Хитин-специфичные пероксидазы растений

Черепанова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хитин-специфичные пероксидазы растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хитин-специфичные пероксидазы растений"

На правах рукописи

ЧЕРЕПАНОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХИТИН-СПЕЦИФИЧНЫЕ ПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2005

Раб01а выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук. сне

Максимов Игорь Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических нау к. профессор

Ибра! имов Ринат Исмагилович

кандидат биологических наук Ьасченко Игорь Анатольевич

Ведущая opi аиизаиия: Институт биохимии им А.Н. Баха РАН

Зашита диссертации с0сюи!ся «16» июня 2005 i в ¿¿¿_ часов на 5аседании Peí ионального диссертационного совета КМ 002 133 01. при Институте биохимии и генетики Уфимскою научною центра РАН по адресу. 450054. Уфа. проспект Октября. 71.

С шссергацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научною центра РАН

Авторефера! разослан « » мая 2005 г

Ученый секретарь

Peí монадьною диссертационно!о совета Z'У h < - Ьикбулатова С М.

ОЫЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Определение механизмов взаимодействия между молекулярными компонентами растений и патогенов, ведущих к формированию совместимых или несовместимых отношений между партнерами, является одной из наиболее актуальных задач современной биохимии В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода (АФК), большое внимание стали уделять оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке [Ilippeli el al. 1999: Droge. 2002]. Среди тгого обширного класса ферментов особый интерес представляет пероксидаза, учаавующая во многих биохимических реакциях, происходящих в живом организме [Савич. 1989. Passardi et al, 2004]. Основная функция этого фермента состоит в детоксикации Н2О2 [Gechev et al. 2002] и окислении фенольных соединений с образованием лигнина и суберина | Hawkins. Boudet. 2003: Kawano. 2003], однако роль отдельных изопероксидаз в биохимических процессах, происходящих в растениях, до конца не ясна.

Активность пероксидазы коррелирует с развитием устойчивости растений как к абиотическим, гак и биотическим стрессам Лигнификация, осуществляемая пероксидазой. играет чрезвычайно важную роль в защите растительных тканей от фитопатогенов Образовавшийся при этом механический барьер ограничивает водный обмен и поступление питательных веществ в зону проникновения патогенных микроорганизмов [Denny et al.. 2003]. К сожалению, не известно, какие силы формируют вокруг места инфицирования лигнин, и почему эта зона характеризуется активной генерацией АФК [7hou et al, 2000: Heitefuss, 2001]. Существуют данные о лигнификации не только растительных тканей, но и гиф патогена [Milosevic. Slusarenko. 1996. Denny et al.. 2003], хотя этот факт остается мало изученным. В нашей лаборатории ранее была выявлена способность анионной пероксидазы пшеницы с изоэлектрической точкой (pi) - 3.5 к сорбции на хитин [Максимов. 1994] и пока!ано ее участие в защитных реакциях растений против грибных патогенов [Хайруллин и др. 2000] Раскрытие механизмов, лежащих в основе формирования устойчивости растений к болезням, является важным шагом в поиске путей ее повышения.

Цель данной работы состояла в молекулярной i етерог енности

пероксидазы. выделенной из разных видов рфтенЖ*и498йА#А№*А^имодействия ее

июформ с комноненгами клеточных С1енок фибов

Задачи исследований:

1 Определить распространенность среди различных видов растений иадпероксидаз. способных связываться с хитином

2 Определив возможность связывания растительных изопероксидаз с компонентами клеючной стснки фитопатогенных фибов.

3 Выделить анионную пероксидазу из проростков пшеницы и охарактеризовать биохимические механизмы се связывания с хитином

4 Получить антитела против анионной пероксидазы мягкой пшеницы и провести ее иммунохимическое сравнение с белками из других видов растений

5 Выявить механизмы вовлечения анионной пероксидазы в развитие индуцированных хитоолигосахаридами. салициловой кислотой и освещением защитных реакций каллусов пшеницы в совместной культуре с грибом Т carien.

Научная новизна Впервые из различных видов растений были выделены и охарактеризованы изопероксидазы. специфически взаимодействующие с хитином и мицелием пато1енных фибов Выявлено иммунохимическое сходство анионной пероксидазы пшеницы с белками из других видов растений Изучена динамика активности пероксидазы и её изоформ различной локализации в каллусах пшеницы при их инфицировании возбудителем твердой головни и воздействии света, хиюолигосахаридов и салициловой кислоты.

Практическая значимость работы. Разработан способ выделения и очистки отдельных изоформ пероксидазы растений с использованием хитина и хитозана Активация анионной пероксидазы в ответ на добавление индукторов устойчивости в сред} культивирования совместных культур клеток пшеницы с возбудителем твердой киовни может служить в качестве маркера для эффективного отбора препаратов с иммунооимулирующей активностью

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (Пенза. 2003). общества биохимиков и молекулярных биологов (С.-Петербург. 2Ó02), общества генетиков и селекционеров (Москва. 2004). конференции по защите и иммунитету растений (С -IIeiep6>pi - П>шкин. 2002). "Актуальные проблемы био.клии" (Сыктывкар. 1999). "Биология - на\ка 21 BqKa" (Пущино. 2001). "Молодые ученые Волго-Уральскою

региона на рубеже веков" (Уфа. 2001), на международном конгрессе FESPB (Краков. 2004). Международных конференциях "Новые достижения в исследовании хитина и чигозана" (Москва. 2001: С.-Петербург. 2003). "Molecular Plant - Microbe Interactions" (('-Петербург, 2003). "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва, 2001). "I еном растений" (Одесса, 2003)

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 01-04-48495) "Хитин-специфичные" пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе", РФФИ (№ 05-0448310) "Хитин-специфичные" оксидоредуктазы в сигнальной регуляции устойчивости растений к фитопато1енным грибам". РФФИ-Агидель (№ 02-04-97923) "Совместые к\льт\ры клеток пшеницы с фигопатогенами как модель для скрининга средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами" и грантом №207 6-го конкурса экспертизы молодых ученых РАН "Активация анионных нероксидаз как показатель неспецифической ответной реакции пшеницы против фитопато! енных грибов"

Публикации. Список основных публикаций по материалам диссертации включает 18 работ, включающий 5 статей в рецензируемых журналах

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 114 страниц, включая 4 таблицы и 43 рисунка. Список использованной литературы включает 187 работ, в том числе 133 зарубежных авторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работы проводились на растениях различных видов однодольных и двудольных высших рас гений, всего 22 вида. В отдельных опытах использовали разновозрастные проростки мягкой пшеницы (Tritwum aestivumj сорта Жница Каллусы мягкой пшеницы (Т ae.stivum, сорт Жница) и пшеницы однозернянки (Т urartu Thum Сх Gandil. Образец ВИР к-58498). а также их совместные культуры с грибом Tilletia canes (DC ) lui. были любезно предоставлены кбн ОБ С\риной В качестве инд\кторов устойчивости использовали салициловую кислоту (CK. "Реахим". Россия) и

чигоолигосачариды (ХОС). полученные кб.н И') Ахмсювой Мицелий и споры грибов Т caries. Ustilago triticí. Septoria nodorum Berk, и Bipolarus <¡orokiniana были отобраны at котлекции лаборатории биохимии иммунитета растений (ИБГ УНЦ РАН) Хишн е различной степенью ацетилирования (СА) получали реакцией химическою щелочного дезацетилирования хитина [Плиска и др.. 1977] Хитин-глюкановый комплекс из спор и мицелия фитопатогенных грибов получали согласно рекомендациям [Феофилова, 2002]

Ферментные жстракты свободной (циюплазматической). ионно- и ковалентно-связанной с клеточной стенкой расшний пероксидаз получали по методике Bircska и Miller [1974] Все образцы перед анализами подвергались диализ) против 0 01 М фосфатного буфера рН 6.0 (ФБ).

При проведении хромат oí рафии растительный экстракт наносили на колонку, наполненную соо1ветс1вующим носителем и уравновешенную против ФБ. Аликвот\ не связывающихся белков опирали при установлении самого высокого уровня белков На солевую фракцию отбиралась проба, элюируюшаяся с матрицы раствором 1 М NaCl в ФБ. Активность пероксидазы определяли по методу Бояркина [Ермаков и др.. 1987]. Концентрацию белка определяли по Bradford.

Изоэлектрофокусирование (И')Ф) проводили с использованием 7%-ного ПААГ и 2% изолитов рП 3.0-10.0 ("ISN"). а электрофорез - по методу Лэммли в камере С'тадиера с использованием SDS-Na в градиентальном ПААГ [Остерман, 1981] Препаративный электрофорез проводили аналогично, но без добавления SDS-Na. Пероксидазы в ПАА1 выявляли с использованием 0 01% 3.3-диаминобензидина солянокислого (ДАБ) в присутствии 0.001 % Н202 в 0.1 М ФБ На оксалагоксидазу гель проявляли, используя 0.01% раствор ДАБ в 0.05 М сукцинатном буфере рН 3 8 - 4 0 с добавлением 2 5 мМ щавелевой кислоты и пероксидазы хрена

Кроличьи антитела против выделенных нами хитин-специфичных белков и анионной пероксидазы пшеницы получали согласно [Бейлез и др.. 1990j и использовали для двойной иммунодиффузии в агарозном геле и определения содержания анионной пероксидазы методом непрямого иммуноферментною анализа (ИФА)

Опыты проводили в лаборатории при комнатой [CMriepaiype. Эксперименты включали не менее 3-х биоло!ических новюров Сгаюбработка рез>лыаюв проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение хитин-специфичной анионной пероксидазы пшеницы и изучение её свойств

Значительную роль в связывании анионной пероксидазы пшеницы с хитином играют специфичные участки в ее белковой молекуле, ионообменно взаимодействующие с ацетильными остатками хитина (рис. 1). Важность присутствия ацетильных групп в структуре хитина при взаимодействии этой изоформы доказывается ее связыванием с ацетилцеллюлозой (рис. 2). Обнаруженное свойство использовалось нами для получения гомогенного препарата анионной пероксидазы.

а 0.»-

i 0J -

б .07 -

5 |<u -

i 3 04 -

l goj-

0.2 -

< 0.1 ■

¿1

М 0.75

1»

0.» «1

0,7 U 4Í 0.« 0J 0J 0.) о

еЪ

01 023 0J 1.0 Коидапрмия NaCl М

12 23 45 И Степень utermmpoaan* тгпша

ХштспоСта

Концентраций ФЕ, М

Ш Пероюжшзям шшт

Рис. 1. Зависимость десорбции пероксидазы с хитина от концентрации фосфатного буфера (a), NaCl (б) в растворе и степени ацетилирования хитина (в)

т-т

Рис. 2. Сорбция пероксидазы пшеницы из полученных после хроматографии иа хитине фракций белка на ацетилцеллюлозу: 1) грубый экстракт, 2) фракция, ие связывающаяся с хитином, 3) элюент с хитина.

Для этого белки из корней 4-х суточных проростков пшеницы экстрагировали в ФБ с добавлением 1 мкМ PMSF, 1 мкМ дитиотрейтола (ДТТ) ("Loba", Австрия) и 3% поливинилпирролидона ("Reseach organics", США) и после центрифугирования, фракцию, высаливающуюся 60% (NH^SO* диализовали. Затем пероксидазу выделяли на последовательных колонках с хитозаном и хитином, уравновешенных ФБ. Сорбирующиеся на хигин белки элюировали с хитиновой колонки раствором 1 М раствором NaCl в ФБ и концентрировали.

Во фракции белков, элюирующихся с хитина, кроме пероксидазы с молекулярной массой около 37 кДа, были идентифицированы белки с оксалатоксидазной активностью (мол. масса ~ 26 кДа и ~ 100 кДа) (рис. 3). Вероятно, высоко-молекулярная форма этого фермента является тетрамером [Gane et al., 1998].

67 кДа {М г9 МЛ

Рис. 3. Профили спектров белков после ЯПН-Ха-»лект рофореза (а) и электрофореза без добавления (б).

45 «На Шк ' * маркерные белки;

_ 2 - белки, элюируюшиеся с хитина 1 М 1МаС1;

3 - оксалатоксидаза;

4 - анионная пероксидаза.

20,4 кДа --

У 2 3 4

Анионную нероксидазу выделяли методом электрофореза в ПААГ и последующей электроэлюцией из него [Остерман, 1985]. Препарат содержал единственную изоформу пероксидазы с р1 ~ 3.5. Сравнивали рН ошимум работы суммарной цитоплазматической пероксидазы пшеницы и выделенной нами анионной ! чс л изоформы (рис. 4) Показано, что

пероксидаза из фубою растительного экстракта имеет рН оптимум работы в пределах 4.5 - 6.0, как это было определено в работе [МтЬауеуа е! а!., 2003]. рН оптимум анионной пероксидазы сдвинут

относительно рН оптимума пероксидазной

« ( - ь

н активности грубого экстракта на 0.5 ед в

Рис. 4. рН оптимум обшей пероксидазной кислую сторону. подобно сдвигу, активности грубого экстракта (1) и

очищенной анионной пероксидазы (2) характерному и для анионнои пероксидазы пшеницы табака [Оагапап « а!.. 1996]

Препараты хитин-специфичных белков и анионной пероксидазы пшеницы использовались для получения против них антител и определения их иммунохимического сходства с другими хитин-специфичными белками. Иммуноспецифичносгь полученных антител по отношению к анионной пероксидазе пшеницы оказалась высокой (рис. 5). Поскольку эти антитела не взаимодействовали с пероксидаза ми пшеницы, не сорбирующимися на хитин, можно предположить, что структура анионной изоформы иммунохимически оттичается от других изопероксида! этой культуры.

Рис. 5. Полосы преципитации кроличьи! антител, полученных против анионной пероксидазы, с белками грубого экстракта из корней пшеницы (1), белками, связывающимися с хитином (2), белками, не сорбирующиеся на хитин (3), агглютинином зародышей пшеницы (4), конканавалином А (5), бычьим сывороточным альбумином (6).

2. Способность пероксидаа из различных видов растений взаимодействовать с хитином.

В связи с обнаруженным свойством анионной пероксидазы пшеницы сорбироваться на хитин, интерес представляет то, насколько характерно для изопероксидаз других видов растений подобное свойство. Обнаружено, что после хроматографии растительных экстрактов на хитине, у одних видов происходит много!фатное повышение активности пероксидазы во фракции белков, не сорбирующихся ча хитин, а у других - во фракции, элюирующейся с хитина 1 М раствором NaCl (таблица 1). Например, активность пероксидазы картофеля (S tuberosum) и лагенарии (L. siceraria) после контакта с этим биополимером увеличивается более чем в 2 раза. А у капусты, гороха и петунии более чем в 3 раза возрастает пероксидазная активность в солевом элюенте.

Анализ изоферментного состава пероксидаз, связывающихся с хитином, выявил как сходства, так и различия между видами растений. У представителей семейства злаков была отмечена сорбция на хитин анионных изоферментов, а у других видов растений способностью связываться с хитином обладали и катаонные изоформы. Эти данные позволили причислить сорбирующиеся на хитин пероксидазы к хитин-специфичным, аналогично анионной пероксидазе пшеницы.

Иммунохимический анализ белков основан на реакции специфического взаимодействия антиген-антитело. В этой реакции проявляется одна из элементарных биологических функций белка - способность к избирательному взаимодействию по принципу "узнавания", поэтому "иммунохимический метод следует рассматривать как биологический метод идентификации белков, позволяющий оценивать не простое

Габлшм 1

11ероксидазная активность при хроматографии белковых экстрактов из проростков различных видов растений па хитине ______________________(ед./мг белка)_________

Вид растения I рубый экстракт Пероксидазная активность во фракции белков, не связывающихся с хитином Солевой элюент с хитина

Пероксидазная I Количество активность | изопероксидаз 11ероксидазная активность - р! пероксидаз

Tnticum aestivum 10.5±1.2 9 4.3±0.5 11.0±3.0 3.5

Avena sativa 3.6±0.5 11 3.1±0.1 11 1±2.5 3.3 и 34

Oryza sativum 1.7±0.2 15 4.9±0.6 0.5±0.1 3.7 и 4.8

Zea тауч 1.5±0.3 7 2.9±0.7 0.3±0.1 3.6

Ailium cepa 1,7±0.2 7 0.5±0.1 0.4±0.1 5.8; 6.8 и 8.3

Allium porrum 1,4±0 2 6 1.2±0.2 следы -

Ailium sativum 2.3±0.5 7 0.4±0.1 1 8±0.4 4.2; 5.8; 6.5; 7 2; 8.1; 8 8

Aloe vera 1.0±0.3 4 1.6±0.2 0.7±0.3 5.5

Hasta glauca 2.6±0.5 8 2.8±0.3 0.2±0.1 4.2; 6.8 и 7.0

Lihum regale 2.5±0.5 11 2.2±0.3 следы -

Raphanus sativus 9.0±0.7 6 11.3±0.9 2.9±0.3 3.8

Brassica oleraceae 5.6±0.2 6 6.2±0.3 15.5±0.8 7.2 и 7.8

Armoracia rusticana 7.±1.0 8 19.2±2.3 2.0±0.4 3.8 и 4.0

Petunia hybrida 5.2±0.5 6 3.7±0.6 23.9±2.2 3.5; 3.7; 7.2 и 7 5

Solanum tuberosum 1.9±0 2 19 6.8±1 1 1.6±0.9 4.2 и 4.3

Nicotiana tabacum 24,0±0.9 6 9.(Ш).9 13.7±2.0 3.7

Lagenaria siceraria 2.4±0.3 8 4.6±0.4 следы -

Cucurbita pepo 6.2±0 6 4 1.7±0.2 5 1±0.8 3.7; 3.8; 8 8 и 9.0

Cucumis sativus 9.8±0.5 8 1.9±0.1 13 5±0.9 3.4; 3.5; 3.7 и 3.8

Galega orieníalis 3.9±0.3 8 4.3±0.2 4.2±0.2 3.5; 7.1; 8.2; 9.0; 9.2 и 9.3

Arachis hypogaea 8 2±1.1 13 1.3±0.1 6.1 ±0.9 от 3.6 до 6.0

Pisum sativum 3.8±0 3 11 2.9±0.5 26.U3.9 3.5; 3.7. 5.0 и 8.1

А_______

^со о с о Г о

1 2 3 456 7 8 9 10

Рис. 6. Схема перекрестов, образуемых экстрактами однодольных растений с антителами против хитин-специфичных белков (А) и против анионной пероксидазы (Б) пшеницы. 1 - пшеница мягкая, 2 - овес посевной, 3 - рис культурный, 4 - кукуруза, 5 - лук репчатый, 6 - лук - порей, 7 - чеснок посевной, 8 - алоэ, 9 - лилия царствепная, 10 - хоста.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 7. Схема перекрестов, образуемых экстрактами двудольных растений с антителами против хитин-специфичных белков (А) и против анионной пероксидазы (Б) пшеницы. 1 - хрен деревенский, 2 - редис посевной, 3 - капуста белокочанная, 4 - табак курительный, 5 - петуния садовая, 6 - картофель, 7 - огурец посевной, 8 - лагенария, 9 - кабачок, 10 - горох посевной, 11 - арахис подземный, 12 - козлятник восточный.

сходство, а биологическую гомологию белка" [Конарев и др., 1993]. Образование

преципитата между антителами против анионной пероксидазы пшеницы и белками

некоторых видов растений различных семейств, например, мятликовых и бобовых

(рис. 6, 7), свидетельствует о сходстве их антигенных детерминант. Белки практически

всех видов растений реагировали с антителами против хитин-специфичных белков, что

предполагает их эволюционно раннее, в сравнении с пероксидазами, происхождение.

3. Сорбция изопероксидаз пшеницы на клеточные стенки фитопатогенных грибов и микроорганизмов

Для проверки предположения о прямом взаимодействии пероксидаз с компонентами клеточных стенок грибов использовали хитин-глюкановый комплекс, выделенный из мицелия и спор фитопатогенных грибов - возбудителей твердой головни, пыльной головни, септориоза и корневой гнили пшеницы. Обнаружено, что из множества пероксидаз у пшеницы к сорбции на компоненты клеточных стенок грибов способны изоформы с р! ~ 3.5 и катионная с р! ~ 9.7 (рис. 8).

« (

| Рис. 8. Изоферменты пероксидазы пшеницы, сорбирующиеся на мицелий (1,3, 5, 7) и проросшие споры (2,4, 6, 8) фитопатогениых грибов Т. caries (1, 2), j U. tritici (3, 4), В. sorokiniana (5,6) и S. nodorum (7,8). 18.4

18,6 ivi _ маркерные белки

& тШШ

12345 678м

Поскольку клеточная стенка грибов состоит из хитина и глюканов. го. вероятно, анионные пероксидазы пшеницы сорбировались на поверхность мицелия именно по лшиновым еашам. Природа сорбции на мицелий ¡риба катионных изопероксидаз нам не известна, но можно предположить, что они сорбируются на друюй компонент мицелия гриба - глюканы, подобно сорбции катионных пероксидаз цуккини и арабидопсиса на пектины [Carpin et al.. 2001. Shah et al., 2004]. Однако данное предположение нуждается в экспериментальной проверке. Из литературы известно, чго споры I рибов полностью покрыты слоем ьноканов и лишь при прорастании в апикальной части клеточной стенки мицелия часть хитина обнажается [Santiago et al.. 2000] 1аким образом, сорбция пероксидаз на клеточные стенки фитопатогснных фибов и хитин может являться одним из необходимых условий проявления в последующем защитных реакций растения-хозяина на внедрение в их ткани паразитических микрооронизмов.

4. Влияние хитоолигосахаридов, салициловой кислоты и освещения на устойчивость каллусов пшеницы к возбудителю твердой головни

Широко известно вовлечение анионных пероксидаз в защитные реакции растений [Lagrimini et al, 1997: Bernards et al. 1999: Kaothien et al.. 2000]. что предполагает возможность под влиянием различных индукторов устойчивости, в том числе олигомеров хитина и салициловой кислоты (СК). накопления и активации пероксидазы пшеницы, способной сорбироваться на хиган.

Обработка каллусов хигоолигосахаридами приводила к повышению активности

4 7 10 13

tyiKH кулыивирования

О 3 6 9

суюк после инфицирования

: Количество анионной пероксидазы в контроле

4 7 10 13

сутки культивирования 0 3 6 9

суток после инфицирования

_ Пероксидазная активность в контроле Пероксидазная активность в опыте

ижтн Количество анионной пероксидазы в опыте

Рис. 9. Влияние рамичиых концентраций ХОС на активность пероксидазы (в ед. оптич. ПЛ01Н0С1И при 470 нч) и количество анионного изофермента (в нг/г сырой массы) в совместных культурах каллусов. А - культивирование на среде МС; Б -культивирование на среде МС+0.01 мг/л ХОС; В - культивирование на среде МС+1 mi/л ХОС; Г - культивирование на среде МС + 100 мг/л ХОС

Щ -

4 ф Рис. 10. Изменение ■s.i нзоферментного состава —~ >.9 пероксидазы в Я цитоплазмагической фракции b белка каллусов пшеницы под

влиянием ХОС и инфицирования Т. caries. 1,2 - среда МС; ¡U 3,4 - среда МС+ ХОС 0.01 мг/л; х-4 5,6 - среде МС + ХОС 1 мг/л; *л 7,8 - среда МС + ХОС 100 mi /л. 1,3, 5, 7 контроль, 2,4,6, 8 - инфицирование.

и количества изопероксидаз в каллусах пшеницы (рис 9, 10). Высокие концентрации ХОС (более 1 мг/л) приводили к активации щелочных изопероксидаз, тогда как низкие - избирательно увеличивали активность пероксидаз с pi ~ 7.5 и ~ 9.7 и анионных с pi ~ 3.5,-4.3, ~ 4.5 и ~ 5.2 (рис. 10).

Проведенный ИФА выявил значительное увеличение содержания анионной пероксидазы в свободно-растворимой фракции белков под влиянием 1 и 0.01 мг/л ХОС на 3 сут совместного культивирования (рис. 9). В дальнейшем в этой фракции наблюдается тенденция снижения как общей активности пероксидазы, так и количества анионной пероксидазы, что может быть связано с перераспределением изоферменгов в клетке, например, их переходом в зону, прилежащую к клеточным стенкам [Комизерко и др., 1988; Газарян, 1992] и/или связыванием с компонентами клеточных стенок патогена [Milosevic, Slusarenko, 1996; Denny et al., 2003]. Действительно, под влиянием ХОС во фракции ковалентно-связанных с клеточной стенкой белков происходила активация пероксидазы с pi ~ 3.5 (рис. 11 А), где она, как известно, может активно вовлекаться в процессы укрепления межмолекулярных связей и лигнификации [Lagrimini, 1996; McDougall, 2001]. Вероятно, присутствие в среде культивирования препарата ХОС усиливает эти процессы, вследствие чего фермент оказывается более прочно связан с клеточной стенкой.

Пероксидазы, секретирующиеся во внеклеточную среду, принимают непосредственное участие в защите растительных тканей от фитопатогенов [Hiraga et al., 2001; Bolwell et al., 2002, Минибаева, Гордон, 2003].

ф * ь

* 5,9

6,6 6.8 U

3,5

Рис. 11. Изоферментный спектр пероксидаз, выделяемых в среду культивирования каллусов пшеницы (А) в ковалентно-связанных с клеточной стенкой изоформ (Б) 20 суток совместного культивирования. Обозначения те же, что и на рис. 10.

1 2 5 6 М

8,3 М 8.6

9,3

1 2 3 4 5 6 7 8 М

Пол влиянием инфицирования и ХОС пероксидазная активность в >юй фракции многократно повышалась (рис. II, Б). Интересно, ню в среде культивирования каллусов. выращенных на среде МС. была обнаружена только пероксидаза с р! - 3 5. а под влиянием инфицирования - и с более основными pi. Препарат ХОС индуцировал выход во внеклеточную среду изопероксидазы (с р! -9.7). способной сорбироваться на мицелий грибов. В то же время пероксидаза с pi -3 5 накапливалась в клеточно-стеночной фракции, что. вероятно, сопряжено с ее способностью к кросс-связыванию с клеточной стенкой растения [Denny et а!.. 20021 и хитином

Гаким образом, нами показано, что ХОС влияют на активность изопероксила). играющих важную роль в защитном ответе растительных клеток на инфицирование и усиливают выделение натопи- и хитин-специфичных изоформ пероксидазы во внеклеточное пространство. 1дс последние MOiyT выполнять свои функции эффективнее |Минибасва. Гордон. 20031.

Воздействие СК на активность пероксидазы в целом отличалось от действия ХОС В начальный срок опыта у совместных культур, растущих на СК с патогеном, активность цитоилазматической пероксидазы была ниже, чем в контроле (рис.12). Под влиянием СК. на фоне снижения активности многих изоформ. многократно активировались пероксидазы с pi - 3.5. а гакже с pi ~ 4.8. - 7 5 и 9 7 (рис 12).

я = 02-

gS0.l5 и ~

11 0 I

V ~ О ~

- У

X <

10 13

сугки кулыимфомння 3 6 9 20

су) ки после инфицирован и« □ МС кошроль gj -НТК кшлроль

Ш МС инфицирование Щ +СК инфицирование

Рис. 12. Изменение активное!и (слева) и изоферментного спектра пероксидаш (спрана, 20 су(ки совместною культивирования) под влиянием СК в цитоилазматической фракции белков совместной культуры каллусов Т. aestivum с Г, caries. М - маркерные белки. МС контроль(а); МС инфицирование (б); +СК контроль (в); +СК инфицирование (г).

7 10 13

суты культивирования

3 6 9

сутки после имфшрфомви* П МС контроль S +СК контроль ,

■ МС ияфмвцюишие Ü -ЮС нифицироааше а 6 * г М

Рис. 13. Изменение активности (в ед. оптической плотности при 470 нм) (слева) и изоферментного спектра пероксидазы (справа) в ионно-связанной с клеточными стенками фракции белков совместной культуры каллусов Т. aestivum с Т. caries под влиянием СК. Обозначения те же, что и на рис. 12

Рис. 14. Изоферментные спектры пероксндаз, локализованных во фракциях ковалентно-связанных с клеточными стенками белков (А) (10 сут) н выделенных из среды культивирования каллусов пшеницы (Б) (20 сут совместного культивирования). Обозначения те же, что и на рис. 12.

Во фракциях ионно- и ковалентно-связанных с клеточными стенками белков CK активировала изоформу с pl ~ 3.5 (рис. 13, 14). Причем в зараженных Т caries каллусах пероксидазы не только концентрировались в клеточно-стеночной фракции, но и выделялись в среду культивирования, где нами обнаружены пероксидазы с pl от 3.5 до 4.8, а также изоформа с pl - 7.5, антифунгальное свойство которой описано в работе С. Caruso с соавторами [2001].

Важно отметить, что CK, снижая активность многих изопероксидаз, способствовала активации изоформ, задействованных в защите от патогенов. Это предполагает модулирующее влияние данного соединения на активность пероксидаз, благодаря чему в клетках может поддерживаться определенный про-/анти-оксидантиый статус, способствующий усилению защитных свойств клеток.

Ишестно. что свет может влиять на активное ib некоюрых. ферментов [Asselin et al. 1985. Александрушкина и др , 2004] и вызывать экспрессию PR-белков [Genoud et al. 2002], в юм числе и пероксидазы [Boeuf et al.. 1999; Agrawal et al.. 2003]. Это означает, что и в совмссшых кулыурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни свет может изменять активное ib пероксидазы, повышая тем самым их устойчивость к пато!ену.

Действительно, при культивировании на свету каллусы оказались гораздо менее подверженными инфицированию. При этом пероксидазная активность наиболее интенсивно проявлялась в зонах заселения грибом. Окрашивание срезов флороглюцином. специфическим красителем на лигнин, показало, что ори освещении процессы лигнификации клеток каллуса, контактирующих с Т canes, происходят интенсивнее, чем в темноте Кроме того, у клеток каллуса пшеницы, контактирующих с мицелием гриба и находящихся под влиянием освещения, наблюдалось интенсивное образование некрошческих зон. подобных сверхчувствительной (СВЧ) реакции.

Под действием света в совместной культуре каллусов пшеницы с грибом происходило повышение активности большинства выявляемых изоформ пероксидазы (рис. 15) В го же время следует заметить, что в каллусах, растущих в темноте, naioi en приводил к снижению активности специфичной к клеточным стенкам гриба изопероксидазы с р! - 9.7.

Д Б

0.5

1=0.4 ^ s*

|§о,з.

и j

m °

£50.1 <

Л'

-Ï3

сутки совместного культивирования

Рис. 15. Изменение активности (А) и изоферментиого спектра пероксидазы (Б) (20-е сут культивирования) в каллуса* Т. urartu, инфицированных грибом Т. caries, пол влиянием освещения. 1 - темнота; 2 - темнота + инфицирование; 3 - свет; 4 - свет + инфицирование

Совокупность полученных данных указывает, что в каллусах пшеницы, культивируемых на свету и питательных средах, содержащих индукторы устойчивости, происходят значительные изменения в изоферментном составе пероксидазы. Наиболее активно реагирующими на индукторы устойчивости изоформами являются изопероксидазы с pl ~ 3.5 и ~ 9.7, способные к сорбции на клеточные стенки фитопатогенных грибов.

Поскольку в иммунизированных каллусах патоген развивается слабо, можно предположить, что повышение активности пероксидаз, обладающих сродством к компонентам клеточных стенок фитопатогенных грибов и в частности к хитину, является важным механизмом формирования резистентности растений к инфицированию в спектре их защитных реакций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что одним из основных механизмов защиты растений от грибных патогенов является формирование вокруг их инфекционных структур лигнина, который представляет собой эффективный защитный барьер на пути проникновения гриба. В растениях имеются белки, способные специфически связываться с хитином и глюканом клеточной стенки фитопатогенных грибов (лектины, хитиназы и глюканазы) [Лахтин, 1987.]. Однако непосредственно в процессах лигнификации эти белки не участвуют. Способностью катализировать полимеризацию фенольных соединений в лигнин и суберин обладает активный участник системы антиоксидантной защиты клеток - фермент пероксидаза [Quiroga et al., 2000; Keren-Keiserman et al., 2004]. До наших исследований механизм направленного отложения лигнина в точках проникновения фитопатогена и концентрирования стресс-индуцируемой пероксидазы в этих зонах был неизвестен.

Полисахариды являются не просто катализаторами процесса лигнификации [Rasmussen et al., 1995], а могут также играть роль матриксов для ее инициации [Liu, Kolattukudy, 1997]. Это доказывается и тем, что синтез лигнина повышается в растворе пероксидазы с эвгенолом при внесении хитозана [Siegel, 1957; Van der Westhuizen et al., 1998]. Как свидетельствуют полученные нами результаты, анионная пероксидаза с pl ~ 3.5 вовлекается в ответные реакции пшеницы на инфицирование посредсгвом ее сорбции на хитин и клеточные стенки фитопатогенов. Способность

>гои изопероксидазы выделяться в межклеточное пространство, закрепляться в клеточной стенке и на поверхности хитин-содержащих патогенов, позволяет считать, что она может офаничивать рост и развитие инфекции [Joseph et al. 1998: Caruso et al 2001] посредством синтеза лигнина непосредственно на мицелии гриба. При этом ткани с высокой активностью фермента, индуцированной иммунорегуляторами (ХОС и салициловая кислота), оказывакнея более "подготовленными" к защите oi инфицирования их фигопатогеном.

Активирование пероксидазы под атиянием хитина и сорбция ее отдельных изоферментов на нем предполагает возможность участия этого фермента в процессах, лежащих в основе двух типов защитных реакций растений против фитопатогенов Первый включает быструю активацию фермента при его контакте с клеточными структурами гриба, что. вероятно, сравнимо с ее активированием при СВЧ-реакции [Dangl et al. 1996: Wojtaszek. 1997]. Второй шп реакции можно сравнить с постепенным накоплением молекул фермента в зоне локализации гриба, связанным с появлением своеобразного "аттрагирующего" центра, формирующего в несовместимой патогенной сиаеме условия для лшнификации зоны проникновения фитопато! ена [El Gueddari et al. 2002; Shinogi et al.. 2003].

Полученные данные раскрывают новые аспекты формирования отношений паразит - хозяин, демонстрируя возможность существования систем, способных регулировать поступление сигнальных молекул в растительную клетку и участие в защитных реакциях, направленных на укрепление клеточной стенки Следовательно, от скорости активации пероксидазы в клетках, подвергшихся инфицированию, и интенсивности сорбции этого фермента на мицелий хитин-содержащсго патогена зависит судьба прохождения патоло! ического процесса.

ВЫВОДЫ

1 У различных видов однодольных и двудольных растений выявлено семейство хитин-специфичных белков с пероксидазной активностью. Обнаружены определенные различия между видами в количестве изопероксидаз. сорбирующихся на хитин. У растений семейства мятликовых на хитин сорбировались анионные пероксидазы. toi да как у других видов сродством к нему обладали и катионные изоформы фермента.

2. Анионная пероксидаза пшеницы, специфически взаимодействующая с ацетильными остатками хитина, выделена в чистом виде и изучены ее основные физико-химические свойства (молекулярная масса, изоэлектрическая точка. рН оптимум рабош фермеша).

3 Определено высокое иммунохимическое сходство анионной пероксидазы пшеницы с хитин-специфичными белками семейства злаков и отличие л ой изоформы от других изопероксидаз пшеницы.

4. У пшеницы наряду с анионной пероксидазой. на хитин сорбируекя оксалатоксидаза. что предполагает кооперативное участие этих ферментов в защите растений oí хишн-содержащих пато!енов.

5. Впервые j пшеницы обнаружены изопероксидазы (анионная с pl - 3 5 и катионная с pl - 9.7), способные сорбироваться на компоненты клеточных стенок фитоиаю1Снных грибов - возбудителей твердой юловни. пыльной головни, сешориоза и корневой гнили. Предполагается, что анионная пероксидаза при этом связывается с хшином клеточных стенок iрибов. а катионная - с глкжаном.

6. Показано, что индукторы устойчивости (хитоолигосахариды и салициловая кислота), а также освещение, приводят к усилению устойчивости клеток каллуса пшеницы в совместной культуре с возбудителем твердой головни, что коррелируй с увеличением количества и активности изопероксидаз с pl ~ 3.5 и ~ 9 7.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Хайруллин Р. М. Связывание пероксидазы из разных видов растений с хитином. // Актуальные проблемы биологии: Материалы 5 молодежной конф,- Сыктывкар. 1999. - С. 132-133.

2. Максимов И.В.. Черепанова Е.А., Хайруллин Р.М., Ахметова И.О. О природе взаимодействия анионных пероксидаз с хитином. // Материалы 6 межд\ народной конференции "Новые достижения в исследовании хитина и хшозана". - Москва. 2001. - С. 88-91.

3 Черепанова Е.А., Янбаева Д. Г. Максимов И.В Взаимодействие пероксидазы с компонентами клеточных стенок фитопатогенных грибов. // Материалы юбилейной научной конференции молодых ученых "Молодые ученые Вол ю-Уральского peí иона на рубеже веков" - Уфа, 2001 -С 155-157

4. Максимов И В , Черепанова Е.А., Хайруллин Р М„ Ачметова И Э Поиск сайтов взаимодействия с хитином у растительной пероксидазы и их роль в формировании устойчивости к фиюнатогенам The search for sites of interaction of plant peroxidase with chitin and their role in forming of resistance to pathogens l! Материалы международною симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология". Москва. 2001 С. 106-107.

5 Максимов ИВ. Черепанова Е.А., Ахметова И.Э. Юсупова ЗР Хайруллин Р M Участвуют ли анионные пероксидазы в регуляции уровня элиситоров. поступающих в клетку'' // Материалы первой всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям - ('-Петербург. 2002 -С 37-38.

6 Максимов И.В.. Сурина О Б.. Черепанова Е.А., Трошина H Б Активация анионной пероксидазы в совместной к\льтуре каллусов пшеницы с возбудителем твердой юловни пол в жянием периодического освещения Ч Материалы 3-ю съеиа биохимического общества. - С-Петербург. 2002 - С 42-43

7 Максимов И В. Черепанова Е.А., Хайруллин P.M. "Хитин-специфичные" пероксидазы в растениях //Биохимия 2003, т 68 № 1.-С 133-138

8 Черепанова Е.А., Максимов И.В . Сурина ОБ.. Ахметова И.Э Влияние читоолигоеахаридов на активность и изоферментный состав растительной пероксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с грибом Tilletia caries (DC ) Tul /V Ма1ериалы 5 сьезда Общества физиологов растений. - Пенза 2003 - С 196-197

9. Максимов И.В . Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г "Хитин-специфичные" белки пшеницы выделение и характеристика. /' Материалы 7 международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана". - С -Петербург, 2003, - С. 94-96.

10 Makbimo\ I.V.. Yarullina LG.. Cherepanova E.A.. Akhmetova I.E. Yusupova 7 R "Chitin-specific" enzymes of wheat. // Molecular Plant Microbe Interactions- Neu bridges between Past and Futur 11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. - St.-Pet.. 2003. P. 257

11 Яруллина Л 1 . Максимов И.В.. Трошина H Ь.. Черепанова Е.А., Слрииа О.Б Влияние салициловой кислоты на активность оксалатоксидазы и генерацию

перекиси водорода в каллу сных культурах пшеницы. // Maiepna.iw 4 Международной конференции "Геном раоений" - Одесса (Украина). 2003 - С. 82

12 Максимов ИВ. Черепанова Е.А., Сурина OR.. Сахабутдинова АР Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с во)б\дителем твердой юловни Tilletia caries. // Физиоло1ия растений. 2004. том 51. № 4. - С. 534-540.

13 Черепанова Е.А., Максимов И В Иммунохимическое сходство "хитин-специфичных" пероксидаз пшеницы с белками из других видов растений // Материалы III съезда ВОГиС "Генетика в XXI веке". - Москва. 2004 - С. 315

14 Cherepanova F А . Maksimov I V . Surina О В . Jusupova 7.R The change of peroxidase activity in the common cultures of wheat calluses and bunt pathogens under the influence of chitooligosaccharides // Acta physiologia plantarum. 2004. V 26. No 3. P 267.

15 Максимов ИВ. Черепанова E.A., Ахметова И Э Хайруллин РМ. Участие хитина и его олигомеров в индуцированной устойчивости растений против фиюиакменов. // А1рохимия 2004. - №8 - С. 77-89.

16 Maksimov Г V, Troshina N В . Yarullina L G.. Surina О В . Jusupova Z.R , Cherepanova Н.А 7Ъе co-culture of wheat callus and bunt pathogen as a suil test-system for the search of plant resistance inducers // "Biotechnology and agriculture and the food industry" cd. G.E Zaikov. New York: Nova Science Publ. 2004 P 35-41

17 Трошина Н.Б.. Максимов И.В.. Яруллина Л.Г.. Сурина О Б . Черепанова Е.А. Индукторы >стойчивости растений и активные формы кислорода' 1 Влияние салициловой кислом,i на генерацию перекиси водорода в клетках каллусов пшеницы при инфицировании возбудителем твердой головни. // Цитология 2004. № 11. - С 1001-1005

18 Трошина Н Б . Максимов И В . Яруллина Л Г . Сурина О.Б . Черепанова Е.А. Индукторы устойчивости растений и активные формы кислорода: 2. Влияние хитоолигосахарилов на продукцию перекиси водорода с участием оксалатоксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с возбудитетем твердой головни // Циюло! ия 2004. №11 - С. 1006-1010.

Черепанова Екатерина Александровна

ХИТИН-СПЕЦИФИЧНЫЕ ПЕРОКСИДАЗЫ РАСТЕНИЙ

Спсииалыюсз ь 03.00 04 - биохимия

Автореферат дисеер1ации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ьчмага офсегная. Формат 60x84/16. Гарнитура Times Отпеча1ано на ризографе. Усл.печ л 1.5 Тира ж 100 жз. Заказ 155. Отпечатано в типографии Б177У 4500(10. РБ г Уфа. vi Октябри кой ревотции ЗА

IP -89 38

РНБ Русский фонд

2006-4 4366

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Черепанова, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. РОЛЬ ПЕРОКСИДАЗЫ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ обзор литературы).

1.1. Распространенность фермента пероксидазы, история его изучения и практическое значение.

1.2. Строение и свойства растительной пероксидазы.

1.2.1. Структура и физико-химические свойства.

1.2.2. Реакции, катализируемые пероксидазой

1.3. Физиологические функции растительной пероксидазы.

1.3.1. Полифункциональность растительных пероксидаз.

1.3.2. Физиологические функции отдельных изопероксидаз в растениях.

1.3.3. Функции пероксидаз, связанные с защитными реакциями растений на инфицирование патогенами

1.4. Биополимеры, входящие в состав клеточных стенок фитопатогенов и взаимодействие растительных пероксидаз с ними

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Постановка опытов.

2.3. Получение ферментных экстрактов свободной, ионно- и ковалентно-связанной с клеточными стенками фракций пероксидазы, а так же её внеклеточных форм.

2.4. Подготовка хроматографических матриц

2.5. Выделение пероксидаз, способных сорбироваться на хитин.

2.6. Определение активности ферментов.

2.7. Колориметрический метод определения белка по Bradford.

2.8. Методы электрофореза белков.

2.9. Иммунологические методы.

2.9.1. Получение поликлональных антипероксидазных антител.

2.9.2. Двойная иммунодиффузия в агарозном геле.

I 2.9.3. Определение концентрации анионной пероксидазы методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа

2.9.4. Вестерн-блоттинг.

2.10. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Е 3.1. Сорбция пероксидаз на клеточные стенки фитопатогенных грибов и ризобиальных бактерий.

3.1.1. Взаимодействие пероксидаз пшеницы с хитин-глюкановым комплексом клеточных стенок фитопатогенных грибов.

3.1.2. Взаимодействие пероксидаз из корней козлятника восточного с клеточными стенками ризобиальных бактерий.

3.2. Выделение гомогенного препарата хитин-специфичной пероксидазы пшеницы и изучение её свойств.

3.2.1. Исследование механизмов сорбции пероксидазы пшеницы на хитин

3.2.2. Локализация хитин-специфичной пероксидазы в растениях пшеницы.

3.2.3. Получение гомогенного препарата анионной пероксидазы пшеницы

3.2.4. Характеристика хитин-специфичных белков пшеницы.

3.2.5. Иммуноспецифичность антител, полученных против анионной пероксидазы и хитин-специфичных белков пшеницы.

3.3. Взаимодействие пероксидаз различных видов растений с хитином.

3.3.1. Влияние хитина на активность пероксидазы в белковых экстрактах из различных видов растений. i 3.3.2. Изоферментный состав пероксидаз разных видов растений.

З.З.З.Исследование иммунохимического сходства пероксидаз разных видов с хитин-специфичными белками пшеницы

3.4. Влияние хитоолигосахаридов, салициловой кислоты и освещения на устойчивость каллусов пшеницы к возбудителю твердой головни.

3.4.1. Изменение активности и изоферментного спектра пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с грибом Т. caries под влиянием хитоолигосахаридов.

3.4.2. Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов Т. aestivum с Т. caries.

3.4.3. Влияние освещенности на активность пероксидазы пшеницы в совместных культурах каллусов Т. urartu и Т. caries.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хитин-специфичные пероксидазы растений"

Актуальность исследований. Определение механизмов взаимодействия между молекулярными компонентами растений и патогенов, ведущих к формированию совместимых или несовместимых отношений между партнерами, является одной из наиболее актуальных задач современной биохимии. В связи с открытием сигнальной и защитной роли активных форм кислорода (АФК), большое внимание стали уделять оксидоредуктазам, регулирующим их уровень в клетке [Hippeli et al., 1999; Droge, 2002]. Среди этого обширного класса ферментов особый интерес представляет пероксидаза, участвующая во многих биохимических реакциях, происходящих в живом организме [Савич, 1989; Passardi et al., 2004]. Основная функция этого фермента состоит в детоксикации перекиси водорода [Gechev et al., 2002] и окислении фенольных соединений с образованием лигнина и суберина [Hawkins, Boudet, 2003; Kawano, 2003], однако роль отдельных изопероксидаз в биохимических процессах, происходящих в растениях, до конца не ясна.

Активность пероксидазы коррелирует с развитием устойчивости растений как к абиотическим, так и биотическим стрессам. Лигнификация, осуществляемая пероксидазой, играет чрезвычайно важную роль в защите растительных тканей от фитопатогенов. Образовавшийся при этом механический барьер ограничивает водный обмен и поступление питательных веществ в зону проникновения патогенных микроорганизмов [Denny et al., 2003]. К сожалению, не известно, какие силы формируют вокруг места инфицирования лигнин, и почему эта зона характеризуется активной генерацией АФК [Zhou et al., 2000; Heitefuss, 2001]. Существуют данные о лигнификации не только растительных тканей, но и гиф патогена [Milosevic, Slusarenko, 1996; Denny et al., 2003], хотя этот факт остается мало изученным. В нашей лаборатории ранее была выявлена способность анионной пероксидазы пшеницы с изоэлектрической точкой (pi) ~3.5 к сорбции на хитин [Максимов, 1994] и показано ее участие в защитных реакциях растений против грибных патогенов [Хайруллин и др., 2000]. Раскрытие механизмов, лежащих в основе формирования устойчивости растений к болезням, является важным шагом в поиске путей ее повышения.

Цель данной работы состояла в изучении молекулярной гетерогенности пероксидазы, выделенной из разных видов растений, и механизмов взаимодействия её изоформ с компонентами клеточных стенок грибов.

Задачи исследований:

1. Определить распространенность среди различных видов растений изопероксидаз, способных связываться с хитином.

2. Определить возможность связывания растительных изопероксидаз с компонентами клеточной стенки фитопатогенных грибов.

3. Выделить анионную пероксидазу из проростков пшеницы и охарактеризовать биохимические механизмы ее связывания с хитином.

4. Получить антитела против анионной пероксидазы мягкой пшеницы и провести ее иммунологическое сравнение с белками из других видов растений.

5. Выявить механизмы вовлечения анионной пероксидазы в развитие индуцированных хитоолигосахаридами, салициловой кислотой и освещением защитных реакций каллусов пшеницы в совместной культуре с грибом Т. caries.

Научная новизна. Впервые из различных видов растений были выделены и охарактеризованы изопероксидазы, специфически взаимодействующие с хитином и мицелием патогенных грибов. Выявлено иммунохимическое сходство анионной пероксидазы пшеницы с белками из других видов растений. Изучена динамика активности пероксидазы и её изоформ различной локализации в каллусах пшеницы при их инфицировании возбудителем твердой головни и воздействии света, хитоолигосахаридов и салициловой кислоты.

Практическая значимость работы. Разработан способ выделения и очистки отдельных изоформ пероксидазы растений с использованием хитина и хитозана. Активация анионной пероксидазы в ответ на добавление индукторов устойчивости в среду культивирования совместных культур клеток пшеницы с возбудителем твердой головни может служить в качестве маркера для эффективного отбора препаратов с иммуностимулирующей активностью.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийских съездах общества физиологов растений (Пенза, 2003), общества биохимиков и молекулярных биологов (С.-Петербург, 2002), общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), конференции по иммунитету растений (С.-Петербург, 2002), «Актуальные проблемы биологии» (Сыктывкар, 1999), «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2001), «Молодые ученые Вол го-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), на международном конгрессе FESPB (Краков, 2004), Международных конференциях «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва, 2001; С.-Петербург, 2003), «Molecular Plant - Microbe Interactions» (С.-Петербург, 2003), «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001), «Геном растений» (Одесса, 2003).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 01-04-48495) «Хитин-специфичные» пероксидазы как регуляторы интенсивности элиситорных сигналов при грибном патогенезе", РФФИ (№ 05-04-48310) «Хитин-специфичные» оксидоредуктазы в сигнальной регуляции устойчивости растений к фитопатогенным грибам», РФФИ-Агидель (№ 02-04-97923) «Совместные культуры клеток пшеницы с фитопатогенами как модель для скрининга средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами» и грантом №207 6-го конкурса экспертизы молодых ученых РАН «Активация анионных пероксидаз как показатель неспецифической ответной реакции пшеницы против фитопатогенных грибов».

Публикации. Список основных публикаций по материалам диссертации включает 18 работ, включающий 5 статей в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черепанова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

1. У различных видов однодольных и двудольных растений выявлено семейство хитин-специфичных белков с пероксидазной активностью. Обнаружены определенные различия между видами в количестве изопероксидаз, сорбирующихся на хитин. У растений семейства мятликовых на хитин сорбировались анионные пероксидазы, тогда как у других видов сродством к нему обладали и катионные изоформы фермента.

3. Определено высокое иммунохимическое сходство анионной пероксидазы пшеницы с хитин-специфичными белками семейства мятликовых и отличие этой изоформы от других изопероксидаз пшеницы.

4. У пшеницы наряду с анионной пероксидазой, на хитин сорбируется оксалатоксидаза, что предполагает кооперативное участие этих ферментов в защите растений от хитин-содержащих патогенов.

5. Впервые у пшеницы обнаружены изопероксидазы (анионная с pi ~ 3.5 и катионная с pi ~ 9.7), способные сорбироваться на компоненты клеточных стенок фитопатогенных грибов - возбудителей твердой головни, пыльной головни, септориоза и корневой гнили. Предполагается, что анионная пероксидаза при этом связывается с хитином клеточных стенок грибов, а катионная — с глюканом.

6. Показано, что индукторы устойчивости (хитоолигосахариды и салициловая кислота), а также освещение, приводят к усилению устойчивости клеток каллуса пшеницы в совместной культуре с возбудителем твердой головни, что коррелирует с увеличением количества и активности изопероксидаз с pi ~ 3.5 и ~ 9.7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что одним из основных механизмов защиты растений от грибных фитопатогенов является формирование вокруг инфекционных структур гриба лигнина, который представляет собой эффективный защитный барьер на пути их проникновения. В растениях имеются белки, способные специфически связываться с хитином и глюканом клеточной стенки фитопатогенных грибов (лектины, хитиназы и глюканазы) [Лахтин, 1987.]. Однако непосредственно в процессах лигнификации эти белки не участвуют. Способностью катализировать полимеризацию фенольных соединений в лигнин и суберин обладает активный участник системы антиоксидантной защиты клеток - фермент пероксидаза [Quiroga et al., 2000; Keren-Keiserman et al., 2004]. До наших исследований механизм направленного отложения лигнина в точках проникновения фитопатогена и концентрирования стресс-индуцируемой пероксидазы в этих зонах был неизвестен.

Нами показано, что в растениях самых различных видов присутствуют изопероксидазы, способные к сорбции на хитин. Причем близкие по изоэлектрическим точкам изоформы могут обладать различным сродством к хитину, что позволяет сравнивать хитин-специфичные ее изоформы с экстенсинами. Эти моновалентные растительные лектины характеризуются высокой аффинностью к гемицеллюлозе [Brownleader et al., 2002] и функционально связаны с клеточной стенкой растений, выполняя роль ее модификаторов. Пролин-богатые участки, схожие с таковыми у экстенсинов, найдены у некоторых изоформ пероксидазы, выделенных из Scutellaria baicalensis Georgi, растения семейства губоцветных [Morimoto et al., 1999]. Некоторые пероксидазы томатов могут образовывать комплексы с классическим экстенсином клеточных стенок [Brownleader et al., 2002].

Свойство пероксидаз активироваться под влиянием хитина и сорбироваться на нем предполагает возможность их участия в процессах, лежащих в основе двух типов защитных реакций растений против фитопатогенов. Первый включает быструю активацию фермента при его контакте с клеточными структурами патогенов, как это наблюдается, например, при взаимодействии с хитином пероксидазы риса посевного, картофеля, хрена деревенского, подобно ее активированию при реакции гиперчувствительности. Второй тип реакции можно сравнить с постепенным накоплением молекул фермента в зоне локализации гриба, связанным с появлением своеобразного «аттрагирующего» центра в виде хитин-содержащих структур фитопатогена. Мы не исключаем и сопряженности этих явлений. В этом случае в тканях, подвергшихся интенсивному заселению грибом, происходит некроз, связанный с увеличением токсичных свободных радикалов [Huckelhoven et al., 1999], а в близлежащих клетках, при непосредственном участии «хитин-специфичных» изопероксидаз, происходит лигнификация проникших туда единичных патогенных структур, [Хайруллин и др., 2000]. Следовательно, от скорости активации пероксидазы в клетках, подвергшихся инфицированию и интенсивности сорбции этого фермента на мицелий хитин-содержащего патогена, вероятно, зависит судьба прохождения патологического процесса.

Поскольку с этим биополимером могут связываться как анионные, так и катионные изопероксидазы растений, можно предположить, что сорбция некоторых пероксидаз на хитин не носит классического ионообменного характера. Нами показано, что сорбция анионной пероксидазы пшеницы на хитин напрямую зависит от его степени ацетилирования. Выявлено, что главную роль во взаимодействии этого изофермента с хитином играют ацетильные группы полисахарида с одной стороны, и специфические участки молекулы белка - с другой.

Для изучения динамики изменения уровня анионных пероксидаз в инфицированных растениях и определения их роли в защите растений мы с использованием хроматографических колонок содержащих хитин и хитозан получили гомогенный препарат этого белка и антитела к нему. Обнаружено, что с хитином связываются 4 белка с молекулярной массой от 100 до 26 кДа, среди которых белок размером 26 кДа оказался оксалатоксидазой, а 37 кДа — пероксидазой с pi ~ 3.5. Показано, что анионная хитин-специфичная пероксидаза пшеницы иммунохимически отличается от других изопероксидаз этой культуры. Анализ иммунохимического сходства анионной пероксидазы пшеницы с хитин-специфичными белками других видов растений показал, что они не всегда похожи. Например, антитела против анионной пероксидазы пшеницы не взаимодействовали с белками растений из семейства пасленовых, а среди представителей семейств капустных, бобовых и тыквенных можно было встретить виды, как формирующие комплекс антиген-антитело (к анионной пероксидазе пшеницы), так и не способные к этому. Следует обратить внимание на то, что иммунохимическим сходством с хитин-специфичной пероксидазой пшеницы обладали анионные пероксидазы, выделенные из растений семейства мятликовых.

Совместное культивирование фитопатогенных микроорганизмов и растительных тканей в условиях in vitro представляет упрощенную модельную систему для исследования взаимоотношения хозяина и паразита. Преимущества этого метода состоят в возможности их асептического культивирования, регулирования химического состава среды и физических условий выращивания инфицированных тканей растений [Трошина и др., 2000].

В совместных культурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни периодическое освещение, салициловая кислота и хитоолигосахариды приводят к активации анионной пероксидазы. Показано, что активность пероксидазы зависит от концентрации хитоолигосахаридов. При инфицировании обработанных этими индукторами устойчивости каллусов происходит активация и выделение в среду культивирования изоферментов с pi ~ 3.5, ~ 4.8, ~ 7.5 и ~ 9.7, принимающих непосредственное участие в процессах, связанных с защитой растительных клеток при инфицировании. Добавление СК в среду культивирования каллусов, на фоне снижения общей активности фермента, усиливает активность изопероксидаз (с pi ~ 9.7 и ~ 3.5), способных сорбироваться на компоненты клеточных стенок фитопатогенных грибов.

Полученные данные позволяют предположить вовлечение пероксидаз с pi ~ 3.5 и — 9.7 в систему взаимоотношений пшеницы с патогенными микроорганизмами благодаря выделению этих изоформ в апопласт, где они могут выполнять специфические функции (сорбция на инфекционные структуры гриба, синтез и утилизация АФК с образованием лигнина). Тем более, что их активность усиливается под влиянием элиситоров и эндогенных индукторов устойчивости, а также инфицирования. Вероятно, в этом процессе важную роль играет наличие у производных хитина или других полисахаридов ацетильных остатков, на которые могут сорбироваться некоторые изопероксидазы.

Локальная активация пероксидаз в зоне инфицирования и непосредственно на поверхности хитина предполагает развитие защитных реакций именно «в том месте» и «в то время», когда с появлением в растительных тканях микроорганизмов, содержащих хитин, автоматически появляется мишень для их «атаки» этими ферментами. Кроме того, внедрение фитопатогена привлекает в зону инфицирования и другие PR-белки с высокими антифунгальными свойствами [Veronese et al., 2003]. Синергизм все этих реакций может значительно повышать эффективность защитных мероприятий растительных клеток при патогенезе.

Итак, нами выявлен механизм концентрирования пероксидаз в зоне инфицирования фитопатогенными грибами являющийся, вероятно, одним из важнейших сложно-регулируемых факторов многокомпонентной неспецифической защиты, который позволяет растению контролировать активность поступления элиситоров и вторичных мессенджеров в растительную клетку и снижать степень ее повреждения микроорганизмами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черепанова, Екатерина Александровна, Уфа

1. Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений

2. Усп. совр. биол. 1991. Т. 111. С. 722-738.

3. Андреева В.А. Фермент пероксидаза: Участие в защитном механизме растений (от вирусной инфекции). М.: Наука. -1988. -129с.

4. Антонюк JI. П., Игнатов В. В. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку // Физиол. раст. 2001. Т. 48. С. 427433.

5. Ахимова Г.П., Верхотуров В.В., Соколова М.Г., Нечаева JI.B., Лузова Г.Б. Изменение активности и каталитических свойств пероксидазы корней гороха на начальных этапах инфицирования Rhizobium leguminosarum. //Агрохимия, 2004, №1, с. 86-90

6. Ахметова И.Э. Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов. Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.б.н. Уфа. 2000. 24 с.

7. Бах А.Н. Собрание трудов по химии и биохимии. М.: Изд-во АН СССР, 1959. 622с.

8. Бейлез Э.М., Ричардсон П. Дж., Лузио Дж. П. Иммунологические методы исследования мембран // Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Финдлея Дж. Б. и Эванса У.Г. М.: Мир, 1990. С. 109-149.

9. Бовин Н.В. Углевод-углеводное взаимодействие // Биохимия. 1996. Т.61.вып.6. С. 968-983

10. Васильева Г.Г., Глянько А.К., Миронова Н.В. О содержании перекиси водорода в проростках гороха на ранних стадиях бобово-ризобиального симбиоза// С.-х. биология. 2004. №3. С.101-105.

11. Газарян И.Г. Пероксидазы растений //Биотехнология пероксидаз растений и грибов. Итоги науки и техники. Сер. биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1992. Т.36. 328 с

12. Газарян И.Г., Упоров И.В., Чубарь Т.А. и др., Влияние рН настабильность анионной пероксидазы табака и ее взаимодействие с перекисью водорода// Биохимия. 1998. Т.63. С. 708-715.

13. Ганиев P.M. Взаимоотношения пшеницы с возбудителем твердой головни Tilletia caries (DC.) Tul. на ранних этапах патогенеза. Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.б.н. Курган. 2000. 18 с.

14. Горбачева JI.A., Дударева Н.А., Салганик Р.И. Молекулярные механизмы устойчивости растений к патогену // Успехи совр. биологии. 1991. Т.111, вып.1. С. 122-136.

15. Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.JI., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Из-во Общества фитопатологов, 2001.302 с.

16. Ермаков А.И. Арасимович В.В., Яраш Н.П, Методы биохимического исследования растений JL: Агропромиздат, Ленинградское отделение, 1987. 400 с.

17. Зиновьева С.В., Васюкова Н.И., Озерецковская O.JI. Биохимические аспекты взаимодействия растений с паразитическими нематодами // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т.40. С. 133-142.

18. Иванова Т.М., Рубин Б.А. О природе фенолоксидазного действия пероксидазы //Биохимия. 1962. Т. 27, вып. 4. С. 622-630

19. Каратыгин И.В. Головневые грибы. Онтогенез и филогенез. JI.: Наука, 1981.216 с.

20. Лахтин В.М. Молекулярная организация лектинов // Мол. биол. 1994. Т. 28. С.245-273.

21. Лебедева О.В., Ежова Т.А., Мусин С.М., и др. Ген PXD контролирует образование трех изоформ анионных пероксидаз Arabidopsis thailiana II Изв АН. Сер. биол. 2003. №2. С. 159-168.

22. Маатис Э., Кайн Я. Прикрепление Rhizobiaceae к растительным клеткам // Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий взаимодействующих с растениями. Под ред. Спайнк Г., и др. / перевод Тихоновича И.А., Проворова

23. Н.А. С-Пб, 2002. С. 259-274.

24. Максимов И.В. Изучение факторов устойчивости пшеницы иэгилопса к септориозу. Автореф дисс.канд. биол. наук. С-Петербург. 1994.21 с

25. Максимов И.В., Хайруллин P.M., Ямалеев A.M., Ямалеева А.А. // Вопросы биотехнологии / под ред. Ахметова P.P. Уфа: Изд-во Баш ГУ, 1995, с.120-127.

26. Минибаева Ф.В. Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе. Автореф дисс.на соискание докт. дисс. С.-Петербург. 2005. 42 с.

27. Минибаева Ф.В., Гордон J1.X. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Физиол. раст. 2003. Т. 50. С. 459-464.

28. Озерецковская O.J1. Проблемы специфического иммунитета // Физиол. раст. 2002. Т.49. С. 148-154.

29. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 218 с.

30. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.536 с.

31. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Фомина В.А., Муштакова В.М. Пероксидазосомы клеток растений //Изв. РАН. Сер. Биол. 1996. №7. С. 16-22.

32. Савич И.М. Пероксидазы стрессовые белки растений // Усп. совр. биол. 1989. Т. 107. вып.З. С.406-417.

33. Садвакасова Г. Г., Кунаева Р. М. Некоторые физико-химические свойства пероксидазы растений // Физиология и биохимия культурных растений. 1987, N 2 , С. 107-119.

34. Сахаров И.Ю. Перокисидазы пальм // Биохимия. 2004. т.69. С.10131020.

35. Серова З.Я., Юшко Л.С., Подчуфарова Г.М. Функции белков в фитопатогенезе. Минск: Наука и техника, 1992. 270 с.

36. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: ФЭН, 2001.448 с

37. Тихонович И. А., Проворов Н.А. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. С.-Петербург: Наука, 1998. 194 с.

38. Трошина Н.Б., Максимов И.В., Сурина О.Б., Хайруллин P.M. Развитие Tilletia caries (D.C.) Tul. в каллусных и суспензионных культурах пшеницы // Изв. РАН. 2000. №3. С. 377-381.

39. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т.67. С.339-352.

40. Тютерев С.Л. Научные основы индуцирования болезнеустойчивости растений. С-Пб. 2002. - ООО «Инновационный центр защиты растений» ВИЗР. 328 с.

41. Угарова Н.Н., Лебедева О.В. Структура и функции пероксидазы из хрена // Биохимия. 1978. Т.43. С. 1731-1740.

42. Фёдорова Е.Э., Жизневская Г.Я., Калиберная З.В., и др. Метаболизм ИУК при установлении симбиоза между Phaseolus vulgaris и Rhizobium phaseoli. //Физиология растений. 2000. т. 47. С. 231-235.

43. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука. 1983. 248с.

44. Феофолова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы использования // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука. 2002. С. 368.

45. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Органоспецифичные спектры пероксидаз у кукурузы // Физиол. раст. 1995. Т.42. С.281-289.

46. Хайруллин P.M., Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Ахметова И.Э. Активация хитолигосахаридами окисления ортофенилендиамина проростками пшеницы в присутствии щавелевой кислоты//Биохимия. 2001. Т.66. №6. С.354-358.

47. Часов А.В. Генерация супероксид-иона и активность пероксидазы при модификации проводимости плазмалеммы корневых клеток пшеницы. Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.б.н. Казань, 2002. 23 с.

48. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160 с.

49. Шакирова Ф.М., Сахабутдинова А.Р., Сигнальная регуляция устойчивости растений к патогенам // Усп. совр. биол. 2003. Т. 123. С. 563-572.

50. Яруллина Л.Г. Максимов И.В., Ямалеев A.M. Защитная роль лигнификации при инфицировании пшеницы септориозом // Микол. и фитопатол. 1997. т. 31. С.43-46

51. Aist R., Israel H.W. Cytological Aspects of Host Responses to Primary Penetration by Fungi. // Biochem. and Cytology of Plant — Parasite Interaction / Eds Tomiyama K. et al. Tokio: Kodansha LTD, 1997, P. 26 31

52. Alvarez M.E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 429-442.

53. Baga M., Chibbar R.N., Kartha K.K. Molecular cloning and expression analysis of peroxidase genes from wheat // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P.647-662

54. Barcelo A. The generation of H2O2 in the xylem of Zinnia elegans is mediated by an NADPH-oxidase-like enzyme II Planta. 1998. V. 207. P. 207-216

55. Bernards, M. A.Razem, F. A. The poly(phenolic) domain of potato suberin: a non-lignin cell wall bio-polymer // Phytochemistry. 2001. V. 57. P. 11151122.

56. Bestwick C.S., Brown I.R., Bennett M.H.R., Mansfield J.W. Localization of hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola II Plant Cell. 1997. V.9. P. 209-221.

57. Bindschedler L.V., Minibayeva F., Gardner SL. et al. Early signaling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured french bean cells involve cAMP and Ca2+//New Phytologist. 2001. V. 151. P. 185-194.

58. Birecka H., Miller A. Cell wall and protoplast isoperoxidases in relation injury, indolileacetic acid and ethylene effects // Plant Physiol. 1974. V.53. P. 569574.

59. Blinkovsky A.M., McEldon J.P., Arnold J.M., Dordick J.S. Peroxodase-catalyzed polymerization and depolymerization of coal in organic solvents //Appl. Biochem. and Biotechnol. A. 1994. V. 49. N 2. P. 153-164.

60. Bolwell G.P., Blee K.A., Butt V.S. et al. Recent advances in understanding the origin of the Apoplastic Oxidative Burst in plant Cells // Free Radical Res. 1999. V. 31. P. 131-145.

61. Brownleader M.D., Hopkins J., Mobasheri A. et al. Role of extension peroxidase in tomato {Lycopercicon esculentum Mill.) seedling growth // Planta. 2002. V. 210. P. 668-676.

62. Buntemeyer K., Luthen H., Bottger M., Auxin-induced changes in cell wall extensibility of maize roots // Planta. 1998. V. 204. P. 505-509.

63. Calderon A.A., Pedreno M.A., Ros Barcelo A., Munoz R. A spectrophotometric assay for quantitative analysis of the oxidation of 4-hydroxystilbene by peroxidase-H202 systems // J. Biochem. Biophys. Methods. 1990. V. 20. P. 171.

64. Carpin S., Grevecoeur M., Greppin H., Penel C. Molecular cloning and tissue-specific expression of an anionic peroxidase in zucchini // Plant Physiol. 1999. V. 120. P. 799-810.

65. Caruso C., Chilosi G., Caporale C., et al. Induction of pathogenesis-related proteins in germinating wheat seeds infected with Fusarium culmorum II Plant Sci. 1999. V. 140. P.87-97.

66. Caruso C., Chilosi G., Leonardi L. et al. A basic peroxidase from wheat kernel with antifungal activity// Phytochem. 2001. V.58. P. 743-750.

67. Cassab G.I., Lin J.J., Lin L.S., Varner J.E. Ethylene effects on extensin and peroxidase distribution in the subapical region of pea epicotyls //Plant Physiol. 1988. V. 88. P. 522-524.

68. Chen Z., Silva H., Klessig D.F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid // Science. 1993. V. 263. P. 1883-1886.

69. Chittoor J.M., Leach J.E., White F.F., Differential induction of a peroxidase gene family during infection of rice by Xanthomonas oryzae pv. Oryzae II Mol. Plant-Microbe Inter. 1997. V. 10. P. 861-871.

70. Christensen J.H., Overney S., Rohde A., et al. The syringaldazine-oxidizing peroxidase PXP 3-4 from poplar xylem: cDNA isolation, characterization and expression. // Plant Mol Biol. 2001. V. 47. P. 581-593.

71. Cook D., Dreyer D., Bonnet D., Howell M., Nony E., VandenBosch K. The Plant Cell. 1995. V. 7. P. 43-55.

72. Cooper J.B. and Long S.R. Morphogenetic rescue of Rhizobium meliloti nodulation mutants b у trans-zeatin secretion //Plant Cell. 1994. V. 6. P. 215-225.

73. Czaninski Y., Sachot R.M., Catesson A.M. Cytochemical localization of hydrogen peroxide in lignifying cell walls //Ann. of Botany. 1993. V. 72. P. 547-550.

74. Delincee H., Radola B.J., Drawert F. The effect of heat on the isoelectric and size properties of horseradish peroxidase // Experientia. 1971. V.27. N 11. P. 1265-1267.

75. De Leonardis S., Dipierro N., Dipierro S. Purification and characterization of an ascorbate peroxidase from potato tubers mitochondria // Plant Physiol. Biochem. 2000. V. 38. P.773-779.л

76. Droge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function // Physiol Rev. 2002. V. 82. P.47-95.

77. Dunand C., Tognolli M., Overney S. et al. Identification and characterisation of Ca2+-pectate binding peroxidase in Arabidopsis thailiana // J. Plant Physiol. 2002. V. 159. P. 1165-1171.

78. Durner J., Klessig D.F. Inhibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid and 2,6-dichloroisonicotinic acid, two inducers of plant defense // Proc. Natl.

79. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 11312-11316.

80. Duroux L., Welinder K.L. The peroxidase gene family in plants // J. Mol. Evol. 2003. V.57. P.397 407.

81. El Gueddari N. E., Rauchhaus U., Moerschbacher B.M., Deising H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi // New Phytologist. 2002. V. 156. P. 103-112.

82. Espelie K.E., Kolattukudy P.E. Purification and characterization of an abscisic acid-inducible anionic peroxidase associated with suberization in potato (Solanum tuberosum) //Arch. Biochem. Biophys. 1985.V. 240. P. 539-545.

83. Fukamizo Т., Honda Y., Toyoda H. et al. Chitinous component of the cell wall Fusarium oxysporum, its structure deduced from chitosanase digestion // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. V. 60. P. 1705-1708.

84. Gaspar Т., Penel C., Thorpe Т., Greppin H. Peroxidases. 1970-1980: A survey of their biochemical and physiological roles in higher plants. Geneve: Univ.de Geneve, Centre de Botanique. 1982. 324p.

85. Gaspar Т., Penel C., Castillo I., Greppin H. A two-step control of basic and acidic peroxidases and its significance for growth and development //Physiol. Plant. 1985. V. 64. P. 418-423.

86. Gazarian G.I., Lagrimini L.M., George S.J., Thorneley R.N.F. Anionic tobacco peroxidase is active at extremely low pH: veratryl alcohol oxidation with a pH optimum of 1.8 // Biochem. J. 1996. V. 320. P. 369-372.

87. Gechev Т., Gadiev I., Van Breusegem F. et al. Hydrogen peroxide protect tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxidant enzymes // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V.59. P.708-714.

88. Genoud Т., Buchala A.J., Chua N.-H., Metraux J.-P. Phytochrome signaling modulates the SA-perceptive pathway in Arabidopsis // Plant J. 2002. V.31. P. 87-95.

89. Guan L., Scandalios J. Developmentally related responses of maise cata-Iase gene to salicylic acid // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 5930-5954.

90. Hadwiger L.A. Host — parasite interaction: elicitation of defense responses in plants with chitosan // EXS. 1999. V. 87. P. 185-200.

91. Hammerschmidt R. Determination of natural and wound-induced potato tuber suberin phenolics by thioglycolic acid derivatization and cupric oxide oxidation //Potato Res. 1985. V. 28. P. 123-127.

92. Hammerschmidt R., Kuc J. Lignification as a mechanism for induced systemic resistance of cucumber // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1982. V.20. P.61-70.

93. Hamilton R.H., Meyer H.E., Bupke R.E., et al. Metabolism of Indole-3-acetic acid // Plant Physiol. 1976. V. 58. P. 77-81.

94. Hardham A.R., Mitchell H.J. Use of molecular cytology to study the structure and biology of phytopathogenic and mycorrhizal fungi // Fungal Gen. Biol. 1998. V. 24. P. 252-284.

95. Harkin J.M., Obst J.R. Lignification in trees induction of exclusive peroxidase participation // Science. 1973. V.180. P.296-298.

96. Hawkins S., Boudet A. Defense lignin and hydroxycinnamyl alcohol dehydrogenase activities in wounded Eucalyptus gunnii II Forest Path. 2003. V. 33. P. 91-104.

97. Heitefuss R. Defense reactions of plants to fungal pathogens: principles and perspectives, using powdery mildew on cereals as an example // Naturwissenschaften. 2001. V. 88. P.273-283.

98. Henriksen A., Mirza O., Indiani C. et al. Structure of soybean seed coat peroxidase: a plant peroxidase with unusal stability and haem-apoprotein interaction // Protein sci. 2001. V.10. P. 108-115.

99. Hippeli S., Heiser I., Elstner E. F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants // Plant Physiol. Biochem. 1999. V. 37. P.167-178.

100. Hiraga S., Sasaki K., Ito H. et al. A large family of Class III Plant Peroxidases // Plant Cell Physiol. 2001. V.42. P.462-468

101. Hrubkova M., Cvikrova M., Meravy L. et al. Phenolic accumulation andperoxidase activity in in vitro selected alfalfa callus cultures resistant to filtrate of Fusarium spp. // Biologia plant. 1992. V. 34. P. 203-211.

102. Jansen M.A.K., Van den Noort R.E., Tan M.Y. et al. Phenol-oxidizing peroxidases contribute to the protection of plants from ultraviolet radiation stress // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 1012-1023.

103. Johansson M.W. Peroxinectin, a cell-adhesive peroxidase // Plant Peroxidase Newsletter. 1997. N. 9. P. 3-5.

104. Kaothien P., Shimokawatoko Y., Kawaoka A. et al. A c/s-element containing PAL-box functions in the expression of the wound-inducible peroxidase gene of horseradish // Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 558-562.

105. Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. // Plant Cell Rep. 2003. V. 21. P. 829-837.

106. Kay L.E., Basile D.V. Specific peroxidase isoenzymes are correlated with organogenesis //Plant Physiol. 1987. V. 84. N 1. P. 99-105.

107. Kazan K., Goulter K.C., Way H.M., Manners J.M. Expression of a pathogenesis related peroxidase of Stylosanthes humilis in transgenic tobacco and canola and its effect on disease development // Plant Sci. 1998 a. V. 136. P. 207-217.

108. Keren-Keizerman A., Tanami Z., Shoseyov O., Ginzberg I. Peroxidase activity associated with suberization processes of the muskmelon (Cucumus meld) rind // Physiol. Plantarum. 2004. V. 121. P. 141-148.

109. Klapper M.N., Hackett D.P. Investigations on the multiple components of commercial horseradish peroxidase I I Biochem. et Byophys. Acta. 1965. V. 96. P. 271-282.

110. Kolattukudy P.E., Rogers L.M., Li D., et al. Surface signaling in pathogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4080-4087.

111. Kreger D.R. Observation cell wall of yeast and other fungi by X ray difraction and solubility tests // Biochemist et Biophys acta. 1954. V.13. P. 1-9.

112. Kuzniak E., Sklodowska M. The effect of Botrytis cinerea infection an ascorbate-glutatione cycle in tomato leaves //Plant Science. 1999. V. 148. P. 69-76.

113. Lagrimini M.L., Gingas V., Finger T. et al. Characterization of antisense transformed plant deficient in the tobacco anionic peroxidase //Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 1187-1196.

114. Lamb C., Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance // Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 1997. V. 48, P. 251-275

115. Lane B.G., Dunwell J.M., Ray J.A. et al. Germin a protein marker of early plant development, is an oxalate oxidase // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 12239-12242.

116. Liszkay A., Kenk В., Schopfer P. Evidence for the involvement of cell wall peroxidase in the generation of hydroxyl radicals mediating extension growth // Planta. 2002. V. 217. P.658-667.

117. Lucena M.A., Romero-Alanda R., Mecardo J.A. et al. Structural and physiological changes in the roots of tomato plants over-expressing a basic peroxidase // Physiol. Plant. 2003. V.l 18. P.422-429.

118. Luo J.-P., Jiang S.-T., Pan L.J. Enhanced somatic embryogenesis by salicylic acid of Astragalus adsurgens Pall.: relationship with H202 production and H202-metabolizing enzyme activities. Plant Science. 2001. V.l61. P. 125—132

119. Margalit H., Fisher N., Ben-Sasson S.A. Comparative analysis of structurally defined heparin binding sequences reveals a distinct spatial distribution of basic residues//J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 19228-19231.

120. Martinez C., Blanc F., Le Clarie E. et al. Salicylic acid and ethylene pathways are differentially activated in melon cotyledons by active of heat-denatured cellulase from Trichoderma longibrachiatum!/Plant Physiol. 2001. V.127. P.334-344.

121. Medeghini, B.P., Larenzini, G., Baroni, F.R., Nali, C., Sgaili E. Cytochemical detection of cell wall bound peroxidase in rust infected broad bean leaves //J. Phytopathology. 1994. V.140. P. 319-325

122. McDougall G.J. Cell-wall proteins from Sitka spruce xylem are selectively insolubilised during formation of dehydrogenation polymers of coniferyl alcohol //Phytochem. 2001. V. 57. P. 157-163.

123. Medina M.I., Quesada M.A., Pliego F. et al. Expression of the tomato peroxidase gene tpxl in NaCl-adapted and unadapted suspension cells // Plant Cell Rep. 1999. V. 18. P. 680-683.

124. Metraux J.-P. Systemic acquired resistance and salicylic acid: current state of knowledge // Eur. J. of Plant Pathol. 2001. V. 107. P. 13-18.

125. Minibayeva F., Gorgon L.K., Kolesnokov O.P., Chasov A.V. Role of extracellular peroxidase in the superoxide production by wheat root cells // Protoplasma. 2001. V.217. P. 125-128.

126. Minibayeva F., Mika A., Luthje S. Salicylic acid changes the properties of extracellular peroxidase activity secreted from wounded wheat (Triticum aestivum L.) roots // Protoplasma . 2003. V. 221. P. 67-72.

127. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends in Plant Sci. 2002. V.7. P. 405-410.

128. Moore J.P., Paul N.D., Whittaker J.B., Taylor J.E. Exogenous Jasmonic acid mimics herbivore-induced systemic increase in cell wall bound peroxidase activity and reduction in leaf expansion // Functional ecology. 2003. V.17. P.549-554.

129. Morimura Y., Iwamoto K., Ohya T. et al. Light-enhanced induction of ascorbate peroxidase in Japanese radish roots during postgerminative growth // Plant Sci. 1999. V. 142. P. 123-132.

130. Murashige Т., Scoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

131. Muzzarelli R.A. Chitin. Pergamon press. 1977.

132. Nagy N. E., Fossdal C.G., Dalen L.S. et al. Effects of Rhisoctonia infection and drought on peroxidase and chitinase activity in Norway spruce (Picea abies) //Physiol. Plant. 2004. V. 120. P. 465-473.

133. Okushima Y., Koizumi N., Kusano Т., Sano H. Secreted proteins of tobacco cultured BY2 cells: identification of a new member of pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. P. 479-488.

134. Otte O., Barz W. Characterization and oxidative in vitro cross-linking of an extensin-like protein and a proline-rich protein purified from chickpea cell walls // Phytochem. 2000. V. 53. P. 1-5.

135. Park S.Y., Ryu S.H., Kwon S.Y. et al. Differential expression of six novel peroxidase cDNAs from cell cultures of sweetpotato in response to stress // Mol Gen Genomics. 2003. V. 269. P. 542-552.

136. Passardi, F. et al. (2004) The plant peroxidase multigenic family in rice and its evolution in green plants // Phytochemistry 65, 1879—1893.

137. Passardi F., Penel C. and Dunand C. Performing the paradoxical: how plant peroxidases modify the cell wall // TRENDS in Plant Science 2004. V. 9. P.

138. Ramonell K.M., Zhang В., Ewing R. M. et al. Microarray analysis of chitin elicitation in Arabidopsis thaliana II Mol. Plant Pathol. 2002. V.3. P. 301-311.

139. Rebmann G., Hertig C., Bull J. et al. Cloning and sequencing of cDNAs encoding a pathogen-induced putative peroxidase of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Mol. Biol. 1991. V. 16. P. 329-331.

140. Repka V., Jung M. Organ-specific expression of the stress-related anionic peroxidases in cucumber flowers // Biol. Plantarum. 1995. V. 37. P. 523-531.

141. Riddle V.M., Maselis M. Convertion of tryptophane to indolelacetic acid by plant preparations //Plant physiol. 1965. V. 40. N 3. P. 481-484.

142. Rudiger H., Gabius H-J. Plant lectins: Occurrence, biochemistry, functions and applications // Glycoconjugate J. 2001. V. 18. P. 589-613.

143. Santiago A. P., Saavedra E., Camposa E. P., Cordoba F. Effect of plant lectins on Ustilago maydis in vitro // Cell. Mol. Life Sci. 2000. V. 57. P. 1986-1989.

144. Sasaki K., Hiraga S., Ito H. et al. A wound-inducible tobacco peroxidase gene expressed preferentially in the vascular system // Plant Cell Physiol. 2002. V.43. P.108-117.

145. Savitsky P.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.I. et al. Oxidation of indoIe-3-acetic acid by dioxygen catalyzed by plant peroxidases: specificity for theenzyme structure // Biochem J. 1999. V.340. P. 579-583.

146. Schnabelrauch L., Kieliszewski M., Upharin B.L. et al. Isolation of pl~ 4 extensine peroxidase from tomato cell suspension culture and identification of Val-Tyr-Lys as putative intermolecular cross-link site // Plant J. 1996. V.9. P.477-489.

147. Shannon L.M., Kay E., Lew Y.Y. Peroxidase isoenzymes from horseradish roots. I. Isolation and physical properties //J. Biol. Chem. 1966. V. 241. N9. P. 2166-2172.

148. Sharma P.T.R., Singh B.M. Salicylic acid induced insensitivity to culture filtrate of Fusarium oxysporum f.sp. zingiberi in the calli of Zingiber officinale Roscoe // Eur. J. Plant Pathol. 2002. V.108. P.31-39.

149. Shibuya N., Minami E. Oligosaccharide signalling for defence responses in plant // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2001. V. 59. P. 223-233.

150. Showalter A.M. Structure and function of plant cell wall proteins // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 9-23.

151. Siegel S.M. Non enzymic macromolecules as matrices in biological synthesis. The role of polysaccharides in peroxidase catalyzed lignin polymer formation from eugenol //J. Amer. Chem. Soc. 1957. V.79. P. 1628-1632.

152. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria. Kluwer Academic Publishers, 1998. 567 p

153. Srivastava O.P., van Huystee R.B. IAA oxidase and polyphenol oxidase activities of peanut peroxidase isozymes //Phytochem. 1977. V. 16. N 10. P. 15271530.

154. Sukalovic V., Vuletic M., Vucinic Z. Plasma membrane-bound phenolic peroxidase of maise roots: in vitro regulation of activity with NADH and ascorbate // Plant Sci. 2003. V. 165. V. 1429-1435.

155. Swart S., Logman T.J.J., Smit G. et al. Purification and partial characterization of a glycoprotein from pea (Pisum sativum) with receptor activity from rhicadhesin, an attachment protein of Rhizobiacea II Plant Mol. Biol. 1994. V. 24. P. 171-184.

156. Tadors L.K., Andrrei D., Motas C. The role of carbohydrate in the intracellular degradation of glycoproteins. XIX. The involement of specific sugar residues in the active site of peroxidase isoenzyme A //Rev. Roum. Biochem. 1983. V. 20, P. 293-300.

157. Takabe, K. Takeuchi, M. Sato, T. Ito, M. Fujita, M. Immunocytochemical localization of enzymes involved in lignification of the cell wall //Journal of Plant Research. 2001. V. 114. P. 509-515.

158. Teichmann Т., Guan С., Kristoffersen P., Muster G., Tietz O., Palme K. Cloning and biochemical characterization of an anionic peroxidase from Zea mays H Eur. J. Biochem. 1997. V.247. P.826-832.

159. Thordal-Christinsen H., Zang Z., Wei Y., Collinge D. Subsellular localization of H202 in plants. H202 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley powdeiy mildew interaction //Plant J. 1997. V. 11. P. 1187-1194.

160. Thulke O., Conrath U. Salicylic acid has a dual role in the activation of defence-related genes in parsley // Plant J. 1998. V.14. P. 35-42.

161. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P. Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana II Gene. 2002. V.28. P.129-138.

162. Vandenberg B.M., van Huystee R.B. Rapid isolation of plant peroxidase. Purification of peroxidase a from petunia//Physiol. Plant. 1984. V. 60. P. 294-304.

163. Vander P., Varum K.M., Domard A. et al. Comparison of the ability of partially N-Acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance in wheat leaves//Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1353-1359.

164. Van Huystee R.B. Plant Peroxidases //Isozymes: Current Topics in Biological and Medical Research /Ed. Alan R. V. 16. N. Y.: Liss Inc. 1987. P. 241.

165. Van Loon L.C. Occurrence and properties of plant pathogenesis-related proteins. In Pathogenesis-related Proteins in Plants, Eds Datta S.K., Muthukrishnan S. CRC Press, Boca Raton, FL. 1999. P. 1-19.

166. Wagner V., Matthysse A.G., Involvement of a vitronectin-like protein in attachment of Agrobacterium tumefaciens to carrot suspension culture cells // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5999-6003.

167. Wallace G., Fry S.C. Action of diverse peroxidases and laccases on six wall-related phenolic compounds // Phytochemistry. 1999. V.52. N.5. P.769-773.

168. Wang T.T., Yang S.F. The physiological role of lipoxygenase in ethylene formation from 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid in oat leaves //Planta. 1987. V. 170. N 2. P. 190-196

169. Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H. et al. An epidermis/papilla-specific oxalate oxidase-like protein in the defence response of barley attacked by the powdery mildew fungus // Plant Mol. Biol. 1998. V. 36. P. 101-112.

170. Welinder K.G. Superfamily of plant, fungal and bacterial peroxidases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1992. V. 2. P. 388-393.

171. Welinder K.G., Justesen A.F., Kjsersgard I.V. et al. Structural diversity and transcription of class III peroxidases from Arabidopsis thaliana II Eur. J Biochem. 2002. V.269. P.6063-6081.

172. Whetten R., Sederoff R. Lignin biosynthesis // Plant Cell. 1995. V.7. P. 1001-1013.

173. Xu J.F., Sun Y., Su Z G. Enhanced peroxidase production by suspension culture of carrot compact callus aggregates // J. of Biotech. 1998. V. 65. P. 203-208.

174. Yabuta Y., Motoki Т., Yoshimura K. et al. Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress // Plant J. 2002. V. 32. P. 915-925.

175. Yamaguchi, Т., Ito Y., Shibuya N. Oligosaccharide elicitors and their receptors for plant defense responses// Trends in Glycosci. Glycotech. 2000. V. 12. P. 113-120.

176. Zhang В., Ramonell K., Sommervile S., Staccey G. Characterization of early, chitin-induced gene expression in Arabidopsis II Mol. Plant-Microbe Interact. 2002. V. 15. P. 963-970.

177. Zhou F., Andersen C.H., Burhene K. et al. Proton extrusion is an essential signaling components in the HR of epidermal single cells in the barley-powdery mildew interaction // Plant J. 2000. V.23. P.245-254.

178. Zhu J.K., Damsz В., Kononowicz A.K., et al. A higher plant extracellular vitronectin-like adhesion protein is related to the translational elongation factor la // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 393-404.

Информация о работе

Черепанова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Уфа, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Хитин-специфичные пероксидазы растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы