максимумами при 834 см'1, что на основе известных эмпирических корреляций позволяет предположить, что

связывание моносахаридных остатков в основном происходит за счет а-гликозидных связей. Наличие полос в области 885-890 см'1 свидетельствует о присутствии, хотя и в меньшей степени, р-гликозидиых связей в структуре ПС. Небольшое смещение пояос, наблюдаемое в ИК-спектрах, может быть обусловлено недостаточно точным соблюдением техники подготовки образцов.

Спектральные методы исследования структуры органических соединений обладают неоспоримым преимуществом гораздо меньшей затраты времени по сравнению с чисто химическими методами. Однако только совокупность нескольких спектральных методов дает возможность получить всестороннее подтверждение отдельных данных о строении вещества, и, таким образом, более надежно определять структуру соединений. Поэтому нами было предпринято исследование структуры повторяющегося звена О-полисахаридов исследуемых штаммов методом ЯМР-спектроскопии.

В результате проведенных исследований нами было установлено, что 13С-ЯМР - спектры всех исследуемых полисахаридов были идентичны друг другу. В них присутствовали сигналы пяти аномерных атомов углерода при 97,8-103,3 мл., пяти метальных групп (Шщ С-б) при 17,8-17,9 м.д., и двадцати остальных атомов углерода моносахаридных циклов в области 68,4-79,0 м.д. Соответственно, в 'Н-ЯМР спектре полисахаридов (рис, 5) присутствовали сигналы пяти аномерных протонов при 4,82-5,20 мл., пяти метальных групп (КЬа Н-б) при 1,30-1,33 м.д., и других прогонов в области 5 3,43-4,25.

Следовательно, на основании представленных данных можно сделать вывод, что исследуемые полисахарида построены из одинаковых по структуре пентасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих только остатки О-КЬа. Дальнейшее структурное исследование было выполнено на полисахариде А. ЬгазИете 8р245.

V

О « 2,5

А.

I

Рис, 5. Спектры 'Н-ЯМР препаратов ОПСкмзя (I) и ОПСщо« (2) из ЛПС бактерий А.Ьгазйете КМ252 и КМ018 соответственно.

Положение С-6 сигналов в области близкой к 18 м.д. и отсутствие в 13С-ЯМР спектре сигналов ниже области 80 м.д. показывают, что все рамнозные остатки содержатся в пиранозной форме (Bock and Pedersen, 1983).

Для последующего структурного анализа 'Н- и ,3С-ЛМР спектры полисахарида (табл. 3, 4) были расшифрованы с использованием двумерной спектроскопии (COSY, TOCSY, and fH,°C HSQC). Положение H-l, 3, 5 сигналов одного нз остатков Rha1 в относительно высоком поле при S 4,82,3,73, и 3,42, соответственно, показали, что этот остаток - р-связан, в то время как другие четыре остатка Rhan-Rhav, где протоны Н-1, 3, 5 резонировали в более низком поле при 5 4,97-5,20, 3,85-4,04, и 3,75-4,21, соответственно, а-связаны, что согласуется с опубликованными данными для р - и а - рамнопираноз (Jansson et aî,s 1989).

Таблица 3.

Данные спектра 'Н-ЯМР О-ИСА. brasilense Sp245 (S, м.д.)

Остаток H-l H-2 H-3 H-4 H-5 H-6

-^H-D-Rhap'-O-*- 4,82 4,07 3,73 3,43 3,42 1,33

->3)-a-D-Rhapu-(l-» 5,09 4,25 4,04 3,53 3,85 1,33

4,97 4,17 3,85 3,55 3,79 1,30

-^J-a-D-Rhap^-il-» 5,12 4,10 3,91 3,49 3,75 1,30

->2)-a-D-Rhapv-(l-» 5,20 4,12 4,02 3,49 4,21 uo

Таблица 4.

Данные спектра 13С-ЯМР О-ПС A. brasilense Sp245 (Ô, м.д.)

Остаток C-l C-2 C-3 C-4 C-5 C-6

->2)-P-D-RW-(I->> 97,8 79,0 74,4 73,3 73,8 17,9

103,3 68,4 78,1 71,6 70,4 17,9

->3 )-a-D-Rhaplll-( 1 -> 103,2 71,0 79,2 72,5 70,6 17,8

101,9 79,4 71,0 73,4 70,0 17,8

->2)-a-D-Rhapv-( 101,4 79,5 71,0 73,4 70,0 17,8

Положение сигналов С-2 или С-3 для каждого из остатков Rha в низком поле при S 78,1-79,5 (табл. 4), по сравнению с их положением в незамещенной а-рамнопиранозе при 5 71-73 (Bock and Pedersen, 1983), показывает, что полисахарид линеен и выявляет положения замещения моносахаридов. NOESY эксперимент выявил межзвеньевые корреляции между аномерными и связанными протонами: Rha'H-I/Rha" Н-2 и Н-3, Rhan H-1/Rham Н-3, Rha1" Н-1/Rha141 Н-2, Rha" H-1/Rhav Н-2, и Rhav H-1/Rha1 Н-2 при 5 4,82/4,25 и 4,04, 5,09/3,85, 4,97/4,10, 5,12/4,12, и 5,20/4,07, соответственно. Rha1 была охарактеризована с помощью внутризвеньевых корреляций Н-1, Н-2, 3, 5, в то время как остальные четыре остатка Rha демонстрировали только Н-1, Н-2 корреляции. Эти данные подтвердили положения замещения и аномерные

конфигурации моносахаридов и определили их последовательность в повторяющемся звене полисахарида. Таким образом, повторяющееся звено О-ПС A. brasilense Sp245, а также О-ПС A. brasilense КМ018 и КМ252, имеет следующую структуру: ^2)-P-l>Rhapl-(l-+3)-a-D-Rhap!:t-(l->3)-a-D-Rh£!pI11-{l->2)-a-D-Rhap^-f 1 ->2)-a-D-Rhapv-{ 1 ->.

По нашим данным подобная структура не была пока обнаружена среди природных полисахаридов. Однако, как и у A. brasilense, у Pseudomonas syringae (Книрель с соавт., 1988) и Xanthomoms campestris (Knirel and Zdorovenko, 1997), рамноза (D иди L) является преимущественным или даже единственным компонентом О-ПС и достаточно распространена среди фитопатогенных бактерий. Это может являться показателем того, что данный углевод играет немаловажную роль в процессах узнавания и взаимодействия растений и микроорганизмов.

Остается открытым вопрос о причине гетерогенности .О-ПС. Возможно, наличие заряда О-ПС может быть связано с присутствием фосфатов в качестве заместителей. Анализы содержания общего фосфора были проведены колориметрическим методом, основанным на специфической реакции на фосфаты с фосфорно-молибденовой кислотой. Результаты анализов представлены в таблице 2. Содержание, фосфатов невелико во всех образцах ЛПС, однако, в ЛПС^з количество фосфора было максимальным и в 9 и 5,4 больше, чем в ЛПС KM2S2 и ЛПС кмои, соответственно, что согласуется с высказанным ранее предположением.

Одной из причин гетерогенности образцов ЛПС по заряду является нестехиометрическое количество заряженных ipyrai в области кора. Поэтому при использовании колонки с DEAE-Trisacryl выявлялась гетерогенность условно кислого О-ПС штамма Sp245. Возможно, применение иных буферов или хроматографических носителей могло бы привести к дальнейшему фракционированию ПС. Помимо этого, характерной особенностью молекул ЛПС является их микрогетерогенность, связанная с различием в дайне О-полнсахаридной цепи, наблюдаемая при алектрофоретическом разделении, и не сопровождающаяся серьезными структурными перестройками молекул. Так для ЛПС Yersinia pseudotuberculosis недавно показано, что длина цепи О-ПС варьировала и достигала своей максимальной величины только в стационарной фазе роста, а моносахаридный состав был идентичен на всех стадиях роста (Бахолдина с соавт., 2001).

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о том, что омегоновый мутагенез вызвал существенные изменения в составе ЛПС, не затрагивая структуру повторяющегося звена О-специфической цепи.

б. Определение структуры повторяющегося звена О-ПС A. irakense КВС1

Для выявления межвидовых различий в структуре ЛПС азоспирилл мы предприняли исследование состава ЛПС и первичной структуры О-ПС А. irakense КВС1. Выбор был остановлен на Л irakeme КВС1 в связи с тем, что он является типовым штаммом этого вида. Характерной особенностью бактерий этого штамма является ярко выраженная пектолитическая активность. Кроме

того в его геноме отсутствуют гены, ответственные за биосинтез ауксинов (Vande Broek and Vanderleyden, 1995). Это привлекает особенное внимание к А. irakense КВС1, так как дает возможность оценить степень участия различных механизмов в формировании растительно-микробных ассоциаций, которое, предположительно, обеспечивается воздействием пекголитических ферментов и продукцией фигогормонов, особенно ИУК (Лукин с соавт., 1987).

Культура A. irakense КВС1 достигала конца экспоненциальной фазы роста на жидкой малатной среде к 24 ч выращивания, причем сильно флокулировала во время роста, что существенно отличало ее от A. brasilense Sp245.

Для получения ЛПСква использовали общую схему выделения, представленную на рис, 1, Выход ЛПС составил 0,6 % от сухого веса клеток, что было примерно в четыре раза меньше чем у A. brasilense Sp245. Диализ биополимерного состава ЛПСква (табл. 2) не выявил существенных отличий от nnCsP245- В составе лнпндной компоненты. ЛПСква было зафиксировано преобладание 3-гидроксиалкановых кислот. Близкое по величине содержание жирных кислот позволяет предположить сходное строение лшщдов А ЛПС А. irakense КВС1 и A. brasilense Sp245. Из данных электрофоретического анализа следовало, что исследуемый ЛПС относится к S-форме молекул. Методом тонкослойной хроматографии было установлено преобладание в ЛПСква нейтральных моносахаридов: Rha, Glc, галактозы (Gal) и маннозы (Мал).

Рутинный метод получения О-ПС характеризуется большой трудоемкостью, продолжительностью и достаточно низким выходом ПС. Не так давно был предложен метод выделения О-ПС из целых бактериальных клеток, минуя стадию экстракции и очистки индивидуальных препаратов ЛПС (Hïsatsune et al., 1990). Он заключается в обработке бактериальной массы уксусной кислотой, что приводит к разрыву кетозщшой связи между липидным и углеводным фрагментами ЛПС и переходу последнего в растворимое состояние. Этот метод был достаточно успешно применен для характеристики О-ПС бактерий рода Vibrio (Kondo and Hisatsune, 1989), Использование модификации этой методики для У. pseudotuberculosis позволило авторам предложить ее для получения О-ПС из других видов грамотрицательных микроорганизмов и исследования их химической структуры (Красикова с соавт., 1998).

О-ПС A. irakense КВС1 выделяли двумя методами: традиционным -гидролизом 1 % CHjCOOH (О-ПСква) и экстракцией из сухой микробной массы 10 % СНзСООН (О-ПС'квсд- Выделенные препараты очищали хроматографически. Выход ОПС составил 0,18 % от веса сухих бактериальных клеток, а ОПС1 - 2,3 %. Это вполне объяснимо, т.к. даже истощающая экстракция горячим водным фенолом не дает полного извлечения ЛПС из наружной мембраны бактерий (Красикова с соавт., 1998). Кроме того, часть молекул ЛПС, извлекаемая той или иной системой растворителей, неизбежно подвергается деструкции и отбрасывается при хроматографической очистке или ультрацентрифугировании.

Чтобы доказать идентичность строения О-ПСква и О-ПС'ква, мы предприняли сравнительное исследование их состава и структуры. Гидролиз О-

ПСквс! и 0-ПС'квс1 2 М трифторуксусной кислотой с последующим анализом моносахаридов в виде ацетатов полиолов привел к идентификации Rha, Gal и Man в соотношении 3:2:1 (рис. 6А). Таким образом, О-ПС, выделенные двумя описанными методами, имели сходный моносахарид« ый состав.

U-

„ ш h

Рис. 6. ГЖХ анализ ацетатов альдитов гндролизата О-ПС A. irakense КВС1 на хроматографе Hewlett-Packard 5880: А - О-ПСквсь О-ПС'квсь Б - О-ПС'зт-

Первичную структуру повторяющихся звеньев О-ПСква и О-П0'квс1 определяли методом ]Н и lîC - ЯМР спектроскопии, включая COSY, TOCSY, NOESY — эксперименты. Оказалось, что спектры О-ПС практически не отличались друг от друга, что свидетельствовало об идентичности их структуры. К сожалению, полное отнесение сигналов в спектре - ЯМР было затруднено многочисленными совпадениями. Это могло быть вызвано гетерогенностью структуры О-ПС, а именно присутствием минорной серии, или наличием в повторяющемся звене достаточно длинной боковой цепи. Для разъяснения этого вопроса 0-ПС'квс1 был подвергнут распаду по методу Смита (Захарова, Косенко, 1982) и продукты последующего мягкого кислотного гидролиза были разделены хроматографией на геле TSK HW-40, что позволило выделить высокомолекулярный полисахарид О-ПС's™ ■ Методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов в составе О-ПС'^ были идентифицированы Rha, Gal и Man в соотношении 2:1:1 (рис. 6Б). Следовательно, распад по методу Смита привел к окислению и отщеплению остатков Rha и Gal, находящихся в боковой цепи. Методом ЯМР-спектроскопии было показано, что 0-nC'Sm является регулярным разветвленным гетерополисахаридом с тетрасахаридным повторяющимся звеном следующей структуры: [-*4)-ct-Rhap-(J-»3)-ß-Galp-(l-*]

3 Î I

|*-Mai¥>-(1^3)-c(-Rh4P

Очевидно, что остатки Rha и Gal в повторяющемся звене исходного ПС являлись терминальными сахар амн боковой цепи, и положение их замещения может быть выяснено с использованием анализа методом метилирования.

Таким образом, нами был выделен и охарактеризован ЛИС A. irakense КВС1. На основании сравнительного анализа биополимерного состава можно предположить, что липиды А ЛПС A. irakense КВС1 и A. brasilense Sp245 имеют сходное строение. Было показано, что выход ПС A. irakense КВС1,

полученного методом прямой экстракции с поверхности бактериальных клеток на порядок превосходит выход О-ПС после гидролиза ЛПС 1 % уксусной кислотой. Данные ЯМР-спектроскопии подтвердили что О-ПС'ква имеет структуру полностью - идентичную структуре полисахаридой части ЛПС, что делает возможным использование ПС, выделенных подобным методом, как для структурного исследования, так и для определения биологической активности в отношении растения-хозяина.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ биополимерного состава липополисахаридов, выделенных из внешних мембран отмытых от капсулы клеток бактерий рода АгозртИит, В углеводных компонентах липополисахаридов показано наличие рамнозы, глюкозы, глюкозамина. ЖнрнокислотныЙ состав липидов А представлен 3-окситетрадекановой, 3-оксигексадекановой, гексадекановой и окгадеценовой кислотами. Для мутанткых штаммов отмечено изменение соотношения жирных кислот в гидрофобной части липополисахаридов, а также содержания глюкозамина и фосфора.

2. Установлено, что адсорбционная способность бактерий А. Ъга&йетг Бр245 на корнях проростков пшеницы значительно превышает таковую у его омегон-Кга мутанта КМ252 с измененным составом липополисахарида. Выявлено, что мутация также привела к значительному понижению относительной гадрофобности бактериальной поверхности азоспирилл.

3. Впервые была показана способность липополисахаридов азоспирилл вызывать различные морфологические изменения корневых волосков проростков пшеницы, являющиеся одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий. Причем для ЛПС мутантных штаммов было отмечено значительное снижение этой активности.

4. Исследование О-специфических полисахаридов бактерий А. ЬгазИете Бр245, КМ018, КМ252 методом ЯМР-спектроскопии позволяет утверждать, что они характеризуются регулярностью строения. О-специфические полисахариды этих штаммов имеют идентичную первичную структуру повторяющихся пентасахаридных звеньев и являются гомополнмерами Е>-рамнозы.

5. Определен фрагмент структуры повторяющегося звена О-специфического полисахарида А. хгакете КВС1, состоящего из разветвленных гексасахаридных мономеров.

6. Выявлена идентичность структуры повторяющихся звеньев 0-полисахарцдов, выделенных методом деградации липополисахарида и прямой экстракцией бактериальной массы А. ггакете КВС1. Показано, что адаптированный для азоспирилл метод прямой экстракции О-специфических полисахаридов является более эффективным, благодаря снижению трудоемкости процесса выделения и увеличению выхода полисахарида.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Konnoya S., Fedonenko Yu., Brykova О., Ignatov V. Comparative investigation of the lipopolysaccharides from Azospirillum brasilense Sp245 and its mutant KM252 // 9-th International Congress "Molecular Plant-Microbe Interactions", Amsterdam. 1999. Book of abstracts.-P. 192.

2. Федоненко ЮЛ., Егоренкова И.В., Ьрыкова О.С., Коннова СА., Игнатов ВЗ. Исследование роли бактериальной капсулы в процессе адсорбции AzospirUlum brasilense Sp245 иа корнях проростков пшеницы // Тезисы докладов [V съезда Общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999.-С. 245-246.

3. Федоненко Ю.П., Коннова С А., Кусганова Г. А, Игнатов В.В. Исследование лшгополисахаридов бактерий AzospirUlum brasilense штамма Sp245 и его омегои-Кт мутантов КМ018 и КМ252 И Тезисы стендовых сообщений школы-конферешши Горизонты физико-химической биологии Пупщно, 28 мая-2 июня 2000.-С. 211.

4. Fedonenko Yu.Pl, Yegorenkova I.V., Konnova SA., Ignatov V.V, Effect of structural alteration of the polysaccharide portion of lipopolysaccharides oa the biological activity of AzospirUlum И Fourth European Nitrogen Fixation Conference: Abstr. - Sevilla, Sprain, Sept 16-20,2000.-P.160,

5. Федоненко Ю.П.,. Коннова СЛ., Брыкова О.С., Игнатов В.В. Сравнительное исследование химического состава н биологической активности лмюполисахаридов бактернй AzospirUlum brasilense Sp245 и его каиамшшн-устойчнвых мутантов КМ252 и КМ018 // Известия Саратовского государственного ун-та. Сер. Биологическая. Изд-во СГУ,2001.-С. 111-122.

6. Егоренкова ИЗ., Коннова С .А., Федоненко Ю.П., Дьпсман JI.A., Игнатов В.В. Роль нолисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков шнеянцы // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 1. - С. 4550.

7. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В,, Коннова СА-, Игнатов В.В. Участие липопоянсахаридов азоспирши во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиологи». - 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

8. Федоненко ЮЛ., Егоренкова ИЗ,, Куставова ГА., Коннова СА., Игнатов ВЗ. Липополисахарнды азоспирилл в процессе взаимодействия с поверхностью корней пшеницы // Вопросы биологии, экологии, химии и методики обучения: Сборник научных статей. - Саратов: ЗАО "Сигма-шпос", 2001. - Вып. 4. - С 79-83.

9. Konnova S.A., Fedonenko Yu.P„ Makarov O.E., Ignatov V.V. Study of the effect of conditions for the cultivation of the bacteria AzospirUlum brasilense 11 Abstract book of the 2- , nd Balkan Conference of Microbiology Thesaloniki, Greece, November 2001. - P.13S.

10. Fedonenko YilP., Konnova SA„ Ignatov V.V. Study of the effect of conditions cultivation of the bacteria Azospirillum brasilense on the composition bacterial extracellular polysaccharide containing material // Abstract book of the 134h International conference on nitrogen fixation Hamilton, Canada 2001. - P. 70.

П. Федоненко ЮЛ, Коннова C.A, Игнатов В.В. О-спепифические полисахариды липополисахарндов бактерий Azospirillum brasilense Sp245 И Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: материалы конференции / 1-я региональная кайф, молодых ученых Саратов, 26-27 марта 2002. Саратов: Изд-во С арат, ун-та, 2002. -С. 25.

12. Федоненко Ю.П., Егоренкова ИЗ., Коннова СА., Игнатов ВЗ. Влияние изменений структуры ЛПС Azospirillum brasilense на биологическую активность в растительно-микробных взаимодействиях И Биология — наука XXI века: сборник -тезисов / 6-я Путинская школа конференция молодых ученых Пущино, 20-24 мая 2002. • Тула: Изд-во Туп. пед. ун-та, 2002. - Т. 3. - С. 241.

13. Fedonenko Yu.P, Zatonsky G.V., Konnova S A, Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. - 2002. - Vol. 337. - P. 869-872.

Подписано в печать 25.04.2003. Формат бОх 84/16. Гарнтура Тип«. Бумага типовая, Ризопечггъ. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №283

Отпечатано с топового оригинал-иаяета в ИБФРМ РАН 410049, Саратов, пр. Этуз настов, 13