Дезацетилирование хитина как фактор регуляции взаимоотношений гриба Septoria nodorum Berk. с пшеницей

Валеев, Альберт Шакирьянович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дезацетилирование хитина как фактор регуляции взаимоотношений гриба Septoria nodorum Berk. с пшеницей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дезацетилирование хитина как фактор регуляции взаимоотношений гриба Septoria nodorum Berk. с пшеницей"

На правах рукописи

ВАЛЕЕВ АЛЬБЕРТ ШАКИРЬЯНОВИЧ

ДЕЗАЦЕТИЛИРОВАНИЕ ХИТИНА КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ГРИБА Septoria nodorum BERK. С ПШЕНИЦЕЙ

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА 2009

003488960

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Максимов Игорь Владимирович

Официальные доктор биологических наук, профессор

оппоненты: Хайруллин Рамиль Магзинурович

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Башкирский государственный аграрный университет

доктор биологических наук Антонюк Людмила Петровна Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «лА> ноября 2009 г. в «_&_>> ч на заседании диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН:

http://ibg.anrb.ru /dissov.html: e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « № » С(с2^СЦ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.М.Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. К числу наиболее вредоносных возбудителей болезней, вызывающих значительные потери урожая пшеницы, относится гриб Septoria nodorum Berk. (син. Stagonospora nodorum Castell. et Germano; телеоморфа: Leptosphaeria nodorum E. Mull., син. Phaeosphaeria nodorum (E. Mull.) Hedjar.). Прогрессирующее его распространение, наблюдаемое в последнее время, обусловлено использованием в растениеводстве сходных по химической структуре фунгицидов [Rezgui et al. 2008; Cools, Fraaije, 2008]. В этих условиях, одним из наиболее перспективных подходов для снижения уровня развития грибных болезней является применение в растениеводстве иммуномодуляторов, индуцирующих у растений естественную системную устойчивость. Однако, при этом необходимо учитывать, что проявление биологической активности такого рода препаратов находится в четкой зависимости от их молекулярной структуры [Дьяков, 1967, 2001; Тарчевский, 2002; Озерецковская, 2002; Veronese et al., 2003; Kwone et al., 2008; Плотникова 2009]. Так, элиситорная активность внедряемых в практическое растениеводство препаратов, созданных на основе производных хитина [Тютерев, 2002], существенно варьирует от их степени ацетилирования (СА) [Vander et al., 1998; Falcon et al., 2008; Dos Santos et al., 2009]. Использование таких препаратов для получения высококачественной экологически безопасной продукции требует познания биохимических механизмов реализации собственной защиты растений для эффективного управления ими.

Ранее в лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН было выявлено, что анионные изопероксидазы относятся к эффективным компонентам защитной системы растений от патогенов, благодаря их способности сорбироваться на хитин, но не на хитозан [Максимов и др., 1995; Хайруллин и др., 2000]. Любопытно, что многие патогенные грибы, в том числе и возбудитель септориоза S. nodorum, вырабатывают ферменты хитиндезацетилазы [Tokuyasu et al., 1997; Martinou et al., 2002; Blair et al., 2006], дезацетилирующие хитин своих клеточных стенок, что может быть одним из факторов, снижающих защитный потенциал растений [El Gueddari et al., 2002]. Это предполагает важную роль в формировании защитного ответа растений на инфицирование СА хитина, а также наличие как у патогена, так и хозяина механизмов регуляции этого показателя биополимера, от которых, в конечном счете, может зависеть становление устойчивости/восприим-чивости в системе растение-хозяин/гриб-патоген. Проверке этой гипотезы и посвящена настоящая работа.

Цель исследований состояла в выявлении роли степени ацетилирования хитина в регуляции взаимоотношений патогенного гриба S. nodorum Berk, с пшеницей.

Задачи исследований:

1) определить влияние хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования, известного индуктора устойчивости растений салициловой кислоты, а также штаммов гриба 5. по<1огит с разной степенью агрессивности на устойчивость растений пшеницы к возбудителю септориоза и функционирование компонентов растительной про-/антиоксидантной системы;

2) выявить молекулярно-биохимические особенности штаммов гриба 8. пойогит, определяющие разную степень их агрессивности;

3) оценить уровень экспрессии гена хитиндезацетилазы гриба в растениях пшеницы, инфицированных штаммами пос1огит с разной степенью агрессивности;

4) разработать молекулярно-генетический метод диагностики степени агрессивности гриба & пос1огит в растениях пшеницы.

Научная новизна. Установлено, что значительный вклад в устойчивость пшеницы к патогену вносит ранняя активация оксалатоксидазы и пероксидазы в апопласте, тогда как в проявление свойств агрессивности у штаммов 5. пос1огит -каталазы и хитиндезацетилазы гриба. Обнаружена зависимость индуцированной ХОС устойчивости пшеницы к септориозу от степени их ацетилирования. Выявлены различия в характере генерации активных форм кислорода в листьях пшеницы, инфицированных разными по агрессивности штаммами гриба. Впервые в белковой фракции устойчивых к возбудителю септориоза проростков пшеницы ТгШсит ИторИееуН (гЪик.) гЪик. обнаружена ацетилирующая хитин активность, что вносит важный вклад в формирование эффективной системы защиты этого вида пшеницы.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет понимание биохимических механизмов фитоиммунитета. Доказано, что при применении препаратов на основе хитина и их композиций с другими индукторами важна СА биополимера. Продемонстрирована эффективность использования обратно-транскрипционной ПЦР (от-ПЦР) для определения степени агрессивности патогенов. Предложен метод ДНК-диагностики гриба 51. пос1огит в тканях растений пшеницы с применением праймеров к гену хитиндезацетилазы этого патогена.

«Устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды» (Иркутск,

2007); на собраниях и съездах общества физиологов растений (Ростов на Дону, 2006; Сыктывкар, 2007), на втором съезде микологов России (Москва, 2009), на международных конференциях и симпозиумах: «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Казань, 2006; Ставрополь,

2008), «Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture» (Kiev, 2007).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами Федеральной целевой программы России № 02.512.11.2051 (2007), РФФИ (№ 05-04-48310) (2005-2008), международного гранта РФФИ-ККРНТ 08-04-90259узб_а (2008-2009), регионального гранта РФФИ-Агидель (№ 0204-97923) (2002-2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК ......

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 243 источников. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 таблицами и 27 рисунками.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. И.В. Максимову, сотрудникам лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН, в которой проводились исследования: д.б.н. Н.Б. Трошиной, д.б.н. Л.Г. Яруллиной, к.б.н. О.Б. Суриной, к.б.н. Е.А. Черепановой за постоянное внимание к работе и помощь в ходе ее выполнения и обсуждения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследования использовали проростки мягкой пшеницы Т. aestivum L. (сорт Жница) и пшеницы Т. timopheevii (Zhuk.) Zhuk. (образец к-58666 из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН). Мицелий и споры штаммов хитин-содержащего гриба S. nodorum [Parijs et al., 1991] любезно предоставлены сотрудниками Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси. Развитие гриба S. nodorum оценивали согласно рекомендациям Г.В. Пыжиковой, Е.В. Карасевой [1986]. Мицелий и споры патогенных грибов Tilletia caries Thul., Ustilago tritici Pers, Fusarium culmorum W.G. Smith., Bipolaris sorokiniana Sacc., Septoria tritici Blotch, и Beauveria bassiana Bals. отобраны из коллекции лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН.

Водорастворимые хитоолигосахариды (ХОС) со степенью ацетилирования (СА) 65% и 13% и молекулярной массой 10 кДа получены в

нашей лаборатории [Ахметова, 2000]. Хитин 85% CA и хитозан 3% CA приобретены в ЗАО «Сонат» (Москва). CA хитина контролировали ионометрическим титрованием и ядерно-магнитной резонансной спектроскопией ('Н-ЯМР-спектроскопии) с использованием, соответственно, Иономера И-120.2 (Грузия) и ЯМР-спектрометра AM - 300 (Bruker, США). Препараты салициловой кислоты (CK) (Реахим, Россия), в концентрации 0,05мМ, а так же ХОС различной CA в концентрации 1 мг/л вводили в среду культивирования отрезков листьев пшеницы.

Для определения локализации генерации Н202 с участием оксалатоксидазы отрезки листьев пшеницы через 12, 24 и 48 ч после инокуляции погружали в раствор 3,3-диаминобензидина (ДАБ) (1.5 мг/мл) с добавлением 2,5 мМ щавелевой кислоты на 30 мин. После появления стойкого бурого окрашивания окисленного ДАБ отрезки листьев фиксировали в 96%-ном этаноле.

Для получения свободно-растворимой (цитоплазматической) фракции белков растительный материал гомогенизировали в 0.01 M Na-фосфатном буфере (ФБ) pH 6,2 (1:10, г/мл). Для выделения ионно-связанной с клеточными стенками фракции белков клеточные стенки листьев пшеницы, после их 10-и кратного отмывания ФБ, содержащим 1%-ный тритон Х-100 (ICN, США) (1:10, г/мл), подвергали обработке 2М NaCl в ФБ (1:1, г/мл).

Активность пероксидазы и каталазы определяли по методу, описанному А.И. Ермаковым с соавторами [1987], а оксалатоксидазы по В. Dumas с соавторами [1995] микрометодом при 20-24°С в планшетах Nunk с использованием прибора Benchmark Microplate Reader («BioRad», США). Изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе горизонтального электрофореза («Хийу-Каллур», Эстония). Содержание белка определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976].

ДНК из проростков пшеницы и мицелия грибов выделяли фенольно-детергентным методом [Graham, 1978]. Для выделения и очистки РНК использовали метод P. Chomczynski и N. Sacchi [1987]. Концентрацию ДНК и РНК измеряли при A2«/A280 на спектрофотометре Smart Spec™ Plus («BioRad», США). Для получения кДНК на основе мРНК проводили реакцию обратной транскрипции (от-ПЦР) с использованием M-MuLV обратной транскриптазы, согласно протоколу поставщика. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе ТП4-ПЦР-01-"Терцик" («ДНК-Технология» Россия). После амплификации реакционную смесь фракционировали методом электрофореза с использованием прибора miniProtean 3 Cell («BioRad», США) согласно описанию Т. Маниатис и др. [1984]. После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 2% агарозном геле или 7% полиакриламидном геле. Для определения размеров синтезированных ампликонов использовали маркерные ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder («Fermentas», Латвия).

В работе анализировали биоматериал, каждого из трех повторов одного варианта опыта. Биохимический анализ проводили в пяти повторах. Статистическая обработка проводилась компьютерными программами фирмы Stat Soft (Statistica 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Г. Влияние хитоолигосахаридов разной степени ацетилировання и салициловой кислоты на динамику развития септориоза пшеницы. Известно, что растения приобретают устойчивость к патогенам после их предварительной инокуляции слабоагрессивными штаммами или обработки иммунизаторами [Муромцев и др., 1987; Новожилов, Тютерев, 1993; Lyon et al., 1995; Hassini et al., 2004]. Нами была проведена серия работ с использованием ХОС с разной СА и СК в качестве индукторов устойчивости, а отрезки листьев пшеницы, инфицированных штаммами возбудителя септориоза гриба S. nodorum разной степени агрессивности, в качестве объекта исследования.

Развитие на листьях пшеницы штаммов гриба S. nodorum с разной степенью агрессивности. Обнаружено, что септориоз на листьях проявляется на 4-е сут после инокуляции в виде бурых пятен, размер которых различался в зависимости от штамма патогена уже в начальные фазы формирования болезни. В варианте с использованием штамма 9ВД гриба S. nodorum некротические образования превышали таковые, проявившиеся под влиянием штамма 4МН (рис. 1 А). Следовательно, развитие септориоза на листьях пшеницы, под влиянием штамма 9ВД, происходило более интенсивно, чем при инфицировании штаммом 4МН. Можно считать, что штамм 9ВД является более агрессивным, по сравнению со штаммом 4МН в отношении проростков мягкой пшеницы сорта Жница. Влияние ХОС различной степени ацетилировання и СК на устойчивость пшеницы к агрессивному штамму 9ВД гриба S. nodorum. На рис. 1 Б представлены данные по влиянию ХОС различной СА и СК на развитие септориоза на отрезках листьев пшеницы. Как видно, ХОС (СА 65%) характеризуется более высокими элиситорными характеристиками в сравнении как с ХОС (СА 13%), так и СК. Интересно, что при совместном использовании композиций СК + ХОС (СА 65%) и СК + ХОС (СА 13%) были обнаружены значительные различия в развитии септориоза на листьях. Композиция СК + ХОС (СА 65%) приводили к многократному снижению развития болезни, тогда как композиция СК + ХОС (СА 13%) полностью подавляла защитный эффект отдельно использованных препаратов.

Этот факт свидетельствует, во-первых, о синергическом эффекте композиций СК и высоко ацетилированных ХОС на иммунную систему растений и, напротив, взаимном физиологическом антагонизме между СК и ХОС с низкой степенью ацетилировання (рис. 1 Б). Следовательно, при

4 6 S Ii) 12 14

Время после заражения, сут

4 Г, S 12 14

Время после заражения, сут

Рис. 1. Влияние инфицирования растений пшеницы штаммами гриба S. nodorum с разной степенью агрессивности (А) (1 - штамм 9ВД, 2 -штамм 4МН), а также обработки ХОС разной CA, CK и их композициями (Б) на динамику развития септориоза. а - контрольные листья, б - ХОС (CA 65%); в - ХОС (CA 13%); г - салициловая кислота; д- ХОС (CA 65%) +СК; е - ХОС (CA 13%) + CK.

использовании препаратов на основе хитина и составлении его композиций с другими индукторами устойчивости необходимо учитывать CA олигосахаридов хитина.

II. Влияние штаммов гриба S. nodorum с разной степенью агрессивности, а также CK и ХОС различной CA на состояние компонентов про-/антиоксидант-ной системы пшеницы

Известно, что начальные этапы развития защитных реакций растений против патогенов характеризуются резким и значительным накоплением активных форм кислорода (АФК) [Huckelhoven, Kogel, 2003]. В связи с этим нами проведены исследования влияния ХОС различной CA, а также патогенного гриба S. nodorum на состояние компонентов про-/антиоксидантной системы пшеницы.

Влияние штаммов гриба S. nodorum с разной степенью агрессивности на генерацию пероксида водорода с участием оксалатоксидазы листьями пшеницы. На рис. 2 показаны изменения в интенсивности генерации пероксида водорода (Н202) с участием растительной оксалатоксидазы в листьях пшеницы в зоне инфицирования штаммами гриба на разных сроках патогенеза. Как видно, уже к 12 ч. после инокуляции на листьях выявляются зоны растительных клеток, генерирующие Н202, что свидетельствует о схожести ответной реакции на

воздействие разных по агрессивности штаммов патогена на начальных этапах болезни. Однако уже через 24 часа на листьях пшеницы, инфицированных слабоагрессивным штаммом, интенсивность генерации Н202 значительно возрастает, а в варианте с использованием агрессивного штамма, напротив, снижается (рис. 2 б). К моменту следующей фиксации на 48 ч (рис. 2 в), наблюдается полное подавление продукции Н202 в листьях инфицированных агрессивным штаммом. В то же время, на листьях инфицированных слабоагрессивной формой гриба зона его локализации характеризуется интенсивной генерацией Н202.

Рис. 2. Генерация Н202 в листьях пшеницы, инфицированных грибом 5. пойогитгг. а - 12 ч; б - 24 ч.; в - 48 ч. 1 - агрессивный штамм 9ВД; 2- слабоагрессивный штамм 4МН.

Таким образом, нами обнаружены различия в генерации Н202 при инфицировании отрезков листьев растений пшеницы различными по агрессивности штаммами патогенного гриба & пос!огит. Так, если на первом этапе наблюдалась генерация Н202 при использовании обоих штаммов патогена, то на втором этапе накопление АФК происходило только в листьях инфицированных слабоагрессивным штаммом гриба.

Следовательно, одним из важных источников локальной генерации Н202 в листьях пшеницы на ранних этапах взаимодействия с патогеном 5. пойогит, является оксалатоксидаза, которая, как известно, может ионообменно взаимодействовать с хитином [Максимов, и др., 2005], за счет чего, вероятно, и происходит локализация этого фермента в зоне роста гриба. Поскольку агрессивный штамм гриба способен снижать эффективность генерации Н202 в инфицированных тканях растений, можно предположить, что в негативную регуляцию уровня Н202 вовлекаются молекулярные компоненты гриба 5. пос1огит.

Влияние штаммов гриба Б. по(1огит с разной степенью агрессивности на активность пероксидазы растений пшеницы. Регулирование уровня АФК растением является одним из важных факторов, формирующих устойчивость к патогенам. Важную роль в регуляции уровня АФК в тканях растений играют пероксидазы. Ранее было обнаружено

активное окисление пероксидазой фенольного субстрата ДАБ в присутствии Н202 в местах инфицирования [Трошина и др., 2004], что предполагает возможность ее активации в этой зоне. В листьях пшеницы на ранних этапах патогенеза (12 - 72 ч после инокуляции), двукратная активация пероксидазы в цитоплазматической фракции белка происходила под воздействием как слабо-, так и сильноагрессивного штаммов гриба (рис. 3). Различия в активности пероксидазы под влиянием изученных штаммов гриба становились заметными к 5-м и 7-м сут опыта, когда симптомы болезни в варианте с агрессивным штаммом начинали проявляться (рис 1). В эти сроки активность фермента в листьях, инфицированных слабоагрессивным штаммом гриба, была более чем в 5 раз выше контрольных. При инокуляции агрессивным штаммом активность пероксидазы также повышалась, но в меньшей степени (рис. 3).

Таким образом, активация пероксидазы в ответ на инфицирование различными по агрессивности штаммами гриба подтверждает существующее в литературе мнение о ее неспецифической функции при формировании защитной реакции растений на стрессовые факторы [Mittler, 2002]. При этом можно говорить, что тотальная активность фермента в начальные фазы развития септориоза не зависит и от степени агрессивности патогена.

600 ■

Время после инфицирования, сут

Рис. 3. Активность пероксидазы в листьях пшеницы, инфицированных грибом Я. пойогит: 1 - штамм гриба 4МН; 2 -штамм гриба 9ВД.

Влияние СК и ХОС различной СА на активность пероксидазы в листьях пшеницы, инфицированной агрессивным штаммом 9ВД гриба 51 пойогит. Как было установлено, активность пероксидазы в начальные фазы опыта в листьях пшеницы, обработанных как ХОС, так и СК, незначительно снижается по сравнению с контролем. Однако в дальнейшем она повышается и поддерживается на высоком уровне. Особенно высокой она была у растений пшеницы, обработанных композицией СК + ХОС (СА

65%) и последующим инфицированием.Ранее было показано, что активность анионных пероксидаз растений характеризуется высокой чувствительностью к инфицированию различными патогенами [Хайруллин и др., 2001]. При этом обнаружено, что некоторые изоформы, например, изопероксидаза пшеницы с изоэлектрической точкой (рI) ~ 3.5, способны взаимодействовать с полисахаридами клеточных стенок грибов, в том числе и с хитином [Максимов и др., 1995]. В связи с этим нами проведен анализ анионных изопероксидаз пшеницы в листьях, обработанных препаратами ХОС 65%-ной и 13%- ной СА с последующим инфицированием грибом пойогит (рис. 4). Обнаружено повышение активности анионной изопероксидазы с р/ ~ 3.5 в листьях пшеницы, обработанных ХОС и инфицированных патогенным грибом. Несмотря на то, что ХОС (СА 65%) в

■ . """ - . . — _ —■ 3.5

' - ~ 4.6

.</' „ * - ""5.1

' I 5.9 ■ • 6.6

5 6 7 8 р/

3,5

, - 4,6

! ^ • -Г. 5,1

" 5,9

Р 6,6

12 34 5678 р/

Рис. 4. Влияние ХОС различной степени ацетилирования и СК на активность анионных изопероксидаз в листьях пшеницы инфицированных и не инфицированных агрессивным штаммом гриба Б. пос1огит: 3,4 - ХОС (СА 65%); 5,6 - ХОС (СА 13%); 7,8 - СК; А - растворимые изопероксидазы; Б - ионно-связанные с клеточными стенкам изопероксидазы; 1,3,5,7 -неинфицированные; 2, 4, 6, 8 - инфицированные, р/ -маркеры изоэлектрических точек белков.

опытных вариантах усиливали активность этой изоформы, при их инфи даровании, активность этой изоформы снижалась и была сравнима с активностью в инфицированных контрольных листьях. В то же время, инфицированные грибом листья, обработанные ХОС (СА 13%), эту изоформу сохраняли, но ее активность была меньше, чем в обработанных ХОС (СА 65%) листьях (рис. 4-А, полоса 6). СК также активирует анионные изопероксидазы (рис. 4-А, полоса 7, 8). Некоторое снижение активности изопероксидазы с р/ ~ 3.5 в цитоплазматической фракции белков, происходящее в инфицированных листьях, обработанных ХОС (СА 65%), можно объяснить ее концентрированием в клеточной стенке посредством взаимодействия с олигомерами хитина, а также с полисахаридами клеточной стенки патогена [Максимов и др., 2005].

Во фракции иоино-связанных с клеточными стенками изопероксидаз контрольных листьев обнаруживается только изофермент с рI ~ 4.6 (рис. 4-Б, полоса 1). При инфицировании грибом S. nodorum в клеточных стенках проявляли свою активность несколько изопероксидаз с р/~ 4.0-5.9 (рис. 4-Б, полоса 2). На фоне отсутствия значительных изменений в изоферментном спектре пероксидаз под влиянием ХОС (СА 65%) в неинфицированных растениях, приводило к проявлению активности изопероксидаз с р/~ 3.5 и ~ 4.6 в этой фракции белка (рис. 4-Б, полоса 4), при инфицировании.

Интересно, что в инфицированных листьях, обработанных ХОС (СА 65%), изопероксидаза с р/ ~ 3.5 обнаруживалась во внеклеточной фракции белка. Этого не происходило в варианте с ХОС (СА 13%). Слабая степень проявления активности пероксидазы при отдельном влиянии ХОС и СК, а также при инфицировании, вероятно, обусловлена более прочным связыванием ферментов в этих вариантах с клеточной стенкой [Трошина и др., 2004] и, соответственно, сложностью их экстрагирования.

Таким образом, ХОС (СА 65%) запускают защитные реакции растительных клеток, посредством активации пероксидазы, в особенности анионных изоформ, подобные тем, что происходят под влиянием СК. В то же время выявлено, что активация анионной пероксидазы под влиянием ХОС (С А 13%) не сопровождается последующим значительным концентрированием изопероксидазы с р/~ 3.5 в зоне клеточных стенок. Это предполагает возможность ингибирования под их влиянием секреции анионных изопероксидаз с р/ ~ 3.5 в межклеточное пространство. Однако это предположение требует еще дополнительных доказательств.

Таким образом, с использованием лабораторных тест-систем на отрезках листьев пшеницы показано, что препараты ХОС (СА 65%) являются более эффективными в защите пшеницы от септориоза, по сравнению с ХОС (СА 13%).

Активность каталазы в растениях пшеницы, инфицированных штаммами гриба поЛотит с разной степенью агрессивности. В

регуляции уровня Н202 важное место занимает каталаза. На рис. 5 представлены данные изменения ее активности в листьях пшеницы, инфицированных штаммами возбудителя септориоза разной степени агрессивности. Как видно, активность каталазы в листьях пшеницы была выше при инфицировании агрессивной формой патогена, по сравнению со слабоагрессивной.

Анализ способности штаммов гриба 5. пос1огит продуцировать каталазу в культуральной среде показал, что между изолятами гриба с разной степенью агрессивности существуют отличия (табл. 1). Так, если в 20-ти суточном культуральном фильтрате слабоагрессивного штамма 4МН активность фермента составила около 358.3 мкМ Н202/мин мг белка, то у агрессивного штамма 9ВД она была в 2 раза выше. Следовательно, повышение активности каталазы в инфицированных листьях пшеницы связана с продукцией ее патогеном.

450-

^ НН+

Рис. 5. Активность каталазы в листьях пшеницы, инфицированных грибом & пойогипг. 1- контрольные

неинфицированные листья;

2 - слабоагрессивный штамм 4МН;

3 - агрессивный штамм 9ВД.

24 48 72

время после инфицирования, ч

Таблица. Активность каталазы в культуральном фильтрате штаммов гриба

51 пойогит

Штамм Активность каталазы, мкМ Н202/м1ш. мг белка

3-й сут 6-е сут 9-е сут 20-е сут

4МН 13.3±1.0 66.6±3.5 173.2± 11.0 358,3±21.0

9ВД 119.8±9.7 153.2Ш.0 639.4±43.0 716,2±52.0

Таким образом, снижение продукции Н202, вызываемое агрессивным штаммом гриба посредством активации внеклеточных катал аз, на ранних этапах патогенеза, может негативно отражаться на развитии защитного ответа растений пшеницы и способствовать развитию гриба 5. пойогит. Соответственно, резкое повышение уровня генерации Н202, напротив, приводит к формированию у растений устойчивости к патогену. Высокая активность каталазы в листьях, пораженных агрессивным штаммом гриба 9ВД, предполагает, что он может «обходить» защитные системы растений, связанные с генерацией Н202 посредством их инактивации. Действительно, обнаружено, что агрессивные формы гриба 5. пойогит проявляют устойчивость к высокими концентрациями Н202, по сравнению со слабоагрессивными штаммами [Трошина и др., 2009].

III. Морфологические и биохимические особенности штаммов гриба 51. пойопап с разным уровнем агрессивности

Морфофизиологическая характеристика штаммов гриба 5". пойотт. Рост и развитие штаммов 4МН и 9ВД патогенного гриба & пойотт на агаризированной среде Чапека различались. Штамм 4МН формировал округлые колонии оранжевого цвета с густым белым опушением по краю. Культура окрашивала среду под колонией в светло-коричневый цвет. Зрелая колония имела более желтоватую, бледную окраску, по сравнению с молодой. На ней были хорошо видны выраженные концентрические круги, состоящие из темных пикнид - органов споруляции гриба. Колонии штамма 9ВД были округлыми, белого цвета, с более густым опушением в центре и по краям культуры. Среда под колонией гриба окрашивалась в розовато-оранжевый цвет. Концентрические круги ярко выражены. Штамм 9ВД формировал пикниды, расположенные концентрическими кругами, в более ранние сроки, чем штамм 4МН.

Влияние штаммов 5". пойогит различного уровня агрессивности на степень ацетилирования хитина. Исследованиями последних лет показано, что СА хитина клеточных стенок патогенных грибов может быть определяющим в развитии защитных реакций растительных клеток [Е1 СиесШап а а1., 2002; ВЫг й а1., 2006]. Причем, некоторые исследователи полагают, что хитиндезацетилазы патогенов являются важными в их агрессивности [Ни е1 а1., 2007]. Однако, по отношению к грибу 5. пойогит таких исследований практически не проводилось. В связи с этим, изучали влияние культурального фильтрата штаммов & пойотт на изменение СА хитина. Оказалось (рис. 6), что штаммы гриба с высокой агрессивностью обладали способностью к снижению СА хитина в большей степени, по сравнению со слабоагрессивными. Так, если СА хитина до опыта была 85%, то после обработки культуральным фильтратом штаммов 5. пойогит, она составила соответственно: у 9В Д - 72.6%, а у 4МН - 80.7% (рис. 6).

100

г?

| 85

I 80

К 75

аЗ

65 0

Рис. 6. Изменение степени ацетилирования хитина под влиянием культурального фильтрата штаммов 5. пос/огит в жидкой среде Чапека (20-сут культивирования):

1 - исходная СА необработанного коммерческого хитина;

2 - обработанный культуральным фильтратом штамма 4МН хитин;

3 - обработанный культуральным фильтратом штамма 9ВД хитин

Вероятно, гриб 5. по<1огшп выделяет в внеклеточную среду соединения, дезацетилирующие хитин. При этом у агрессивного штамма 9ВД их активность оказалась выше, по сравнению со слабоагрессивной формой.

Идентификация гена хитиндезацетилазы (СБА) штаммов гриба Б. по(1огит с разной степень агрессивности в инфицированных листьях пшеницы. К настоящему времени достаточно высокоспецифичным методом диагностики инфекционных заболеваний растений, животных и человека является ПЦР [С)'Оогте1, 1999; Наш та й а1., 2001; КЪакуаг е1 а1., 2008]. Судя по тому, что экспрессионная активность генов патогенов, например хитиндезацетилазы, тесно связана с последующим проявлением ими агрессивности [Ьеукэ й а!., 2001; Ни е! а1., 2007], вероятно, метод ПЦР можно использовать и для определения степени агрессивности патогенов.

С использованием праймеров, специфичных к грибному гену хитиндезацетилазы (СБА) и ДНК из мицелия гриба & пойогит была проведена ПЦР. Ее результаты представлены на рис. 7. Как видно, размер амшшкона на электрофореграмме соответствовал теоретически рассчитанным для участка гена СБА гриба 5. пойогит - 387 п.н. С помощью праймеров показана возможность идентификации в тканях пшеницы патогена 5. посИогит уже к 10-и часам после инокуляции (рис. 8). Таким образом, данный метод позволяет ускорить диагностику возбудителя септориоза в инфицированных грибом тканях пшеницы.

Так как заболевание, вызываемое этим патогеном, становится визуально заметным спустя 4 сут после инокуляции и только на листьях, то с помощью разработанной ДНК-диагностики можно определять скрытые формы болезни, например, в растениях в биотрофной фазе развития гриба или в зерновках пшеницы.

Рис. 7. Продукты амплификации гена CDA из мицелия гриба S. nodorum с использованием праймеров CDA2F-CDA2R: М-маркер, 1 - 4МН штамм, 2-9ВД штамм.

Рис. 8. Амплификация ДНК участка гена CDA штаммов гриба S. nodorum, выделенного из листьев неинфицированных (1, 2) и инфицированных штаммами гриба 4МН (3) и 9ВД (4) растений пшеницы. 10 ч. после заражения. М - маркер GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Латвия).

Определение специфичности праймеров для идентификации гриба S. nodorum. ДНК-диагностика является эффективным методом определения наличия патогена в тканях растений только в случае его высокой специфичности к конкретной форме возбудителя. Для подтверждения этого также изучены пять видов грибов, поражающих пшеницу: Т. caries - возбудитель твердой головни, U. tritici - возбудитель пыльной головни, F. culmorum - возбудитель фузариозной корневой гнили, В. sorokiniana Sacc. - возбудитель корневой гнили и бурой пятнистости на листьях, S. tritici Blotch. - возбудитель листовой пятнистости, а также неспецифичный к растениям вид гриба В. bassiana Bals., вызывающий микоз насекомых, из лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН. Как видно из рис. 9, амплификация с праймерами к гену CDA гриба S. nodorum происходила только при использовании ДНК, выделенной из мицелия этого гриба (полоса 7). Отсутствие в полосках 1-6 ампликона свидетельствовало о специфичности праймеров, к гену CDA гриба S. nodorum.

Использование гена CDA для определения агрессивности штаммов патогена гриба S. nodorum. Как ранее было показано, активность фермента хитиндезацетилазы гриба S. nodorum была выше у агрессивного штамма, чем у слабоагрессивного (рис. 6). Можно предположить, что уровень экспрессии гена, кодирующего данный белок, у штамма 9ВД тоже может быть выше по сравнению со штаммом 4МН. Одним из эффективных методов определения экспрессии генов является от~ПЦР.

*** w Цг"" hffti-

тщ

®ss

£00 пн 500 п.н

400 ПН ЗООпн.

WO п.и.

l 2 3 4 5 6 7 М Рис. 9. Результаты амплификации гена CDA с использованием ДНК разных видов грибов:

1 - В. bossinana; 2 — U. trilici; 3-5. sorokiniana; 4 - F. culmorum; 5 -Т. caries; 6-5. tritici; 1 - S. nodorum; M - маркер молекулярных масс ДНК.

170

160

и 150

о U S 140

Я о о е- 130

СJ о е* с i о а 120

В S

Г) 110

Рис. 10. Уровень экспрессии гена CDA в листьях пшеницы инфицированных штаммами гриба S. nodorum с разной степенью агрессивности, 24 часа после заражения, % от контроля: 1 - 4МН; 2 -9ВД.

С его использованием определена экспрессия гена CDA гриба S. nodorum. На рис. 10 представлены результаты от-ПЦР к фрагменту гена CDA штаммов S. nodorum 4МН и 9ВД. Как видно, агрессивный штамм S. nodorum 9ВД проявляет более сильную экспрессию гена CDA по сравнению со слабоагрессивным штаммом 4МН. Связь данных по экспрессии гена этого фермента со степенью развития болезни на листьях пшеницы, а так же с активностью хитиндезацетилазы предполагают важную роль этого фермента в процессе дезацетилирования хитина собственной грибной клеточной стенки и формировании восприимчивости растений.

Секвенирование участка ДНК гена хитиндезацетилазы S. nodorum. Лия доказательства того, что мы анализировали ген CDA 5. nodorum, а также поиска полиморфных участков в амплифицированном фрагменте этого гена, был секвенирован фрагмент ДНК гена CDA штаммов 4МН и 9ВД и проведено их сравнение с нуклеотидными последовательностями ДНК гриба S. nodorum из генбанка NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez]. Обнаружено, что нуклеотидная последовательность ДНК амштиконов после секвенирования на 99% совпала с данными к соответствующему фрагменту гена CDA штамма SN 15 из генбанка. При этом нами обнаружены единичные замены в нуклеотидной последовательности изученного фрагмента ДНК штаммов 4МН, 9ВД отличающие их от штамма SN 15. Полученные данные свидетельствуют о том, что в работе был исследован фрагмент гена CD А гриба S. nodorum.

Рис. 12. Влияние растворимых белков из проростков Т. йторкееуп (а) и Т. авьИуит (б) на степень апетилирования хитозана.

1 - исходная СА коммерческого хитозана;

2 - неинфицированные проростки;

3 - проростки, инфицированные штаммом 4МН гриба 5. пойогит\

4 - проростки, инфицированные штаммом 9ВД гриба & пойогит

IV. Роль белков растения в регуляции степени ацетилирования хитина

Влияние белковых экстрактов из проростков пшеницы на степень ацетилирования хитина. Ранее было показано, что СА хитина играет значительную роль как во взаимодействии со специфичными пероксидазами, так и в формировании общего индуцированного иммунитета пшеницы к патогену 5'. пойогит. Можно предположить, что растения имеют механизм, противодействующий процессу дезацетилирования хитина под влиянием дезацетилаз гриба, поскольку от этого зависит последующая ответная реакция, связанная с сорбцией некоторых защитных белков, в том числе пероксидаз, на хитин. В опытах с использованием свободно растворимых белков из проростков пшеницы Т. ИторЬееуи, обладающей иммунностью к ряду грибных болезней, в том числе и к септориозу, обнаружено, что они повышают СА хитозана, по сравнению с экстрактом белков из проростков восприимчивой пшеницы Т. аеьШит (рис. 12). Поскольку в исследуемой системе, присутствует только хитозан, можно предположить, что под влиянием белков растений пшеницы в его структуре происходит увеличение числа ацетильных групп.

Выдвинутое предположение было доказано с использованием метода 'Н-ЯМР-с пе ктр о м е тр и и. Нами обнаружено появление в молекулярной структуре хитозана, обработанного растительным белком компонента, близкого по расположению к ацетильной группе хитина (рис. 13).

Таким образом, впервые нами обнаружено повышение СА хитозана под влиянием белков из проростков устойчивой пшеницы. Это предполагает наличие среди растворимых белков у устойчивых к патогенам растений ферментов, ацетилирующих хитин. В то же время, слабое влияние на СА хитозана белкового экстракта из восприимчивой к патогенам формы пшеницы предполагает ослабленную ответную реакцию растений на инфицирование

СИ.-ОН VH«

M'> llf.-Oir

<IU>H

Sjl«C» II I ll."ll

Рис. 13. Изменение структуры хитозана после обработки белковым экстрактом из проростков устойчивой пшеницы Т. Л/порИееуН: 'Н-ЯМР спектры хитозана до (а) и после (б) взаимодействия с белковым экстрактом.

Заключение

Стратегия противостояния защитной системы растений против патогенов достаточно разнообразна и подчиняется известной теории взаимодействия двух разнородных генетических систем [Flor, 1971]. По этой теории против конкретного гена устойчивости хозяина вирулентный патоген в своем арсенале имеет конкретный ген агрессивности, и, соответственно, против любого средства агрессивности патогена у иммунных форм растений эволюционно формируются также уникальные средства защиты [Дьяков и др., 2001]. Причем, уровень экспрессии генов как защитных систем хозяина, так и систем агрессивности патогена, в условиях их активного противостояния также усиливается [Jones, Dangl, 2006; Hern et al., 2009].

Нами обнаружено индуцированное агрессивным штаммом патогена снижение уровня локальной генерации Н2Ог в растениях, обусловленое выделением грибами во внеклеточную среду каталазы и хитиндезацетилазы. Поскольку, ранее [Максимов и др., 2005], было показано, что наиболее вероятной мишенью ряда защитных белков-оксидоредуктаз (анионной пероксидазы и оксалатоксидазы) является выскоацетилированный хитин, логично предположить, что патоген, дезацетилируя хитин своих клеточных стенок хитиндезацетилазами, может препятствовать концентрированию

защитных белков, в том числе оксалатоксидазы и хитин-специфичной пероксидазы, в зоне инфицирования. Соответственно, это приводит к подавлению продукции Н202 в зоне инфицирования и развитию восприимчивости.

Следует подчеркнуть, что нами впервые обнаружен факт повышения степени ацетилирования хитозана под влиянием растворимых белков из проростков пшеницы Т. timopheevii, высокоустойчивой к ряду патогенов, в том числе и к грибу S. nodorum, что подтверждает выдвинутые нами предположениие о важной роли СА хитина клеточных стенок грибов в регуляции активности ферментов, участвующих в продукции АФК в зоне распространения патогена Другим независимым механизмом, регулирующим ряд компонентов агрессивности патогена, может быть активация грибной катал азы и хитиндезацетилазы, с последующим снижением уровня АФК в зоне инфицирования и подавлением сорбции на хитин оксалатоксидазы и пероксидазы с р/~ 3.5.

Выводы

1. Обнаружены различия в биологической активности ацетилированных и дезацетилированных производных хитоолигосахаридов. ХОС с высокой степенью ацетилирования (65%) характеризуется большей элиситорной активностью на растениях пшеницы, проявляющейся в активации изопероксидаз с рI ~ 3,5 в ионно-связанной с клеточными стенками фракции белка, в сравнении с ХОС с низкой степенью ацетилирования (13%).

2. В культуре in vitro и in vivo выявлены различия в морфо-биохимических особенностях штаммов гриба S. nodorum различной степени агрессивности. В проявление агрессивности штаммов важный вклад вносят внеклеточные каталазы и хитиндезацетилазы патогена, способные снижать в зоне инфицирования уровень Н202 и, соответственно, подавлять развитие защитного ответа растений.

3. Выявлено, что в ходе формирования устойчивости растений пшеницы к слабоагрессивному штамму S. nodorum наблюдается ранняя активация оксалатоксидазы и пероксидазы с р/~ 3.5.

4. В белковой фракции проростков устойчивой к септориозу пшеницы Т. timopheevii впервые обнаружена хитинацетилирующая активность, многократно возрастающая в ответ на инфицирование S. nodorum.

5. Впервые предложено использование метода от-ПЦР с использованием праймеров к гену хитиндезацетилазы для определения степени агрессивности патогена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валеев А.Ш., Муллагалиев И.Р., Максимов И.В. Изменение структуры хитозана под влиянием белков из проростков пшеницы II Тезисы в сборнике трудов XII молодежной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, 2005. с.42.

2. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Валеев А.Ш., Максимов И.В. Влияние салициловой кислоты на генерацию перекиси водорода с участием оксалатоксидазы и пероксидазы в растениях пшеницы при септориозе // Тезисы IV Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Минск, 2005. с. 266.

3. Валеев А.Ш., Черепанова Е.А. Влияние хитоолигосахаридов и салициловой кислоты на защитные свойства растений //Материалы 9-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино, 2005. с.72-73.

4. Яруллина Л.Г., Черепанова Е.А., Муртазина Г.Ф., Валеев А.Ш. Максимов И.В. Хитин-специфичные оксидоредуктазы и защитный ответ растений на инфицирование фитопатогенами II Материалы второго съезда по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем». С-Петербург, 2005. с.509-511

5. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г., Юсупова З.Р., Валеев А.Ш., Муллагалиев И.Р. Связь элиситорной активности хитина с его степенью ацетилирования // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. М.: Изд-во ВНИРО, 2006. с. 335-338.

6. Валеев А.Ш., Аюпова А.Х., Максимов И.В. Влияние штаммов S. nodorum на степень ацетилирования хитина // Тезисы докладов годичного собрания Общества физиологов растений «Физиология растений -фундаментальная основа современной фитобиотехнологии». Ростов на Дону. 2006. с. 64.

7. Максимов И.В., Валеев А.Ш. Степень ацетилирования хитина и его активность в фитоиммунитете // Микология и фитопатология. 2007. т. 41. №5. с. 393-402.

8. Максимов И.В., Валеев А.Ш. Изменение структуры хитина и хитозана под влиянием белков из проростков пшеницы и культурального фильтрата штаммов S. nodorum Berk. II Материалы VI съезда общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар. 2007. часть 2 . с. 51-52.

9. Трошина Н.Б. Яруллина Л.Г., Валеев А.Ш., Максимов И.В. Индукция салициловой кислотой устойчивости пшеницы к Septoria nodorum Berk. II Известия РАН. Серия биологическая. 2007. Т. 34. с. 545-550.

10. Максимов И.В., Валеев А.Ш., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Сурина О.Б. Генерация пероксида водорода и активность

окислительных ферментов в листьях пшеницы при инфицировании Septoria nodorum различной вирулентности // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды. Иркутск, 2007, с. 39-43.

11. Валеев А.Ш., Хайдар Г.М., Максимов И.В. Хитиндезацетилазы грибов как фактор вирулентности // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». Уфа, 2007, с. 14-15.

12. Troshina Н.Б., Surina О.Б., Gimalova F.A., Valeev A.Sh., Maksimov I.V. Antistressful action of jasmonic acid chemical analogues on wheat plants // ABSTR. 2nd International Symposium Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture". Kyiv, Ukraine, 2007, P. 128.

13. Хайдар Г.М., Валеев А.Ш. Хитиндезацетилаза и роль экспрессии ее гена в вирулентности фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk. // Материалы II международной школы молодых учёных «Эмбриология, генетика и биотехнология». Уфа, 2007, с. 119-120.

14. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Валеев А.Ш. Степень ацетилирования хитина и защитный ответ растений // Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам. Санкт-Петербург, 2008, с. 21-24

15. Валеев А.Ш., Удалов М.Б., Хайдар Г.М., Максимов И.В. Диагностика гриба Septoria nodorum Berk, в инфицированных тканях пшеницы с использованием гена хитин-дезацетилазы // Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам. Санкт-Петербург, 2008, с. 269-272.

16. Valeev A., Udalov M., Ptitsin К., Maksimov I.V. Polymorphism and expression of gene chitindeacetylase Phaeosphaeria nodorum of South Ural.// NCBI Accession № 219879350.2009.

17. Валеев А.Ш., Удалов М.Б., Максимов И.В. Внутри- и межвидовой полиморфизм ДНК ряда фитопатогенных грибов. // Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2009. №1. c.l 1.

18. Максимов И.В., Валеев А.Ш., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г. Продукция активных форм кислорода в листьях пшеницы, инфицированных разновирулентными штаммами S. nodorum Berk. // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 46, №4. С. 481-486.

Сокращения

АФК - активные формы кислорода; ПЦР - полимеразная цепная реакция; от-ПЦР - обратной транскрипционная ПЦР; CK - салициловая кислота; CA - степень ацетилирования; ХОС - хитоолигосахариды; Н202 -пероксид водорода; р/— изоэлектрическая точка.

Валеев Альберт Шакирьянович

ДЕЗАЦЕТИЛИРОВАНИЕ ХИТИНА КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ГРИБА SEPTORIA NODORUM BERK. С ПШЕНИЦЕЙ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР№ 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 16.10.2009 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,26. Уч.-изд. л. 1,32. Тираж 100 экз. Заказ 684.

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Вапиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Валеев, Альберт Шакирьянович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СИГНАЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЫ В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ ОТ

ПАТОГЕНОВ (обзор литературы).

1.1. Сигнальная регуляция иммунитета растений.

1.2. Индуцирование салициловой кислотой защитных свойств растительных клеток.

1.3. Хитин и устойчивость растений к фитопатогенным грибам.

1.3.1. Распространенность хитина и сферы его применения.

1.3.2. Хитин и его воздействие на рост микроорганизмов.

1.3.3. Элиситорные и рост-регулирующие свойства хитина.

1.3.5. Оксидоредуктазы как наиболее чувствительный элемент ответной реакции растений на воздействие хитина.

1.4. Хитиндезацетилазы грибов, как факторы вирулентности грибов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Постановка опытов.

2.3. Методы работы с патогенными грибами.

2.3.1. Получение и размножение инфекционного материала гриба

Я. пос!огит.

2.3.2. Инфицирование растений.

2.3.3. Оценка пораженности растений грибом & пос1огит.

2.4. Методы работы с биопрепаратами.

2.5 Биохимические методы работы с белками и хитином.

2.5.1. Подготовка хитина для анализа активности ферментов растений и грибов, регулирующих степень его ацетилирования.

2.5.2. Определение локализации генерации пероксида водорода с участием оксалатоксидазы.

2.5.3 Получение ферментных экстрактов свободно-растворимой и ионно-связанной с клеточными стенками фракций пероксидазы.

2.5.4. Определение активности ферментов.

2.5.5. Изоэлектрофокусирование белков.

2.5.6. Колориметрический метод определения уровня белка.

2.5.7. Ионометрическое титрование.

2.5.8. Ядерно-магнитно резонансная спектроскопия.

2.6. Молекулярно-биологические исследования.

2.6.1. Выделение и очистка ДНК из растений и мицелия грибов.

2.6.2. Выделение и очистка мРНК из инфицированных грибом & поёотт растений пшеницы.

2.6.3 Измерение концентрации ДНК и РНК.

2.6.4. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей гена хитиндезацетилазы гриба & пос1огит.

2.6.5. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в полимеразной цепной реакции ДНК.

2.6.6. Полимеразная цепная реакция ДНК.

2.6.7. Реакция обратной транскрипции РНК и полу количественный анализ экспрессии генов.

2.6.8. Электрофорез фрагментов ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях.

2.6.9. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние хитоолигосахарвдов разной степени ацетилирования и салициловой кислоты на динамику развития септориоза пшеницы.

3.1.1. Развитие на листьях пшеницы штаммов гриба & пойогит с разной степенью агрессивности.

3.1.2. Влияние хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования и салициловой кислоты на устойчивость пшеницы к агрессивному штамму 9ВД гриба & пойогит.

3.2. Влияние штаммов гриба Я. пос1огит с разной степенью агрессивности, а также салициловой кислоты и хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования на состояние компонентов про-/антиоксидантной системы пшеницы.

3.2.1. Влияние штаммов гриба Б.пос^огит с разной степенью агрессивности на генерацию пероксида водорода с участием оксалатоксидазы листьями пшеницы.

3.2.2. Влияние штаммов гриба & пойогит с разной степенью агрессивности на активность пероксидазы растений пшеницы.

3.2.3. Влияние хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования и салициловой кислоты на генерацию пероксида водорода в листьях пшеницы, инфицированных агрессивным штаммом 9ВД гриба & пойогит.

3.2.4. Влияние хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования и салициловой кислоты на активность пероксидазы в листьях пшеницы, инфицированных агрессивным штаммом 9ВД гриба S. nodorum.

3.2.5. Влияние штаммов гриба S. nodorum на активность каталазы.

3.3. Морфофизиологические и биохимические особенности штаммов гриба S. nodorum с разным уровнем агрессивности.

3.3.1. Морфофизиологическая характеристика штаммов гриба S. nodorum

3.3.2. Влияние штаммов S. nodorum различной степени агрессивности на степень ацетилирования хитозана и хитина.

3.3.3. Идентификация гена хитиндезацетилазы {CDА) штаммов гриба

S. nodorum с разной степенью агрессивности.

3.3.4 Секвенирование участка гена CDA гриба S. nodorum.

3.3.5 Определение специфичности праймеров к гену CDA для идентификации гриба S. nodorum.

3.3.6 Использование гена CDA для определения агрессивности штаммов патогена гриба S. nodorum.

3.4. Роль белков растения в регуляции степени ацетилирования хитина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дезацетилирование хитина как фактор регуляции взаимоотношений гриба Septoria nodorum Berk. с пшеницей"

Ранее в лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН было выявлено, что анионные изопероксидазы относятся к эффективным компонентам защитной системы растений от патогенов благодаря их способности сорбироваться на хитин, но не на хитозан [Максимов и др., 1995; Хайруллин и др., 2000]. Любопытно, что многие патогенные грибы, в том числе и возбудитель септориоза S. nodorum, вырабатывают ферменты хитиндезацетилазы [Tokuyasu et al., 1997; Martinou et al., 2002; Blair et al., 2006], дезацетилирующие хитин своих клеточных стенок, что может быть одним из факторов, снижающих защитный потенциал растений [El Gueddari et al., 2002]. Это предполагает важную роль в формировании защитного ответа растений на инфицирование степени ацетилирования хитина, а также наличие как у патогена, так и хозяина механизмов регуляции этого показателя биополимера, от которых, в конечном счете, может зависеть становление устойчивости/восприимчивости в системе растение-хозяин/гриб-патоген. Проверке этой гипотезы и посвящена настоящая работа.

Задачи исследований: 1) определить влияние хитоолигосахаридов различной степени ацетилирования, известного индуктора устойчивости растений салициловой кислоты, а также штаммов гриба Я. пос1огит с разной степенью агрессивности на устойчивость растений пшеницы к возбудителю септориоза и функционирование компонентов растительной про-/антиоксидантной системы;

2) выявить молекулярно-биохимические особенности штаммов гриба <£ пос1огит, определяющие разную степень их агрессивности;

3) оценить уровень экспрессии гена хитиндезацетилазы гриба в растениях пшеницы, инфицированных штаммами & пос1огит с разной степенью агрессивности;

Научная новизна. Установлено, что значительный вклад в устойчивость пшеницы к патогену вносит ранняя активация оксалатоксидазы и пероксидазы в апопласте, тогда как в проявление свойств агрессивности у штаммов пос!огит -каталазы и хитиндезацетилазы гриба. Обнаружена зависимость индуцированной ХОС устойчивости пшеницы к септориозу от степени их ацетилирования. Выявлены различия в характере генерации активных форм кислорода в листьях пшеницы, инфицированных разными по агрессивности штаммами гриба. Впервые в белковой фракции устойчивых к возбудителю септориоза проростков пшеницы ТгШсит ИторИееуп (21шк.) 2Ьик. обнаружена ацетилирующая хитин активность, что вносит важный вклад в формирование эффективной системы защиты этого вида пшеницы.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет понимание биохимических механизмов фитоиммунитета. Доказано, что при применении препаратов на основе хитина и их композиций с другими индукторами важна степень ацетилирования биополимера. Продемонстрирована эффективность использования обратно-транскрипционной ПЦР (от-ПЦР) для определения степени агрессивности патогенов. Предложен метод ДНК-диагностики гриба S. nodorum в тканях растений пшеницы с применением праймеров к гену хитиндезацетилазы этого патогена.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2005), на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), в школе-семинаре молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), на съездах по защите растений (Санкт-Петербург, 2005; Санкт-Петербург, 2008), на Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды» (Иркутск, 2007); на собраниях и съездах общества физиологов растений (Ростов на Дону, 2006; Сыктывкар, 2007), на втором съезде микологов России (Москва, 2009), на международных конференциях и симпозиумах: «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Казань, 2006; Ставрополь, 2008), «Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture» (Kiev, 2007).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами Федеральной целевой программы России № 02.512.11.2051 (2007), РФФИ (№ 05-04-48310) (2005-2008), международного гранта РФФИ-ККРНТ 08-04-90259узба (2008-2009), регионального гранта РФФИ-Агидель (№ 02-0497923) (2002-2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК .

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Валеев, Альберт Шакирьянович

Выводы

1. Обнаружены различия в биологической активности ацетилированных и дезацетилированных производных хитоолигосахаридов. ХОС с высокой степенью ацетилирования (65%) характеризуется большей элиситорной активностью на растениях пшеницы, проявляющейся в активации изопероксидаз с р/ ~ 3,5 в ионно-связанной с клеточными стенками фракции белка, в сравнении с ХОС с низкой степенью ацетилирования (13%).

Заключение

Нами обнаружено индуцированное агрессивным штаммом патогена снижение уровня локальной генерации Н202 в растениях, обусловленое выделением грибами во внеклеточную среду каталазы и ХДА. Поскольку, ранее [Максимов и др., 2005] было показано, что наиболее вероятной мишенью ряда защитных белков-оксидоредуктаз (анионной пероксидазы и оксалатоксидазы) является выскоацетилированный хитин, логично предположить, что патоген, дезацетилируя хитин своих клеточных стенок ХДА, может препятствовать концентрированию защитных белков, в том числе оксалатоксидазы и хитин-специфичной пероксидазы в зоне инфицирования. Соответственно, это приводит к подавлению продукции Н202 в зоне инфицирования и развитию восприимчивости.

Следует подчеркнуть, что впервые обнаружен факт повышения степени ацетилирования хитозана под влиянием растворимых белков из проростков пшеницы Т. ИторИее\и, высокоустойчивой к ряду патогенов, в том числе и к грибу & пснЗогит, что подтверждает выдвинутые нами предположениие о важной роли СА хитина клеточных стенок грибов в регуляции активности ферментов, участвующих в продукции АФК в зоне распространения патогена Другим независимым механизмом, регулирующим ряд компонентов агрессивности патогена, может быть активация грибной каталазы и ХДА с последующим снижением уровня АФК в зоне инфицирования и подавлением сорбции на хитин оксалатоксидазы и пероксидазы с р/~ 3.5.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Валеев, Альберт Шакирьянович, Уфа

1. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений//Усп. совр. биол. 1991. Т. 111. С. 722-738.

2. Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Фролова М.А. Хитозан в косметике // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. 2002. М.: Наука. С.360-363.

3. Ахметова И.Э. Физиологические особенности формирования защитных реакций пшеницы при действии хитоолигосахаридов. Автореф. дисс. уч. степени к.б.н. Уфа, 2000.

4. Гальбрайх JI.C. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. С. 52-56.

5. Гилязетдинов Ш.Я., Нугуманов А.Х., Пусенкова Л.И. Эффективность антистрессовых препаратов и биофунгицидов в системе защиты сельскохозяйственных культур от неблагоприятных абиотических и биотических факторов. Уфа: Гилем. 2008. 372 с.

6. Горовой Л.Ф., Кошевский И.И., Теслюк В.В., Трутнева И.А. Влияние препарата Микосан и хитозана на устойчивость ячменя к болезням // Труды 6-й международной конференции «Новые достижения висследовании хитина и хитозана. М. Изд. ВНИИРО. 2001. С. 78-81.

7. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс // Физиол. раст. 2003. Т. 50. С. 465-474.

8. Дьяков Ю.Т. Генетическое регулирование сверхчувствительности растений//Цитология и генетика. 1967. Т.1. №3. С. 81-90.

9. Дьяков Ю.Т., Багирова С.Ф. Что общего в иммунитете растений и животных//Природа. 2001. №11. с. 17-34.

10. Дьяков Ю.Т. На пути к общей теории иммунитета // Журнал общей биологии. 2005. Т.66. №6. С. 451-458.

11. Евдокимов Ю.М. Нуклеиновые кислоты и хитозан // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. Под ред акад. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука. 2002. С. 178-200.

12. Едрева A.M. Стрессовые белки растений: РЫ(Ь)-белки // Физиология растений. 1991. Т. 38. С. 788-800.

13. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Яраш Н.П. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, Ленинградское отделение, 1987. 400 с.

14. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

15. Куликов С.Н., Варламов В.П. Роль структуры в элиситорной активности хитозана // Ученые записки казанского государственного университета. 2008. Т. 150. кн. 2. С. 1-16.

16. Ладыженская Э.П., Глинка Е.М, Проценко М.А. Участие фитогормонов в действии фитопатогенного гриба на клетку растения // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 143-147.

17. Любимова Н.В., Щербухин В. Д. Процессы межклеточного узнавания и индуцирование устойчивости клубней картофеля к болезням (Обзор) И Прикладная биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. С. 3-16.

18. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения (Обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. С. 355-362.

19. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Хайруллин P.M. «Хитин-специфичные» пероксидазы в растениях // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 131-136.

20. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Яруллина Л.Г., Ахметова И.Э. Выделение «хитин-специфичных» оксидоредуктаз пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №6. С.616-620.

21. Максютова H.H., Галеева Е.И., Румянцева Н.И., Викторова Л.В. Влияние салициловой кислоты на белковый состав каллусов гречихи татарской Fagopirum tataricum с различной способностью к морфогенезу // Биохимия. 2005. Т.70. С. 390-396.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480 с.

23. Минибаева Ф.В., Гордон JI.X. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе // Физиол. раст. 2003. Т. 50. С. 459-464.

24. Мосолов В.В., Григорьева Л.И., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ из растений как полифункциональные белки // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т. 37. С. 643-650.

25. Накова Л.В. Факторы вирулентности эшерихий и их роль в маркировании бактерий//Автореф. дисс. канд. биол. наук., Нальчик. 1997. 23 с.

26. Немцев C.B., Авдиенко И.Д., Варламов В.П., Скрябин К.Г. Рострегулирующее действие низкомолекулярного хитозана // Труды 6-й международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. М. Изд. ВНИИРО. 2001. С. 94-95.

27. Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений биогенными элиситорами фитопатогенов // Прикл. биохим. и микробиол. 1994. Т.30. С.325-339.

28. Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Роменская Г.И., и др.

29. Фрагменты ксилоглюкана регуляторы иммунных эффектов в картофеле // Физиол. раст. 1995. Т. 42. С. 773-779.

30. Озерецковская О.Л., Роменская И.Г. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений // Физиология растений. 1996. Т. 43. С. 743-752.

31. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Зиновьева C.B. Хитозан как элиситор индуцированной устойчивости растений // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. Под ред. акад. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука. 2002. с. 339-345.

32. Озерецковская О.Л. Проблемы специфического иммунитета // Физиол. раст. 2002. Т.49. С. 148-154.

33. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Панина Я.С., Чаленко Г.И. Действие иммуномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophthora infestons // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 546-553.

34. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л. Изменение активности каталазы клубней картофеля под действием иммунорегуляторов // Доклады АН. 2004. Т. 395. С. 712-714.

35. Переход Е.А., Чаленко Г.И., Герасимов Н.Г. и др. Хитозан -регулятор фитофтороустойчивости картофеля // Доклады АН. 1997. Т. 355. С. 120-122.

36. Потехина Н.В. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамм положительных бактерий // Успехи биологической химии. 2006. т. 46. С. 225-278.

37. Пыжикова Г.В., Карасева Е.В. Методика изучения возбудителей септориоза на изолированных листьях пшеницы // С.-х. биология. 1985. №.12. С.112-114.

38. Тарчевский И.А. Сигнальные системы растений // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 321-331.

39. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: ФЭН, 2001.448 с.

40. Тарчевский И.А. Сигнальные системы растений. М.: Наука, 2002.294 с.

41. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. С.-Петербург: Наука, 1998. 194 с.

42. Трошина Н.Б., Максимов И.В., Исаев Р.Ф., Ямалеев A.M.

43. Влияние возбудителей грибных болезней на функциональную активность ядер пшеницы // Микология и фитопатология. 1992. Т.26. №5. с. 148-152.

44. Тютерев C.JI. Научные основы использования химических активаторов болезнеустойчивости в защите растений от патогенов. Автореф. дисс. докт. биол. наук. С.-Петербург. Пушкин, 1999. 54 с.

45. Тютерев C.JI. Научные основы индуцирования болезнеустойчивости растений. С.-Пб., ООО «Инновационный центр защиты растений» ВИЗР. 2002. 328 с.

46. Финеан Д. Биологические ультраструктуры. М.: Мир, 1970. 325 с.

47. Фрей-Висслинг А., Мюлеталер К. Ультраструктура растительной клетки. М.: Мир, 1968. 517 с.

48. Хайруллин P.M., Ахметова И.Э., Сурина О.Б., Трошина Н.Б. Влияние хитоолигосахаридов на рост каллусов пшеницы // Труды 6-й международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана. М. Изд. ВНИИРО, 2001. С. 113-115.

49. Чайлахян М.Х. Регуляция цветения высших растений. М.: Наука, 1988. 500 с.

50. Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение. Под ред акад. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука. 2002. с. 327-338.

51. Чирков С.Н., Ильина A.B., Сургучева H.A., и др. Влияние хитозана на системную вирусную инфекцию и некоторые защитные реакции в растениях картофеля // Физиология растений 2001. Т. 48. С. 890-896.

52. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Атабеков И.Г. Стимуляция синтеза клеточных белков и ингибирования вирусной инфекции хитозаном в изолированнных протопластах табака//Докл. РАН 1995. Т. 341. С. 836-838.

53. Чугункова Т.В., Губанова Н.Я. Неспецифические элиситоры -модуляторы иммунных реакций растений // Физиология и биохимия культурных растений. 2005. Т.37. №3. С. 198-206.

54. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160 с.

55. Шакирова Ф.М., Сахабутдинова А.Р. Сигнальная регуляция устойчивости растений к патогенам // Усп. совр. биол. 2003. Т. 123. С. 563572.

56. Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Исаев Р.Ф., Ганиев P.M., Хайруллин P.M. Новые аспекты в изучении механизмов действия индукторов устойчивости пшеницы к твердой головне // Агрохимия. 2001. № 5. С.66-63.

57. Achuo Е.А., Audenaert К., Meziane Н., Hofte М. The salicylic aciddependent defence pathway is effective against different pathogens in tomato and tobacco // Plant Pathol. 2004. V.53. P. 65-72.

58. Araki Y., Ito E. A pathway of chitosan formation in Mucor ruoxi H Eur. J. Biochem. 1975. V. 189. P. 249-253.

59. Baier R., Schiene K., Kohring B., et al Alfalfa and tobacco cells react differently to chitin oligosaccharides and Sinorhizobium meliloti nodulation factors //Planta. 1999. V. 210. P. 157-164.

60. Barber M.S., Ride J.P. A quantitative assay for induced lignificaton in wounded wheat leaves and its use to survey potential elicitors of the response // Phyisiol. Mol. Plant Pathol. 1988. V. 32. P. 185-187.

61. Benhamou N., Kloepper J.W., Tuzun S. Induction of resistance against Fusarium wilt of tomato by combination of chitosan with an endophytic bacterial strain: ultrastructure and cytochemistry of the host response // Planta. 1998. V. 204 P. 153-168.

62. Blair D.E., Hekmat O., Schuttelkopf A.W., Sheresta B., Tokuyasu K., Withers S.G., Van Aalten D.M.F. Structure and mechanism of chitin deacetylase from the fungal Pathogen Colletotrichum lindemuthianum II Biochemistry. 2006. V. 45. P. 9416-9426.

63. Brunner F., Stintzi A., Fritig B. Legrand M. Substrate specificities of tobacco chitinases // Plant J. 1998. V.14 P. 225-234.

64. Gaffhey T., Freidrich L., Vernioij B., et al. Requirement of salicylic acid for the induction systemic acquired resistance // Science. 1993. V.261. P.745-756.

65. Ganesan V., Thomas G. Salicylic acid response in rice: influence of salicylic acid on H202 accumulation and oxidative stress // Plant Sci. 2001. V. li>0. P. 1095-1106.

66. Cardinale F., Jonak C., Ligternik W., et al. Differential activation of four specific MAPK Pathways by distinct elicitors // J. Biol. Chem. 2000. V. 27^5. P. 36734-36740.

67. Carolin A., Hadwiger L.A. The fungicidal effect of chitosan on i'lm^i of varying cell wall compositions // J. Exp. Mycol. 1979. V. 3. P. 285-287.

68. Carver T.L., Anderson-Moris S.M. Effect of inoculum density on germling development by Erisiphe graminis in relation induction of resistance "to pathogens//Phytopathology. 1989. V.79. P.721-730.

69. Caufrier F., Martinou A., Dupont C., Bouriotis V. Carbohydrate esterase family 4 enzymes: substrate specificity // Carbohydrate Research. 2003. ^V. 338. P. 687-692.

70. Chang M-M., Hadwiger L.A., Horovitz D. Molecular characterization of a pea P-l,3-glucanase induced by Fusarium solani and chitosan challenge SJ Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 609-618.

71. Chen H., Segun P., Archambault A., Constan L., Jabaji S. Geraie expression and isoflavone concentration in soybean sprouts treated with chitosan // Crop science. 2009. V. 49. P. 224-236.

72. Chen Z., Lyer S., Caplan A., et al. Differential accumulation of salicylic acid-sensitive catalase in different rice tissues // Plant Physiol. 19i?~7-V.114. P.193-201.

73. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. V.162. P. 156-159.

74. Christodoulidou A., Bouriotis V., Tireos G. Two sporulation-specific chitin desacetilase-encoding genes are required for the ascospore wall rigidity of Sacharomyces cervisiae IIJ. of Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 31420-31425.

75. Cohn J., Day R.B., Stacey G. Legume nodule organogenesis // Trends in Plant Science. 1998. V. 3. P. 105-110.

76. Conrath U., Chen Z., Ricigliano J.R., Klessing D.F. Two inducer of plant defense responses 2,6-dichloroisonicotinic acid and salicylic acid inhibit catalase activity in tobacco II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 71437147.

77. Conrath U., Domard A., Kauss H. Chitosan elicited synthesis of callose and coumarin derivatives in parsley cell suspension cultures // Plant Cell Reports. 1989. V. 8. P. 152-155.

78. Creelman R.A., Mullet J.E. Oligosaccharides, brassinolides, and jasmonates: nontraditional regulators of plant growth, development, and gene expression // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1211-1223.

79. Dalisay R.F. Enhanced peroxidase and its persistence in cucumber plants immunized against anthracnose by foliar inoculation with Colletotrichun lagenarium II Phytopathology. 1989. V. 79. P.l 150-1155.

80. Davis L.L., Bartincki-Garsia L. Chitosan synthesis by the tandem action of chitin sintetase and chitin deacetilase from Mucor ruoxii II Biochemistry. 1984. V. 23. P. 1065-1072

81. Day R. B., Okada M, Ito Y., et al. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 1162-1173.

82. DMaz C.L., Spaink H.P., Kijne J.W. Heterilogous rhizobial lipochitin oligosacharides and chitin oligomers induce cortical cell division in red clover roots // Mol. Plant-Microbe Interaction 2000. V.13. P. 268-276.

83. Doares S.H., Syrovets T., Weiler E.W. Oligogalacturonides and chitosan activate plant defensive genes through the octadecanoid pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4095-4098.

84. Dong X. Finding the missing pieses in the pulse of plant disease resistance II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 7137-7139.

85. Dubery I.A., Teodorczuk L.G., Louw A.E. Early responses in methyl jasmonate-preconditioned cells toward pathogen-derived elicitors // Mol. Cell Biol. Res. Comm. 2000. V. 3. P. 105-110.

86. Dumas B., Freyssinet G., Pallet K. Tissue-specific expression of germin-like oxalate oxidase development and fungal infection of barley seedlings //Plant Physiol. 1995. V. 107. P.1091-1096.

87. Durner J., Klessig D.F. Inhibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid and 2,6-dichloroisonicotinic acid, two inducers of plant defense // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 11312-11316.

88. Dyachok J.V., Tobin A.E., Price N.P.J., von Arnold S. Rhizobial Nod factors stimulate somatic embryo development in Picea abies II Plant Cell Reports. 2000. V. 19. P. 290-297.

89. El Gueddari N.E., Rauchhaus U., Moerschbacher B.M., Deising H.B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi//New Phytologist. 2002. V. 156. P. 103-112.

90. Fauth M., Schweizer P., Buchala A. et al. Cutin monomers and surface wax constituents elicit H2C>2 in conditioned cucumber hypocotyl segments and enhance the activity of other H202 elicitors // Plant Physiol. 1998. V.117. P. 1373-1380.

91. Felle H.H., Kondorosi E.A., Kondorosi A.A., Schultze M. Nod factors modulate the concentration of cytosolic free calcium differently in growing and non-growing root hairs of Medicago sativa L. // Planta. 1999. V. 209. P .20*7-212.

92. Ferreira R.B., Monteiro S., Freitas R., Santos C.N., Chen Z., Batista L.M., Duarte J., Borges A., Teixiera A.R. The role of plant defence proteins in fimgal pathogenesis // Mol. Plant Pathol. 2007. V. 8. P. 677-700.

93. Fernandez M.R., Heath M.C. Interaction of the nonhost french bean plant (Phaseolus vulgaris) with parasitic and saprophytic fungi // Can. J. Botany. 1991. V. 69. P. 1642-1646.

94. Flese A.P., Panda T. Studies on application of chitin and its derivatives // Bioprocess Engineering. 1999. V. 20. P. 505-512.

95. Flor H.H. Current status of the Gene-for Gene Concept // Aniru. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296.

96. Flors V., Ton J., Jakab G., Mauch-Mani B. Abscisic acid and callose: team players in defence against pathogens? // J. Phytopath. 2005. V. 153. P.377-383.

97. Fukusaki E., Kato T., Maeda H., et al., DNA Aptamers that bind tochitin // Bioorganic Medicinal Chemistiy Letters. 2000. V. 10. P. 423-425.

98. Galis I., Matsuoka K. Transcriptomic analysis of salicylic acid -responsive genes in tobacco BY-2 cells // Salicylic acid: A plant Hormone. Ed. Hayat S., Ahmad A. 2006. Springer. P. 371-396.

99. Garre V., Tenberge K.B., Eising H. Secretion of a Fungal Extracellular Catalase by Claviceps purpurea during Infection of Rye: Putative Role in Pathogenesity and Suppression of Host Response // Phytopathology. 1998. V. 88. P. 744-753.

100. Gechev T., Gadiev I., Van Breusegem F., et al. Hydrogen peroxide protect tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxidant enzymes // Cell. Mol. Life Sei. 2002. V.59. P.708-714.

101. Geiger O., Glushka J., Lugtenberg B.J.J., et al. NodFE-dependent fatty acids that lack an alpha-beta unsaturation are subject to differential transfer, Leading to novel phospholipids // Mol Plant-Microbe Interaction. 1997. V. 11. P. 33-44.

102. Govrin E.M., Levine A. Infection of Arabidopsis with a necrotrophic pathogen, Botrytis cinerea, elicits various defense responses but does not induce systemic acquired resistance (SAR) // Plant Mol. Biol. 2002. V.48. P.267-276.

103. Guan L., Scandalios J. Developmental^ related responses of maise cata-lase gene to salicylic acid // Proc Natl. Acad. Sei. USA. 1995. V. 92. P. 59305954.

104. Goodwin P.H., Li J.L., Jon S. A catalase gene of Colletotrichum gloeosporioides f, sp. malvae is highly expressed during the necrotrophic phase ofinfection of round-leaved mallow, Malva pussilla II FEMS Microbiology Letters. 2001. V.202. P. 103-107.

105. Hadwider L.A. Host parasite interaction: elicitation of defense responses in plants with chitosan // EXS. 1999. V. 87. P. 185-200.

106. Hadwider L.A., Adams M. Nuclear changes associated with the Hostparasite interaction between Fusarium solani and peas // Phys Plant Pathol. 1978. V. 12. P. 63-72.

107. Hadwider L.A., Beckman J.M. Chitosan as component of pea F. solani interaction // Plant Pysiol. 1980. V. 66. P. 205-211.

108. Hadwider L.A., Losckie D.C. Molecular communication in host -parasite interaction hexosamine polimers (chitosan) as regulators compound in race-specific an other interaction //Phytopathology. 1981. Y. 71. P. 756-762.

109. Hadwiger L.A, Ogawa T, Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Molecular Plant-Microbe Interact. 1994. V. 7. P. 531-533.

110. Hammerschmidt R., Kuc J. Lignifications as a mechanism for induced systemic resistance of cucumber // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1982. V. 20. P. 6170.

111. Harkin J.M., Obst J.R. Lignifications in trees induction of exclusive peroxidase participation // Science. 1973. V. 180. P. 296-298.

112. Hayat S., Ali B., Ahmad A. Salicylic acid: biosynthesis, metabolism and physiological role in plants // Salicylic acid: A plant Hormone. Ed. Hayat S., Ahmad A. 2006. Springer. P. 1-14.

113. Heil M., Bostok R.M. Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the contex of induced plant defences // Annal. Botany. 2002. V.89. P. 503-512.

114. Hein I., Gilroy E.M., Armstrong M.R., Birch P.R.J. The zig-zag-zig in oomycete-plant interactions // Mol. plant pathol. 2009. V.10. P.547-562.

115. Hirano S., Hayashi M., Murae K., et al. Chitosan and derivates as activators of plant cell in tissues and seeds // Appl. Bioactive Polimeric Materials. N.Y.: Plenum Pibl. Corp. 1989. P. 45-59.

116. Hirano S., Nagao N. Effect of chitosan, pectic acid, lizozyme and chitinase on the growth of several phytopathogens // Agric and Biol Chem 1989. V. 53. P. 3065-3066.

117. Hirano S., Yamamoto T. Chitinase activity in seed coated with chitosan derivatives//Agr. Biol. Chem. 1990. V. 54. P. 2719-2720.

118. Horoshi I., Yasuhiro Y., Yoshitsugu I., et al. Tree extracellular chitinases in suspension cultured rice cells elicited by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci. Biotechnol. and Biochem. 1996. V. <50. P. 1956-1961.

119. Huckelhoven R., Kogel K.H. Reactive oxygen intermediates in plantmicrobe interactions: Who is who in powdery mildew resistance? Planta. 2003. V. 6. P. 891-902.

120. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. V. 12. P. 347356.

121. John M., Rohrig H., Schmidt J., et al. Rhizobium NodB protein involved in nodulation signal synthesis is a chitooligosaccharide deacetilase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. V. 90. P. 625-629

122. Jong A.J.D., Cordewener J., Lo Schiavo F., et al. A carrot somatic embryo mutant is rescued by chitinase // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 425-433.

123. Jones J.D.G., Dangl J.L. The plant immune system // Nature. 2006. V. 444. P.323-329.

124. Jung H.W., Tschaplinski T.J., Wang L., Glazebrook J., Greenberg J.T. Priming in systemic plant immunity // Science. 2009. V. 324. P. 89-91.

125. Kaku H., Shibuya N., Xu P., et al. N-acetylchitooligosaccharides elicit expression of a single (1-3) P-glucanase gene in suspension-cultured cells from barley (Hordeum vulgare) II Physiol. Plantarum. 1998. V. 100. P. 111-118.

126. Kauss H. Callose biosynthesis as a Ca2+ regulated process an possible relation to the induction of other metabolic changes // J. Cell Science. 1985. V. 75. P. 89-103.

127. Kauss H., Jeblick W., Domard A, The degrees of polymerization and N-acetylation of chitosan determine its ability to elicit callose formation in suspension cells and protoplasts of Catharanthus roseus II Planta. 1989. V. 178. P. 385-392.

128. Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. // Plant Cell Rep. 2003. V. 21. P. 829-837.

129. Kawano T., Furuichi T. Salicylic acid as a defence-related plant hormone: Roles of oxidative and calcium signaling paths in salicylic acid biology

130. Salicylic acid: A plant Hormone. Ed. Hayat S., Ahmad A. 2007. Springer. P. 277 -322.

131. Kendra D.F., Hadwider L.A. Calcium and calmodulin my not regulate the disease resistance and pisatin formation response of Pisum sativum to chitosan of Fusarium solani II Mol and Phis, plant Pathol. 1987. V. 31. P. 337-349.

132. Kikuyama M., Kuchitsu K., Shibuya N. Membrane depolarization induced by N-acetylchitooligosaccharide elicitor in suspension-cultured rice cells // Plant and Cell Physiology 1997. V. 38. P. 902-909.

133. Kovats K., Binder A., Hohl H. Cytology of induced systemic resistance of cucumber to Coletotrichum lagenariumll Planta. 1991. V.183. P.484-490.

134. Klusener B., Young J.J., Murata Y., et al. Convergence of calcium signaling pathways of pathogenic elicitors and abscisic acid in arabidopsis Guard Cells // Plant Physiol. 2002. V. 130. P. 2152-2163.

135. Knoblauch M.5 van Bela A.J.E. Sieve tubes in action // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 35-50.

136. Knogge W., Scheel D. LysM receptors recognize frend and foe // PNAS. 2006. V. 103. P.10829-10830/

137. Koga D., Hirata T., Sushide N., Tanaka S. Induction pattern of chitinases in yam callus by inoculation with autoclaved Fusarium oxysporium ethylene and chitosan oligosacharides // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. V. 56. P. 280-285.

138. Laflamme P., Benhamou N., Bussieres G., Dessureault M. Differentialeffect of chitosan on root rot fungal pathogens in forest nurseries // Can. J. Bot. 1999. V. 77. P. 1460-1468.

139. Lavertu M., Xia Z., Serreqi A.N., et al. A validated JH-NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan // J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003. V.32. P. 1149-1158.

140. Leon J., Lawton M.A., Raskin I. Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1673-1678.

141. Lesney M.S. Growth responses and lignin production in cell suspension of Pinus eliotti "elicited" by chitin chitosan or mycelium of Coronartum quercum f sp. fusiforme II Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1989. V. 19. P. 23-31.

142. Li X.-F., Feng X.-Q., Yang S„ Wang T.-P., Su Z.-X. Effects of molecular weight and concentration of chitosan on antifungal against Aspergilus niger // Iranian Polymer J. 2008. V. 17. P. 843-852.

143. Lienart Y., Driguez H., Domard A. Chitosan as elicitor of P-D glucanase from Rubus cell // Chitin and chitosan: Sources; Chem., Biochem., Phys. Prop, and Appl.: Proc. 4th Int conf., Trondheim Aug. 22-24. 1988. London; New York, 1989. P. 225-231.

144. Lim C.H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. 2003. V. 43. P. 223-269.

145. Link V.L., Hoffman M.G., Sinha A.K., et al. Biochemical evidence for the activation of distinct subsets of mithogen-activated protein kinases by voltageand defense-related stimuli //Plant Physiol. 2002. V.128. P.271-281.

146. Lipetz J., Garro A.J. Ionic effect of lignifications and peroxidase in tissue cultures //J. of Cell Biol. 1965. V. 25. p. 25-35.

147. Long S.R. Rhizobium symbiosis: Nod factors in perspective // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1885-1898.

148. Luo J.-P., Jiang S.-T., Pan L.J. Enhanced somatic embryogenesis by salicylic acid of Astragalus adsurgens Pall.: relationship with H202 production and H202-metabolizing enzyme activities // Plant Sci. -2001. V. 161. P. 125-132.

149. Metraux J.-P. Systemic acquired resistance and salicylic acid: current state of knowledge//Eur. J. of Plant Pathol. 2001. V. 107. P. 13-18.

150. Minibayeva F., Gorgon L.K., Kolesnokov O.P., Chasov A.V. Role of extracellular peroxidase in the superoxide production by wheat root cells // Protoplasma. 2001. V.217. P. 125-128.

151. Mithofer A., Ebel J., Bhatwat A.A., et al. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cell challenged with (3-glucan orchitin elicitors // Planta. 1999. V. 207. P. 566-574.

152. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends in Plant Sci. 2002. V.7. P. 405-410.

153. Muranaka T., Miyata M., Ito K., Tachibana S. Production of podophyllotoxin in Juniperus chinensis callus cultures treated with oligosaccharides and a biogenetic precursor // Phytochemistry. 1998. V.38. P.380-385.

154. Muzzarelli R.A. Chitin. Pergamon press. 1977.

155. Nichols E.J., Beckman J.M., Hadwiger L.A. Glycosidic enzyme activity in pea tissue and pea tissue and pea Fusarium solani interaction // Plant Physiol. 1980. V. 66. P. 199-205.

156. Nishimura M.T., Stein M., Hou B.H., Vogel J.P., Edwards H., Somerville S.C. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance // Science. 2003. V. 301. P. 969-972.

157. Onaga S., Taira T. A new type of plant chitinase containing LysM domains from a fern (Pteris ryukyuensis): Roles of LysM domains in chitin binding and antifungal activity // Glycobiology. 2008. V. 18. P. 414-423.

158. Okazaki Y., Isobe T., Iwata Y., et al. Metabolism of avenanthramide phytoalexins in oats // Plant J. 2004. V.39. P. 560-572.

159. Parijs J.V., Broekaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W.J. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex // Planta 1991. V.183 P. 258-264.

160. Park C.J., Kim K.J., Shin R. Pathogenesis-related protein 10 isolated from HOT pepper function as a ribonuclease in an antiviral pathway // Plant J. 2004. V. 37. P. 186-198.

161. Peck S.C., Nuhse T.S., Hess D., et al. Directed proteomic identifies a

162. Plant-Specific Protein rapidly phosporylated in Response to Bacterial and Fungal Elicitor // Plant cell. 2002. V. 13. P. 1467-1475.

163. Peltonen S., Mannonen L., Karjalainen R. Elicitor-induced changes phenylalanine ammonia -lyase activity in barley cell suspension cultures // Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 1997. V.50. P. 185-193.

164. Pingret J.-L., Journet E.-P., Barker D.G. Rhizobium Nod Factor Signaling: Evidence for a G Protein-Mediated Transduction Mechanism // The Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 659-671.

165. Prithiviraj B., Zhou X., Souleimanov A., et al. A host-specific bacteria-to-plant signal molecule (Nod factor) enhances germination and early growth of diverse crop plants // Planta. 2002. V. 216. P. 347-445.

166. Ramonell K.M., Zhang B., Ewing R.M., et al. Microarray analsis of chitin elicitation in Arabidopsis thaiana II Mol. plant pathol. 2002. V. 3. P. 301311.

167. Raskin I. Role of Salicylic Acid in Plants // Annu. Rev. Plant Physiol.

168. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 439-463.

169. Raskin I., Ehmann A., Melander W.R., Meeuse B.J.D. Salicylic Acid: A Natural Inducer of Heat Production in Arum Lilies // Science. 1987. V. 237. N. 4822. P. 1601 1602.

170. Rasmussen J., Smith J., Williams S., et al. cDNA cloning and systemic expression of acidic peroxidases associated with systemic acquired resistance to disease in cucumber // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1995. V. 46. P. 389-400.

171. Roby D., Gadelle A., Toppan A. Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants // Bioch. Biophys. Res. Comm. 1987. V. 143. P. 885-892.

172. Rogers L.M., Kim Y.-K., Guo W., et al. Requirement for either a host or pectin-induced pectate lyase for infection of Pisum sativum by Nectria hematococca II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. V. 97. P. 9813-9818.

173. Rohrig H., Schimdt J., Waiden R., et al. Growth of tobacco protoplasts stimulated by synthetic lipo-chitooligosaccharides (LCO) // Science. 1995. V. 269. P. 841-843.

174. Roustan J.P., Latche A., Fallot J. Inhibition of ethylene production and stimulation of carrot somatic embryogenesis by salicylic acid // Biol. Plant. 1990. V. 32. P. 273-276.

175. Rufer M., Steipie B., Zenk M.H. Evidence against specific binding of salycilic acid to plant catalase // FEBS letter. 1995. V. 37. P, 175-180.

176. Ryan A.C., Farmer E.E. Oligosaccharide signals in plants: a currentassessment//Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 651-674.

177. Saito M., Chikazawa T., Matsuoka H., Nishizawa Y., Shibuya N. Elicitor action via cell membrane of a cultured rice cell demonstrated by the single-cell transient assay // J. Biotechnol. 2000. V. 76. P. 227-232.

178. Santos A., Guedarri N., Tromboto S., Moerschbacher B.M. Partialy acetylated chitosan oligo-and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia II Biomacromolecules. 2008. V. 9. P. 3411-3415.

179. Sathiyambama M., Balasubramanian R. Chitosan inducts resistance components in Arachis hypogaea against leaf rust caused by Puccinia arachidis Speg. // Crop Protection. 1998. V. 17. P. 307-313.

180. Schultze M., Kondorosi E., Ratet P., et al. Cell and molecular biology of Rhizobium-plant interactions // Int. Rev. Cytol. 1994. V. 156. P. 1-75.

181. Seo S., Katou S., Seto H., Gomy K., Ohashi Y. The mytogen-activated protein kinases WIPK and SIPK regulate the levels of jasmonic and salicylic acids in wounded tobacco plants // Plant J. 2007. V. 49. P. 899-909.

182. Shibel W., Pelissier T., Reidel L., et al. Isolation of an RNA -directed RNA polymerase -specific cDNA clone from tomato // Plant Cell 1998. V. 10. P. 2087-2102.

183. Shibuya N., Minami E. Oligosaccharide signalling for defence responses in plant // Physiological and Molecular Plant Pathology 2001. V. 59. P. 223-233.

184. Siegel S.M. Non enzyme macromolecules as matrices in biological synthesis. The role of polysaccharides in peroxidase catalyzed lignin polymer formation from eugenol //J. Amer. Chem. Soc. 1958. V. 79. P. 1628-1632.

185. Skubatz H., Nelson T.A., Meeuse B.J.D., Bendich A.J. Heat Production in the Voodoo Lily (Sauromatum guitatum) as Monitored by Infrared Thermography //Plant Physiol. 1991. V. 95. P. 1084-1088

186. Sneh B. Use of pathogenic or hypovirulent fungal strains to protect plants against closely related fungal pathogens // Bioteh. Adv. 1998. V.16. P. 1-32.

187. Stossel P., Leubow J.L. Effect of chitosan, chitin and some aminosugars in growth of various soil borne phytopathogenic fungi // Phytopathol. Z. 1984. V. Ill P. 82-90.

188. Tada Y., Hata S., Takata Y., et al. Induction and signaling of apoptic response typified by DNA laddering in the defense response of oats to infection and elicitors // Mol Plant-Microbe Interact. 2001. V. 14. P. 477-486.

189. Takahashi A., Kawasaki T., Henmi K., et al. Lesion mimic mutants of rice with alterations in early signaling events of defense // Plant J. 1999.V. 17. P.535.545.

190. Takeshi M. Seed treatment with chitin solution for accelerated growth // Jpn. Kokai Tokyo Koho J.P. 03.133.304.06 Jun 1991. Appl. 89 1268-875 180 et 1989. 5 pp.

191. Takezava D. A rapid induction by elicitors of the mRNA encoding CCD-1, a 14 kDa Ca+2-binding protein in wheat cultured cells // Plant Molecular Biology 2000. V. 42. P. 807-817.

192. Tharanathan R.N., Kuttur F.S. Chitin the undisputed biomolecule of great potential // Crit. Rev. Food Sei. Nutr. 2003. V. 43. P. 61-87.

193. Thulke O., Conrath U. Salicylic acid has a dual role in the activation of defence-related genes in parsley // Plant J. 1998. V.14. P. 35-42.

194. Toedt J.M., Braswell E.H., Schuster T.M., et al. Biophysical characterization of designed TMV coat protein mutant, R46G, that elicits a moderate hypersensitive response in Nicotiana silvestris II Protein Sei. 1999. V. 8. P. 261-270.

195. Tokuyasu K., Kaneko S., Hayashi K., Mory Y. Production of a recombinant chitin deacetilase in the culture medium of Escherihia coli sells // Febs Letter. 1999. V. 458. P. 23-26.

196. Trotel-Aziz P., Couderchet M., Vernet G., Aziz A. Chitosan stimulates defense reaction in grapevine leaves and inhibits development of Botrytis cinerea I I Eur. J. Plant Pathology. 2006. V. 114. P. 405-413.

197. Tsai G.J., Su W.H. Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli II J. Food Protection. 1999. V. 62. P. 239-243.

198. Tsigos I., Martinou A., Kafetzopolus D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: new, versatile tools in biotechnology // Trends in Biotechnology. 2000. V. 18. P. 305-312

199. Van Hengel A.J., Tadesse Z., Immerzeel P., et al. N-acetylglucosamine and glucosamine-containing arabinogalactan proteins control somatic embriogenesis //Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 1880-1890.

200. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant molecular Biology. 1985. V. 27. P. 1205-1213.

201. Van Loon L.C., Van Strien E.A. The families of pathogenesis related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins // Physiol.

202. Molec. Plant Pathol. 1999. V. 55. P. 85-97/

203. Van Loon L.C. Significance of inducible defence-related proteins in infected Plants // Ann. Rev. Phytopathol. 2006. V 44. P. 135-162.

204. Vander P., Varum K.M., Domard A. et al. Comparison of the ability of partially N-Acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance in wheat leaves // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1353-1359.

205. Vernooij B., Fredrich L., Morse A., Reist R., Kolditz J.R., et al. Salicylic acid is not the translocated signal response for inducing SAR but is required in signal transduction // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 959-965.

206. Vuletic M., Sukalovich V.H. Characterization of cell wall oxalate oxidase from maize roots //Plant Sci. 2000. V. 157. P. 257-263.

207. Wan J., Zhang X.-C., Neece D., et al. LysM Receptor-Like Kinase Plays a Critical Role in Chitin Signaling and Fungal Resistance in Arabidopsis// Plant Cell. 2008. V. 20. P. 471-481.

208. Walker-Simmons M.? Ryan C.A. Proteinase inhibitor synthesis in tomato leaves. Induction by chitosan oligomers and chemically modified chitosan and chitin // Plant Physiol. 1984. V. 76. P. 787-790.

209. Wheeler R.T., Fink G.R. A drug-sensitive genetic network masks fungi from the immune system // PLOS Pathogens. 2006. V.2. P. 328-339.

210. Willats W.G.T, McCartney L., Mackie W., Knox J.P. Pectin: cell biology and prospects for functional analysis // Plant Mol. Biol. 2001. V. 47. P. 927.

211. Woloshuk C.P., Meulenhoff J.S., Sela-Buurlage M., et al. Pathogeninduced proteins with inhibitory activity toward Phytophthora infestans // Plant Cell. 1991. V.3. 619-628.

212. Xu J., Zhao X.5 Han X., Du Y. Antifungal activity of oligochitosan against Phytophthora capsici and other plant pathogenic fungi in vitro // Pesticide Biochem. And Physiol. 2007. V.87. P. 220-228.

213. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., Ahatsuka T. Induction of phitoalexin formation in suspension culture rise cells by N-acetylchitooligosacharides //Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. P.405-409.

214. Yamaguchi T.5 Ito Y., Shibuya N. Oligosaccharide Elicitors and Their Receptors for Plant Defense Responses // Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2000. V.12. P. 113-120.

215. Young D.H., Kauss H. Relage of calcium from suspension cultured Glycine max cell by chitosan other polycations in relation of effect on membrane permeability // Plant Physiol. 1983. V. 73. P. 698-702.

216. Young D.H., Konle H., Kauss H. Effect of chitosan on membrane permeability of suspension cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cell // Plant Physiol. 1982. V. 70. P. 1449-1454.

217. Zhang B.5 Ramonell K., Sommervile S., Staccey G. Characterization of early Chitin-Induced Gene expression in Arabidopsis // Mol Plant-Microbe Interaction 2002. V.15. P.963-970.

218. Zhanh Z., Henderson C., Guur S.J. Blumeria graminis secretes an extracellular catalase during infection of barley: potential role in suppression of host defense // Mol. Plant Pathol. 2004. V. 5 P. 537-547.

Информация о работе

Валеев, Альберт Шакирьянович
кандидата биологических наук
Уфа, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Дезацетилирование хитина как фактор регуляции взаимоотношений гриба Septoria nodorum Berk. с пшеницей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы