Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР AZOSPIRILLUM BRASILENSE, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕАЛИЗАЦИИ «СОЦИАЛЬНОГО» ПОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР AZOSPIRILLUM BRASILENSE, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕАЛИЗАЦИИ «СОЦИАЛЬНОГО» ПОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИЙ"

^МЬЪГ

На правах рукописи

ШИРОКОВ Александр Александрович

ИГгШУНОХИМИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР Дг05Р/Я/£.£.1Ш ВГгАВН-ЕЫЗЕ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕАЛИЗАЦИИ «СОЦИАЛЬНОГО» ПОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИЙ

03,00,07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сарэтсв - 2008

с-;; \ * &

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растениП и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель

доктор биологических наук Матора Лариса Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор оиологическнх наук Богатырев Владимир Александрович

доктор биологических наук, профессор Эль-Регнстан Галина Ивановна

Ведущая организация:

Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Зашита состоится

23

апрели

2008 г. в ¡4.00 на заседании

диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г.Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте htt р: //w w w л bp pm. sarato v ,ru/o by a v _d i s. hi i n I

Автореферат разослан 22 марта 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета , _

доктор биологических наук Уу./к'""' Никитина В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из наиболее характерных черт современной микробиологии можно признать переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах без выраженного социального поведения к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания (Грузина, 2003). Понятие «социальное поведение» активно используется современными исследователями при описании процессов и явлений, обеспечивающих выживание бактерии в неблагоприятных условиях (Олескин с соавт., 2000).

Работы по изучению различных форм кооперативного поведения микробов, а также инициирующих его внешних условий и поверхностных бактериальных структур, обеспечивающих реализацию той или иной формы поведения, представляются перспективными для понимания оперативного «искусства» выживания бактериальных видов в природных экосистемах.

Бактерии рода AiospiriUum оказывают рост-стимулируюшее влияние на растения (Okon and Vanderleyden, 1997) и широко используются исследователями как модельный объект при изучении эффектов микробно-растительной ассоциативности (Steenhoudt and Vanderleyderi, 2000). Исследования последних нескольких лет показали, что для азоспирилл характерны несколько типов «социальной» активности, такие как образование бактериальных биопленок на границе раздела фаз, коллективное распространение в вязких средах с формированием концентрических колец роения и коллективная миграция в полужидких средах с образованием микроколоний (Кацы, 2007).

Формирование специфически организованных биопленок является очень распространенной формой существования бактерий в природных условиях, и наиболее активно этот феномен исследуется на примере патогенных бактерий (Хмель и Метлицкая, 2006; Kievit and lglewski, 2000). Особенности процесса формирования биопленок почвенными бактериями, в том числе, бактериями рода Azospirilltim, практически не исследованы. Вместе с тем, можно предположить, что именно этот способ социальной активности позволяет обитателям почвы не только выживать в неблагоприятных экологических условиях, но и, в случае ассоциативных взаимоотношений с растениями, обеспечивает эффективное взаимодействие с корневой поверхностью.

Известно, что при колонизации корней растений азоспириллы могут формировать мпкроколонни (Burdman el al., 2000). Очевидный интерес представляет исследование зависимости этого явления от способности изучаемых бактерий образовывать мпкроколонни (Gri* фенотип) при коллективной миграции в полужидких средах (Шелудько и Кацы, 2001), а также выявление поверхностных структур, обеспечивающие /мэдцзаиию. такого ,тппа «социального» поведения. [ РГАУ-МСХ.А

I имени К.А. Тимирязсиа | ЦНБ имени Н.И. Железно»;' ! Фон*, научной JiuxepiiTvtibi

\ N° л. -<2Ж гэ

Приспособление азоспирилл к различным условиям среды путем альтернативного запуска механизмов коллективного распространения в полужидких средах (роения или коллективной миграции с образованием микрокодоний) может значительно повышать адаптивный ресурс данных бактерий (5сЬе1ш1'ко е( о/., 2007). Поэтому заслуживает внимания поиск компонентов бактериальной поверхности, участвующих в определении способа коллективного поведения азоспирилл в средах, служащих прообразом пространства, окружающего корень растения.

В целом, выявление поверхностных полимеров, необходимых для реализации того или иного типа социальной подвижности ассоциативных бактерий, в первую очередь, в прикорневой зоне растений, представляется весьма актуальной проблемой, решение которой может способствовать развитию современных агробактернальпых технологий. При этом развитие нммунохимических подходов, позволяющих оценивать роль компонентов бактериальной поверхности в осуществлении различных процессов с участием бактерий, является самостоятельным и актуальным методологическим аспектом исследования.

Целью настоящей работы являлось выявление поверхностных структур А:о5р1гШим Ъгшйепье, участвующих в реализации различных типов «социальной» активности данных бактерии.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать природу межклеточного биополимерного вещества, образуемого А. ЬгавИете при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы,

2. Отработать методики на основе иммуноферментного анализа для оценки эффективности колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективности формирования биопленок на абиотических поверхностях.

3. Исследовать иммунохимнческую специфичность поверхностных иммуногенных белков А. ЬгазИете и оценить возможность выявления антигенов, характеризующих бактерии с определенным типом социальной активности.

4. Изучить вклад полнсахаридных и белковых антигенов в процесс коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах и колонизации корней растений,

5. Оценить изменения поверхностных структур А. ЬгахИете при контакте с соединениями, способствующими смене у бактерий способа социальной подвижности.

Научная новнзна работы определяется ее следующими основными результатами:

• Впервые выявлен белковый антигенный маркер, характеризующий бактерии А. ЬгазНете, коллективно мигрирующие с образованием мнкроколоний.

• Впервые показано, что реализация описанного ранее механизма распространения азоспирилл с образованием микроколоний (Шелудько и Кацы, 2001) может обеспечивать в ризосфере заселение этими бактериями растущих корневых волосков.

• Впервые нммунохнмическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя конго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий Gri* фенотипа) с детерминантами лнпополисахаридов (ЛПС) азоспнрплл.

Практическая значимость работы в значительной степени определяется развитыми в ходе ее выполнения методическими приемами, позволяющими оценивать эффективность колонизации азоспириллами корней пшеницы и эффективность формирования биопленок на абиотических поверхностях, а также уровень экспрессии тех или иных поверхностных структур, необходимых для реализации определенного типа социальной подвижности. Разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может быть рекомендован для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с молельными штаммами Azospirüium brasilense, и/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

Материалы диссертации использованы при написании учебно-методического пособия «Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам» (Саратов: Изд-во Научная книга, 2007 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Липополисахариды участвуют в структурной организации биопленок А. brasilense на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность». Прикрепление азоспнрплл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахарпдных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды.

• В составе наружной мембраны штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 дикого типа выявляется видо/родоспецифичный белковый антиген, идентичный таковому GrÍ+-мутантов A. brasilense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоннй.

• Усиление синтеза предсушествующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс мнкроколониального распространения азоспнрплл, происходит в результате взаимодействия с корнями пшеницы.

• Тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами Л, brasilense, »/или для отбора мутантов по структуре ЛПС.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщении на 9-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005); 2-м Агробиотехнологическом симпозиуме стран Балтии (Гамбург, Германия, 2006); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, Украина, 2006); 3-ей Региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Между народной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущ и но, 2006); Международной конференции «Ризосфера — 2» (Монпелье, Франция, 2007); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007) и Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007).

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории физической химии клеточных структур ПБФРМ РАН 1 февраля 2008 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано ] 3 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы н методы исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка не пользованных источников, содержащего 160 источников, и двух приложений. Работа изложена на N4 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 2 таблицы.

Работа выполнена в лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН в соответствии с плановыми темами НИР «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№ гос. регистрации 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.) и «Комплексный иммунохимическнй анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Выяснение молекулярно-генетическнх механизмов взаимодействий микроорганизмов с растениями как основы для развития эффективных современных генно-инженерных, экологических, аграрных и иных биотехнологий» в рамках государственного контракта с Роснаукой № 02.445.11.7130 (ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы») (руководитель научной школы д.б.н., профессор Игнатов В.В.). Работа поддержана грантами Президента РФ №№ 11111-1529.2003.4 и НШ-6177.2006.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из следующих разделов: 1.1. Понятие социальной активности бактерий; 1.2. Почвенные ассоциативные азотфиксирующие бактерии рода AzospiriUum как объект исследовании; 1.3. Молекулярные механизмы «ощущения кворума» (QS); 1.4. Формирование многоклеточных бактериальных образований; 1.4.1. QS-регуляиия в многоклеточных образованиях (биопленках); 1.4.2. Роль матрикса в мнкробных колониях; 1.4.3. Факторы, влияющие на эффективность формирования многоклеточных ассоциаций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии выращивали на синтетической малатной среде (Döbereiner and Day, 1976) при 30nC. Полужидкая среда содержала 0.4 % агар-агара. В некоторых случаях бактерии выращивали на среде LB (Sambrook et a!., J 989).

Для получения антител (Ат), специфичных к соматическим антигенам бактерий, использовали методику иммунизации животных целыми бактериальнымн клетками, предварительно обработанными 2% глутаровым альдегидом (Матора с соавт,, 199S).

Для получения Ат на весь пул поверхностных бактериальных антигенов кроликов иммунизировали путем инъекций в подколенные лимфатические узлы или множественных внутри кожных инъекций 1-го мл бактериальной суспензии, смешанной с равным объемом адъюванта Фрейнда, с четырьмя недельными интервалами.

Использованные в работе Ат на флагеллин типового штамма А. brasilense Sp7 были получены на высокоочишенные субъединицы полярного жгутика, разделенные с помощью электрофореза в ПААГ и извлеченные из геля путем специальной диффузии (Бурыгнн. 2003).

Двойную нммунодиффузию проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979),

Линейный и двумерный иммуноэлектрофорез проводили по Аксельсон с соавторами (Axelson et а/., 1973) с помошъю прибора «Multiphor II» (LKB. Швеция). Использовали 1%-ные агарозные гели, приготовленные на барбитал-глицпн-Трис-буфере с ионной силой 0.02 и pH 8.S.

ДСН-электрофорез (Hitchcock and Brown, 1983) проводили в 12.5% ПААГ. Для визуализации белков гели окрашивали Кумассн R-250.

При иммуноблоттинге проводили электроперенос разделенных компонентов на нитроцеллюлозные фильтры («Sigma», 0.22 мкм).

Для нммунодетекции антигенов в качестве первых Ат использовали кроличьи Ат на флагеллин типового штамма A. brasilense Sp7. В качестве вторых Ат использовали козьи антикроличьи Ат, меченые пероксидазой хрена («Sigma», США) (Tsang et я/., 1983).

Способность бактерий к формированию биопленок изучали согласно рекомендациям, приведенным в работе (Fernere and Clarke, 2003).

В экспериментах по инокуляции растений использовали мягкую яровую пшеницу Triticum aestivum cv. Саратовская 29. Распределение бактериальных клеток на корнях определяли методом нммунолюминесценции, Гомогенат отделенных корней трех растений использовали для определения численности бактерий методом подсчета колон иеобразующих единиц (КОЕ) и для нммуноферментного анализа с использованием Ат различной специфичности,

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в полистироловых 96-луночных планшетах. Тестируемые соединения иммобилизовали за счет простой адсорбции. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козлиными анти-кроличьнми антителами («Sigma», США). В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИИ, г. Санкт-Петербург).

Микроскопический анализ характера взаимодействия Ат с поверхностью бактериальных клеток проводили на приборе «BS-500» («Tesla», ЧССР) при ускоряющем напряжении 80 кВ, используя в качестве метки конъюгат коллоидного золота с протеином А.

Люминесцентную микроскопию проводили на микроскопе DAS фирмы Leica (модель DMLB), снабженным встроенным фотоаппаратом Leica MPS 60 (Швейцария).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунохимнческая идентификация поверхностных структур, участвующих в реализации социального поведения А:охр1п/1ит ЬгазНете, предполагала использование Ат, специфичных в отношении различных биомакромолекул, экспонированных на наружной мембране исследуемых бактерий. В настоящей работе использовали полнклональные кроличьи Ат.

Для оценки роли ЛПС азоспирилл были использованы обладающие О-антигенной специфичностью Ат, полученные на обработанные глутаровым альдегидом клетки бактерий модельных штаммов А. ЬгаьНете 5р7 и Йр245. С учетом моноспецнфичности данных Ат в отношении ЛПС (Матора с соавт., 1998; 2005), полученные таким способом Ат мы обозначали также как «Ат на ЛПС», а определения «экстракт наружных бактериальных мембран» н «препарат

ЛПС» в описании иммунохимических экспериментов с использованием этих Ат употребляли как синонимы,

Для опенки роли Н-антигена полярного жгутика использовали Ат на изолированные субъединицы жгутика типового штамма А. ЬгазМеже Бр7 (Бурыгин, 2003), Для исследования роли поверхностных белковых антигенов нефлагеллиновой природы в работе были получены и охарактеризованы антитела на пул белковых антигенов наружной мембраны.

Исследование специфичности нмму ноге иных, белковых антигенов бактерий

А. ЬгазНепве

Для оценки антигенной специфичности поверхностных иммуногенных белков азоспирилл были получены кроличьи поликлональные Ат на интактные клетки бактерий модельных штаммов А, ЬгазНеже Бр7 и Бр245, относящихся к различным серологическим группам согласно характеристикам их ЛПС или О-антигена (Матора с соавт., 2005). Кроликов иммунизировали суспензиями отмытых от капсулы клеток, вводя их внутрикожно или в подколенные лимфатические узлы. Полученные Ат на интактные клетки, в отличие от О-слецифнческих Ат на клетки, обработанные глутаровым альдегидом (Матора с соавт,, 1998), обладали более широкой специфичностью и, наряду с О-антигеном, взаимодействовали с белками, входящими в состав наружной мембраны всех протестированных штаммов азоспирилл. В то же время, у Ат на интактные клетки азоспирилл не было выявлено перекрестных реакции с препаратом флагеллина типового штамма А. Ьга$Ие>ке 5р7. Последний результат ,....,,..-г.. согласовался со сделанным ранее наблюдением о наличии : , ; ■ ; чехла полисахаридной природы на поверхности полярного жгутика азоспирилл (Бурыгин, 2003), который экранирует флагеллин жгутика, в том числе, и от им му но компетентных клеток.

Анализ картины пммунопрешшнташш позволил выявить в составе наружной мембраны диких типов Бр7 и 5р245 не менее трех различных видо'родоспецифичных белковых антигенов (отлнчных от антигена полярного жгутика или Н-антигена) (рис. I). Полученные результаты свидетельствовали о консерватизме мажорных белков, формирующих наружную мембрану азоспирилл, и позволили в дальнейшем использовать для перекрестного выявления белковых антигенов данных бактерий Ат на целые клетки серологически отличного штамма.

Рис, I. Результат линейною 11 м м \ I к>мешрофоре>а экстрактов наружных меч (¡ран штаммов ,4. Ьпзч>к»'><.' )!) и Йр245 (2} с ашн телами на интактные клетки 5р7 (А).

Иммунохнмнческий анализ взаимодействия азосиприлл с абиотическими и биотическими поверхностями

Известно, что при росте бактерий в природных местах обитання, а также на абиотических поверхностях формируются бноплёнкн - высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. С помощью ИФА, иммунодиффузионного анализа и им мунофлуоресцентной микроскопии с использованием Ат различной специфичности была исследована природа межклеточного биополимерного вещества, образуемого азоспириллами при прикреплении к стеклу, полистиролу и к поверхности корней растений. Работа выполнялась совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов и лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН.

Для определения антигенной природы биопленок, формируемых азоспириллами при прикреплении к гидрофильной поверхности, в качестве твердой фазы использовали покровные стекла, которые выдерживали в течение 4-х суток (96 ч) в бактериальной суспензии, осторожно отмывали ЗФР, инкубировали в растворе соответствующих кроличьих выявляющих Ат, а затем в растворе ослиной анти-кроличьей люминесиирующей сыворотки. Образованные в процессе непрямого мечения комплексы просматривали с помощью люминесцентного микроскопа. Использование Ат на ЛПС (в отличие от Ат на белковые детерминанты) приводило к выявлению в препаратах ярко светящихся структур на темном поле, что служило доказательством образования иммунных комплексов (рис, 2).

л Е

Рис. 2. Результат имччноф.туоресцентноП микроскопии бн о плен к и. сформированной А. М«|А™<? Sp24^ на иойеръносш стекла. Ятя выявления антигенов нснолыавапы Лт на ЛИС (Л) и ролоспсимфичные Ат на оелковые до юрмппэнтьг (Б), Для сравнения в ннткнеч рял> приведены >1 юпражешгя. получен лис в нсюхоляшем свете. Длина масштабной линейки 100 мкч

Следовательно, межклеточный матрнкс, формируемый азоспирилдами при прикреплении к гидрофильной поверхности (по меньшей мере, его экспонированный слой) имеет пол пса хари дну ю природу и содержит антигенные детерминанты, идентичные детерминантам ЛПС.

Для анализа бнопленок, формируемых на гидрофобной поверхности (полистироле) штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами с измененной структурой ЛПС, был использован метод иммуноферментного анализа. 18-часовые культуры бактерий в LB разводили стерильной средой, вносили суспензии в ячейки полистирольных планшетов и инкубировали без встряхивания в теченне 96 ч при 30°С. По окончании культивирования планктонные бактерии удаляли аспирацией, и ячейки планшетов осторожно промывали водой. Иммуноферментиый анализ сформированных бактериями биопленок проводили непосредственно в лунках данных планшетов. Параллельно проводили ИФА планктонных бактериальных культур, выращенных на жидкой среде LB, а также оценивали выраженность бактериальных пленок, образуемых на поверхности пластика, с использованием красителя кристаллического фиолетового (Ferriére and Clarke, 2003).

Было установлено, что общее количество полисахаридных антигенов в биопленках, образуемых на гидрофобной поверхности диким штаммом Sp245 и его мутантами, дефектными по синтезу одного из двух характерных для дикого типа О-специфических полисахаридов - 0-ПС1, различается несущественно, В то же время планктонные клетки О-ПСГ мутантов взаимодействовали в ИФА с антителами менее эффективно, чем штамм дикого типа. С учетом примерно равного количества биомассы в пленках, формируемых штаммом дикого типа и мутантами, можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках О-ПСГ мутантов активируется синтез полисахаридов.

Обшее количество полисахаридных детерминант, продуцируемых 0-ПС2" мутантом, как бульонной культуре, так и в биопленках, было значительно выше, чем у других штаммов. Однако и у данного мутанта при взаимодействии с твердой гидрофобной поверхностью можно было наблюдать усиление продукции полисахаридных антнгенов.

Очевидно, что дефект синтеза каждого из О-ПС исследованных бактерий компенсируется повышением уровня продукции других ПС, принимающих участие в образовании бнопленки, При этом продолжительный контакт с гидрофобной поверхностью приводит к активизации синтеза полнсахарпдных детерминант.

Таким образом, было показано, что липополисахариды (О-антигены) участвуют в структурной организации бнопленок азоспирилл на границе раздела фаз «жидкость - твердая гндрофнльная/гидрофобная поверхность». При этом прикрепление азоспирилл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антнгенов, нзодирукшжх бактерии от окружающей среды.

Иммуиофлуоресцентная микроскопия корней растений, ино кулмрованных

Л, brasiiense Sp245

С помощью и м му нофл у о pec це нт но й микроскопии был исследован характер экспрессии поверхностных антигенов A. bras'dense Sp245 в процессе прикрепления бактерий к поверхности корней проростков пшеницы.

Результаты иммуномечения показали, что, в отличие от контакта с абиотическими поверхностями, взаимодействие с поверхностью растительного корня приводит к экспрессии как полисахаридных, так и белковых поверхностных антигенов. Однако характер выявления данных антигенов существенно различался. В то время как Ат на ЛПС выявляли скопления бактериальных клеток н сформированную пленку на поверхности корней и корневых волосков (рис. ЗА), Ат на белковые детерминанты выявляли исключительно клеточные агрегаты (рис. ЗБ). При этом картина иммунофлуоресценцин в части выявления скоплений бактериальных клеток в случае использования Ат на ЛПС заметно отличалась от таковой с использованием Ат на белковые детерминанты. В первом случае немногочисленные клеточные агрегаты тесно прилегали к поверхности корневых волосков, оплетая их (рис. ЗА), и, очевидно, отсоединялись от поверхности корня в ходе растяжения клетки волоска. В то время как в последнем случае флуоресценция агрегатов носила диффузный характер (рис. ЗБ).

Следует подчеркнуть, что наблюдаемая картина была характерной для седьмых суток, прошедших с момента инокуляции корней

бактериями. Анализ полученных результатов (с учетом среднего времени жизнн одного корневого волоска - 24 часа), позволил высказать

предположение, что заселению растущих корневых волосков азоспириллами может способствовать реализация описанного ранее механизма распространения с образованием мнкроколоний (Шелудько и Кацы, 2001). Тогда как распространение исследуемых бактерий по поверхности собственно корня (и, в значительно меньшей степенн, по поверхности корневых волосков), очевидно, происходит в составе биопленок.

Рис. 3. Результат нч ч > нофл vopec iw нп юП микроскопии корпсП пшеницы, инскулираванмых А. brtisik-iгл.* Np245. П.1Я выявления aintiгенов пеполыовзны Дг на ЛИС (Л) и ролосн^нифичкые Ат на (»елковме детерминанты <F>>. Длина чзсчмабноЯ линейки 100 мкм.

Выявление белкового антигена, характеризующего Gri+ фенотип бактерий A. brastlense

Коллективная ми фация с образованием зернистых скоплений бактерий (мнкроколоннй) — так называемый, Gri+-Tim подвижности — является одним из проявлений социальной активности бактерий рода AzospiriUum (Шелудько и Кацы, 2001), Этот способ колониальной подвижности реализуется у мутантов азоспирилл, неспособных к роению в полужидких средах за счет вращения полярного жгутика, а также у диких штаммов под влиянием ряда факторов окружающей среды (Шелудько с соавт., 2006; Кацы, 2007),

Для выявления у азоспирилл антигена, характеризующего бактерии с Gri+ фенотипом, был проведен сравнительный иммунохимическнй анализ белковых антигенов, выделенных из наружной мембраны дикого штамма A. brastlense Sp245 и его GrT-мутанта SK048, Для выявления антигенов использовали Ат на ннтактные клетки штамма A. brastlense Sp7.

Было установлено, что только один из родоспецифичных белковых антигенов азоспирилл А

идентичен таковому Gri1"-мутанта, распространяющегося с образованием микроколоннй (рис. 4).

С помощью иммуноферментного анализа сравнили общее количество белковых детерминант, синтезируемых планктонной культурой дикого типа Sp245, с общим количеством белковых детерминант планктонной культуры его Gri+-мутанта. Примерно одинаковый уровень выявления )

данных детерминант позволил сделать вывод о с верх продукции белкового антигена, характерного для \ j

мутантного штамма. ^ I j * 2

Для подтверждения возможности означенного антигена являться маркером Gri* фенотипа у азоспирилл, провели серию экспериментов с использованием витального j красителя конго красного. Выбор данного агента был обусловлен тем, что его адсорбция на клеточной поверхности * -азосппрнлл приводит к стабильному проявлению у бактерий i : способности к распространению в полужидкой среде с образованием мнкроколоннй (Шелудько с соавт., 2006). : ' ™ .............

Рис. 4. Результат сравнительного линейного пмчуномектрофорои (чгжовмх антигенов наружной исчораны планктонной культуры дикого штамча -•). brasilense Sp2-t5 (1) н Gri "-мутанта SKCM8 (2) с родоснеиифичнычи А г на белковые лстермлиалты.

Смену способа коллективной подвижности клеток модельного штамма в полужидкой среде, содержащей краситель (переход от роения к Gri~-подвижности), наблюдали визуально, уровень экспрессии белковых антигенов оценивали посредством ИФА, идентификацию Gri-антигеиа в образцах проводили с помощью двумерного иммунозлектрофореза.

По результатам ИФА, переход к Сп+-типу подвижности дикого штамма Бр245 в присутствии конго красного сопровождался выявлением на поверхности его клеток на 30% больше белковых детерминант по сравнению с клетками, выращенными на полужидкой среде без красителя.

В ходе двумерного пммунозлектрофореза экстрактов наружных мембран клеток 5р245, распространяющихся в полужидкой среде с помощью роения (¡) и мигрирующих с образованием мнкроколоннй (и) в сравнении с экстрактом наружных мембран ОгГ-мутанта 5К048 (¡и) Ат на белковые детерминанты выявили один и тот же мажорный антиген в составе двух последних препаратов.

Для точной классификации данного белка представляется необходимым проведение в дальнейшем соответствующих биохимических и электронно-микроскопических экспериментов. Вместе с тем, полученные к настоящему времени результаты дали основание рассматривать антиген белковой природы, экспрессируемый бактериями, мигрирующими с образованием микроколоний, в качестве антигенного маркера СгГ фенотипа азоспирилл.

Количественная оценка участия поверхностных антигенных детерминант в колонн 1ашш штаммом Л. ЬгазЫепзе 5р245 корней пшеницы

Использованный в предыдущих экспериментах витальный краситель конго красный, приводящий к проявлению у азоспирилл способности к распространению с образованием мнкроколоннй, может имитировать действие определенных компонентов поверхности корней растений (Кацы, 2007). Настоящий раздел работы был посвящен количественной оценке уровня синтеза поверхностных антигенных детерминант клетками штамма 5р245 при колонизации корней пшеницы. Работа выполнялась совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН.

Дтя получения количественных оценок участия поверхностных антигенов азоспирилл в процессе колонизации корней пшеницы были оптимизированы условия проведения твердофазного ИФА. Тестируемыми образцами в данном случае являлись гомогенаты корней инокулированных растений. Экспериментально были выбраны оптимальные разведения образцов, дающие достоверные результаты при проведении сравнительного ИФА. Анализ результатов титрования антигена позволил производить разведение проб (т.е. гомогенатов корней 3-х растений в 1 мл забуференного фосфатами физраствора) в 80 раз. Концентрация выявляющих антител составляла 50 мкт.'мл. С учетом необходимых повторностей (до 8-ми), в одном эксперименте анализировали до 40 различных проб. Данные, полученные с помощью ИФА. соотносили с результатами подсчета КОЕ,

Результаты, полученные с помощью ИФА с использованием Ат на ЛПС. продемонстрировали хорошую корреляцию с результатами подсчета КОЕ (рис, 5) и позволили прийти к заключению о возможности применения

оптимизированного протокола ИФА для количественной оценки колонизации азосппрнллами корней пшеницы.

" '' -¿м г чи " ■

• ЛНУТЧ1 >,' ЧЧ^ I 1М'> . '->■: Л.

СО £о

ММиччы

Рис. 5. Определение количества бактериальных липополнеахаридных детерминант в гомогенатах корней растеипП, ннокулнрованных А. Ьгашк'пхе Эр245 с помошыо ИФЛ с негюдьтованнем Дг на ЛПС А. Ьга$/!епхе Яр245 (Л), коррелирующее с результатами подсчета КОЕ (Г>).

Результаты ИФА с использованием Ат на белковые антигены показали, что динамика выявления данных детерминант отлична от липополнеахаридных. Если количество выявляемых Л ПС-детерминант достигало максимума к 3 ч и снижалось через 7 суток более чем в 2 раза (что коррелировало со снижением численности бактерий по результатам подсчета КОЕ), то количество выявляемых белковых детерминант при этом не уменьшалось, а, напротив, увеличивалось (в пересчете на количество бактерий (рис. 6).

Полученные данные вкупе с результатами иммунофлуоресиентной микроскопии и нормированных корней растений позволили предположить, что в процессе взаимодействия с корнями лшенниы у азоспнрнлл происходит усиление синтеза предсуществующнх белковых поверхностных структур -возможно, пилей. обеспечивающих ОгГ-тип подвижность.

Это предположение

подтверждалось результатами

экспериментов по колонизации корней пшеницы СгГ-мутантамн штамма 5р245. Будучи выращенными на бульонной культуре, клетки этих мутантов и дикий тип 5р245 демонстрировали близкий уровень выявления липополнеахаридных детерминант. На этапе адсорбции липополисахаридиые детерминанты в

ф.ити'

ГН; ■

Ч ¡] I»

XI I.

Рис. 6, Определение количества бактериальных липополнеахаридных и оелковы* детерминант в гомогенатах корней раекчшн, ннокчдирояанных А. ЬюзНепБе Кр245 с помощью ИФЛ с использованием ро.юснецпфн'шых Л г на оелковые (Ат.-'Б) н А г на ЛПС Л|,

составе образцов (гомогенатов корней) выявлялись в несколько раз лучше в случае инокуляции диким типом 5р245 по сравнению с мутантами - что говорило об определяющей роли полярного жгутика (не функционирующего у ОгГ-мутантов) на данном этапе колонизации. Однако на более поздних этапах колонизации (7 суток) именно для ОгГ-мутантов было характерно существенное нарастание количества прикрепившихся клеток, что, вероятно, объяснялось участием пилей.

Следовательно, антиген белковой природы, характерный для клеток А. ЬгшИепзе, распространяющихся в составе микроколоний, участвует в заселении корней пшеницы данными бактериями. Усиление его синтеза, очевидно, может быть вызвано как взаимодействием азоспирилл с некими (пока неизвестными) компонентами корней растений, так и препятствиями любого рода, возникающими при распространении бактерий в вязких средах.

Исследование коллективной подвижности бактерий Л. ЬгахИепзе в полужидких средах, содержащих антитела различной специфичности

Чтобы выяснить, меняется ли коллективное поведение азоспирилл при создании препятствий их распространению в вязких средах, мы использовали оригинальный подход, основанный на добавлении Ат на различные детерминанты бактериальной поверхности в полужидкую синтетическую среду для культивирования (которую с некоторым допущением можно рассматривать как аналог среды обитания бактерий). Мы оценивали влияние на коллективную подвижность Ат, взаимодействующих с флагеллпновыми, с общим пулом белковых, а также с липополисахаридными детерминантами бактерий рода А:озр1П'11шп.

Известно, что на поверхности полярного жгутика модельных штаммов азоспирилл обнаруживается чехол (лнпо)полнсахарндной природы, и добавление к клеточной суспензии штаммоспецифичных Ат на ЛПС приводит к ингнбированию подвижности бактерий в жидких средах, Для штамма А. ЬгахНепзе 5р245, являющегося объектом нашего исследования, было показано, что материал чехла жгутика иммунохимически идентичен одному из О-специфических полисахаридов (О-ПС!) (Бурыгин, 2003), Нам предстояло выяснить, насколько полно полнсахариднын чехол экранирует флагеллин, и не происходит ли смещения чехла при движении бактерий в вязкой среде.

Добавление Ат на флагеллин в полужидкую среду не изменяло характер распространения тестируемых штаммов и практически не сокращало диаметр кольца роения бактерий (рис. 7), что говорило о надежной экранирован ноет и флагеллина полярного жгутика у азоспирилл.

Ат на белковые детерминанты незначительно, но достоверно сокращали диаметр зоны распространения клеток 5р245 в полужидкой агаризованной среде. Однако характер их распространения не изменялся, и бактерии в присутствии данных Ат формировали концентрические кольца роения.

Рис. 7, Характер коллектив но (1 подвижности клеток А. ЬгахНепщ 5р245 в полужидких средах в присутствии Лт на флагеллин (Дт/Па), на белковые детерминанты (Лт/Б) и на ЛИС (Ат/ЛПС),

Антитела к ЛПС значительно снижали скорость распространения азоспирнлл, н способ распространения бактерий изменялся с увеличением концентрации Ат. На рис. 7 можно видеть, что добавление штаммоспецифичных Ат на ЛПС в полужидкую среду до конечной концентрации 5^7 мкг/мл приводило к появлению во фронте распространения одиночных мнкроколоний, однако бактериальная популяция сохраняла способность к роению. В то время как при концентрации Ат 10+100 мкг/мл колонии формировались только на поверхности агара, а в толще полужидких сред распространение бактерий блокировалось полностью.

Вероятно, Ат к ЛПС, будучи добавленными в среду распространения бактерий до концентрации 10 мкг/мл, начинали создавать препятствия (возможно, стерического характера) для вращения полярного жгутика, и дальнейшее увеличение концентрации данных Ат полностью блокировало любой тип коллективной подвижности.

Учитывая, что Ат на белковые детерминанты (взаимодействующие с собственно бактериальной поверхностью) даже в больших концентрациях лишь сокращали диаметр зоны роения бактерий, мы полагаем, что смена способа коллективного распространения азоспирнлл в присутствии Ат на ЛПС является, в частности, следствием возникновения затруднений вращения полярного жгутика, в результате чего у бактерии в полужидких средах может индуцироваться Оп* фенотип.

Следует также отметить, что в настоящей работе была оценена возможность практического использования эффекта ннгибирования подвижности азоспирнлл в присутствии Ат на ЛПС и разработан тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в агаризованные среды со специфическими Ат, предложенный к применению для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами А. ЬговИете, и/ил и для отбора мутантов по структуре ЛПС.

11 мму но* и ми чески Л анализ ЛПС бактерий А. ЬгаьНете 5р245, выращенных в присутствии конго красного

Несомненный интерес представляла регистрация изменений, происходящих с ЛПС азоспирилл при контакте с природными соединениями, предположительно, способствующими смене у части бактерий способа коллективной подвижности. Но, поскольку гомогенаты/экссудаты корней растения представляют собой сложную многокомпонентную систему, оправданным было использование конго красного для оценки возможных вариаций бактериальных ЛПС,

Были оценены изменения, происходящие с ЛПС А. ЬгаьНете 5р245 при их росте на среде, содержащей данный краситель. В экспериментах использовали клетки дикого типа $р245 и мутантов этого штамма с измененной структурой ЛПС. Для подавления роения бактерий и проявления у них СгГ фенотипа краситель добавляли в полужидкую культуральную среду до концентрации 37,5 мкг/мл. Антигенные структуры сравнивали с помощью линейного иммуноэлектрофореза с использованием штаммоспецифичных Ат на ЛПС.

Было установлено, что выращивание бактерий в присутствии конго красного изменяет картину нммунопрецнпитации их ЛПС и приводит к выявлению дополнительных иммунных комплексов (рис. 8).

Рис. 8. Картина имчппопрештиташш препаратов ЛПС дикого штамма А. ЬгазИепж 5(>245, его О-ПС Г- мутантов К\Ш8 и КМ252 и 0-ПС2 -мутантов КМ 139 н КМ018, Буквой «к», о&иначепы препараты, выделенные п> бактерии выращенные в полужидкой среде с добавлением конго красного (37,5 мкт/ил). Для выявления знтнгеиов нспольтовалн А г на ЛПС 5р24.\

Результаты линейного иммуноэлектрофореза показали, что данный краситель связывается с некими детерминантами в составе исследуемых препаратов, что приводит к формированию структур, обладающих катодной подвижностью. При этом основная масса красителя при электрофорезе двигалась независимо от ЛПС, в результате чего можно было наблюдать окрашенные треки, имеющие характерную форму ракеты и направленные в сторону анода.

Сравнение картин иммунопреципитации ЛПС дикого штамма 5р245 и его мутантов с измененной структурой ЛПС показало, что дополнительные полосы появляются как у О-ПСГ-, так и у 0-ПС2~-мутантов, Поскольку выявляемые новые иммунные агрегаты нельзя было однозначно охарактеризовать как полосы преципитации (исключение составлял лишь ЛПС КМ134), мы предположили, что конго красный может образовывать прочные комплексы с липидной или с коровой областью ЛПС азоспирилл. Возможно, блокирование красителем именно этих детерминант в составе ЛПС Бр245 делает невозможным (или затрудняет) роение клеток, вследствие чего индуцируется ОН* фенотип.

Следует отметить, что полученные результаты хорошо согласовались с данными Конновой с соавт. (1994) о комплексообразовании конго красного с липополнсахарнд-белковыми комплексами и с полисахаридами, выделенными из полисахарид-липидных комплексов ряда штаммов А. ЬгаШепм, а также полученными в настоящей работе результатами сравнительного спектроскопического анализа свободного и адсорбированного на поверхности бактериальных клеток красителя (пик поглощения света красителем сдвигался в последнем случае в длинноволновую область на 19±2 нм (примерно от 490 до 510 нм).

Таким образом, в настоящей работе впервые нммунохпмнческими методами удалось выявить взаимодействие витального красителя конго красного с детерминантами ЛПС азоспирилл и зафиксировать сопряженное с этим событием усиление синтеза белковых структур, являющихся, по нашему предположению, маркерами ОН+фенотипа у азоспирилл.

Поскольку данное соединение имитирует действие неких компонентов поверхности корней растений, изменяющих социальное поведение азоспирилл, полученные результаты могут способствовать раскрытию молекулярных механизмов взаимовыгодных отношений ассоциативных азоспирилл с растениями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененные и развитые в настоящей работе нммуиохпмические приемы (в частности, варианты иммуноферментного анализа для определения специфических антигенных детерминант в составе бактериальных биопленок, количественных оценок колонизации азоспнрлллами корней растений; оригинальный тест, основанный на точечной инокуляции исследуемых бактерий в полужидкие агаризованные среды с антнтелами различной специфичности и

др.) позволили идентифицировать поверхностные структуры, участвующие в реализации различных форм социального поведения почвенных ассоциативных бактерий А-оьрггШипг ЬгазИете.

Наиболее значимым результатом работы представляется выявление способа социального поведения азоспирнлл, дающего им возможность заселять корневые волоски растений. На основе полученных экспериментальных данных сформулировано предположение о том, что именно реализация описанного ранее механизма распространения азоспирнлл с образованием микроколоний (Кацы, 2007) обеспечивает в ризосфере заселение азоспириллами растущих корневых волосков. Тогда как распространение исследуемых бактерий по поверхности собственно корня, преимущественно, происходит в составе бнопленок.

С помощью иммуноферментного и иммунодиффузионного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии исследована природа межклеточного биополимерного вещества, образуемого азоспириллами при формировании бактериальных биопленок на абиотических поверхностях и корнях пшеницы, Для модельного штамма А. Ьгаз1!еп$е Бр245 установлено, что материал, экстрагированный из бнопленок, как и капсульный материал, антигенно идентичен одному из О-спеинфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данного штамма.

Выявленное в работе усиление синтеза полисахаридных антигенов, сопровождающее прикрепление азоспирнлл к абиотическим поверхностям, очевидно, имеет защитный характер. В то время как биопленка на поверхности растительных корней, кроме защитных функций, может обеспечивать также пассивный способ распространения иммобилизованных в ней бактерий по растущему корню.

Анализ полученных результатов позволил предположить существование следующей стратегии поведения азоспирнлл в ризосфере:

• при контакте с поверхностью корня происходит формирование многоклеточных бактериальных образований, изолированных от окружающей среды полисахарндным матрнксом;

• бактериальные биопленки, тесно прилегающие к растительной ткани, растягиваются по поверхности корня в процессе его роста;

• при изменении влажности среды у части популяции может возвращаться способность к роению, которое, в свою очередь, при определенных условиях сменяется Оп-подвижностью.

Переход от роения к Оп-подвижности является как следствием возникновения затруднений для вращения полярного жгутика, так и результатом взаимодействия неких компонентов корней растений (а также соединений, имитирующих их действие) с консервативной областью ЛПС наружной мембраны бактерий. Представляется весьма вероятным, что макромолекулы ЛПС выполняют ключевую роль (среди контактных структур) в определении способа коллективного поведения бактерий Л:о5р!гШит ЬгазИете в

полужидких/вязких средах, которые обычно возникают в пространстве, окружаюшем корень растения.

В составе наружной мембраны диких типов серологических различных модельных штаммов A. brasileme Sp7 и Sp245 выявлен белковый антнген, идентичный таковому ОгГ-мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний. Полученные результаты дали основание рассматривать этот видо/родоспецифичный антиген белковой природы, экспрессируемыП бактериями, мигрирующими с образованием микроколоний, в качестве антигенного маркера Gri+ фенотипа азоспирилл.

Выявленное в работе усиление синтеза данного маркерного белка азоспирилл при взаимодействии бактерий с корнями пшеннцы хорошо согласуется с литературными данными и, в частности, с результатами, полученными в работе Башан и Леванони (Bashan and Levanony, 1989). Имеются основания полагать, что продемонстрированное этими авторами существенное усиление адсорбции клеток A. brasUense Cd на поверхности корневых волосков после предобработки азоспирилл корневыми экссудатами обеспечивается именно экспрессией у бактерий Gri* фенотипа.

Исследование коллективного распространения азоспирилл в полужидких средах в присутствии антител на различные детерминанты клеточной поверхности позволило получить свидетельства вклада выявленного ранее (Бурыгин, 2003) полисахаридного чехла полярного жгутика в реализацию подвижности данных бактерий. Последний методический прием может быть рекомендован в качестве серологического теста для использования в микробиологических лабораториях, не оснащенных специальным оборудованием и реактивами для иммунохнмнческих экспериментов.

Полученные в работе результаты могут способствовать более полному пониманию молекулярных механизмов взаимовыгодных отношений ассоциативных бактерий с растениями, а также развитию соответствующих агробактериальных технологий,

ВЫВОДЫ

1. Иммунохимический анализ с использованием антител, специфичных в отношении различных биомакромолекул, экспонированных на наружной мембране Azospirilhmi brasHense. позволил качественно и количественно охарактеризовать вклад полисахарндных и белковых антигенов в осуществление коллективной миграции азоспирилл в вязких средах; их роль в процессах образования бактериальных бнопленок на границе раздела фаз и распространения в полужидких средах с образованием зернистых скоплений бактерий (микроколоний).

2. Показано, что л и по полисахариды (О-антигены) участвуют в структурной организации биопленок Azospirilfum brasilensc на границе раздела фаз «жидкость - твердая гидрофильная/гидрофобная поверхность».

Установлено, что прикрепление азоспирнлл к абиотическим поверхностям сопровождается усилением синтеза поверхностных полисахаридных антигенов, изолирующих бактерии от окружающей среды.

3. В составе наружной мембраны штаммов A. brastlense Sp7 и Sp245 дикого типа выявлено не менее трех в и до/ро лоспец иф 11 ч н ы х белковых антигенов, отличных от Н-антигена полярного жгутика. Обнаружено, что только один из этих антигенов идентичен таковому GrP-мутантов A. brastlense Sp245, распространяющихся с образованием микроколоний.

4. Показано, что в процессе взаимодействия с корнями пшеницы происходит усиление синтеза предсуществующих белковых поверхностных структур, вовлеченных в процесс микроколониального распространения азоспирилл и являющихся антигенными маркерами GrP фенотипа у данных бактерий.

5. Впервые иммунохимическими методами продемонстрировано взаимодействие витального красителя коиго красного (приводящего к стабильному проявлению у бактерий GrP фенотипа) с детерминантами ЛПС азоспирнлл.

6. Показано, что разработанный тест, основанный на точечной инокуляции бактерий в полужидкие агаризованные среды, содержащие антитела на ЛПС, может применяться для скрининга штаммов, демонстрирующих антигенные перекресты с модельными штаммами Azospirillum brastlense, и/пли для отбора мутантов по структу ре ЛПС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурыгин ГЛ., Широков A.A., Ше,. ^ A.B., Каиы E.H., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю, Выявление чехла" 'W¡ поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense И Микробиология. - 2007, - Т. 76, № 6. - С. 822-S29.

2. Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам / Сост.: A.B. Шелудько, Е.И. Кацы, Л.Ю. Матора, Г.Л. Бурыгин, A.A. Широков, С.Ю. Щеголев; под ред. В.В. Игнатова: Учеб. метод, пособие для студентов и аспирантов хим. и биол. факультетов. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2007. - 56 с.

3. Широков A.A., Шелудько A.B., Бурыгин ГЛ., Кацы Е.И., Панасенко В,И., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Исследование влияния антител различной специфичности на подвижность бактерий Azospirilhm brasilense в жидких и агаризованных средах // Сб. тр. 9-й Международной Пушннской школы-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пушино, Россия, 1822 апреля 2005 г. - С. 222.

4. Matora L.Yu., Burygin G.L., ShíroVfw A.A., Krasov A.A. Immunochemical detection and enumeration of ba<- ' --the environment // Abst. The Second Baltic Sea Region Symposium agro-biotechnology focused on root-microbe systems. - Hamburg, February ■—■°o, Germany, - P. 38,

5. Бурыпш ГЛ., Широков A.A., Шелудько A.B.. Соколова М.К., Соколов О.И., Плешакова Е.В„ Кацы Е.И, Щёголев С.Ю., Матора Л.Ю. Специфическое выявление бактерий в почве и на корнях растений // Тез и доповией Мгжнаролна наукова конферншя «Mrtcpoôni бютехнологш». — Одеса, У кража, 11-15 вересня 2006. - С. 40.

6. Кулнбякина О.В., Шелудько A.B., Петрова Л.П„ Широков A.A., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Роль л »полисахаридов AzospiriUum brasileme в формировании бнопленок П Матер, 3-ей регион, конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 10-12 октября 2006 г.). - Саратов: Изд-во «Научная книга». - С. 15.

7. Шелудько A.B., Широков A.A., Кулнбякина О.В., Петрова Л.П., Хлебцов Б.Н., Соколова М.К., Матора Л.Ю., Капы Е.И. Изменения в социальной активности и взаимодействие AzospiriUum hrasílense с проростками Trilictim aesrivimi cv /7 Там же. - С. 18.

8. Широков A.A., Шелудько A.B., Кулнбякина О.В., Матора Л.Ю. Использование иммунохимическпх подходов в исследовании роли липополисахаридов бактерии AzospiriUum brasil ease в реализации социального поведения бактерий // Там же. - С. 30.

9. Петрова Л.П., Шелудько A.B., Широков A.A., Матора Л.Ю.. Кацы Е.И. Генетическая гетерогенность и изменения структуры клеточной поверхности в популяциях AzospiriUum brasílense H Материалы межд. школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». - Москва-Пушино, 28 ноября-1 декабря 200 ; -^.С. 70.

10. Burygin G., Shirokov A., Krasov A. ^Jiciiyogolev S., Matora L. Immunochemical revealing of soil and rhizosplier».-bacteria tl Abstr. Intern. Conference «Rhizosphere-2», - Montpellier. France, August 26-31.2007. - P. 79,

П. Шелудько A.B., Тугарова A.B., Широков A.A.. Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Внешние факторы, влияющие на социальную активность стимулирующих рост растений бактерий рода AzospiriUum И Сб. матер. Междунар, науч. конф. «Микроорганизмы и биосфера» - Москва. 19-20 ноября 2007 г. - С. 149,

12. Широков A.A., Шелудько A.B.. Бурыгнн Г.Л.. Каны Е.И.. Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Антигенные структуры бактерий рода AzospiriUum, участвующие в реализации их социальной активности // Сб. магер. Всеросс. конф. с междунар. участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 25-27 сентября 2007 г.). -Саратов: Научная книга, 2007. - С. 37.

13. Шелудько A.B., Широков A.A., Кулнбякина О.В.. Пономарева Е.Г.. Тугарова A.B., Никитина В.Е., Ahtohkv '''.-JJ.. Матора Л.Ю.. Кацы Е.И. Внутрипопуляционные и внешнйе фаыоры. определяющие изменения в социальной активности AzospiriUum hr^tsUense .'-■* Там же. - С. 42.