Патогенность дейтеромицетов

Кобыльский, Геннадий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Патогенность дейтеромицетов
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Патогенность дейтеромицетов"

На правах рукописи

КОБЫЛЬСКИЙ Геннадий Иванович

ПАТОГЕННОСТЬ ДЕЙГЕРОМИЦЕТОВ [НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ПШЕНИЦЫ -ГРИБА SEPTORIA NODORUM (BERK.) BERK.]

06.01.] I - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Филиале Государственного научного учреждения Тамбовского научно-исследовательского института сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук "Среднерусской научно-исследовательской фитопатологической станции"

Официальные оппоненты: академик РАСХН, доктор биологических наук профессор Соколов Михаил Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Дьяков Юрий Таричанович

доктор биологических наук, профессор Мазин Валентин Викторович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН

Защита состоится: ¿3 2005 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 220.043.04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА им К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, И-550, Тимирязевская ул., 49, Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К. А. Тимирязева

Автореферат разослан _ «*ТХ%-9 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, профессор гу__В.В. Исаичев

гооб-ч_ тнь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дейтеромицеты (Deuteromycetes) или несовершенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе. Многие из них паразитируют на высших растениях. К возбудителям болезней сельскохозяйственных культур, оказывающим наиболее существенный вред производству, относятся грибы рр. Botrytis Mich, Verticillium Nees, Rinchosporium, Trichothecium Lk, Piricularia Sacc., Cercosporella Sacc, Cladosporium Link, Alternaría Nees, Helminthosporium Lk: Fr., Drechslera Ito, Bipolaris, Curvularia Boed, Fusarium Lk: Fr (порядок гифомицеты), р. Colletotrichum Sacc (порядок мелан-кониальные) и рр. Phoma sp., Phomopsis Sacc, Ascochyta Lid. и Septoria Fr. (порядок сферопсидальные).

Возбудители септориозных пятнистостей пшеницы - грибы р. Septoria в настоящее время насчитывают свыше 10 видов. Среди них наиболее часто на посевах встречаются S. tritici Rob. et Desm и S. nodorum Berk. Первый из них поражает, в основном, листья, а второй - колос, хотя практически S. nodorum Berk. способен поражать все надземные органы. Оба вида часто можно обнаружить на одних и тех же полях и даже растениях (Соколов и др., 1998).

В 1987 г. на европейской территории бывшего СССР 50 - 80% случаев возникновения массовых пятнистостей на пшенице было вызвано поражением её септориозом (Супрун, 1990). Сильное развитие септориоза на посевах пшеницы отмечено на Алтае и в Северном Казахстане (Васецкая, Столяров, 1988), в Сибири (Лебедева, 1984; Кашуба, 1989), на Северном Кавказе (Фиссюра и др., 1996; Чуприна и др., 1997) и в Украине (Дубиневич, 1971; Гонтаренко и др., 1998). Особенно широкое распространение септориоз получил с середины 80-х и начала 90-х годов (Новожилов, 1996), став доминирующим заболеванием на посевах озимой и яровой пшеницы (Павлюшин и др., 2005). Показано, что в благоприятные для развития болезни годы септориоз вызывает снижение урожая зерна на 10 - 20, а в некоторых случаях до 30 - 50 %(Дымина, 1997; Гонтаренко и др., 1998).

Г oVtrmrj

токсины (Tapp, 1975; Йодер, 1984; Асада, 1985; Дурбин, 1985), гормоны (Tapp, 1975; Пегг, 1984; Косуге, Комаи, 1985) и другие биологически активные соединения. Сведения подобного плана в отношении грибов р. Septoria ограничены, поэтому проведение исследований, направленных на изучение пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогор-монов как возможных биохимических факторов патогенное™ S. nodorum Berk, является актуальным и имеет большое научное общебиологическое и прикладное значение.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение физиолого-биохимической природы патогенности S. nodorum Berk, как теоретической основы направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику роста и споруляции S. nodorum Berk, в чистой культуре, выявить зависимость их от состава питательной среды (источники азота и углерода, ростовые факторы и т.д.) и проанализировать взаимосвязь между физиологической специализацией S. nodorum Berk и его патогенностью;

•выяснить способность S. nodorum Berk, к мутационной изменчивости, создать для экспериментальных целей коллекцию морфологических и контрастных по патогенности мутантных штаммов гриба и изучить физиологические особенности некоторых из них;

• проследить за динамикой активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, синтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) и фитотоксинов в процессе роста S. nodorum Berk, в чистой культуре; провести анализ взаимосвязи между патогенностью гриба и способностью его к продуцированию ферментов, фитотоксинов и ИУК;

•изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов, а также у слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S. nodorum Berk;

•выявить особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в системе "растение - хозяин - патоген" в процессе развития болезни;

•изучить действие экзогенных ферментных препаратов, фитотоксинов и фитогормонов на характер взаимоотношений патогена и растения - хозяина;

•разработать схему взаимодействия на уровне пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) между возбудителем септориоза - грибом S. nodorum Berk, и растениями пшеницы.

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогор-монов как возможных факторов патогенности возбудителя септориоза пшеницы - гриба S nodorum Berk Эксперименты выполнены с использованием не только природных изолятов, но и конрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk, впервые полученных на основе изолята 85-254. Впервые с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления удалось количественно оценить способность S. nodorum Berk, к синтезу фитотоксинов и ПУК при выращивании его в чистой культуре.

Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов, продуцирует ряд фитотоксичных метаболитов и фитогормоны, в частности, ИУК. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5-7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции сопровождается снижением активности ферментов и увеличением количества ИУК с 1,5 до 6,7 нг/г сырой массы. При прорастании пикноспор резко повышается активность ферментов, возрастает содержание фитотоксинов и ИУК, одновременно усиливается секреция их в окружающую инкубационную среду.

Впервые показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью гидролитических ферментов, особенно полигалактуроназы и ß-глюкозидазы, а также повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Между патоген-ностью мутантов S. nodorum Berk, и способностью их к синтезу ИУК обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Впервые представлены данные сравнительного анализа активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы у слабо- и высокопатогенных мутантов S. nodorum Berk., доказывающие преимущества последних по числу изоферментов эстеразы, ß-глюкозидазы, кислой фосфатазы и пероксидазы.

Впервые с использованием восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы исследованы особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в процессе развития болезни у растений, инфицированных слабо- и высокопатогенным мутантами S. nodorum Berk. Показано, что и в данном случае различия между слабо- и высокопатогенным мутантами и пре-

имущество последнего сохраняются, особенно в опытах с восприимчивым к септориозу сортом пшеницы.

В экспериментах с изучением действия экзогенных гидролаз, фитоток-синов и фитогормонов на растения впервые доказано, что экстракты ферментов из мицелия S nodorum Berk, вызывают на листьях повреждения, характерные для септориоза. Фитотоксины, напротив, не способны вызывать подобных внешних симптомов, однако при добавлении в споровую суспензию повышают степень поражения инокулированных растений пшеницы, а при поступлении через корни влияют на транспирацию и водный обмен. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их 51. nodorum Berk, в значительной степени снижает развитие септориоза.

На основе полученных результатов и данных литературы предложена схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы.

Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов:

• создана коллекция мутантов гриба S. nodorum Berk, (свыше 30 штаммов), различающихся по морфолого-культуральным признакам и патогенно-сти;

• выделены фитотоксины гриба S. nodorum Berk, которые могут быть использованы в работах по селекции пшеницы на устойчивость к септориозу с помощью культуры клеток и тканей;

• разработаны схема препаративного выделения токсинов из культуры гриба S nodorum Berk., "Методика определения фитотоксинов гриба S nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления";

• составлены "Рекомендации по направленному синтезу фунгицидов, предназначенных для борьбы ссепториозом".

Основные положения, выносимые на защиту:

• наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и ß-глюкозидазы (г=0,70);

• высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Berk., превалируют по количеству продуцируемых септорина и медленна (охрацина), суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секретируемых фитотоксинов над слабопатогенными штаммами;

• между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции фитогормона ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость;

• схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы, предложенная на основе полученных результатов и данных литературы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научно-теоретических конференциях НИСХИ МСХ СССР (пгт Гвардейский, 1981,1983,1988 ), VIII научной конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1989 ), научно-теоретической конференции Среднеазиатского НИИ фитопатологии МСХ СССР (Ташкент, 1989), I и II Всесоюзном совещаниях по физиолога - биохимическим основам иммунитета с.-х. растений к грибным болезням (Уфа, 1988, 1990 ), заседаниях научно-технического совета при ВНИИ фитопатологии МСХ СССР (Голицыно, 19801991), бюро Отделения защиты растений Россельхозакадемии (Москва, Санкт-Петербург, Голицыно, 1992-2002), IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991 ), III (Санкт-Петербург, 1993 ) и IV (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений, научно-методическом совещании по селекции яровой пшеницы, посвящённом 110-летаю А.П. Шехурдина (Саратов, 1996), V и VI международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999, 2001), международной научно-практической конференции "Биологизация защиты растений: состояние и перспективы" (Краснодар, 2000), I съезде микологов (Москва, 2002), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано- 50работ.

Структура и объём диссертадии. Диссертационная работа состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы и 36 стр. приложения. Работа изложена на 360 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 78 рисунками. Библиография включает 384

источника, в том числе 227 на иностранных языках.

♦ » *

Исследования выполнены в 1979-1999 гг. по планам НИР, утвержденным МСХ СССР, и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН. Место проведения экспериментов: НИСХИ МСХ СССР (ныне Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан НИСХИ, п.г.т. Гвардейский) и Среднерусская Н.-И. фитопатологическая станция РАСХН (ныне Филиал ГНУ Тамбовского НИИСХ РАСХН «Среднерусская Н.-

И. фитопатологическая станция»). В выполнении отдельных разделов работы принимали участие М.Н. Васецкая, Г.В. Кобыльская, В.Д. Борзионов, A.A. Ах-метов, Е.В. Бочарова, Н.М. Герцог и Е.Г. Дорохова, которым автор выражает искреннюю благодарность.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1, Биологические и физиолого-биохимические факторы па-тогенности дейтеромецетов (обзор литературы)

В обзоре литературы освещено современное состояние проблемы пато-генности дейтеромицетов, паразитирующих на растениях. Проанализированы и обобщены экспериментальные данные, полученные различными авторами при изучении распространения, видового состава, вредоносности, жизненных циклов, биологической специализации и патогенности представителей дейтеромицетов - грибов р Septoria. Рассмотрен механизм заражения растений дейтеро-мицетами. Особое внимание в обзоре уделено критическому анализу результатов исследования ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных биохимических факторов патогенности.

Глава 2. Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследований в работе использовали природные изо-ляты гриба S. nodorum Berk, и полученные на их основе мутанты.

Культуру гриба в зависимости от цели эксперимента выращивали в стационарных условиях в термостате или в климатической камере "Sherer" с освещённостью 12-15 тыс. люкс и 16-час. фотопериодом при температуре 22-24°С. Питательной средой служил картофельно-декстрозный агар (КДА) с добавлением томатного сока (200 г/л) и СаСОэ (0,5 г/л). В опытах использовали также синтетическую глициновую среду, жидкую и агаризованную среду Фриза (Bousquet et al., 1980), жидкую питательную среду Чапека с добавлением гид-ролизата казеина, свободного от витаминов, и перловую крупу. При изучении специфических потребностей в факторах роста в среду для культивирования S. nodorum Berk, включали минеральные компоненты по Ричардсу (Richards, 1951), 20 г D-глюкозы и 20 г агара "Difco" на 1 л среды. Ростовые факторы вводили по схеме, предложенной Холлидеем (Захаров и др., 1980). Кроме того, в работе были использованы агаризованные среды Чапека-Докса, минимальная и синтетическая (Krüger, Hoffman, 1978).

В опытах по индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, в качестве источника УФ-лучей применяли лампы БУВ-ЗОП. Для получения мутантов использовали и химические мутагены: нитрозо-1-метилмочевину (НММ) и N-метил-Ы-нитро-Ы-нитрозогуанидин (НГ).

Споры гриба S. nodorum Berk, выделяли из биоматериала, полученного на перловой крупе, проращивали в колбах Эрленмейера на среде TBN, содержащей 0,01% Твина-20 в Са/К-фосфатном буфере, pH 7,0 (Maheshwari et al., 1967) и 10"4 н-нониловый спирт (Dunkle, Allen, 1971), через 18-20 ч осаждали центрифугированием и использовали для анализов.

Патогенность природных изолятов и мутантов S. nodorum Berk, оценивали на изолированных листьях (Пыжикова, Карасёва, 1985), а также на растениях пшеницы в фазу 2-3 листьев. Последние выращивали в вазонах (по 15-20 шт. в каждом), в климатической камере "Sherer" при 16-час. фотопериоде и освещённости 15-20 тыс. люкс. На 14 сутки после инфицирования проводили учёт степени поражения растений. В полевых условиях растения инокулировали в фазу колошения по методике М.Н. Васецкой и др. (1983).

Содержание белка в культуральной жидкости, в экстрактах из мицелия и спор S. nodorum Berk, а также из листьев пшеницы определяли по Лоури (Lowri et al., 1951). Количество Р„ при анализе кислой фосфатазы учитывали по методу Лоури и Лопез в модификации Хонда (Гавриленко и др., 1975). Активность кислой фосфатазы, кроме того анализировали по методике, описанной М.А. Ту-кеевой (1977). Определение активности эстеразы проводили по В.В. Чигрину и др. (1976), ß-глюкозидазы - по методике, предложенной Е. Onogur (1978), РНК-азы - по Martinez-Honduville (1975), а пероксидазы - по методу А.Н. Бояркина, описанному Б.П. Плешковым (1976).

Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов анализировали в экстрактах из мицелия (Гусева, 1980). В качестве субстрата для поли-галактуроназы, эндо-ß-l ,4-глюканазы (или Сх-целлюлазы,) и ксиланазы использовали соответственно 1%-ные растворы пектина, Na-КМЦ и 2%-ный раствор ксилана. Активность экзо-ß-1,4-глюканазы (или Ci-целлюлазы) определяли по количеству глюкозы (Курзина и др., 1980), образующейся в реакционной смеси, содержащей в качестве субстрата хлопковое волокно. Об активности ß-глюкозидазы судили по интенсивности окраски нитрофенола, образующегося в результате гидролиза р-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозида (Родионова и др., 1966).

Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле, pH 8,9 (Маурер, 1971) и в 7,5%-м геле в щелочной (pH 8,9) системе Орнстейна и Дэвиса (Методы эксп. микол., 1982) в пластинах на приборе GE-4 фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Окраску гелей для определения изоферментного спектра эстеразы вели по модифицированному нами методу, описанному В.В. Чигриным и др. (1976). Изоферменты кислой фосфатазы выявляли по методу Adams, Joly (1980), описанному E.B. Левитес (1986), с некоторыми изменениями. В качестве субстрата для выявления ß-глюкозидазы использовали а-нафтил-Р-Б-глюкопиранозид (Жданов и др., 1978). С целью определения изоферментного спектра пероксида-зы гели инкубировали в 6 мМ растворе о-дианизидина, приготовленном на 0,1 M ацетатном буфере, pH 6,0 (Yamamoto et al., 1978).

Для сравнения легкорастворимых белков и изоферментов различных изо-лятов вычисляли коэффициент сходства (Кс) по формуле, предложенной В.Ф. Гальченко и А.И. Нестеровым (1981), и коэффициент различия (Кр) по формуле, приведённой в своей работе И. А. Можиной и др (1986).

Для изучения качественного состава и биологической активности фито-токсичных метаболитов S. nodorum Berk, использовали этилацетатные экстракты среды культивирования, мицелиальной массы и спор гриба (Bousquet et al, 1980). Биологически активные вещества разделяли методом одно- и двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "Silufol UV-254" в системах растворителей: хлороформ-этилацетат, 5:1 (Devys et al., 1980), петролейный эфир-этилацетат, 1:1 (Bousquet, Skajennikoff, 1974), бензол-уксусная кислота, 3:1 (Берестецкий и др., 1979). Обнаруженные таким образом метаболиты гриба S nodorum Berk проверяли на биологическую активность с помощью биотеста на семенах пшеницы Саратовская 29. Количество фитотоксинов в пробах определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления по разработанной нами методике.

Фитогормоны первоначально исследовали, используя комплексный метод, разработанный П.В. Власовым и др. (1979). Для обнаружения гибберелли-нов использовали ферментный тест по Джонсу и Варнеру (Гродзинский, Грод-зинский, 1973) с некоторыми изменениями (Кобыльский и др., 1974; Кобыль-ский, Письменов, 1974,1976). Анализ свободных ауксинов и ингибиторов роста проводили по методам, предложенным В.И. Кефели и др. (1973) и E.H. Артё-менко и др. (1973). О наличии ауксинов на хроматограмме судили по приросту отрезков колеоптилей пшеницы (Полякова, 1979). Содержание ИУК в исследуемых объектах определяли по методу, предложенному A.M. Умновым и др. (1984) с помощью жидкостного хроматографа системы "Gold" ("Beckman").

Обработку растений пшеницы (фаза 2-х листьев) фитогормонами проводили за сутки до инокуляции и в момент инокуляции. Учёт количества образовавшихся пикнид на листьях (в расчёте на 1 мм2) проводили под МБС-9 с окуляр-микрометром, а длину гиф проросших спор S. nodorum Berk измеряли под микроскопом МБИ-6.

Результаты исследований обрабатывали математически. Подсчёт среднего арифметического значения и стандартного отклонения проводили по формулам, изложенным Р.Х. Кармолиевым (1971). Наименьшую существенную разность между вариантами опытов (НСР) определяли по Б.А. Доспехову (1979). Корреляционный анализ осуществляли, используя программу "Statistical Graphics System" (USA; 1985-1986) для персонального компьютера IBM PC/AT.

Глава 3. Изучение биологических особенностей возбудителя сеп-ториоза пшеницы - гриба Septoria nodorum Berk.

Для выяснения природы патогенности S. nodorum Berk и получения данных, позволяющих моделировать поведение патогена в процессе взаимодействия его с растением-хозяином, прежде всего были изучены динамика роста и споруляции гриба в чистой культуре, зависимость данных процессов от различных источников азота, углерода и специфических факторов роста, присутствующих в питательной среде, а также наличие и степень проявления у патогена физиологической специализации.

3.1. Рост и споруляция гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре. Культивирование гриба на КДА в климатической камере при температуре 20° С и 16-час. фотопериоде показало (Кобыльский, Ахметов, 1989), что с момента инокуляции чашек Петри споровой суспензией и до 10 суток накопление биомассы идет по логарифмической кривой (рис. 1).

В это время гриб обладал максимальной удельной скоростью роста, с 10 по 16 сутки она снижалась до нуля, а затем принимала отрицательные значения. Появление спор отмечалось на

3-5-е сутки роста

0 2 4 6 8 10 12 14 16 я „

гриба. Резкое уси-

Рис. 1. Изменение логарифма биомассы (I) и спо- ление спорулирую-руляции (II) гриба S. nodorum Berk, (изолят 78 Д) при способности

выращивании его в чистой культуре патогена происхо-

дило на 7-е, а достижение максимума - на 10-е сутки. Увеличение продолжи-

тельности выращивания гриба до 14 суток, как правило, приводило к снижению количества спор.

Таким образом, рост гриба S. nodorum Berk, при культивировании его на плотной питательной среде подчиняется законам роста простой периодической культуры (Перт, 1978). Полученные при этом показатели удельной скорости роста (2,0-2,2% • ч'1) позволяют отнести данный гриб к числу медленнорастущих патогенов.

Выращивание гриба на средах с различными ростовыми факторами по Холлидею (Захаров и др., 1980) показало, что достаточно активный рост гриба наблюдается во всех вариантах опыта. Диаметр колоний колебался в зависимости от состава среды и изолята в пределах от 29,5 до 67,5 мм. Наиболее интенсивная споруляция гриба наблюдалась на средах, содержащих такие компоненты, как аденин, гипоксантин, другие пуриновые и пиримидиновые основания и ряд аминокислот, в том числе глицин и лейцин.

Таблица 1. Влияние состава питательной среды на рост и споруляцию гриба S nodorum Berk.

И з о л я т ы

Среда 538 Б 72 Г

Диаметр Число Диаметр Число спор,

колоний, спор, колоний, шт.-Ю6

мм шт.-Ю6 мм

Ричардса без источника

азота + аспарагин 22-35 13,41 32-35 37,88

метионин 11-23 1,41 23-26 7,12

лизин 11-15 3,94 25-30 8,94

тирозин 12-20 11,34 30-34 6,75

треонин 11-13 10,78 14-16 5,00

глицин 24-30 51,56 31-44 53,72

изолейцин 16-18 4,69 23-32 11,44

гипоксантин 13-14 4,50 33-35 14,91

Чапека - Докса 20-33 4,87 17-25 12,00

Минимальная 19-23 12,19 26-33 31,31

Синтетическая 11-24 9,94 19-28 19,22

НСРо5=2,6 НСРо5=4,1

Sx= 5,2 % Sx= 5,1 %

Увеличение количества вносимых в среду аминокислот до 0,425 г/л по азоту, т.е. приравнивание их к 2 г аспарагина, позволило более четко решить вопрос об эффективности каждой аминокислоты и их взаимозаменяемости в качестве источника азота. Было выяснено, что наибольшую спорулирующую способность изоляты гриба S. nodorum Berk, проявляют при введении в среду глицина (табл. 1). Эффективность аспарагина была в 1,4 (изолят 72 Г) и в 4 раза (изолят 538 Б) ниже. Влияние таких аминокислот, как лизин, тирозин, треонин и изолейцин было еще слабее. Причем лизин и изолейцин усиливали споруля-цию только у изолята 72 Г, а тирозин и треонин - у 538 Б. Гипоксантин также оказывал стимулирующее действие на споруляцию одного из изолятов, а именно изолята 72 Г, однако и он уступал по эффективности глицину и аспарагину. Споруляция обоих изолятов S. nodorum Berk, на средах Чапека-Докса, минимальной и синтетической (Krüger, Hoffinann, 1978) была значительно ниже.

Естественно, что изучение роли источника углерода и его концентрации на споруляцию гриба проводилось с использованием именно глициновой среды. Нами установлено, что S. nodorum Berk, может эффективно использовать в качестве источника углерода не только глюкозу (или сахарозу, как в среде Чапека-Докса), но и галактозу и раффинозу. Однако споруляция гриба в случае замены глюкозы в среде на данные углеводы при концентрации 5 г/л снижалась на 26,5-29,5 %. Преимущество глюкозы, как видно из табл. 2, сохранялось и при использовании более высоких концентраций (15,20 и 25 г/л).

Таблица 2. Влияние источников углерода и их концентрации на споруляцию изолята 25 Д гриба 5. nodorum Вегк.(шт.106)

Источники углерода Концентрация, г/л Средние по углеводу

5,0 15,0 20,0 25,0

Глюкоза 77,74 146,92 95,87 97,63 104,50

Галактоза 57,20 95,83 78,69 41,04 68,20

Раффиноза 54,85 55,67 40,28 44,13 48,70

Средние по

концентрации, 63,30 99,50 71,60 60,90

НСРо5 = 10,2 Sx= 6,6% НСРо5 = 8,17

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее эффективным источником азота для роста и споруляции S. nodorum Berk, в синтетических или полусинтетических средах является глицин. Установлено, что глюкоза в качестве источника углерода в отличие от данных, полученных Ри-чардсом (Richards, 1951), на изученных изолятах S. nodorum Berk в 1,5 раза эф-

фективнее галактозы. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает.

3.2. Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk, и пато-гениость. В отношении возбудителя септориоза вопрос о физиологической специализации и наличии рас до сих пор еще не решен. Имеющиеся на сегодня данные, с одной стороны, говорят о существовании определенной взаимосвязи между сортами пшеницы и изолятами S. nodorum Berk. (AUingham, Jackson, 1981), а с другой, напротив, не позволяют разделить штаммы гриба на физиологические расы и биотипы (Kristiansson, 1974; Griffiths, Ао, 1980; Brönnimann, 1968; Rufty et al., 1981).

Учитывая важность дифференциации S. nodorum Berk по патогенности, были поставлены эксперименты, в которых исследовали физиологическую специализацию 25 изолятов гриба с использованием 12 различных сортов пшеницы. Причем опыты ставили не только в теплице, но и в полевых условиях. Установлено, что все отобранные изоляты S. nodorum Berk, в условиях теплицы, проявляют высокую патогенность на сортах пшеницы. Степень поражения растений колебалась от 24,1 до 89,5%. Различия в средних значениях патогенности у изолятов S. nodorum Berk, на наборе сортов практически не были обнаружены ни в одном из опытов.

В полевых условиях, напротив, наблюдалась вполне определенная дифференциация изолятов по пагогенности. Наиболее высокопатогенными на наборе сортов в целом проявили себя изоляты 176 Е (47,9%), 538 Б (48,8%), 83-30 (49, 1%), 101 Д (50,8%) и 810 В (57,2%). Изоляты 25 Д, 143 Г, 71 Е и 154 Г поражали сорта пшеницы в среднем на 23,3-34,7%. Различия между изолятами наблюдались и на отдельных сортах.

Таким образом, проведенные исследования показали, что все испытанные изоляты S. nodorum Berk., различающиеся по происхождению и морфолого-культуральным признакам, обладают потенциально высокой патогенностью и вирулентностью, проявление которых во многом определяется климатическими факторами в период от инокуляции растений до обнаружения болезни. В жёстких полевых условиях юга Казахстана (высокая температура, низкая относительная влажность воздуха и т.д.) степень поражения растений снижалась, при этом четче прослеживались различия в патогенности между изолятами как на Наборе сортов, так и на каждом их них в отдельности. В более оптимальных для заражения растений условиях теплицы патогенность всех изолятов значительно повышалась, а различия между ними, напротив, сглаживались.

Ученые Западной Андалузии на основании своих наблюдений пришли к выводу, что физиологическая, межвидовая и внутривидовая специализация у S tritici и S. nodorum вообще отсутствует (Marin, Aguirre, 1986). А устойчивость,

обнаруживаемая у некоторых сортообразцов к S. nodorum и S. tritici, по мнению авторов, является неспецифической. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что S. nodorum Berk, действительно если и обладает, то обладает слабо выраженной физиологической специализацией.

Глава 4. Мутационная изменчивость н патогенность гриба

Septoria nodorum Berk.

Для дейтеромицетов мутационная изменчивость является одним из основных факторов эволюции. Именно она обусловливает появление в природе большого количества новых биотипов, рас и форм грибов, различающихся мор-фолого-культуральными, физиологическими и биохимическими признаками (Левитин, 1977, 1983, 1986; Мацкевич, 1981). Не исключено, что подобный спонтанный формообразовательный процесс идет и в популяции S. nodorum Berk.

4.1. Морфолого-культуральные особенности и патогенность мутантов гриба S. nodorum Berk. Проведённые эксперименты показали, что размах изменчивости S nodorum Berk, под влиянием УФ-лучей определяется в основном природой изолята, а не дозой (продолжительностью) облучения. Наибольшее количество морфологически изменённых вариантов было получено у изолятов 83-30 (11) и 259 Г (12). По 7 - 8 мутантов было выявлено у изолятов 390 Е, 154 Г, 25 Д и 83-150 , а у изолятов 323 Е, 83-6 - всего 2 и 3 мутанта соответственно.

Характерной особенностью большинства обнаруженных мутантов является их лабильность, неустойчивость. Стабильные мутанты удалось получить только из изолятов 390 Е, 25 Д, 83-150 и 154 Г. Все они, за исключением телесно-светло-коричневого карлика, проявляли более высокую патогенность, чем исходные изоляты. Так, степень поражения листьев у пшеницы сорта Артур 71 при инокуляции её изолятом 390 Е была 43,5%, а его мутантом - 90%. Изоляты 83-150 и 154 Г поражали листья на 53,8 и 49,6%, а их черно-зелёный и серо-оливковый мутанты- на 90,0 и 78,6% соответственно. Патогенность изолята 25 Д (58,8%) и его мутанта (51,2%) была практически одинаковой.

При облучении спор изолята 85-254 УФ-светом нами было выделено семь морфологических типов или форм. Причем в большинстве случаев доминировал оливково-песочный вариант, характерный для исходной формы изолята 85-254. За ним следовали оливково-песочный с розовым ободком (18,5-50,0%) и черный (15,4-30,5%) варианты. На долю болотно-оливковых, горчично-оливковых, серо-черных и темно-розовых вариантов приходилось всего по 0,78,5%.

При обработке суспензии спор НММ в рассевах полностью отсутствовали розовато-телесные, розовато-лиловые и оливковые гладкие с розовым ободком варианты. На фоне же основных оливково-песочных колоний резко выделялись оливково-черные (37,7-48,5%). Отмечено появление одиночных мышино-серых (2,6-3,5%) и горчичных (1,9-3,4%) колоний. Обработка споровой суспензии НГ приводила к появлению значительно большего количества морфологически измененных вариантов с самыми различными цветовыми оттенками, которые чаще всего формировали колонии складчатого типа, приподнятые над поверхностью среды на 0,5-1,0 см.

Всего из изолята 85-254 S. nodorum Berk, с помощью физического (УФ-лучи) и химических (НММ, НГ) мутагенов получено 28 мутантов (Кобыльский, Герцог, 1991). Установлено, что большинство мутантов являются активно спо-рулирующими. Наиболее сильная споруляция отмечена у мутантов 85-254/5, 85-254/15, 85-254/21 и 85-254/27 (от МО6 до 4-Ю6).

Из числа мутантов, характеризующихся относительно стабильными свойствами, были сформированы две основные группы, представляющие несомненный интерес для дальнейших исследований. Это слабопатогенные (85-254/2, 85-254/8, 85-254/13) и высокопатогенные (85-254/15, 85-254/23 и 85-254/27) мутанты. Стабильность отобранных мутантов была подтверждена в экспериментах не только с восприимчивым (Саратовская 29) но и с относительно устойчивым к септориозу (Castan) сортом пшеницы. Слабопатогенные мутанты не вызывали образования на листьях сорта Castan характерных для заболевания пятен (табл. 3). Высокопатогенные штаммы поражали и этот сорт, однако, степень поражения листьев была ниже, чем у сорта Саратовская 29, особенно при использовании мутанта 85-254/23.

Таким образом, всего в результате экспериментов получено свыше 30 мутантов S. nodorum Berk.. Для изучения физиолого-биохимической природы патогенности были отобраны шесть, три из которых (85-254/2, 85-254/8, 85254/13) обладают слабой (степень поражения пшеницы Саратовская 29 - 4,59,8%) и три (85-254/15, 85-254/23, 85-254/27) - высокой патогенностью (степень поражения этого же сорта - 63,0-82,0%).

4.2. Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования. Патогенность испытанных мутантных форм S. nodorum Berk, при всех значениях температуры и продолжительности влажной камеры, за редким исключением, была выше, чем у исходных природных штаммов гриба (рис. 2). Наиболее четкие различия в патогенности проявлялись при температуре 6°С и 24-час. продолжительности влажной камеры, т.е. в более экстремальных условиях.

Прорастание пикноспор и рост гиф при температуре 6°С у природных

Таблица 3. Патогенность мутантов S. nodorum Berk, на восприимчивом и относительно устойчивом к септориозу сортах пшеницы

Мутант Степень поражения, %

Саратовская 29 Castan

1-го листа 2-го листа 1-го листа 2-го листа

Слабопатогенные

85-254/2 9,8+0,7 1,0±0,03 Одиночные пятна Одиночные пятна

85-254/8 4,5+0,06 1,0±0,01 Пятен не выявлено Пятен не выявлено

85-254/13 5,2+0,7 0,8+0,06 Пятен не выявлено Пятен не выявлено

Высокопатогенные

85-254/15 82,0+4,5 63,0±1,6 40,2+2,1 10,0+0,06

85-254/23 63,0+3,7 30,0+4,2 19,5+0,3 1,2+0,04

85-254/27 78,6+4,5 61,0+3,4 28,0+3,0 15,4+0,90

штаммов были подавлены, особенно у штамма 390 Е. С повышением температуры данные процессы активировались и достигали максимума при 20-30°С. У мутантов даже при низкой температуре прорастание пикноспор достигало 69,792,3 %. С повышением температуры оно возрастало на 7,7-17,6 %. Рост гиф у мутантов был также более интенсивным.

Высокая пластичность мутантов была обнаружена и при изучении зависимости прорастания пикноспор и роста гиф от рН среды (инфекционной капли). Показано, что у мутантов в отличие от природных штаммов прорастание спор идет активно и при низких значениях рН, поэтому подъема при рН выше 6,0 - 6,4 не наблюдалось. Рост гиф у мутантов гриба также был более активным, причем при всех значениях рН. Наиболее четкая картина получена на мутанте штамма 390 Е.

Проращивание спор гриба в растворах сахарозы, взятой в качестве осмо-тика, также показало определенные преимущества мутантов в сравнении с природными штаммами. Так, у мутанта, выделенного при УФ-облучении штамма 390 Е, прорастание спор при всех значениях концентрации сахарозы было выше и изменялось от 68,3 до 82,7 %. У штаммов 83-150 и 154 Г при концентрации сахарозы 0,9 и 1,0 М, что соответствует осмотическому давлению 30,4 и 35,2 атмосфер (Гродзинский, Гродзинский, 1973), прорастание спор уменьшалось в 2 - 3 раза, а у соответствующих мутантов оно оставалось без изменений.

100 -| 80 -60 -40 -20 -0

О4 0

п о 100 -|

о 80 -

и 60 -

н 40 -

аз м 20 -

се

а. 0 +

390 Е, 24 ч

-1-1-1-1-1-1

5 10 15 20 25 30

83-150,24 ч

100 80 60 ■ 40 -20 0

5 10 15 20 25

°С

-1

о4

sf х

SlOO -, ч

О 80 н ю

„ 60 Н

Н 40 н я

« 20 Н

со «

О,

390 Е, 48 ч

О 5 10 15 20 25 30

83-150,48 ч

— 10

—1— 15

°С

20 25 30

100 80 Н 60 40 20 Н О

154 Г, 24 ч

°С

—I-1-1-1-

О 5 10 15 20 25 30

100 80 -60 -40 -20 -О -

154 Г, 48 ч

°С

—I-1-1-1-1-1

О 5 10 15 20 25 30

НСР„,5 для частных средних = 23,5; Sx = 6,3%

Рис. 2. Патогенность природных изолятов S. nodorum Berk, и их мутантов в зависимости от условий инокуляции растений пшеницы

Условные обозначения: % » природный изолят, -о—о- мутант; 24 и 48 ч - продолжительность влажной камеры

Рост гиф у мутантов в данных опытах также был выше, чем у природных штаммов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что мутанты, выделенные из рассевов УФ-облученной споровой суспензии гриба S. nodorum Berk., отличаются по ряду показателей от исходных природных штаммов. В частности, пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6-3 0°С, они более приспособлены к изменению pH среды, устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности, по-видимому, способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды.

Глава 5. Пектолитические и целлюлолитические ферменты гриба

Septoria nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы

По имеющимся данным, внедрение проростковых трубочек S. tritici Rob. et Desm. в ткани растений в большинстве случаев идет через устьичную щель, реже - через клетки эпидермиса (Пересыпкин, Коваленко, 1981), a S. nodorum Berk. - непосредственно через периклинальные клеточные стенки эпидермиса (Karjalainen, Lounatmaa, 1986). В работе Zinkernagel a. Riess, (1987), выполненной также с применением электронного сканирующего микроскопа, признаков прямого проникновения S. nodorum Berk, в эпидермальные клетки обнаружить не удалось. Авторы, однако, не отрицают такую возможность, отводя определенную роль на этом этапе ферментам.

Действительно, трудно себе представить, что процесс внедрения S. nodorum Berk происходит без участия гидролаз. В связи с этим для нас представляло особый интерес исследовать роль пекто- и целлюлолитических ферментов как возможных факторов патогенности данного гриба.

5.1. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в процессе роста гриба S. nodorum Berk. в чистой культуре. Показано, что динамика активности пекто- и целлюлолитических ферментов тесно связана с процессами роста и развития S nodorum Berk, на КДА (Ахметов, Кобыльский, 1989). Установлено, что максимум активности изученных гидролаз приходится, в основном, на 5-7-е сутки, т.е. на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста и переходом гриба к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции (10-е сутки) сопровождалось снижением активности ферментов.

Анализ активности ферментов показал, что S. nodorum Berk, в процессе роста не только синтезирует (судя по изменению активности), но и усиленно секретирует пектолитические, целлюлолитические ферменты и ксиланазу в окружающую инкубационную среду.

5.2. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов и патогенность гриба S. nodorum Berk. Установлено, что высокая патогенность природных изолятов и мутантов (рис. 3) S. nodorum Berk., как правило, сопровождается и более высокой активностью ферментов. Корреляционный анализ, проведённый на основе полученных данных, подтвердил существование между патогенностью nodorum Berk, и активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов прямой зависимости. Особенно тесная связь обнаружена между патогенностью и активностью полигалактуроназы (г = 0,67), ß-глюкозидазы (г = 0,70) и Ci-целлюлазы (г = 0,66). В значительно меньшей степени патогенность зависела от Сх-целлюлазы (г = 0,34) и ксиланазы (г = 0,47).

Механизм проникновения патогена в ткани растений начинается, как известно, с процесса прорастания спор. Поэтому нас, естественно, интересовало различаются ли по ак-

целлюлолитических ферментов и ксиланазы у слабо - тивности ферментов (85-254/8) и высокопатогенного (85-254/15) мутантов покоящиеся споры, гриба S. nodorum Berk., культивируемых на жидкой выделенные из куль-среде Чапека (5 - суточная культура) туры природных изо-

лятов и мутантов 5.

nodorum Berk, и как изменяется активность пекто- и целлюлолитических ферментов на ранних этапах их прорастания.

В результате проведенных экспериментов установлено, что высокопатогенный природный изолят 176 Е значительно превосходит слабопатогенный изолят 25 ДЖ по активности Сх-целлюлазы и ксиланазы в покоящихся спорах, а также - полигалактуроназы, Ci-целлюлазы и ксиланазы у прорастающих спор. Прорастание пикноспор сопровождалось усиленной секрецией белка и фермен-

□ 85-254/8 ■ 85-254/15

Пг Сх -цел. С] -цел. ß-глю. Ксил. Рис. 3. Удельная активность пектолитических,

тов в среду инкубации. Однако и в этом случае при практически равной активности внеклеточных Ci - целлюлазы и ß - глюкозидазы более патогенный изо-лят 176 Е превосходил изолят 25 ДЖ по активности полигалактуроназы и кси-ланазы.

Близкие результаты при изучении динамики активности пекто- и целлю-лолитических ферментов в процессе прорастания спор были получены и у контрастных по патогенности мутантов (рис. 4). Показано, что у высокопатогенных мутантов активность полигалактуроназы, ß - глюкозидазы и Сх - целлюлазы также, как правило, выше активное™ данных ферментов, выделенных из спор или культуральной среды слабопатогенных мутантов. Подтверждение участия пекто- и целлюлолитических ферментов в самых ранних этапах инфекционного процесса и их связи с патогенностью возбудителей болезни можно найти и в работах с другими патогенами (Sudo et al., 1973; Davet, 1976; Verhoeff, 1978; Koller et al., 1982; Wattad et al., 1997; Dumas et al., 1998).

5.3. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в системе "растение-хозяин-патоген". Проведенные нами исследования показали (рис. 5), что высокопатогенный мутант в отличие от слабопатогенного на ранних этапах патогенеза (3-е суток) вызывает подавление в листьях восприимчивого сорта пшеницы Саратовская 29 активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, за исключением Сг целлюлазы. И только на 7-е сутки оба мутанта вызывали усиление активное™ полигалактуроназы, Сх- целлюлазы и ß-глюкозидазы , а на 10-е сутки - и Ср целлюлазы

На относительно устойчивом к септориозу сорте пшеницы Castan различия между высоко- и слабопатогенным мутантами были выражены менее чётко. Мутант 85-254/15 на ранних этапах патогенеза снижал, а мутант 85-254/8 не влиял на активность С г целлюлазы в листьях при практическом равенстве изменений в активности Сх-целлюлазы, ß-глюкозидазы и ксиланазы. Актавность полигалактуроназы при этом снижалась в листьях в 2,5 и 4,5 раза. На поздних этапах патогенеза при равенстве активности Сх- и Ci-целлюлазы, активность полигалактуроназы, ß-глюкозидазы и ксиланазы в листьях, инфицированных высокопатогенным мутантом, была соответственно в 3,0; 1,4 и 1,6 раза выше, чем в варианте со слабопатогенным мутантом.

Одним из критериев участия ферментов, продуцируемых патогенами, в механизме инфицирования растений является способность их при экзогенном применении вызывать у растений повреждения, характерные для самого возбудителя болезни. Так, обработка стеблей и листьев растений томатов частично очищенными пектанлиазой и полигалактуроназой V. albo-atrum приводит к проявлению симптомов заболевания, включая образование гелей в сосудах

11 3 1

Сх-цел. Ci-цел. -10 ß-глю. Ксиланаза

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

□ 85-254/2 ® 85-254/27'

III

I и II - соответственно "покоящиеся" и прорастающие в течение 20 ч споры III - среда прорастания

Сх-цел. Ci-цел. •103 ß -глю. Ксиланаза

Рис. 4. Удельная активность пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в спорах слабо- (85-254/2) и высокопатогенного (85254/27) мутантов гриба 5. nodorum Berk, и в среде их прорастания

Полигалактуроназа

ß - глюкозидаза

со

2 0,3

1 0,2 Н &

•в- 0,1 -л

5 (

о X

Сх - целлюлаза

Время после инокуляции, сут

Рис. 5. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в листьях восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29, инфицированных слабо-(85-254/8) и высокопатогенным (85-254/15) мутантами гриба S. nodorum Berk.

I—I - контроль Ж- 85-254/8 В- 85-254/15

(Cooper, Wood, 1980). По нашим данным, ферментные препараты, выделенные из мицелия 5. nodorum Berk, при нанесении их на листовую поверхность вызывали повреждения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаС12, способного ингибировать активность эндо- и экзополигалактуроназы грибов V. albo-atrum и F. oxysporum f. sp. lycopersici (Cooper, Rankin, 1978; Buescher, Hobson, 1982), не только подавляла действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижала степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

Всё это позволяет высказать предположение о преимущественно энзима-тическом пути проникновения гриба S. nodorum Berk, в ткани растения-хозяина и о большой роли пекто- и целлюлолитических ферментов в процессе патогенеза в целом.

Глава 6. Изоферменты некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба Septoria nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы

В микологии и фитопатологии изоферменты широко используются в качестве высокочувствительных биохимических маркеров при исследовании расового состава, структуры популяций и изменчивости различных фитопатоген-ных грибов (Николаева и др., 1972; Супрун и др., 1986; Можина и др., 1986; Терехова, 1988; Терехова, Рочев, 1989; Терехова и др., 1991; Дьяков, 1998).

В задачи наших исследований входило: изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S. nodorum Berk., а также в системе "растение-хозяин-патоген".

6.1. Полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk Исследования показали, что количество белковых зон в электрофоретическом спектре гриба варьирует от 22 до 47 в зависимости от изолята. Полосы имели Rf в пределах от 0,01 до 0,97. Коэффициент сходства между изолятами колебался в пределах 34,0-78,6%.

Белковый препарат, выделенный из природных изолятов S. nodorum Berk., содержал от 11 до 21 изоферментов эстеразы, от 2 до 5 - пероксидазы и от 3 до 8 изоферментов ß-глюкозидазы. Изоляты гриба в значительной мере различались между собой по спектрам изоферментов.

Сравнительное изучение изоферментного состава у некоторых природных изолятов S. nodorum Berk, и полученных на их основе мутантов показало, что электрофоретический спектр эстеразы наиболее значительным числом зон

представлен у изолята 154 Г (22 зоны) и его мутанта (23 зоны). И у изолята, и у мутанта были обнаружены свои специфические зоны ферментативной активности: пять зон у изолята 154 Г и пять - у мутанта (Rf 0,25-0,26; 0,37-0,38; 0,740,75; 0,86 и 0,95). В спектрах кислой фосфатазы были обнаружены 2 специфические зоны у изолята 83-150 и 4 - у мутанта (с Rf 0,05-0,06; 0,22 и Rf 0,09; 0,39-0,41; 0,52-0,54; 0,84 соответственно), а также 1 - у изолята 85-262 и 3 зоны у его мутанта.

Учитывая более высокую патогенность мутантов можно предположить, что по крайней мере некоторые из обнаруженных у них изоферментов могут выполнять функции маркеров патогенности.

6.2. Активность некоторых гидролаз и оксидоредуктаз, изоферменты и патогенность гриба S. nodorum Berk. В ходе исследований у мутантов, выделенных из изолята 85-254 S nodorum Berk, было выявлено от 9 до 18 изоферментов эстеразы, от 5 до 12 изоферментов ß-глюкозидазы, 2-3 - кислой фосфатазы и от 1 до 4 изоферментов пероксидазы. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), ß-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) было обнаружено у высокопатогенных мутантов. Возможно это связано с тем, что в целом все высокопатогенные мутанты, помимо пекто- и целлюлолитических ферментов, характеризуются повышенной активностью пероксидазы. Существование связи между патогенностью и полиморфизмом белков и ферментов подтверждают и данные, полученные при исследовании рас 1 и 2 F oxisporum f sp spinaciae, различающихся по патогенности (Madhos-ingh, 1980) Подобные данные были получены и нами при исследовании мутантов F graminearum и F. sporotrichiella (Кобыльский и др., 1991). Наибольшее число изоферментов эстеразы (17) в спектре также было отмечено у высокопатогенного мутанта 760/6 F. sporotrichiella

Споры S nodorum Berk., как выяснилось в дальнейших исследованиях, помимо пекто- и целлюлолитических ферментов, обладают достаточно высокой активностью ряда других гидролаз. Так, удельная активность эстеразы у покоящихся спор природных изолятов S nodorum Berk, колебалась от 0,7 до 3,87 мкМ/мг белка, кислой фосфатазы - от 0,19 до 0,85, ß-глюкозидазы - от 0,08 до 1,35 мкМ/мг белка, РНК-азы - от 2,30 до 4,56 усл. ед./мг белка. Показано, что пикноспоры слабопатогенного изолята 25 Д обладают минимальной активностью практически всех изученных ферментов Для изолята 147 Е, напротив, была характерна высокая активность изученных гидролаз, особенно кислой фосфатазы, ß-глюкозидазы и РНК-азы. При прорастании спор изолята 25 Д активность РНК-азы возрастала в 1,2 раза. Активность кислой фосфатазы у слабопатогенного мутанта при этом усиливалась в 2,0 раза, а у высокопатогенных мутантов - в 2,5 - 13,5 раз.

Процесс прорастания спор дейтеромицетов, кроме того, сопровождается изменениями и в составе изоферментов. Так, в изоферментном спектре РНК-аз Aspergillus clavatus найден стадиоспецифичный фермент, который присутствовал в покоящихся конидиях и исчезал при прорастании (Иванова, Полякова, 1982). Прорастание спор S. nodorum Berk, по нашим данным, также было тесно связано с изменениями в изоферментных спектрах. В частности, в эстеразном спектре спорового материала мутантов (рис. 6) обнаружено 12-15 (покоящиеся споры) и 10-16 зон активности (прорастающие споры). Следует отметить, что наименьшее число изоферментов в спектре (12 - у покоящихся спор; 10-у прорастающих) было обнаружено у слабопатогенного мутанта, тогда как у высокопатогенных мутантов число изоферментов эстеразы колебалось от 14 до 15 у покоящихся и от 13 до 14-у проростающих спор. Обращает на себя внимание то, что у высокопатогенных мутантов индивидуальных линий в спектре и покоящихся, и прорастающих спор было больше.

85-254 85-254/2 85-254/15 85-254/23 85-254/27

I II I II I II I II I II

Рис. 6. Изоферментные спектры эстеразы у покоящихся (I) и прорастающих (П) спор природного изолята 85-254 гриба 5. поск>гит Вегк. и его мутантов

Изозимный спектр пероксидазы у мутантов был значительно беднее эсте-разного и содержал от 2 до 4 изоферментов. Причем максимальное число изоферментов у покоящихся (3) и прорастающих (4) спор было обнаружено также у высокопатогенных мутантов.

Изменения в составе изоферментов в процессе прорастания спор S. nodorum Berk., по-видимому, свидетельствуют не только об усилении или ос-

лаблении активности соответствующих ферментов, но и о избирательной секреции некоторых изоферментов из прорастающих спор в инкубационную среДУ-

6.3. Изменение активности и изоферментного спектра кислой фосфа-тазы, ß-глюкозидазы и пероксидазы в системе "растение-хозяин-патоген".

Инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 сопровождалось снижением на 47,7-55,3% активности ß-глюкозидазы на ранних этапах и усилением её активности в 2,7-3,2 раза на более поздних этапах патогенеза. Активность пероксидазы при этом значительно возрастала на всём протяжении опыта, особенно при инфицировании спорами высокопатогенного мутанта S nodorum Berk. Отмечены различия в действии слабо- и высокопатогенного мутантов гриба и на активность кислой фосфата-зы.

На относительно устойчивом к септориозу сорте пшеницы Castan высокопатогенный мутант 85-254/15 в отличие от слабопатогенного 85-254/8 не влиял на активность ß-глюкозидазы и оказывал более значительное стимулирующее воздействие на активность пероксидазы. По характеру действия на кислую фосфатазу слабо- и высокопатогенные мутанты S. nodorum Berk были близки друг к другу.

Инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 S. nodorum Berk., приводило к изменениям и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и окси-доредуктаз. Однако и в данном случае влияние высокопатогенного мутанта было более значительным особенно в отношении ß-глюкозидазы (число изоферментов уже через 7 суток вместо 2 достигало 4) и эстеразы. На сорте Castan существенных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов на изоферментный спектр ß-глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы не было выявлено. В то же время высокопатогенный мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12-0,15. Кроме того, под влиянием мутанта повышалась активность некоторых из изоферментов.

Г л а в а 7. Фитотоксины гриба Septana nodorum Berk, и их роль

в патогенезе септорноза пшеницы

У некоторых фитопатогенных грибов между патогенностью и способностью их к синтезу токсинов обнаружена корреляция и, кроме того, показана высокая специфичность токсинов к растению-хозяину (Йодер, 1984; Пегг, 1984; Дейли, 1985). В связи с этим представляет интерес изучение токсинообразова-ния и у возбудителей септориоза пшеницы, которые, как следует из ряда работ

французских исследователей (Bousquet, SkajennikofF, 1974; Devys et al., 1980; Bousquet et al., 1980; Devys et al., 1980), также способны синтезировать фито-токсичные метаболиты. Им удалось обнаружить и выделить такие вещества, как охрацин, септорин, некоторые производные дигидроизокумарина и др. Однако до сих пор многие вопросы, связанные с продуцированием токсинов и их ролью у S. nodorum Berk., остаются еще не выясненными.

7.1. Выделение, очистка и идентификация фитотоксинов гриба S. nodo-rum Berk. В результате проведенных нами экспериментов установлено, что S nodorum Berk в процессе роста на жидкой питательной среде Фриза синтезирует вещества, способные оказывать ингибирующее действие на рост корней и колеоптилей пшеницы. Выделенные из мицелиальной массы и среды культивирования различных изолятов S. nodorum Berk, фитотоксины (ФТ) в значительной степени различались между собой по окраске в видимом и флуоресценции в УФ-свете, величине Rf для трёх систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограмм проявляющими реагентами и УФ-спектрам поглощения.

Анализ полученных характеристик позволил отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину - веществу изокумариновой природы, дающему вишнёвую окраску с FeCl3 (Devys et al., 1974), a ФТ-3 - к одному из его производных. Среди выделенных веществ два (ФТ-1 и ФТ-2) имели лимонно-жёлтую окраску в видимом свете и абсорбировали в УФ-свете, а также проявлялись под действием хлорного железа, то есть вели себя подобно септорину, второму из фитотоксинов возбудителя септориоза (Bousquet et al., 1980).

С помощью жидкостной хроматографии высокого давления достигнуто чёткое разделение всех фитотоксинов. Одновременно оказалось возможным определить вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34) и микофеноловую кислоту, которая ранее была обнаружена в культуральной среде S. nodorum Berk. (Devys et al., 1980).

Для выделения и наработки фитотоксинов на основе полученных данных была составлена схема, позволяющая препаративно получать все 5 фитотоксинов из культуры гриба S. nodorum Berk. (рис. 7). Кроме того, разработаны "Методика определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" (Кобыльский, Бочарова, 1999) и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба S nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления" (Кобыльский и др., 1999).

7.2. Зависимость токсинообразования от условий культивирования гриба S. nodorum Berk. Установлено, что гриб S nodorum Berk, в течение 14 суток способен продуцировать весь комплекс фитотоксинов. Однако их количество в значительной мере зависит от условий выращивания. Так, в культу-

Культуральная жидкость

Довести 20% К'аОН до рН 6,0; трижды проэкстра-_' гировать равным объемом этилацетата

Этилацетатный экстракт

Выпарить под вакуумом при температуре +46 °С

Маслянистый осадок

Растворить в минимальном объеме этилацетата; очистить на колонке с сухим силикагелем, элюент-этил-ацетат

Рис. 7. Схема препаративного выделения фитотоксинов гриба 5 nodorum Berk.

ральной среде все 5 фитотоксинов были обнаружены только при культивировании гриба на жидкой среде Фриза в камере искусственного климата. В мицелии весь комплекс фитотоксинов зафиксирован при выращивании гриба в термостате как на жидкой, так и на агаризованной среде Фриза, а также - в условиях освещённости на КДА.

7.3, Фитотоксины и патогенность гриба S. nodorum Berk. Показано, что высокопатогенные природные изоляты 101 Д, 176 Е и 538 Б гриба S nodorum Berk отличаются повышенной способностью к продуцированию (рис. 7.4) и секреции (рис. 7.5) фитотоксинов. Изоляты 25 ДЖ и 143 Г, обладающие слабой патогенностью, уступали им и по способности к синтезу фитотоксинов.

Высокопатогенные мутанты по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксинов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) также превалировали (за некоторыми исключениями) над слабопатогенными мутантами. По литературным данным, наличие чёткой корреляции между образованием токсина и патогенностью обнаружено при изучении изолятов Ceratocystis ulmi - телеоморфы гриба Graphium ulmi Schwarz (Takai et al., 1983). Предполагается, что патогенность Cochliobolus victoriae - телеоморфы гриба Helminthosporium victoriae также обусловлена токсином, а именно викторином (Wolpert et al., 1995).

Установлено, что споры гриба S. nodorum Berk., даже находящиеся в состоянии относительного покоя, обладают вполне определённым запасом фитотоксинов. С началом прорастания спор сишез (или предположительно высвобождение из связанного состояния) фитотоксинов и секреция их в инкубационную среду резко активизировались. Более патогенный изолят 176 Е в отличие от слабопатогенного 25 Д характеризовался полным набором фитотоксинов в покоящихся спорах, более активным синтезом и высоким содержанием ФТ-5 в прорастающих спорах, а также более активной секрецией и накоплением ФТ-5 и сер. 0,34 в среде. Суммарное содержание (прорастающие споры + среда) фитотоксинов ФТ-5 и сер. 0,34 у изолята 176 Е было в 2,0 и 1,6 раза соответственно выше, чем у изолята 25 Д. Преимущество высокопатогенных штаммов гриба S. nodorum Berk, в синтезе и секреции фитотоксинов на ранних этапах прорастания спор было подтверждено и в экспериментах с мутантами, различающимися по патогенности.

7.4. фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина. Из всех испытанных фитотоксинов наиболее сильное ингибирующее действие на рост корней и колеоптилей пшеницы Саратовская 29 оказывали ФТ-4 и ФТ-5. Подавление роста корней наблюдалось уже при концентрации 50 мг/л и резко усиливалось с увеличением

¡□143 Г |И25Д ; 0 176 El В101 Д i &538Б

ФТ-1

ФТ-2

ФТ-3

ФТ-4

Г*!«-

ФТ-5

1,2 л

1,0 -0,8

0,6 -

0,4 -

0,2 ■ 0,0

сер.0,34

Микофеноловая кислота

Рис. 8. Содержание фитотоксинов (ФТ) в мицелии слабо-(143 Г, 25 Д) и высокопатогенных (176 Е, 101 Д, 538 Б) природных изолятов гриба S. nodorum Berk.

9 i 8 -

b 7"

i 6-1 а

2 5i

>> »

u 4

s j

i 2

üi 1 н

!D 143 Г 025 Д | И 176 E E3101 Д , |Ш538 Б '

ФТ-1

ФТ-2

ФТ-3

ФТ-4

7 -I

6 -

5 -

4 -

3 -

ФТ-5

11 Ьяя

сер.0,34

Микофеноловая кислота

Рис. 9. Содержание фитотоксинов (ФТ) в среде культивирования сла-бо-(143 Г, 25 Д) и высокопатогенных (176 Е, 101 Д, 538 Б) природных изоля-тов гриба S. nodorum Berk.

концентрации. Подобное действие фитотоксин ФТ-5 оказывал и на рост коле-оптилей

Все фитотоксины, за исключением ФТ-1, проявляли ингибирующий эффект как на восприимчивых, так и на относительно устойчивых к септориозу сортах пшеницы, а также на ячмене и рисе. Кроме того было показано, что фитотоксины при нанесении их на изолированные листья или интактные растения пшеницы не способны вызывать внешние видимые симптомы поражения, ха-рактериные для септориоза. Все это говорит о том, что фитотоксины S. nodorum Berk не обладают специфичностью действия в отношении растения-хозяина.

Вместе с тем было установлено (рис. 10), что фитотоксины, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5, при добавлении их в споровую суспензию повышают степень поражения первого листа инокулированных растений пшеницы на 34,9, 42,3 и 31,2% соответственно (степень поражения в контроле - 46,4%), а при поступлении через проводящие сосуды - влияют на транспирацию и водный обмен. В связи с чем можно предположить, что фитотоксины гриба S nodorum Berk действуют непосредственно на мембраны клеток и тем самым способствуют развитию септориоза на листьях пшеницы. О том, что такое предположение оправдано, говорят данные, полученные в нашей лаборатории аспирантом

о4

я в

СП U t? О

ю и S

£3 а,

100 -| 90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0 --

1-й лист

2-й лист

I I-г

Рис. 10. Влияние фитотоксинов при совместном их применении с инокулюмом гриба S. nodorum Berk, на степень поражения растений пшеницы Саратовская 29 септориозом

□ - Инокулюм ШЖ - Инокулюм+ФТ-1 Е2Я - Инокулюм+ФТ-2 9Ш - Инокулюм+ФТ-3 Ш - Инокулюм+ФТ-4 ESS - Инокулюм+ФТ-5

E.B. Бочаровой (1992). В опытах с дисками из тканей свежей свёклы Beta vulgaris было показано, что наиболее значительное влияние на проницаемость клеточных мембран оказывают фитотоксины ФТ-1 и ФТ-2, под действием которых выход антоцианов в раствор усиливался в 4,7-3,7 раза по сравнению с контролем.

Глава 8. Фитогормоны как возможные факторы патогенности

гриба Septoria nodorum Berk.

К началу нашей работы над данным вопросом сведения о роли фитогор-монов в процессах патогенеза различных болезней растений были весьма ограничены (Tapp, 1975; Пегт, 1984; Косуге, Комаи, 1985), а по септориозу вообще отсутствовали. Поэтому, в первую очередь необходимо было, хотя бы на уровне биотеста, установить, могут ли возбудители септориоза и, в частности, S. nodorum Berk, продуцировать фитогормоны. И только на основе полученных данных решать задачи, относящиеся к анализу взаимосвязи между патогенно-стью S. nodorum Berk, и способностью гриба к синтезу ИУК.

8.1. Синтез фитогормонов в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре. Проведенные с применением биотеста исследования показали, что гриб при культивировании его на КДА способен продуцировать не только фитотоксины, но и фитогормоны, в частности, ИУК. Полученные данные были подтверждены с помощью современного инструментального метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, чю при культивировании природного изолята S. nodorum Berk, в чистой культуре уже через 3 суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК в культуре возрастало в 2,2 раза, а на 10-е, т.е. к моменту максимума спорогенеза, - в 4,5 раза и достигало величины 6,7 нг/г.

Одновременно с синтезом ИУК, наблюдалась активная секреция гормона в окружающую среду. Установлено, что в среде 3-суточной культуры природного изолята S. nodorum Berk, содержится 14,5 нг ИУК, что в 10 раз превышает уровень ее в мицелии. На 7-е сутки количество секретируемой ИУК увеличивалось в 1,4, а на 10-е - в 1,7 раза. По литературным данным (Vasjuk, Andrianova, 1994), максимальное содержание ИУК в культуре грибов р. Septoria составляет 933 нг/г сырой массы. Оно определяется видом гриба, природой изолята и, естественно, условиями культивирования патогена (Васюк и др., 1996).

8.2. Синтез ИУК и патогенность гриба S. nodorum Berk. На контрастных по патогенности мутантах экспериментально доказано, что между патоген-ностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость (рис. И,

12). Подобные данные были получены в работе с изолятами гриба р. Fusarium,, выделенными из семян кукурузы (Marika, 1980). Наиболее интересные данные, подтверждающие существование определенной связи между ИУК и вирулентностью, были зафиксированы на бактериях (Liu et al., 1982; Kosuge et al., 1985; КосугеКомаи, 1985).

Возраст культуры, сут

Рис. 11. Динамика содержания ИУК в мицелии слабо-(85-254/2, 85254/8,85-254/13) и высокопатогенных (85-254/15,85-254/23,85-254/27) мутантов гриба S. nodorum Berk, при выращивании их на жидкой среде Чапека

Установлено, что свежевыделенные из пикнид S. nodorum Berk, споры природного изолята содержат 16,6 нг ИУК на г сырой массы. Среди слабопатогенных, и среди высокопатогенных мутантов встречались формы как с повышенным, так и с пониженным содержанием ИУК. В среднем особых различий в количестве ИУК в "покоящихся" спорах мутантов, различающихся по патоген-ности, не обнаружено.

Через 20 часов прорастания спор ИУК присутствовала уже не только в самих прорастающих спорах, но и в инкубационной среде, в которой они находились это время. По суммарной ИУК (споры+среда) слабо- и высокопатогенные мутанты практически не отличались между собой. Однако в эти первые часы инкубации споры высокопатогенных мутантов (за исключением 85254/27) превосходили по содержанию ИУК споры слабопатогенных мутантов, значительно уступая им по секреции ИУК во внешнюю среду. Это говорит о том, что обратная корреляционная зависимость между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его как к cj

ИУК, обнару-•h

БИБЛИОТЕКА ,

СПетербург (

OS m m j

II I I.W. jf

женная у 3-, 7- и 10-суточной культуры патогена, у прорастающих спор действительна только лишь в отношении секреции ИУК из спор в культуральную среду.

120 -i 100 -80 -

к §60

s з

40 20

□ 85-254/2 ■ 85-254/27

О 85-254/8 Ш 85-254/15

О 85-254/13 Ш 85-254/23

>11

10 3 7 10

Возраст культуры, сут

Рис. 12. Динамика содержания ИУК в среде культивирования слабо -(85-254/2, 85-254/8, 85-254/13) и высокопатогенных (85-254/15, 85-254/23, 85254/27) мутантов гриба S, nodorum Berk

Интересно, что присутствие ИУК в спорах характерно и для биотрофных грибов. Так, значительные количества ИУК были обнаружены в уредоспорах стеблевой ржавчины (Умнов и др., 1978), при прорастании которых запасенный в них ауксин выделялся в культуральную среду (Умнов и др., 1984). Количество ИУК в уредоспорах, проросших спорах и среде, на которой прорастали споры, колебалось от 40 до 100 нг/г сырого веса (Wiese, Grambov, 1986).

8.3. Динамика содержания ИУК в системе "растение-хозяин-патоген". Изучение динамики содержания ИУК в листьях растений восприимчивого (Саратовская 29) и относительно устойчивого к септориозу (Castan) сортов пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk, дало возможность установить некоторые различия как между сортами пшеницы, так и между мутантами гриба S. nodorum Berk., используемыми в опытах. Показано, что инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 уже на третьи сутки приводит к повышению содержания ИУК в листьях на 13,6 (высокопатогенный) - 81,8% (слабопатогенный мутант). На 7-е и 10-е сутки после инокуляции количество ИУК в листьях возрастало в 1,5-2,5 и 1,6-3,2 раза соответственно (рис. 8.6). Причем наиболее сильные изменения в содержании ИУК наблюдались при инфицировании растений слабопатогенным мутантом.

I i i

Рис. 13. Динамика содержания ИУК в листьях восприимчивого ( Саратовская 29 ) и относительно устойчивого ( Castan ) к септориозу сортов пшеницы, инфицированных слабо-( 85-254/8 ) и высокопатогенным ( 85-254/15 ) мутантами гриба S. nodorum Berk.

На сорте Castan были получены менее четкие данные. На первом этапе г под влиянием инфекции наблюдалась тенденция к снижению количества ИУК в

листьях по отношению к контролю, на 7-е сутки был отмечен небольшой подъем, а к концу опыта содержание ИУК увеличивалось на 20,0-33,3% (рис. 13). * Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов S.

nodorum Berk, на синтез ИУК не было обнаружено. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными (Чкаников и др., 1990; Хайрулин и др., 1993).

8.4. Влияние экзогенных фитогормонов на прорастание спор, рост гиф и развитие септориоза у растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk. Известно, что ИУК, НУК, индол-3-масляная кислота, 2,4 Д и ки-нетин угнетают или замедляют прорастание спор Р. oryzae и формирование ап-прессориев при прямом контакте гриба с веществом (Kleiner, 1983).Высокие концентрации ИУК подавляли развитие Р. graminis f. sp. tritici (Grambov,

л о

'á S

8 -

а 7

о.

<и §

Саратовская 29 Т

6 5

4 -

Castan

'□контроль t | ЕЗ 85-254/8 1 '085-254/15

7 10 3 7

Время после инокуляции, сут.

Tücks, 1979), а пассирование F. culmorum на средах, содержащих этиленпроду-цент этрел, приводило к ингибированию мицелиального роста, споруляции и прорастания спор (Michniewicz, Rozej, 1991; Michniewicz, 1992).

Наши исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор, ингибирует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК и кинетин в концентрации 10-25 мкг/мл также подавляли рост гиф на 22,9-44,7 и 16,8-33,1% соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации этих гормонов, как и в варианте с ГК, не приводило к усилению эффекта. В случае с АБК слабый ингибирующий эффект проявлялся только при концентрации 50 мкг/мл. С увеличением концентрации АБК до 75 и 100 мкг/мл наблюдалось значительное подавление роста гиф S. nodorum Berk.

Экзогенные фитогормоны могут оказывать значительное воздействие на поражаемость растений различными болезнями (Митрофанов, Чекуров, 1983; Левин, 1984). Причем данный эффект не обязательно связан с непосредственным влиянием фитогормонов на патоген. В результате проведенных нами исследований установлено, что предобработка растений пшеницы сортов Крестьянка, Кутулукская (восприимчивые) и Castan (относительно устойчивый к сеп-ториозу) фитогормонами с последующим инфицированием их S nodorum Berk. снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона его концентрации и сорта пшеницы на 12,2-65,1%. Наибольший эффект наблюдался при обработке растений кинетином, за ним следовали ИУК, ГК и, наконец, АБК. Показано, что фитогормоны изменяют тип реакции сортов на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов на примере фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk, изучены некоторые биологические и биохимические особенности дейтеромицетов, которые могут непосредственно или опосредованно влиять на проявление ими патогенных свойств.

Установлено, что S. nodorum Berk, прекрасно растет как на природных, так и на сцнтетических питательных средах, не испытывает потребности в каких-либо специфических факторах роста, обладает слабо выраженной (широкой) физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. Все это способствует лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды и проявлению им высокой патогенности.

Показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и цел-люлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы и ß-глюкозидазы. Они превалируют над слабопатогенными штаммами по количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов, а также по количеству сек-ретируемых в инкубационную среду фитотоксинов. Между патогенностью гриба S nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Экспериментально даказано, что ферменты (прежде всего пекто- и цел-люлолитические), фитотоксины и ИУК, продуцируемые S. nodorum Berk, принимают непосредственное участие не только на начальных этапах инфицирования растений пшеницы, но и на протяжении всего процесса патогенеза септо-риоза вплоть до начала споруляции гриба и проявления на листьях видимых симптомов поражения. Все это дает основание к заключению, что исследованные нами ферменты, фитотоксины и фитогормоны действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk., хотя и выполняющими, по всей видимости, различные функции.

Можно предположить, что ферменты, естественно, выполняют, прежде всего, инвазивные функции, а ИУК и фитотоксины - регуляторные. Действительно, ферменты, как известно, непосредственно участвуют в разрушении кутикулы (кутиназа, неспецифические эстеразы), а также в деполимеризации, гидролизе полисахаридов клеточных стенок (полигалактуроназа, ß-глюкозидаза, Сг и Сх-целлюлазы, ксиланаза). ИУК является основным элементом в системе гормональной регуляции у растений (Полевой, 1986), а фитотоксины, по литературным данным, участвуют в системе мембранной регуляции. Они оказывают значительное влияние на проницаемость мембран (Лялин и др., 1980), окислительное фосфорилирование (Bousquet et al., 1980) и работу устьиц (Bousquet et al., 1976).

Обобщая собственные экспериментальные и литературные данные, можно предложить следующую гипотетическую схему взаимодействия гриба S. nodorum Berk и растения-хозяина (рис. 14). Споры гриба S. nodorum Berk, оседают на поверхность листьев растений, закрепляются с помощью комплекса веществ, в том числе гликопротеинов, входящих в состав слизи, и при соответствующих условиях влажности и температуры начинают прорастать.

Прорастание спор сопровождается активным синтезом и секрецией из спор в инфекционную каплю гидролитических ферментов, фитотоксинов и фи-тогормонов, в частности, ИУК. Находящиеся в составе ферментов кутиназа и неспецефические эстеразы разрушают кутикулу. Затем ИУК локально проникает через эпидермис растения-хозяина и включает мембранный механизм дейст-

Факторы патоген-ности

Контролируемая реакция

Этап патогенеза

Ферменты

Фитотоксины

Фитогормоны (ИУК)

Разрушение кутикулы

Взаимодейтсвие с рецептором,

активация Са2+- канала и работы

ГГ-АТФазы X

Закисление за счет ЬГ клеточных стенок, вытеснение из них Са2+ и активация пекто- и целлюлолити-_ческих ферментов_

Модификация клеточных стенок

Гидролиз полисахараридов и локальное разрушение клеточных стенок

Внедрение патогена

*1 Блокирование работы устьиц

Нарушение или прекращение биосинтеза АТФ

Изменение проницаемости плазматических мембран

Подавление механизма защиты растений

Сдвиг в гормональном балансе \-

Усиление активности пекто-и целлюлолитических ферментов _и других гидролаз_

Изменение метаболизма растения-хозяина и создание благоприятных условий яття пятпгеия

Распространение патогена по тканям растений

Разрушение клеточных стенок и перегородок, переход патогена из зараженной клетки в незараженную

Рис 14. Схема взаимодействия S. nodorum Berk с растениями пшеницы на ранних этапах патогенеза

вия ауксина на растительные клетки (Полевой, 1986; Шишова, 1999). В результате работы данного механизма активируется Са2+ -канал и работа Н'-АТФазы, что в конечном счете приводит к закислению за счет ионов Н~ клеточных стенок, вытеснению из них Са2+ и активации ферментов. Последнее приводит к разрыхлению и размягчению клеточных стенок, что делает их более уязвимыми со стороны пекто- и целлюлолитических ферментов гриба. Наблюдающееся затем локальное разрушение клеточных стенок обеспечивает проникновение ростковых трубок S. nodorum Berk, внутрь клетки. Одновременно через образовавшиеся отверствия в клетку попадают и фитотоксины, которые, как известно, самостоятельно не могут проникать в ткани растений.

Представленная схема разработана для случая активного проникновения патогена через клеточные стенки обычных эпидермальных клеток в ткани растений с помощью пекто- и целлюлолитических ферментов. Особенно она, по-видимому, применима для так называемых пузыревидных клеток (клеток растяжения), которые характерны для эпидермиса злаков и других однодольных (Эсау, 1969). По данной схеме, на наш взгляд, может происходить заражение и перезаражение клеток растения-хозяина патогеном и в случае первичного его проникновения не через клеточные стенки эпидермиса, а через устьица.

Из приведенной схемы видно, что основная роль фитотоксинов, если учесть их свойства, описанные выше, сводится к подавлению защитных механизмов растения-хозяина, то есть - обеспечению второго этапа патогенеза.

В дальнейшем (7-е и 10-е сутки) лидирующие позиции снова занимают фитогормоны и ферменты. К этому моменту в листьях растения-хозяина (восприимчивый сорт) значительно возрастает содержание ИУК и повышается активность пекто- и целлюлолитических ферментов, а возможно, и других гидро-лаз. Если учесть, что грибы р. Septoria способны к продуцированию и цитоки-нинов (Васюк и др., 1996), то тем самым создаются все необходимые предпосылки к изменению метаболизма растения-хозяина и обеспечению оптимальных для роста и развития патогена условий.

Распространение патогена по тканям растения-хозяина обеспечивается, на наш взгляд, тем же ферментативно-гормональным механизмом, который используется при первичном внедрении гриба. С той лишь разницей, что при перемещении гиф межклетно (без захода в клетку) вполне достаточно, по-видимому, одного ферментативного аппарата.

Представленная схема или модель взаимодействия возбудителя септорио-за - гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы на уровне пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК), разработанная на основе результатов собственных исследований и данных литературы, может

служить теоретической основой направленного поиска новых средств химической защиты посевов пшеницы от септориоза.

Кроме того, данная модель, особенно с учетом реакции сорта Castan на патоген, может быть использована и для создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы. Одним из наиболее вероятных путей решения этой задачи является, на наш взгляд, использование фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в биотехнологии и клеточной селекции в качестве селектирующего фактора. С целью проверки данного предположения препараты фитотоксинов были переданы нами в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина. Получены предварительные положительные результаты, позволяющие судить о действии фитотоксинов на клеточные культуры различных сортов пшеницы. Подобные данные были получены и другими авторами (Гирко и др., 1993; Keller et al., 1994).

ВЫВОДЫ

1. Среди дейтеромицетов, паразитирующих на растениях, возбудители септориоза - грибы p. Septoria занимают одно из ведущих мест. На кулмурных и дикорастущих злаках число видов и форм Septoria достигает 17. Они поражают пшеницу, рожь, ячмень, овес и другие культуры. Из видов Septoria, обнаруженных на пшенице, наиболее часто встречаются S. nodorum Berk, и S. tritici Rob et Desm. Септориоз распространен повсеместно, однако особенно сильное развише его на озимой и яровой пшенице наблюдается в СевероЗападном, Центральном, Центрально-Черноземном регионах, в Сибири, на Северном Кавказе, в странах Балтии и в Украине. Высокая патогенность грибов р. Septoria в сочетании с высокой вредоносностью и отсутствие устойчивых сортов приводят в благоприятные для развития болезни годы к снижению урожая зерна на 10-20 и даже - 30-50%.

2. Впервые проведены комплексные исследования природы патогенности одного из основных возбудителей септориоза - гриба S. nodorum Berk. Изучение динамики роста и споруляции S. nodorum Berk, на КДА показало, что в первые 10 суток с момента инокуляции гриб растет с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5-7, а достижение максимума на 10 сутки. Гриб растет, спорулирует и сохраняет па-тогенНость при выращивании его не только на природных, но и на синтетических питательных средах. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает.

3. Природные хорошо спорулирующие изоляты S. nodorum Berk., как правило, обладают высокой патогенностью, характеризуются слабо выраженной физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. В процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S nodorum Berk выделено свыше 30 морфологических мутантов. Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6-3 0°С, они более приспособлены к изменению pH среды и устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности способствуют проявлению у мутантов S nodorum Berk более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды.

4. Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов. Максимум их активности приходится на экспоненциальную фазу (5-7 сутки), характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума спору-ляции сопровождаются снижением активности ферментов. При прорастании спор гриба активность ферментов, напротив, резко повышается. Одновременно усиливается секреция их в окружающую среду.

5. Между патогенностью S nodorum Berk и активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов выявлена определенная корреляция. Показано, что наиболее патогенные изоляты и мутанты гриба обладают и более высокой активностью ферментов, особенно, полигалактуроназы (г=0.67) и ß-глюкозидазы (г=0.70). Экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, при нанесении их на листовую поверхность способны вызывать повреждения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаС12 не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S nodorum Berk.

6. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), ß-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено также у высокопатогенных мутантов S nodorum Berk. Показано, что процесс прорастания спор S. nodorum Berk, сопровождается изменениями как в белковом спектре, так и в составе изоферментов. В частности, число изоферментов эстеразы в спорах уменьшается с 14-15 (покоящиеся) до 13-14 (прорастающие), а у пероксидазы, напротив, - увеличивается с 3 до 4.

7. Гриб S nodorum Berk., способен продуцировать целый ряд фитоток-сичных метаболитов. Выделенные из мицелия и среды культивирования фито-токсины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по физико-

химическим свойствам. Анализ полученных данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (охрацину), ФТ-3 - к одному из его производных, а ФТ-1 и ФТ-2 - к септорину. Кроме того, в составе физиологически активных метаболитов гриба обнаружены микофеноловая кислота и неиденти-фицированное серое вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34).

8. Высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изо-ляты гриба S. nodorum Berk., превалируют по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитоток-синов (ФТ-2 и ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) над слабопатогенными штаммами. Исследование динамики содержания фитотоксинов в спорах в процессе их прорастания подтвердило выявленную закономерность.

9. Фитотоксины S. nodorum Berk, не способны при нанесении на изолированные листья или интактные растения вызывать симптомы поражения, характерные для септориоза. Однако при добавлении их, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5, в споровую суспензию степень поражения инокулированных растений пшеницы повышается на 31,2-42,3%.

10. При выращивании S. nodorum Berk, в чистой культуре уже через 3-е суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК возрастает в 2,2 раза, а на 10-е, то есть к моменту максимума спорогенеза, - в 4,5 раза и достигает величины 6,7 нг/г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК идет активная секреция гормона в окружающую инкубационную среду. Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностыо гриба 5. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость.

11. Исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, и характер взаимодействия его с растениями пшеницы показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор гриба, ин-гибирует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК, кинетин (10-25 мкг/мл) и АБК (50-100 мкг/мл) также подавляют рост гиф. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона, его концентрации и сорта пшеницы на 12,2-65,1%. Фитогормоны изменяют тип реакции на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

12. Существенные различия между слабо- и высокопатогенными мутантами обнаружены и при исследовании системы "растение-хозяин-патоген".

Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в отличие от слабопатогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пекто- и целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение активности кислой фосфатазы и, особенно, пероксидазы. С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает. Повышается активность полигалактуроназы, Сх-целлюлазы и ß-глюкозидазы (7 сутки), а затем и Ci-целлюлазы. Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всем протяжении опыта. Отмечены изменения и в изофермент-ных спектрах как гидролаз, так и оксидоредуктаз. Однако и в данном случае влияние высокопатогенного мутанта было более значительным, особенно в отношении ß-глюкозидазы и эстеразы.

13. Инфицирование S. nodorum Berk, относительно устойчивого к септориозу сорта Castan только к концу опыта повышало уровень ИУК в листьях на 20,0-33,3%. Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов на синтез ИУК, динамику активности пекто- и целлюлолитических ферментов, а также изоферментный спектр ß-глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы не обнаружено. Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта было отмечено и на данном сорте. Кроме того, мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12-0,15.

14. Полученные экспериментальные данные дают основание считать, что исследованные нами пекто- и целлюлолитеческие ферменты, фитотоксины и фитогормоны (ИУК) действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk, выполняющими в процессе инфицирования как инвазивные (ферменты), так и регуляторные (ИУК, фитотоксины) функции.

15. Выявленные в результате изучения физиолого-биохимической природы патогенности S. nodorum Berk, закономерности и предложенная схема взаимодействия патогена и растения-хозяина могут служить теоретической основой для разработки стратегии защиты посевов пшеницы от септориоза, включающей в себя целенаправленный синтез новых высокоэффективных химических соединений, способных блокировать факторы патогенности гриба, и создание устойчивых сортов. Одним из наиболее вероятных путей решения задачи по выведению невосприимчивых или толерантных к септориозу сортов пшеницы является использование в качестве селектирующего фактора фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в сочетании с методами биотехнологии и клеточной селекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кобыльский, Г.И. Ингибирование гидроксиламином пероксидазы и образования продуктов окисления ИУК, способных вступать в комплекс с РНК / Г.И. Кобыльский, В.В. Полевой, Г.П. Акимова // Известия СО АН СССР. Серия биол. -мед. наук. - 1969. - вып.1. - № 5. - С. 86-89.

2. Кобыльская, Г.В. Пероксидаза, ауксин-оксидаза и рост растений / Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыльский // Биол. исследования. - Элиста, КГУ. 1973. - С. 38-57.

3. Кобыльский, Г.И. К вопросу о роли мембран в реакции растений на ауксин / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Вопросы экол. и физиол. раст. -Элиста, КГУ, 1974. - С. 101-106.

4. Кобыльский, Г.И. Влияние гиббереллина на секрецию а-амилазы половинками семян пшеницы / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Вопросы экол. и физиол. раст. - Элиста, КГУ. 1974. - С. 122-125.

5. Кобыльский, Г.И. Активность и изоферментный состав а-амилазы, секретируемой половинками семян различных сортов пшеницы под влиянием гиббереллина / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов, В.И. Куля // Вопросы экол. и физиол. раст. - Элиста, КГУ, 1974. - С. 126-130.

6. Кобыльский, Г.И. Влияние гиббереллина на активность а-амилазы в алейроновом слое семян пшеницы / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Материалы к изучению культурной и дикорастущей флоры Калмыкии. - Элиста, КГУ, 1976.-С. 148-151.

7. Кобыльский, Г.И. Биохимические факторы устойчивости растений ашеницы к ржавчинным болезням / Г.И. Кобыльский // Тезисы докл. научно-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. II. - пгт. Гвардейский, 1981. - № 1605. -С. 20-24.

8. Кобыльский, Г.И. Изменение активности полигалактуроназы у гриба Septoria nodorum Berk, в процессе роста его на плотной питательной среде / Г.И. Кобыльский, A.A. Ахметов // Тезисы докл. научно-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. II. - пгт. Гвардейский, 1981. - № 1605. - С. 25-26.

9. Кобыльский, Г.И. Влияние источников азота и углерода на рост и спо-руляцию гриба Septoria nodorum Berk при выращивании его в чистой культуре / Г.И. Кобыльский, М.Н. Васецкая, Г.В. Кобыльская и др. // Тезисы докл. научно-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. II. - пгг. Гвардейский, 1984. - № 2148.-С. 10-16.

10. Борзионов, В.Д. О возможности прогнозирования устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине по содержанию некоторых белков в зерне / В.Д. Борзионов, Г.И. Кобыльский // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 30-31.

11. Кобыльский, Г.И. Гидролитические ферменты фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk I. Рост, споруляция и содержание белка в культуре гриба

/ Г.И. Кобыльский, A.A. Ахметов // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 61-68.

12. Ахметов, A.A. Гидролитические ферменты фитопатогенного гриба Septoria nodontm Berk. II Активность полигалактуроназы, эндо- и экзо - ß - 1,4 -глюканаз, ß - глюкозидазы и ксиланазы в культуре гриба / A.A. Ахметов, Г.И. Кобыльский // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. -Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 68-75.

13.Кобыльский, Г.И. Изучение токсинообразования у различных изолятов гриба Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, E.B. Бочарова // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989,- С. 75-80.

14. Кобыльский, Г.И. Полиморфизм белков гриба Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская, О.Б. Боровая и др. // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 80-83.

15. Кобыльский, Г.И. Изоферментный состав эстеразы и кислой фосфата-зы у некоторых изолятов гриба Septoria nodorum Berk, и их мутантов / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская, О.Б. Боровая и др. // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 83-87.

16. Герцог, Н.М. Выделение и регенерация протопластов из мицелия гриба Septoria nodorum Berk. / Н.М. Герцог, Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 87-89.

17. Ахметов, A.A. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов у различных изолятов гриба Septoria nodorum Berk. / A.A. Ахметов, Г.И. Кобыльский // Тезисы докл. VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1989. - С. 126.

18. Кобыльский, Г.И. Фитотоксичные метаболиты, продуцируемые различными изолятами гриба Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, E.B. Бочарова // Тезисы докл. VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1989. - С. 143.

19. Ахметов, A.A. Влияние источников углерода на активность гидролитических ферментов у фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk. / A.A. Ахметов, Г.И. Кобыльский //Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1989. - № 6. - С. 83-84.

20. Кобыльский, Г.И. Фитотоксины гриба Septoria nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы / Г.И. Кобыльский, Е.В. Бочарова // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1989. -N2 7.- С. 40-41.

21. Кобыльский, Г.И. Биосинтез индолилуксусной кислоты фитопатоген-ным грибом Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, O.A. Алипбеков, Н.М. Герцог // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1990. - № 8. - С. 37-39.

22. Кобыльский, Г.И. Активность и изозимный спектр некоторых ферментов у мутантов грибов - возбудителей фузариоза зерновых / Г.И. Кобыль-

ский, Г.В. Кобыльская, Е.Г. Дорохова // Вестник с.-х. науки Казахстана. -1991.-№6.-С.44-48.

23. Кобыльский, Г.И. Морфолого-культуральные особенности мутантов гриба Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, Н.М. Герцог // Вестник с.-х науки Казахстана. -1991. - № 8. - С. 53-57.

24. Кобыльский, Г.И. О природе фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk и возможности использования их в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Г.И. Кобыльский, Е.В. Бочарова // IX Всесоюзное совещание по иммунитету растений к болезням и вредителям: Тезисы докл., том II. - Минск, 1991. - С.200-201.

25. Герцог, Н.М. Участие индолилуксусной кислоты в патогенезе гриба Septoria nodorum Berk. / Н.М. Герцог, В.Д. Борзионов, Г.И. Кобыльский // Иммунитет сельскохозяйственных культур к возбудителям грибных болезней. -М., 1991. - С. 36-40.

26. Кобыльский, Г.И. Изменение активности и изозимного спектра некоторых ферментов у инфицированных растений восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская // III съезд Всерос. о-ва физиол. раст.: Тезисы докл., т. 6. - СПб., 1993. - С. 614.

27. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1994 год /Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1994 год. - М., 1994. - С. 48-55.

28. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1992 - 1995 годы /Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1992 - 1995 годы. - М., -

1995.-С. 55-61.

29. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1992 - 1996 годы / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1992 - 1996 годы. - М.,

1996.-С. 85-102.

30. Кобыльский, Г.И. Природа фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk. и возможности использования их в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Г.И. Кобыльский // Проблемы селекции яровой пшеницы: Тезисы докл. научно-метод. коорд. совещания по селекции яровой пшеницы, 9-10 июля 1996 г. - Саратов, 1996. - С. 17-18.

31. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1997 год / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1997 год. - М., 1997. - С. 47-52.

32. Кобыльский, Г.И. Отчет о НИР Среднерусской Н,- И. фитопатологи-ческой станции за 1998 год / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1998 год. - СПб., 1998. - С. 81 -88.

33. Кобыльский, Г.И. Фитогормоны и патогенность возбудителя септо-риоза пшеницы - Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский // Пятая междунар.

конф. "Регуляторы роста и развития растений" (29 июня - 1 июля 1999 года): Тезисы докл., ч. II. - М., 1999. - С. 324.

34. Кобыльский Г.И. Методика определения фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии. / Г.И. Кобыльский, Е.В. Бочарова - М„ 1999. - 7 е.- Деп. в ВИНИТИ РАН 09.06.99. № 1868 - В99.

35. Кобыльский, Г.И. Методика количественного определения фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления / Г.И. Кобыльский, В.Д. Борзионов, Е.В. Бочарова - М., 1999. -8 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 09.06.99. № 1869 - В99.

36. Кобыльский, Г.И. Физиолого-биохимические факторы патогенности возбудителя септориоза пшеницы - Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский // IV съезд Всерос. о-ва физиол. раст.: Тезисы докл.., т. 1. - М., 1999. - С. 223-224.

37. Кобыльский, Г.И. Изменение активности пектолитических и целлю-лолитических ферментов у инфицированных растений восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы / Г.И. Кобыльский, A.A. Ахметов, Г.В. Кобыльская // IV съезд Всерос. о-ва физиол. раст.: Тезисы докл.., т. 1.-М., 1999.-С. 223-224.

38. Кобыльский, Г.И. Влияние фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk. на растения пшеницы / Г.И. Кобыльский, Е. В. Бочарова // IV съезд Всерос. о-ва физиол. раст.: Тезисы докл.., т. 1. - М., 1999. - С. 223

39. Кобыльский, Г.И. Первые итоги работы / Г.И. Кобыльский // Защита и карантин раст. - 2000. - № 8.- С. 46.

40. Кобыльский, Г.И. Физиология и биохимия патогенности гриба Septoria nodorum Berk - возбудителя септориоза пшеницы / Г.И. Кобыльский // Вестник защиты растений,- ВИЗР, СПб.- Пушкин, 2000.- № 1.- С. 103.

41. Кобыльский, Г.И. Иммунологические методы создания устойчивых к болезням сортов сельскохозяйственных культур / Г.И. Кобыльский, В.В. Пла-хотник, В.П. Судникова и др. // Принципы, критерии и технологии стабилизации фитосанитарного состояния агроэкосистем: Основные итоги исследований ВИЗР, ВНИИФ, ВНИИБЗР, ДВНИИЗР и СНИФС за 1996-2000 гг. - РАСХН, Отд. защиты раст,- СПб., 2000,- С. 66-71

42. Кобыльский, Г.И. Регуляторы роста защищают зерновые культуры от болезней / Г.И. Кобыльский, В.П. Кратенко, М.Н. Васецкая, В.В. Чекмарев // Агро XXI,- 2001. -№ 1.-С. 12-13.

43. Кобыльский, Г.И. Физиологические особенности мутантов гриба Septoria nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования/ Г.И. Кобыльский // Сельскохозяйственная биология. - 2001.- № 5.- С. 95-100.

44. Кобыльский, Г.И. Влияние ионов Са2+ на поражение растений пшеницы септориозом / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская, A.A. Ахметов // Биоло-ги-зация защиты раст.: состояние и перспективы.- Материалы докл. междунар. научно-практ. конф. 18-22 сентября 2000 г, Краснодар, ч. I,- Краснодар, 2001.-С. 79-80.

45. Кобыльский, Г.И. Влияние фитогормонов на поражение растений пшеницы Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская // VI Ме-

ждунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях" (2628 июня 2001 г): Тезисы докл.- М., 2001.- С. 39.

46. Кобыльская, Г.В. Влияние гормонов на прорастание спор и рост гиф у фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk.! Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыльский // VI Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях" (26-28 июня 2001 г): Тезисы докл.- М., 2001.- С. 164.

47. Кобыльская, Г.В. Активность лектолитических и целлюлолитических ферментов у мутантов гриба Fusarium graminearum Schwabe / Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов,- Тезисы докл.,- М., 2002,- С. 187.

48. Кобыльский, Г.И. Фитотоксины и патогенность возбудителя септо-риоза пшеницы - гриба Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов.- Тезисы докл.,- М., 2002,- С. 187-188.

49. Кобыльский, Г.И. Фитогормоны и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы / Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов.- Тезисы докл.,- М., 2002,- С. 188.

50. Кобыльский, Г.И. Физиолого-биохимические механизмы взаимоотношений растений пшеницы с возбудителем септориоза - грибом Septoria nodorum Berk / Г.И. Кобыльский, Г.В.Кобыльская // Первая Всерос. конф. по иммунитету раст. к болезням и вредителям,- Научные материалы.- СПб., 2002.-С. 30-31.

Объем 3,0 печ. л.

Зак. 627.

Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

) »

í i

i f

i i.

|»20 1 44

РНБ Русский фонд

2006-4 18843

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кобыльский, Геннадий Иванович

1. Актуальность проблемы.

2. Цель и задачи исследований.

3. Научная новизна.

4. Практическая значимость работы.

5. Основные положения, выносимые на защиту.

6. Апробация работы.

7. Публикация результатов исследований.

8. Структура и объем диссертации.

Г л а в а 1. Биологические и физиолого-биохимические факторы патогенности дейтеромицетов (обзор литературы).

1.1. Характеристика дейтеромицетов, паразитирующих на растениях.

1.2. Механизм заражения растений дейтеромицетами.

1.3. Ферменты как возможные факторы патогенности дейтеромицетов.

1.3.1. Пекто- и целлюлолитические ферменты и патогенность дейтеромицетов.

1.3.2. Ферменты, не связанные непосредственно с расщеплением структурных компонентов клеточных стенок растений, и их возможная роль в патогенности дейтеромицетов.

1.4. Фитотоксины как возможные факторы патогенности дейтеромицетов.

1.5. Фитогормоны как возможные факторы патогенности дейтеромицетов.

1.5.1. Ауксины и их роль в патогенезе грибных болезней у растений.

1.5.2. Другие фитогормоны и их роль в патогенезе грибных болезней у растений.

Г л а в а 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Выращивание, изучение мутационной изменчивости и определение патогенности гриба S. nodorum Berk.

2.2. Экстракция белка, определение активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы.

2.3. Выделение, очистка и идентификация фитотоксичных метаболитов гриба S. nodorum Berk.

2.4. Определение содержания фитогормонов в культуре гриба S. nodorum Berk, и растениях пшеницы.

2.5. Изучение влияния фитогормонов на степень поражения растений пшеницы септориозом.

2.6. Статистическая обработка данных.

Г л а в а 3. Изучение биологических особенностей возбудителя септориоза пшеницы — гриба S. nodorum Berk.

3.1. Рост и споруляция гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре.

3.2. Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk. и патогенность.

3.4. Выводы.

Г л а в а 4. Мутационная изменчивость и патогенность гриба

S. nodorum Berk.

4.1. Морфолого-культуральные особенности и патогенность мутантов гриба S. nodorum Berk.

4.2. Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования.

4.3. Выводы.

Г л а в а 5. Пектолитические и целлюлолитические ферменты гриба

S. nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы.

5.1. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре.

5.2. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов и патогенность гриба S. nodorum Berk.

5.3. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в системе "растение-хозяин - патоген".

5.4. Выводы.

Г л а в а 6. Изоферменты некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба

S. nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы.

6.1. Полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk.

6.2. Активность некоторых гидролаз и оксидоредуктаз, изоферменты и патогенность гриба S. nodorum Berk.:.

6.3. Изменение активности и изоферментного спектра кислой фосфатазы, (3 - глюкозидазы и пероксидазы в системе "растение-хозяин - патоген".

6.4. Выводы.

Г л а в а 7. Фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы.

7.1. Выделение, очистка и идентификация фитотоксинов гриба S. nodorum Berk.

7.2 .Зависимость токсинообразования от условий культивирования гриба S. nodorum Berk.

7.3. Фитотоксины и патогенность гриба S. nodorum Berk.

7.4. Фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина.

7.5. Выводы.

Г л а в а 8. Фитогормоны как возможные факторы патогенности гриба S. nodorum Berk,

8.1. Синтез фитогормонов в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре

8.2. Синтез ИУК и патогенность гриба S. nodorum Berk.

8.3. Динамика содержания ИУК в системе растение-хозяин - патоген".

8.4. Влияние экзогенных фитогормонов на прорастание спор, рост гиф и развитие септориоза у растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

8.5. Выводы

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Патогенность дейтеромицетов"

Актуальность проблемы. Дейтеромицеты (Deuteromycetes) или несовершенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе. Многие из них паразитируют на высших растениях. К возбудителям болезней сельскохозяйственных культур, оказывающим наиболее существенный вред производству, относятся грибы pp. Botrytis Mich., Verticillium Nees, Rin-chosporium, Trichothecium Lk, Piricularia Sacc., Cercosporella Sacc., Cladospo-rhim Link, Alternaria Nees, Helminthosporium Lk: Fr., Drechslera Ito, Bipolar is, Curvularia Boed, Fusarium Lk: Fr. (порядок гифомицеты), p. Colletotrichum Sacc. (порядок меланкониальные) и pp. Phoma sp., Phomopsis Sacc., Ascochyta Lid. и Septoria Fr. (порядок сферопсидальные).

Возбудители септориозных пятнистостей пшеницы - грибы p. Septoria в настоящее время насчитывают свыше 10 видов. Среди них наиболее часто на посевах встречаются S. tritici Rob. et Desm. и S. nodorum Berk. Первый из них поражает, в основном, листья, а второй - колос, хотя практически S. nodorum Berk, способен поражать все надземные органы. Оба вида часто можно обнаружить на одних и тех же полях и даже растениях (Соколов и др., 1998).

В 1987 г. на европейской территории бывшего СССР 50 - 80% случаев возникновения массовых пятнистостей на пшенице было вызвано поражением её септориозом (Супрун, 1990). Сильное развитие септориоза на посевах пшеницы отмечено на Алтае и в Северном Казахстане (Васецкая, Столяров, 1988), в Сибири (Лебедева, 1964; Кашуба, 1989), на Северном Кавказе (Фис-сюра и др., 1996; Чуприна и др., 1997) и в Украине (Дубиневич, 1971; Гонта-ренко и др., 1998). Особенно широкое распространение септориоз получил с середины 80-х и начала 90-х годов (Новожилов, 1996), став доминирующим заболеванием на посевах озимой и яровой пшеницы (Павлюшин и др., 2005). Показано, что в благоприятные для развития болезни годы септориоз вызывает снижение урожая зерна на 10 - 20, а в некоторых случаях до 30 - 50 %(Дымина, 1997; Гонтаренко и др., 1998).

Приведенные данные говорят о том, что септориоз относится к числу широко распространенных и опасных по экономическим последствиям болезней зерновых культур. Основными методами борьбы с данным заболеванием являются создание и внедрение в производство устойчивых сортов пшеницы и синтез новых эффективных и экологически безопасных химических средств защиты посевов. Решение данных вопросов сдерживается рядом причин, одной из которых является слабая изученность природы пато-генности возбудителей этого заболевания. Из литературы известно, что детерминантами патогенности ряда бактерий и грибов могут служить ферменты (Тарр, 1975; Езепчук, 1977), токсины (Тарр, 1975; Йодер, 1984; Асада, 1985; Дурбин, 1985), гормоны (Тарр, 1975; Пегг, 1984; Косуге, Комаи, 1985) и другие биологически активные соединения. Сведения подобного плапа в отношении грибов p. Septoria ограничены, поэтому проведение исследований, направленных на изучение пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных биохимических факторов патогенности S. nodorum Berk, является актуальным и имеет большое научное общебиологическое и прикладное значение.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение физиолого-биохимической природы патогенности S. nodorum Berk. как теоретической основы направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• выяснить способность S. nodorum Berk, к мутационной изменчивости, создать для экспериментальных целей коллекцию морфологических и контрастных по патогенности мутантных штаммов гриба и изучить физиологические особенности некоторых из них;

• проследить за динамикой активности пектолитических и целлюлоли-тических ферментов, синтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) и фитоток-синов в процессе роста S. nodorum Berk, в чистой культуре;провести анализ взаимосвязи между патогенностью гриба и способностью его к продуцированию ферментов, фитотоксинов и ИУК;

• изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидро-лаз и оксидоредуктаз у природных изолятов, а также у слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S. nodorum Berk.;

• выявить особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в системе "растение - хозяин - патоген" в процессе развития болезни;

• изучить действие экзогенных ферментных препаратов, фитотоксинов и фитогормонов на характер взаимоотношений патогена и растения -хозяина;

• разработать схему взаимодействия на уровне пекто-и целлюлоли-тических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) между возбудителем септориоза - грибом S. nodorum Berk, и растениями пшеницы.

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных факторов патогенности возбудителя септориоза пшеницы - гриба S. nodorum Berk. Эксперименты выполнены с использованием не только природных изолятов, но и конрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk., впервые полученных на основе изолята 85-254.

Впервые с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления удалось количественно оценить способность S. nodorum Berk, к синтезу фитотоксинов и ИУК при выращивании его в чистой культуре. .

Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов, продуцирует ряд фитотоксичных метаболитов и фитогормоны, в частности ИУК. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5-7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции сопровождается снижением активности ферментов и увеличением количества ИУК с 1,5 до 6,7 нг/г сырой массы. При прорастании пикноспор резко повышается активность ферментов, возрастает содержание фитотоксинов и ИУК, одновременно усиливается секреция их в окружающую инкубационную среду.

Впервые показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью гидролитических ферментов, особенно полигалактуроназы и [3-глюкозидазы, а также повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Между па-тогенностью мутантов S. nodorum Berk, и способностью их к синтезу ИУК обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Впервые представлены данные сравнительного анализа активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы у слабо- и высокопатогенных мутантов S. nodorum Berk., доказывающие преимущество последних по числу изоферментов эстеразы, [3-глюкозидазы, кислой фосфа-тазы и пероксидазы.

В экспериментах с изучением действия экзогенных гидролаз, фито-токсинов и фитогормонов на растеиия впервые доказано, что экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, вызывают на листьях повреждения, характерные для септориоза. Фитотоксины, напротив, не способны вызывать подобные внешние симптомы, однако при добавлении в споровую суспензию повышают степень поражения инокулированных растений пшеницы, а при поступлении через корни влияют на транспирацию и водный обмен. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, в значительной степени снижает развитие септориоза.

На основе полученных результатов и данных литературы предложена схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk. и растений пшеницы.

Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов:

• создана коллекция мутантов гриба S. nodorum. Berk, (свыше 30 штаммов), различающихся по морфолого-культуральным признакам и па-тогенности;

• выделены фитотоксины гриба S. nodorum Berk., которые могут быть использованы в работах по селекции пшеницы на устойчивость к септориозу с помощью культуры клеток и тканей;

• разработаны схема препаративного выделения токсинов из культуры гриба S. nodorum Berk., "Методика определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления";

• составлены "Рекомендации по направленному синтезу фунгицидов, предназначенных для борьбы с септориозом".

Основные положения, выносимые на защиту:

• наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и (3-глюкозидазы (г=0,70);

• высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Berk., превалируют по количеству продуцируемых септорина и меллеина (охрацина), суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секре-тируемых фитотоксинов над слабопатогенными штаммами;

• между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции фитогормона ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная. зависимость;

• схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы, предложенная на основе полученных результатов и данных литературы.

Голицыно, 1980- 1991), бюро Отделения защиты растений Россельхозакаде-мии (Москва, Санкт-Петербург, Голицыно, 1992-2002), IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991 ), III (Санкт-Петербург, 1993 ) и IV (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений, научно-методическом совещании по селекции яровой пшеницы, посвященном 110-летию А.П. Шехурдина (Саратов, 1996), V и VI международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999, 2001), международной научно-практической конференции "Биологизация защиты растений: состояние и перспективы" (Краснодар, 2000), I съезде микологов (Москва, 2002), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 50 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы и 36 стр. приложения. Работа изложена на 360 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 78 рисунками. Библиография

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Кобыльский, Геннадий Иванович

выводы

1. Среди дейтеромицетов, паразитирующих на растениях, возбудители септориоза - грибы p. Septoria занимают одно из ведущих мест. На культур ных и дикорастущих злаках число видов и форм Septoria достигает 17. Они поражают пшеницу, рожь, ячмень, овес и другие культуры. Из видов 4 Septoria, обнаруженных на пшенице, наиболее часто встречаются S. nodorum • Berk, и S. tritici Rob. et Desm. Септориоз распространен повсеместно, однако особенно сильное развитие его на озимой и яровой пшенице наблюдается в Северо-Западном, Центральном, Центрально-Черноземном регионах, в Си бири, на Северном Кавказе, в странах Балтии и в Украине. Высокая патогенность грибов p. Septoria в сочетании с высокой вредоносностью и отсутствие устойчивых сортов приводят в благоприятные для развития болезни годы к снижению урожая зерна на 10-20 и даже - 30-50%.

2. Впервые проведены комплексные исследования природы патоген- • ности одного из: основных возбудителей септориоза - гриба S. nodorum . Berk. Изучение динамики роста и споруляции S. nodorum Berk, на КДА показало,что в первые 10 суток с момента инокуляции гриб растет с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5-7, а достижение максимума - на 10 сутки. Гриб растет, спорулирует и сохраняет патогенность при выращивании его не только на природных, но и на синтетических питательных средах. . Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не ис- . пытывает.

3. Природные хорошо спорулирующие изоляты S. nodorum Berk., как правило, обладают высокой патогенностью, характеризуются слабо выраженной физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. В процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, выделено свыше 30 морфологических мутантов. Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6-30°С, юни более приспособлены к изменению рН среды и устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды.

4. Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов. Максимум их активности приходится на экспоненциальную фазу (5-7 сутки), характери зующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и перехо дом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максиму ма споруляции сопровождаются снижением активности ферментов. При про растании спор гриба активность ферментов, напротив, резко повышается. Од новременно усиливается секреция их в окружающую среду.

5. Между патогенностью S. nodorum Berk, и активностью пектолитиче ских и целлюлолитических ферментов выявлена определенная корреляция. Показано, что наиболее патогенные изоляты и мутанты гриба обладают и бо лее высокой активностью ферментов, особенно, полигалактуроназы (г=0.67) и Р-глюкозидазы (г=0.70). Экстракты ферментов из мицелия S. nodorum Berk, нанесении их на листовую поверхность способны вызывать повреж дения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаСЬ не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

6. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), Р-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено также у высокопа тогенных мутантов S. nodorum Berk. Показано, что процесс прорастания спор S. nodorum Berk, сопровождается изменениями как в белковом спектре, так и в составе изоферментов. В частности, число изоферментов эстеразы в спорах уменьшается с 14-15 (покоящиеся) до 13-14 (прорастающие), а у пероксидазы, напротив, - увеличивается с 3 до 4.

7. Гриб S. nodorum Berk, способен продуцировать целый ряд фитоток-сичных метаболитов. Выделенные из мицелия и1 среды культивирования фитотоксины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по физи ко-химическим свойствам. Анализ полученных Данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (охрацину), ФТ-3 - к одному из его производных, а ФТ-1 и ФТ-2 - к септорину. Кроме того, в составе физио логически активных метаболитов гриба обнаружены микофеноловая кислота и неидентифицированное серое вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34).

8. Высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S. nodorum Berk, превалируют по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фито-токсичных метаболитов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2 и ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) над слабопатогенными штаммами. Исследование динамики содержания фитоток синов в спорах в процессе их прорастания подтвердило выявленную законо мерность.

9. Фитотоксины S. nodorum Berk, не способны при нанесении на изо лированные листья или интактные растения вызывать симптомы поражения, характерные для септориоза. Однако при добавлении их, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5, в споровую суспензию степень поражения инокулированных расте ний пшеницы повышается на 31,2-42,3%.

10. При выращивании S. nodorum Berk, в чистой культуре уже через 3-е суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой мае сы. На 7-е сутки количество ИУК возрастает в 2,2 раза, а на 10-е, то есть к моменту максимума спорогенеза, - в 4,5 раза и достигает величины 6,7 нг/г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК идет активная секреция гормона в окружающую инкубационную среду. Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость.

11. Исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, и характер взаимодействия его с растениями пшеницы пока зали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор гриба, ингибирует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пик нид и их продуктивность. ИУК, кинетин (10-2*5 мкг/мл) и АБК (50-100 мкг/мл) также подавляют рост гиф. Предобработка растений пшеницы фито-гормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона, его концентрации и сорта пшеницы на 12,2-65,1%. Фитогормоны изменяют тип реакции на пато ген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на ли стьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

12. Существенные различия между слабо- и высокопатогенными мутан тами обнаружены и при исследовании системы «растение-хозяин-патоген». Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в отличие от слабопа тогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях актив ности пекто- и целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение ак тивности кислой фосфатазы и, особенно, пероксидазы. С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает. Повышается активность полигалактуроназы, Сх-целлюлазы и Р-глюкозидазы (7 сутки), а затем и С i-целлюлазы. Значительное усиление активности пероксидазы, -которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всем протяжении опыта. Отмечены изменения и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и' оксидоредуктаз. Однако и в данном случае влияние высокопатогенного мутанта было более значительным, особенно в отношении Р-глюкозидазы и эстеразы.

13. Инфицирование S. nodorum Berk, относительно устойчивого к септориозу сорта Castan только к концу опыта повышало уровень ИУК в листьях на 20,0-33,3%. Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов на синтез ИУК, динамику активности пекто- и целлюлолитических ферментов, а также изоферментный спектр Р-глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы не обнаружено. Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта1 было отмечено и на данном сорте. Кроме того, мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появ ление в спектре пероксидазы дополнительного Ю'-го изофермента с Rf 0,120,15.

14. Полученные экспериментальные данные дают основание считать, что исследованные нами "пекто- и целлюлолитеческие ферменты, фитотоксины и фитогормоны (ИУК) действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk, выполняющими в процессе инфицирования как инва-зивные (ферменты), так и регуляторные (ИУК, фитотоксины) функции.

15. Выявленные в результате изучения физиолого-биохимической при роды патогенности S. nodorum Berk, закономерности и предложенная схема взаимодействия патогена и растения-хозяина могут служить теоретической основой для разработки стратегии защиты посевов пшеницы от септориоза, включающей в себя целенаправленный синтез новых высокоэффективных химических соединений, способных блокировать факторы патогенности гриба, и создание устойчивых сортов. Одним из наиболее вероятных путей решения задачи по выведению невосприимчивых или толерантных к септориозу сортов пшеницы является использование в качестве селектирующего фактора фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в сочетании с методами биотехнологии и клеточной селекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ t

Патогенность или способность вызывать инфекционную болезнь у растений - одно из основных свойств фитопатогенных организмов. В широком смысле слова она представляет собой комплекс признаков, отличающих паразитов от непаразитов (Дьяков и др., 2001). С учетом данного положения постараемся проанализировать и обобщить результаты экспериментов по изучению природы патогенности одного из представителей дейтеромицетов, возбудителя септориоза пшеницы — гриба S. nodorum Berk.

В результате проведенных исследований установлено, что рост фи-топатогенного гриба S. nodorum Berk, при культивировании его на агаризо-ванной картофельно-декстрозной питательной среде (КДА) при температуре 20°С и 16-час. фотопериоде в первые 10 суток после инокуляции идёт с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Полученные показатели удельной скорости роста (2,0-2,2%'н"1) характеризуют данный гриб как медленнорастущий. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5 и 7-е, а достижение максимума - на 10-е сутки.

Гриб растёт, спорулирует и сохраняет патогенность при выращивании его не только на природной, но и на синтетических (полусинтетических) средах. Показано, что наиболее эффективным источником азота для роста и споруляции гриба S. nodorum Berk, в этом случае является глицин. Глюкоза в качестве источника углерода в 1,5 раза эффективнее галактозы. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает.

Полевыми и тепличными экспериментами установлено, что все природные хорошо спорулирующие изоляты S. nodorum Berk, различающиеся по происхождению и морфолого-культуральным признакам, обладают потенциально высокой патогенностью и вирулентностью, проявление которых как на наборе сортов, так и на каждом из них в отдельности определяется прежде всего метеоусловиями, наблюдающимися в период инокуляции растений, а затем уже сортом пшеницы.

В биологии фитопатогенных грибов, в том числе и S. nodorum Berk, особый интерес вызывает наличие или отсутствие у них так называемой физиологической специализации, связанной с существованием у патогена опре- ' деленных рас, способных поражать одни и не поражать другие сорта из осо- • бого тест-набора сортов или набора сортов-дифференциаторов. Для возбудителей септориоза пшеницы официально признанного набора сортов-дифференциаторов пока не существует, хотя исследователи разных стран и пытаются, изучая взаимодействие "изолят х сорт", подобрать такие сорта из числа устойчивых или слабовосприимчивых к септориозу (Rufty et al., 1981; Saadaoui, 1987; Meien-Vogeler et al., 1992; Валуевич и др., 1992; Zamorski, Nowicki, 1997; Kema, Van Silfhoum, 1997).

Однако далеко не всегда удается провести дифференциацию по пато- • генности и выявить среди изолятов S. nodorum Berk и S. tritici менее пато- • генные и более патогенные штаммы, используя один или даже несколько сортов пшеницы, как и обнаружить четкие различия в реакции сортов пшеницы на возбудитель септориоза (Le Roux, 1984; Haugen et al., 1985). Слабое специфическое взаимодействие в системе "изолят х сорт" было отмечено и в работе по изучению изолятов S. nodorum Berk, выделенных из различных хозяев, после пассажа через пшеницу (Krupinsky, 1994).

Ученые Западной Андалузии (Испания), обобщая сведения, полученные за 6 лет наблюдений по биологии и эпидемиологии двух наиболее • важных в экономическом отношении возбудителей болезней пшеницы - S. . tritici и S. nodorum, пришли к выводу, что физиологическая, межвидовая и внутривидовая специализация у изученных фитопатогенов вообще отсутствует (Marin, Aguirre, 1986). А устойчивость, обнаруживаемая у некоторых сортообразцов к S. nodorum и S. tritici, по мнению авторов, является неспецифической. По нашим данным, гриб S. nodorum Berk, действительно обладает слабо выраженной физиологической специализацией, что затрудняет дифференциацию его по расовому составу. В связи с этим можно предположить, что популяция S. nodorum Berk. может быть дифференцирована на расы только при условии создания и привлечения в эксперимент иммунных или высокоустойчивых к септориозу сортов пшеницы.

Одной из причин слабо выраженной физиологической специализации гриба S. nodorum Berk, по-видимому, является достаточно высокая степень изменчивости патогена, характерная для дейтеромицетов (Griffiths, Ао, 1980). Нами в процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, установлено, что под влиянием УФ-облучения споровой суспензии гриба S. nodorum Berk происходит интенсивное образование морфологических мутантов, многие из которых отличаются от природных исходных изолятов по морфолого-культуральным и физиологическим признакам, в том числе и более высокой патогенностью.

Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6-30° С, они более приспособлены к изменению рН среды, устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности, по-видимому, способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды.

Для изучения физиолого-биохимической природы патогенности из полученных свыше 30 мутантов были отобраны шесть, три из которых характеризуются слабой (4,5-9,8%) и три - высокой (63,0-82,0%) патогенностью.

Исследованиям природы патогенности возбудителя септориоза предшествовало изучение его. биохимических особенностей и, в частности, способности патогена к синтезу пекто- и целлюлолитических ферментов, токсинов и фитогормонов как наиболее возможных факторов патогенности. К началу исследований было известно лишь, что S. tritici, но не S. nodorum Berk., в условиях in vitro продуцирует ферменты (пектин-метилэстераза, целлюлаза, р-глюкозидаза), разрушающие клетки пшеницы (Onogur, 1977, 1978). В результате наших экспериментов было установлено, что и культура S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитиче-ских ферментов. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5-7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к генеративной фазе своего развития (продуцирование спор). Падение темпа роста и достижение максимума споруляции (10-е сутки)'сопровождаются снижением активности ферментов.

С помощью инструментальных биохимических методов анализа исследована гетерогенность белков и ферментов гриба S. nodorum Berk. Установлено, что количество белковых зон в эдектрофоретическом спектре природных изолятов гриба S. nodorum Berk, варьирует от 22 до 47. Полосы имеют Rf в пределах от 0,01 до 0,97. Коэффициент сходства между изоля-тами колеблется в пределах 34,0 - 78,6%

Белковый препарат, выделенный из мицелия природных изолятов гриба S. nodorum Berk., содержит от 11 до 21 изоферментов эстеразы, от 2 до 5 изоферментов пероксидазы и от 3 до 8 изоферментов р-глюкозидазы.

Экспериментально доказано, что S. nodorum Berk, способен продуцировать ряд фитотоксичных метаболитов. Выделенные из мицелиальной массы и среды культивирования различных изолятов S. nodorum Berk. фитотоксины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по окраске в видимом свете и флуоресценции в ультрафиолете,-величине Rf для трех систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограмм проявляющими реагентами и УФ-спектрам поглощения. Анализ полученных данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (Devys et al., 1974), а ФТ-3 - к одному из его производных. Среди выделенных веществ два (ФТ-1 и ФТ-2), имеют лимонно-желтую окраску в видимом свете, абсорбируют в УФ-свете и дают жёлто-коричневое окрашивание с хлорным железом, то есть ведут себя как септорин (Bousquet et al., 1980).

Наиболее сильное ингибирующее действие на рост корней и колеоп-тилей пшеницы оказывают ФТ-5 и ФТ-4. Действие метаболита ФТ-3 было выражено слабее и практически не изменялось с увеличением концентрации. Из двух веществ с лимонной окраской четкие фитотоксичные свойства проявлялись только у метаболита ФТ-2.

Все обнаруженные и выделенные из гриба-б", nodorum Berk, фитоток-сины (за исключением ФТ-1) проявляют ингибирующий эффект как на восприимчивых, так и на относительно устойчивых к септориозу сортах пшеницы. При нанесении их- на изолированные' листья или интактные растения они не способны вызывать внешние симптомы поражения, характерные для септориоза. Это говорит об отсутствии специфичности у фитотоксинов S. nodorum Berk, в отношении растения-хозяина.

Проведенные с применением биотеста исследования показали, что фитопатогенный гриб S. nodorum Berk, способен продуцировать и фито-гормоны, в частности индолил-уксусную кислоту, являющуюся одним из важнейших природных регуляторов роста растений. Полученные данные были подтверждены с помощью современного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что при культивировании гриба S. nodorum Berk, уже через 3 суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК в культуре возрастало в 2,2 раза, а на 10-е, т.е. к моменту максимума спорогенеза, — в 4,5 раза и достигало величины 6,7 нг/г г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК, как показали исследования, идёт активная секреция гормона в окружающую среду. Максимальное содержание ИУК в культуре грибов р.

Septoria, судя по литературным данным (Vasjuk, Andrianova, 1994), составляет 933 нг/г сырой массы. Оно определяется видом гриба, природой изолята и, естественно, условиями культивирования патогена. (Васюк и др., 1996 а)

Из приведенных данных следует, что возбудители септориоза пшеницы: S. nodorum Berk. и S. tritici способны к продуцированию всех предполагаемых биохимических факторов патогенности, а именно: комплекса пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК.

Дальнейшие исследования показали, что высокая патогенность природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk, как правило, сопровождается и более высокой активностью ферментов. Корреляционный анализ, проведенный на основе полученных данных, подтвердил существование между патогенностью гриба S. nodorum Berk и активностью пектолитических и целлюлитических ферментов прямой зависимости. Особенно тесная связь обнаружена между патогенностью и активностью полигалактуроназы (г=0,67), С[ - целлюлазы (г=0,66) и р - глюкозидазы (г=0,70). В значительно меньшей степени патогенность зависела от Сх - целлюлазы (г=0,34) и ксиланазы (г=0,47). О значительной роли данных ферментов в проявлении патогенности и вирулентности у грибов говорят и результаты, полученные в ряде работ с другими объектами. Так, активность целлюлазы у. высокопатогенных штаммов возбудителя антракноза тыквенных Colletotrichum lagenarium (Touze, 1972; Rabenantoandro, Auiol, 1975),' Pyrieularia oryzae (Sudo et al., 1973 a,6), Pseudocercosporella herpotrichoides и Rhizoctonia cerealis (Afchari-Azad, Wolf, 1992) выше, чем у слабопатогенных. Предполагается, что критерий Р-глюкозидазной активности может быть использован для характеристики вирулентности штаммов Alternaria solani (Аврова, 1993). Имеется достаточно большое количество работ, в которых доказывается существование вполне определенной связи между патогенностью грибов и их способностью к продуцированию не только целлюлолитических, но и пектолдитических ферментов, в частности, полигалакттуроназы Colletotrichum lagenarium (Lule et al., 1977), полиметилгалактуроназы и пектинметилэстеразы Alternariaporri (Wasfy et al., 1977), а также полигалактуронат-трансэлиминазы возбудителя Fusarium spp. (Bulnheim, 1978). Проверка коллекции из 198 штаммов Fusarium spp. in vitro позволила установить, что патогенный штамм гриба чаще обладает высокой активностью ксиланазы: г=0,57-0,72 (Клечковская, 1999). У сумчатого некротрофного гриба Sclerotinia sclerotiorum существенную роль в патогенной стратегии играют эндополигалактуроназы PG-2 и PG-4 (Fava-ron et al., 1993). В качестве подтверждения значительной роли полигалактуроназы в процессе проникновения гриба в ткани хозяина могут служить и данные, полученные в опытах с Cochliobolus sativus (Clay et al., 1997).

Проведенные на 5-суточной культуре S. nodorum Berk, исследования показали, что в целом высокопатогенные мутанты, помимо пекто- и целлюлолитических ферментов, характеризуются повышенной активностью пероксидазы и менее высокой активностью кислой фосфатазы.

В ходе исследований у мутантов S. nodorum Berk. выявлено от 9 до 18 изоферментов эстеразы, от 5 до 12 изоферментов р-глюкозидазы, 2-3 - кислой фосфатазы и от 1 до 4 изоферментов пероксидазы. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), Р-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено у высокопатогенных мутантов. В составе изоферментов мутантных форм S. nodorum Berk, выявлены характерные только для них изоферменты эстеразы и кислой фосфатазы. Кроме того, у всех высокопатогенных мутантов отмечена повышенная активность изоферментов р-глюкозидазы. О существовании связи между патогенностью и полиморфизмом (гетерогеностью) белков и ферментов говорят и данные, полученные при исследовании рас 1 и 2 Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae, различающихся по патогенности (Madhosingh, 1980). Электрофоретическое сравнение изозимов показало, что эти две расы различаются и по набору изози-мов эстеразы, карбоангидразы и кислой фосфатазы. Подобные данные были получены и нами при исследовании мутантов F. graminearum и F. sporotri-chiella (Кобыльский, Кобыльская, Дорохова, 1991). Наибольшее число изоферментов эстеразы (17) в спектре также было отмечено у высокопатогенного мутанта 760/6 F. sporotrichiella

Дейтеромицеты являются активными продуцентами токсичных метаболитов, поэтому интерес исследователей к токсинам, продуцируемым данными грибами, в том числе и S. nodorum Berk., как возможным факторам их патогенности вполне естественен. Нашими исследованиями показано, что высокопатогенные природные изоляты 176 Е, 538 Б и 85-254 гриба S. • nodorum Berk, отличаются повышенной способностью к продуцированию и секреции фитотоксинов. Изоляты 25 ДЖ и 143 Г, обладающие слабой патогенностью, уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов.

Высокопатогенные мутанты по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксинов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) также превалируют (за некоторыми исключениями) над слабопатогенными мутантами. Из приведенных данных следует, что между патогенностью S. nodorum Berk, и способностью . его к синтезу фитотоксинов, хотя и неспецифических, существует вполне определенная положительная связь. По литературным данным, наличие чёткой корреляции между образованием токсина цератоульмина и патогеностью обнаружено при изучении 47 изолятов Ceratocystis ulmi - анаморфа: Graphium ulmi Schwarz (Takai et al., 1983). Предполагается, что патогенность Cochliobolus victoriae - телеоморфа гриба Helminthdsporium victoriae - возбудителя заболевания овса обусловлена токсином викторином (Wolpert et al., 1995).

При анализе фитогормонов как возможных факторов патогенности основное внимание нами было обращено прежде всего на индолилуксусную кислоту (ИУК). Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость. Подобные данные были получены и в работе с изолятами гриба p. Fusarium, выделенными из семян кукурузы (Manka, 1980). Наиболее интересные данные, подтверждающие существование определенной связи между ИУК и вирулентностью, получены, как это отмечалось в обзоре (глава I), на бактериях (Liu et al., 1982; Kosuge et al., 1985; Косуге, Комаи, 1985).

Инфицирование растений, как известно, начинается с процесса прорастания спор на листьях. Поэтому нас, естественно, интересовало: различаются ли по активности ферментов и содержанию фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) покоящиеся споры, выделенные из культуры природных изолятов и мутантов S. nodorum Berk., и что происходит с указанными факторами патогенности на первых этапах их прорастания.

В результате проведенных экспериментов установлено, что покоящиеся споры высокопатогенного природного изолята 176 Е обладают примерно в два раза более высокой активностью Сх - целлюлазы и ксиланазы, чем споры слабопатогенного изолята 25 ДЖ при одинаковой удельной активности полигалактуроназы, Ci - целлюлазы и Р - глюкозидазы. В процессе прорастания спор у изолята 176 Е повышается активность всех изученных пекто- и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы и Ср целлюлазы, а у изолята 25 ДЖ - только полигалактуроназы и Сх - целлюлазы. При этом активность полигалактуроназы, С| — целлюлазы и ксиланазы у прорастающих спор высокопатогенного изолята 176 Е становится значительно выше, чем у слабопатогенного - 25 ДЖ.

Прорастание пикноспор сопровождается усиленной секрецией белка и ферментов в среду инкубации. Удельная активность пектолитических и целлюлолитических ферментов при этом возрастает в среде в несколько раз как у изолята 176 Е, так и у изолята 25 ДЖ. Однако и в этом случае при практически равной активности внеклеточных Ci - целлюлазы и (3 - глюко-зидазы более патогенный изолят 176 Е превосходит менее патогенный изолят 25 ДЖ по активности полигалактуроназы и ксиланазы.

Близкие результаты при изучении динамики активности пекто- и цел- ' люлолитических ферментов в процессе прорастания спор были получены • и у контрастных по патогенности мутантов. Показано, что покоящиеся поры высокопатогенных мутантов в отличие от слабопатогенных характеризуются повышенной активностью полигалактуроназы и (3 - глюкозидазы при практически равной активности Сх и Ci — целлюлазы. Преимущество высокопатогенных мутантов было продемонстрировано и при сравнении активности пекто- и целлюлолитических ферментов у прорастающих в течение 20 ч спор. Выяснилось, что споры высокопатогенных мутантов и в данном случае отличаются более высокой активностью полигалактурона- ' зы, (3 - глюкозидазы (тенденция) и, кроме того, Сх - целлюлазы на фоне ■ пониженной активности Ci — целлюлазы и ксиланазы.

Показано также, что наиболее значительно в спорах высокопатогенных мутантов на первых этапах их прорастания увеличивается активность (3 - глюкозидазы. Практически не изменяется активность Сх - целлюлазы и уменьшается - у полигалактуроназы и Ci - целлюлазы. Тенденция к снижению активности обнаруживается и у ксиланазы. Как оказалось, именно эти три фермента, особенно ксиланаза, наиболее интенсивно секретируются из прорастающих спор в инкубационную среду. Тогда как у (3 - глюкозидазы наблюдается пониженная секреция.

Из представленных данных следует, что прорастание спор гриба S. nodorum Berk, сопровождается активным продуцированием пектолитических и целлюлолитических ферментов и усиленной секрецией их в окружающую среду. Причем у высокопатогенных мутантов (штаммов) активность полигалактуроназы, (3 — глюкозидазы и Сх — целлюлазы, как правило, выше активности данных ферментов, выделенных из спор или культураль-ной среды слабопатогенных мутантов. Подтверждение участия пектолитиче-ских и целлюлолитических ферментов в самых ранних этапах инфекционного процесса, их связи с патогенностью возбудителей болезни можно найти и в работах с другими патогенами ( Sudo et al., 1973; Davet, 1976; Verhoeff, 1978; Koller et al., 1982; Wattad et al., 1997; Dumas et al., 1998).

Помимо пектолитических и целлюлолитических ферментов споры S. nodorum Berk., как выяснилось в дальнейших исследованиях, обладают достаточно высокой активностью ряда других гидролаз. Так, установлено, что удельная активность эстеразы у покоящихся спор природных изолятов гриба S. nodorum Berk, колеблется от 0,7 до 3,87 мкМ/мг белка, кислой фосфатазы - от 0,19 до 0,85, Р - глюкозидазы - от 0,08 до 1,35 мкМ/мг белка, РНК-азы - от 2,30 до 4,56 усл. ед./ мг белка.' Показано, что пикноспоры изолята 25 Д обладают минимальной активностью практически всех изученных ферментов. Для изолята 147 Е, напротив, характерна высокая активность ' гидролаз, особенно кислой фосфатазы, Р - глюкозидазы и РНК-азы. Установ- • лено, что в процессе прорастания пикноспор изолята 25 Д активность РНК -азы возрастает в 1,2 раза. Активность кислой фосфатазы у слабопатогенного мутанта при этом усиливается в 2,0 раза, а у высокопатогенных мутантов - в 2,5 — 13,5 раз. В экстрактах непроросших и проросших конидий Erysi-phe graminis f. sp. hordei также обнаружена активность ряда гидролитических ферментов: эстеразы, липазы, фосфатазы, протеазы, Р - 1,3 - глюканазы, хитиназы и амилазы (Fric, Wolf, 1994).

Процесс прорастания спор, кроме того, сопровождается изменениями в белковом спектре и в составе изоферментов. Представляют интерес, в ча- ■ стности, данные, полученные при изучении активности внутриклеточных РНК-аз в покоящихся и прорастающих спорах Aspergillus clavatus (Иванова, Полякова, 1982). Авторами обнаружена гетерогенность РНК-аз в спорах, характерная и для внеклеточных рибонуклеаз. В изоферментном спектре РНКаз найден стадиоспецифичный фермент, обнаруженный в покоящихся конидиях и исчезающий при прорастании. Прорастание спор гриба S. nodorum Berk., по нашим данным, также тесно связано с изменениями в изофермент-ных спектрах. В частности, в эстеразном спектре спорового материала мутантов обнаружено 12-15 (покоящиеся споры) и 10-16 зон активности (прорастающие споры). Следует отметить, что наименьшее число изоферментов в спектре (12- у покоящихся спор; 10 - у прорастающих) обнаружено у слабопатогенного мутанта, тогда как у высокопатогенных мутантов число изоферментов эстеразы колебалось от 14 до 15 у покоящихся и от 13 до 14 у прорастающих спор.

Эстеразные спектры покоящихся и прорастающих спор каждого мутанта сходны и отличаются друг от друга лишь 1-5 индивидуальными зонами. Однако обращает на себя внимание то, что у высокопатогенных мутантов индивидуальных линий в эстразном спектре и покоящихся, и прорастающих спор всё-таки больше.

Изозимный спектр пероксидазы у мутантов значительно беднее эсте-разного и содержит от 2 до 4 изоферментов. Максимальное число изоферментов пероксидазы у покоящихся (3) и прорастающих (4) спор обнаружена также у высокопатогенных мутантов.

Изменения в составе изоферментов в процессе прорастания спор S. nodorum Berk., по-видимому, свидетельствуют не только об усилении или ослаблении активности соответствующих ферментов, но и о избирательной секреции некоторых изоферментов из прорастающих спор в инкубационную среду.

Исследования динамики содержания фитотоксинов в спорах контрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk, в процессе их прорастания дали возможность установить следующее, на наш взгляд, основные закономерности. Во-первых высокопатогенные мутанты (штаммы, изоляты) гриба S. nodorum Berk., как правило, превалируют над слабопатогенными не только по числу, но и по количеству фитотоксинов, находящихся в исходном споровом материале. Во-вторых, они отличаются относительно более высокой скоростью как синтеза фитотоксинов, так и секреции их из прорастающих спор в окружающую инкубационную среду. Последнее может иметь особенно большое значение на самых ранних этапах развития взаимоотношений между патогеном и растением-хозяином.

Помимо фитотоксинов большой интерес представляло проследить за динамикой содержания ИУК в процессе прорастания спор. В результате проведенных экспериментов установлено, что свежевыделенные из пикнид гриба S. nodorum Berk, споры природного изолята содержат 16,6 нг ИУК на грамм сырой массы. Среди слабопатогенных, и среди высокопатогенных ■ мутантов встречаются формы как с повышенным, так и с пониженным содержанием ИУК. В среднем особых различий в количестве ИУК в покоящихся спорах мутантов, различающихся по патогенности, не обнаружено.

Через 20 часов прорастания спор ИУК присутствовала уже не только в прорастающих спорах, но и в инкубационной среде, в которой они находились это время. По суммарной ИУК (споры+среда) слабо- и высокопатогенные мутанты также практически не отличаются между собой. Однако обращает на себя внимание то, что в эти первые часы инкубации споры вы- ' сокопатогенных мутантов в среднем превосходят по содержанию ИУК споры • слабопатогенных мутантов, хотя при этом значительно уступают им по секреции ИУК во внешнюю среду. Это говорит о том, что обратная корреляционная зависимость между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его как к синтезу, так и секреции ИУК, обнаруженная у 3-, 7- и 10- суточной культуры патогена, у прорастающих спор прослеживается только лишь в отношении секреции ИУК из спор в культуральную среду.

Интересно, что и у биотрофных грибов, в частности в уредоспорах стеблевой ржавчины, обнаружены значительные количества ИУК (Умнов, • Артёменко, Чкаников, 1978). При прорастании спор запасённый в них ауксин . выделяется в культуральную среду, (Умнов, Артёменко, Чкаников, 1984). Этот процесс продолжается на протяжении всего периода развития уредоспор вплоть до образования инфекционных структур гриба. Установлено, что в уредоспорах, проросших спорах и среде, на которой прорастали споры, количество ИУК колеблется от 40 до 100 нг/г сырого веса (Wiese, Grambow, 1986). Сравнительное изучение динамики содержания ИУК в уредоспорах возбудителей двух видов ржавчины показало, что уредоспоры бурой ржавчины отличаются от уредоспор стеблевой ржавчины более низким содержанием ИУК, в том числе свободной, и при прорастании не выделяют ауксин в культуральную жидкость (Чкаников, Артеменко, Гринченко, 1990).

Существенные различия между слабо- и высокопатогенными мутантами S. nodorum Berk, были выявлены и при исследовании системы "растение-хозяин-патоген". Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 слабопатогенным мутантом уже на третьи сутки приводит к повышению содержания ИУК в листьях на 81,8% и снижению активности полигалактуроназы и кислой фосфатазы на 70,2 и 15,7% соответственно. Активность других изученных ферментов при этом остается без изменений. Использование высокопатогенного мутанта практически не вызывает на данном этапе каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, за исключением Q - целлюлазы, повышение активности кислой фосфатазы (на 17,8%) и, особенно, пероксидазы (в 2,4 ■ раза).

На 7-е и 10-е сутки после инокуляции количество ИУК в листьях пшеницы под влиянием S. nodorum Berk, возрастает в 1,5-2,5 и 1,6-3,2 раза соответственно. Активность полигалактуроназы, Сх — целлюлазы, р — глюкозидазы становится выше, чем в контроле, на 7-е, а Ci — целлюлазы и ксиланазы - на 10-е сутки (слабопатогенный мутант). Активность кислой фосфатазы на 7-е сутки оставалась значительно ниже, чем в контроле, однако, на 10е сутки она полностью восстанавливалась, а у пероксидазы возрастала на 13,3 (7-е) и 49,4% (10-е сутки). При использовании высокопатогенного мутанта на фоне спада активности ферментов у здоровых растений в листьях инфицированных растений сначала возрастает активность полигалактуроназы, Сх — целлюлазы и Р — глюкозидазы (7-е сутки), а затем и Ci - целлюлазы, (10-е сутки). Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже на 3-й сутки, сохраняется на всём протяжении опыта.

Инфицирование S. nodorum Berk, растений пшеницы относительно устойчивого к септориозу сорта Castan не вызывает в течение 7 суток отклонений в содержании ИУК в листьях по отношению к контролю и только к концу опыта повышает её уровень на 20,0 -33,3%. Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов S. nodorum Berk, на синтез ИУК не обнаружено. Что касается ферментов, то в целом инфицированные слабопатогенным мутантом растения пшеницы на ранних этапах патогенеза отличаются низкой активностью полигалактуроназы, кислой фосфатазы и, напротив, значительно более высокой активностью Сх - целлюлазы. По активности остальных пекто- и целлюлолитических ферментов пораженные растения данного сорта на протяжении всего опыта были равны или несколько уступали здоровым. Близкие результаты были получены и при использо1 вании высокопатогенного мутанта.

Активность пероксидазы под влиянием слабопатогенного мутанта на сорте Castan повышается только через 7 суток после инокуляции, хотя первые признаки усиления активности фермента можно было обнаружить уже через 3-е суток, а под влиянием высокопатогенного мутанта - на всем протяжении опыта, причем уже через 3-е суток активность фермента возрастает в 2,3 раза.

Инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 мутантами гриба S. nodorum Berk, приводит к значительным изменениям и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и оксидоредуктаз. Однако влияние высокопатогенного мутанта является более эффективным, особенно в отношении изоферментов Р — глюкозидазы и эстеразы.

Исследования, проведенные на относительно устойчивом к септорио-зу сорте Castan не выявили существенных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов S. nodorum Berk. на изоферментный спектр Р — глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы. В то же время показано, что высокопатогенный мутант в отличие от слабопатогенного уже на 3-й сутки после инокуляции вызывает появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12 - 0,15. Кроме того, под влиянием мутанта повышается активность некоторых из изоферментов пероксидазы.

Полученные в процессе физиолого-биохимических исследований системы "растение-хозяин-патоген" результаты подтверждаются литературными данными. Так, показано, что инфицирование листьев пшеницы возбудителем стеблевой ржавчины (совместимая комбинация) приводит к резкому увеличению количества ИУК в период споруляции патогена (Чканинов, Ар-тёменко, Гринченко, 1990). При заражении растений пшеницы бурой ржавчиной эти показатели изменялись незначительно, что хорошо согласуется с относительно слабым накоплением ауксина уредоспорами возбудителя. Особый интерес в связи с этим заслуживают данные, полученные при изучении роли гормонального баланса в растениях пшеницы, инфицированных септориозом. Обнаружено, что заражение растений пшеницы спорами S. nodorum Berk, приводит к накоплению ИУК (Хайрулин и др., 1993). Особенно существенное увеличение уровня ИУК в ходе развития болезни наблюдалось в проростках восприимчивого сорта Саратовская 29. На 6-е сутки после инокуляции содержание ИУК в инфицированных проростках было в 1,5 раза, а на 9-е — более чем в 2,5 раза выше по сравнению с контролем. У растений относительно устойчивого к септориозу сорта Диамант таких изменений в содержании ИУК не наблюдалось. В.А. Васюк (1995) в своей работе также отмечает высокую активность веществ гормональной природы в процессе патогенеза.

Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов у больных растений, согласно литературным данным (Mehta et al., 1974; Ra-benantoandro, Auriol, 1975; Rabenantoandro et al., 1976; Wasfy et al., 1977; Anderson, Powelson, 1979;Kaur,Desphande, 1980; Sathiyanathan, Vidhyaseka-ran, 1980), как правило, выше, чем у здоровых, хотя динамика изменения активности ферментов, вызванная патогеном, во многом определяется природой как самого патогена, так и растения-хозяина. Необходимо, однако заметить, что усиление под влиянием инфекции активности может затрагивать не весь комплекс пекто- и целлюлолитических ферментов, а какой-либо один фермент или даже изофермент. Так, гниль растительных тканей, вызванная грибом Botrytis cinerea, всегда сопровождается выраженной активностью полигалактуроназы PG - 4, особенно в начале гниения по краю поврежденной ткани (Van der Cryssen et al., 1994).

Одним из критериев участия ферментов, фитотоксинов и фитогормо-нов, продуцируемых патогенами, в механизме инфицирования растений является способность их при экзогенном применении вызывать у растений повреждения, характерные для самого возбудителя болезни. Так, обработка стеблей и листьев растений томатов частично очищенными пектинлиазой и полигалактуроназой Verticillium albo-atrum приводит к проявлению симптомов заболевания, включая образование гелей в сосудах (Cooper, Wood, 1980). По нашим данным, ферментные препараты, выделенные из мицелия гриба S. nodorum Berk., при нанесении их на листовую поверхность вызывают повреждения, характерные для септориоза. Обработка растений раствором СаС12, способного ингибировать активность эндо- и экзополигалактуроназы грибов Verticillium albo-atrum и Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Cooper, Rankin, 1978; Buescher, Hobson, 1982), не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk.

Все выделенные из культуры гриба S. nodorum Berk, фитотоксины, при нанесении на изолированные листья или интактные растения пшеницы не способны вызывать внешние симптомы поражения, характерные для септориоза. Вместе с тем установлено, что при добавлении в споровую суспензию S. nodorum Berk, они, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5,повышают степень поражения инфицированных растений пшеницы септориозом.

Согласно литературным данным (Kleiner, 1.983), ИУК, НУК, индол-3-масляная кислота, 2,4-Д и кинетин угнетают или замедляют прорастание спор Pyricularia oryzae и формирование апрессориев при прямом контакте гриба с веществом. Высокие концентрации ИУК подавляют развитие гриба Puccinia graminis f. sp. tritici (Grambov, Tucks, 1979), а пассирование гриба Fusarium culmorum на средах, содержащих этиленпродуцент этрел, приводит к ингибированию мицелиального роста, споруляции и прорастания спор (Michniewicz, Rozej, 1991; Michniewicz, 1992). Наши исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание .пикноспор гриба, ингиби-рует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК и кинетин в концентрации 10-25 мкг/мл и также подавляют рост гиф. Дальнейшее увеличение концентрации этих гормонов, как и в варианте с ГК, не приводило к усилению эффекта. В случае с АБК слабый ингибирующий эффект проявляется только при концентрации 50 мкг/мл. С увеличением концентрации АБК до 75 и 100 мкг/мл наблюдается значительное подавление роста гиф гриба S. nodorum Berk.

Анализ литературных данных показывает, что экзогенные фитогор-моны могут оказывать значительное воздействие на поражаемость растений различными болезнями. Причем данный эффект не обязательно связан с непосредственным влиянием фитогормонов на патоген. Так, в работе Н.Г.

Митрофанова и В.М. Чекурова (1983) показано, что обработка раствором гиббереллина и ауксина в концентрации 30 мг/л растений мягкой пшеницы в фазу проростков и кущения повышает поражаемость листьев бурой ржавчиной. По данным И.М. Левина (1984), развитие бурой ржавчины на растениях восприимчивых сортов пшеницы стимулируется оптимальными концентрациями гиббереллинов, ИУК, кинетина и угнетается АБК, этрелом, высокой концентрацией ИУК.

В результате проведенных нами исследований установлено, что предобработка растений пшеницы сортов Крестьянка, Кутулукская (восприимчивые) и Castan (относительно устойчивый к септориозу) фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk, снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона его концентрации и сорта пшеницы на 12,2 - 65,1%. Наибольший эффект наблюдается при обработке растений кинетином, за ним следуют ИУК, ГК и, наконец, АБК. Фитогормоны изменяют тип реакции сортов на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и, вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

Таким образом, в результате'проведенных исследований с использованием в качестве объекта фитопатогенного гриба S. nodorum Berk, были получены новые экспериментальные данные, характеризующие некоторые биологические и биохимические особенности дейтеромицетов, которые могут непосредственно или опосредованно влиять на проявление ими патогенных свойств.

Установлено, что S. nodorum Berk, прекрасно растет как на природных, так и на синтетических (полусинтетических) питательных средах, не испытывает потребности в каких-либо специфических факторах роста, обладает слабо выраженной (широкой) физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. Все это способствует лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды и проявлению им высокой патогенности. ,

Из приведенных данных следует, что возбудитель септориоза пшеницы - S. nodorum Berk, способен к продуцированию-всех предполагаемых биохимических факторов патогенности, а именно: комплекса пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК.

Показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S. nodorum Berk, обладают и более высокой активностью пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (г=0,67) и Р-глюкозидазы (г=0,70). Они превалируют над слабопатогенными штаммами по количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов, а также по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая -кислота). Между патоген-ностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Исследованиями установлено, что процесс прорастания спор гриба S. nodorum Berk., с которого, как известно, начинается инфицирование растений, сопровождается усиленным продуцированием пектолитических и целлюлолитических ферментов, ксиланазы и других гидролаз, изменениями в составе изоферментов, а также активным синтезом фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК. Одновременно в значительной степени активизируется и процесс секреции ферментов, фитотоксинов и ИУК из прорастающих спор в инкубационную среду. Высокопатогенные мутанты S. nodorum Berk, по активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы, Р — глюкозидазы и Сх — целлюлазы, количеству и общему содержанию фитотоксинов и ИУК в прорастающих спорах, как правило, превосходят слабопатогенные мутанты. Подобная закономерность выявлена и в отношении интенсивности секреции ферментов и фитотоксинов из прорастающих спор в инкубационную среду. В то же время по темпам секреции ИУК во внешнюю среду споры высокопатогенных мутантов, уступают спорам слабопатогенных мутантов.

При исследовании системы "растение-хозяин-патоген" обнаружено, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в отличие от слабопатогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких-либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пек-то- и целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение активности кислой фосфатазы и, особенно, пероксидазы. С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает. Повышается активность полигалактуроназы, Сх - целлюлазы и (3 - глюкозидазы (7-е сутки), а затем и Ci - целлюлазы. Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всём протяжении опыта. Отмечено более значительное влияние мутанта и на изоферментные -спектры особенно в отношении Р - глюкозидазы и эстеразы.

У относительно устойчивого к септориозу сорта Castan инфицирование только к концу опыта повышает содержание ИУК в листьях на 20,0 -33,3%. Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов на синтез ИУК не обнаружено. Не выявлено особых различий и в воздействии мутантов на динамику активности пекто- и целлюлолитических ферментов. Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта, которое сопровождалось появлением в спектре дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12 - 0,15, было отмечено и на данном сорте.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные говорят о том, что ферменты (прежде всего пекто- и целлюлолитические), фитотоксины и ИУК, продуцируемые S. nodorum Berk., принимают непосредственное участие не только на начальных этапах инфицирования растений пшеницы, но и на протяжении всего процесса патогенеза септориоза вплоть до начала споруляции гриба и проявления на листьях видимых симптомов поражения. Все это дает основание к заключению, что исследованные нами пекто- и цел-люлолитические ферменты, фитотоксины и фитогормоны действительно являются факторами патогенности гриба S. nodorum Berk., хотя и выполняющими, по всей видимости, различные функции, -s

ИУК является основным элементом в системе гормональной регуляции у растений. В соответствии с механизмом действия ауксина на рост растяжением ИУК проникает в клетку, взаимодействует с рецептором, индуцирует работу АТФазной Н^-помпы, что сопровождается увеличением мембранного потенциала (Полевой, 1986). По последним данным (Шишова, 1999), рецепторный комплекс ауксина в плазмалемме растительных клеток состоит из трансмембранного домена, представленного Са2+ -каналом, и ре-цепторного домена-ауксинсвязывающего белка 1. Снижение концентрации и повышение концентрации ионов Hf приводит к активации работы Н4"-АТФазы - одного из ключевых ферментов в механизме действия ауксина.

Фитотоксины, по литературным данным, блокируют способность устьиц адекватно реагировать на изменение внешцих условий (Bousquet et al., 1976), оказывают разобщающее действие на окислительное фосфолирова-ние, сходное с действием 2,4-динитрофенола, что приводит к нарушению или прекращению биосинтеза АТФ (Bousquet et al., 1980), влияют на электрическое сопротивление плазматических мембран (Лялин и др., 1980).

Реализация участия ферментов, фитотоксинов и фитогормонов в патогенезе септориоза происходит в несколько этапов, а именно: проникновение (внедрение) гриба в растение, подавление защитных механизмов, изменение метаболизма растения-хозяина с целью создания более благоприятных для патогена условий и распространение паразита по растению.

В связи с этим, обобщая собственные экспериментальные и литературные данные, можно предложить следующую гипотетическую схему взаимодействия гриба S. nodorum Berk, и растения-хозяина на самых ранних этапах патогенеза (рис. ). Споры гриба S. nodorum Berk, оседают на поверхность листьев растений, закрепляются с помощью' комплекса веществ, в том числе гликопротеинов, входящих в состав слизи, и при соответствующих условиях влажности (80-100%) и температуры начинают прорастать (1-е сутки после инокуляции).

Этот процесс сопровождается активным синтезом и секрецией из спор в инфекционную каплю гидролитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов, в частности, ИУК. Находящиеся в составе ферментов кутиназа и неспецефические эстеразы прежде всего разрушают кутикулу. Затем ИУК локально проникает через эпидермис растения-хозяина и включает мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки (Полевой, 1986; Шишова, 1999). В результате работы данного механизма активируется Са -канал и работа Н4^ -АТФазы, что в конечном счете, приводит к закислению за счет ионов ET клеточных стенок, вытеснению из них Са2+ и активации ферментов растения-хозяина. Последнее приводит к разрыхлению и размягчению клеточных стенок, что делает их более уязвимыми со стороны пекто-и целлюлолитических ферментов гриба. Наблюдающееся затем локальное разрушение клеточных стенок обеспечивает проникновение ростковых трубок S. nodorum Berk, внутрь клетки. Одновременно через образовавшиеся от-верствия в клетку попадают и фитотоксины, которые, как известно, самостоятельно не могут проникать в ткани растений.

Рис. Схема взаимодействия S. nodorum Berk, с растениями пшеницы на ранних этапах патогенеза

Представленная схема разработана для случая активного проникновения патогена через клеточные стенки обычных эпидермальных клеток в ткал ни растений с помощью пекто- и целлюлолитических ферментов. Она особенно, по-видимому, применима для так называемых пузыревидных клеток (клеток растяжения), которые характерны для эпидермиса злаков и других однодольных (Эсау, 1969).

По описанной схеме, на наш взгляд, может происходить заражение и . перезаражение клеток растения-хозяина патогеном и в случае первичного его проникновения не через клеточные стенки эпидермиса, а через устьица.

Из приведенной схемы видно, что на этапе проникновения фитотоксины не выполняют активных функций. Основная их роль, если учесть свойства, описанные выше, сводится к подавлению защитных механизмов растения-хозяина, то есть обеспечению второго этапа патогенеза (1-3 сутки).

В дальнейшем (7-е и 10-е сутки) лидирующие позиции снова занимают фитогормоны и ферменты. К этому моменту в листьях растения-хозяина . (восприимчивый сорт) значительно возрастает содержание ИУК и повышает- . ся активность пекто- и целлюлолитических ферментов, а возможно, и других гидролаз. Если учесть, что грибы p. Septoria способны к продуцированию и цитокининов (Васюк и др., 1996 б), то тем самым создаются все необходимые предпосылки к изменению метаболизма растения-хозяина и обеспечению оптимальных для роста и развития патоген^ условий.

Распространение патогена по тканям растения-хозяина обеспечивается, на наш взгляд, тем же ферментативно-гормональным механизмом, который используется при первичном внедрении гриба. С той лишь разницей, . что при перемещении гиф межклетно (без захода в клетку) вполне достаточно, по-видимому, одного ферментативного аппарата.

Представленная схема или модель взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk, и растений пшеницы на уровне пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК), разработанная на основе результатов собственных исследований и данных литературы, может служить теоретической основой направленного поиска новых средств химической защиты посевов пшеницы от септориоза.

С учетом изложенного в составленных нами "Рекомендациях." (приложение 3) с целью создания новых фунгицидов предлагается вести синтез и скрининг соединений, способных:а) ингибировать активность пектолитических и целлюлолитических ферментов гриба S. nodorum Berk.; б) препятствовать действию фитотоксинов, детоксицировать или подавлять их синтез; в) выступать в роли антиауксина.

Кроме того, данная модель, особенно с учетом реакции сорта Castan на патоген, может быть использована и для создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы. Одним из наиболее вероятных путей решения этой задачи является, на наш взгляд, использование фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в биотехнологии и клеточной селекции в качестве селектирующего фактора. С целью проверки данного предположения препараты фитотоксинов были переданы нами в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина и получены предварительные положительные результаты, позволяющие судить о действии фитотоксинов на клеточные культуры различных сортов пшеницы (приложение 4). Подобные данные были получены и другими авторами (Гирко и др., 1993; Keller et al., 1994).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Кобыльский, Геннадий Иванович, Тамбов

1. Аврова, А.О. ГлюкоЗидазная активность при взаимодействии томатов с Alternaria solani / А.О. Аврова // Научно-технич. бюл. ВНИИ растениеводства.- 1993.- № 230.- С. 49-50.

2. Аркадьева, З.А. Промышленная микробиология/ З.А.Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н.Блохина и др. Под ред. Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989.-688 с.

3. Артеменко, Е.Н. Спектрофлуоро-метрическое- определение индолилук-сусной кислоты / Е.Н.Артеменко, Д.И. Чкаников, A.M. Макеев// Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов. М.: Наука, 1973. - С. 22 - 24.

4. Асада, Я. Последние достижения японских учёных в исследовании физиологии заражения растений / Я. Асада // Инфекционные болезни растений: Физиологические и биохимические основы. М.: Агропромиз-дат, 1985.-С. 11-23.

5. Афанасенко, О.С. Изменчивость популяций возбудителей гельминтоспо-риозных пятнистостей ячменя и генетический контроль устойчивости к Pyrenophora teres Drechs. / О.С Афанасенко // Автореферат дисс. докт. биол. наук.- СПб, 1996.-41 с.

6. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов / З.Э. Беккер.- М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988.-230 с.

7. Белякова, Г.А. Токсические метаболиты грибов рода Alternaria. I. Специфические токсины / Г.А. Белякова, JT.M. Лёвкина //Микол. и фитопа-тол. 1990. - 24, № 2. - С. 128 - 136.

8. Берестецкий, О.А. Фитотоксичные метаболиты почвенного гриба Aspergillus ochraceus Wilgelm / О.А. Берестецкий, Т.А. Мамедов, А.В. Боровков // Доклады ВАСХНИЛ. 1979. - №12. - С. 15-17.

9. Бнлай, В.И. Ядовитые грибы на зерне хлебных злаков. Биология и систематика грибов секции Sporotrichiella рода Fusarium / В.И. Билай.- Киев, Изд-во АН УССР, 1953.- 94 с.

10. Билай, В.И. Фузарии / В.И. Билай,- Киев: Наук, думка, 1977.- 440 с.

11. Билай, В.И. Микроорганизмы — возбудители'болезней растений. Справочник / В.И. Билай, Р.И. Гвоздяк, И.Г. Скрипаль и др.; Под ред. Билай . В.И.- Киев, Наук, думка, 1988.- 552 с.

12. Бондарцев, А.Е. Шкала цветов (пособие для биологов при научных и научно-прикладных исследованиях)/А.Е. Бондарцев — М.: Издательство АН СССР, 1954.-27 с.

13. Бородин, Г.И. Физиолого-биохимические основы патогенности возбудителя вертициллезного вилта хлопчатника /Г.И. Бородин, В.И. Рунов. -Ташкент: Изд-во «Фан», 1983.- 176 с.

14. Бочарова, Е.В. Фитотоксины гриба Septoria nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза / Е.В. Бочарова // Автореферат дисс. канд. биол. на-ку. — Голицыно, 1991 24 с.

15. Бэйли, Дж. Методы химии белков / Дж. Бэйли. М.: Мир, 1965. - 284 с.

16. Валуев1ч, А.А. Пол1марф1зм па вирулентнасщ грыба Septoria nodorum (Berk.) Berk, як патагену трыщкале ва умовах Беларус! / А.А. Валуев1ч, А.Ю Лупей, Г.М. Гардзей, Т.А.Гардзей // Весщ АН Беларусь Сер. б1ял. н.- 1992.-№3-4.-С. 26-31.

17. Валынец, А.П. Цитокинины фитопатогенного гриба Helminthosporium teres Sacc. / А.П. Валынец, Н.В. Афанасьева // Докл. АН БССР. 1989. -33, № 8. - С. 744 - 746.

18. Валынец, А.П. Абсцызавая юслота як магчымы 1пдуктар патагенезу /

19. A.П. Валынец, Н.В. Афанасьева // Весщ АН БССР Сер. б1ял. н. 1990. - ' № 1 - С. 28 - 30.

20. Васецкая, М.Н. Методические указания по оценке сортов зерновых культур на устойчивость к септориозу в полевых условиях/ М.Н. Васецкая, Г.Н. Куликова, Ч.А. Баймакова, Т.И. Борзионова. Алма - Ата, Кай-нар, 1983. - 6 с.

21. Васецкая, М.Н.Возбудитель септориоза пшеницы / М.Н. Васецкая, Т.И. Борзионова//Вест. с.-х. науки Казахстана.- 1987.- № 3.- С. 45-47.

22. Васецкая, М.Н. Септориоз на Алтае / М.Н. Васецкая, В.М. Столяров // Защита раст. (Москва). 1988.- № 11.- С. 15.

23. Васецкая, М.Н. Состояние и перспективы развития исследований септо- • риоза пшеницы в СССР / М.Н. Васецкая // Повыш. продуктивности и устойчивости пр-ва зерна озимой пшеницы в СССР.- Мироновка, 1989.- С. 115-134.

24. Васюк, В.А. (Штогормоны в систем! «рослина ф1топатогенный гриб» /

25. B.А. Васюк // Укр. ботан. ж. 1995 - 52, № 4. - С. 505 - 514.

26. Васюк, В.А. Цитоюнши ф!топатогенных гриб1в Septoria tritici Rob. ex. Desm и Stagonospora nodorum (Berk) Cast et Germ. (Septoria nodorum (Berk) Berk) / В.А. Васюк, T.B. Андр1анова, Л.И. Мусатенко // Укр. ботан. • ж. 1996b. - 53, № 6. - С. 717 - 721.

27. Волынец, А.П.Определение гиббереллинов в растительном материале / А.П. Волынец, JI.A. Пальченко // Физиол. раст. 1976. - 23, № 3 - С. 635 - 642.

28. Гавриленко В.Ф. Большой практикум по физиологии растений / В.Ф. Гавриленко, М.Е. Ладыгина, JI.M. Хандобина. М.: Высшая школа, 1975.-392 с.

29. Гальченко, В.Ф.Нумерический анализ белковых электрофореграмм об-лигатных метанотрофных бактерий / В.Ф. Гальченко, А.И. Нестеров // Микробиология 1981.-50, №6. - С. 973 - 979.

30. Гамбург, К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений / К.З. Гамбург. Новосибирск: Изд-во "Наука" Сиб. отд. 1976., - 272 с.

31. Гильманов, М.К. Методы очистки и изучения ферментов растений / М.К. Гильманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев. Алма-Ата: Наука, 1981. -92 с.

32. Гирко, B.C. Оценка устойчивости пшеницы к действию культуральных фильтратов грибных патогенов в культуре незрелых зародышей / B.C. Гирко, С.И. Волощук, А.А. Залисский, Т.П. Руденко. // С. х. биол. Сер. Биол. раст. - 1993 . - № 1 - С. 62 - 70.

33. Головин, П.Н. Фитопатология / П.Н. Головин, М.В. Арсеньева, З.Н. Ха-леева, З.И. Шестиперова; Под ред. М.В. Горленко.- JL: Колос, 1980.- 319 с.

34. Гонтаренко, О.В. Пятнистости листьев пшеницы и тритикале на юге Украины / О.В. Гонтаренко, JI.T. Бабаянц, М.А. Гержова // Микол. и фито-патол. 1998.- 32, №2.- С. 61-64.

35. Гродзинский, А.М.Краткий справочник по физиологии растений / A.M. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. Киев, Наукова думка, 1973. - 592 с.

36. Гуревич, JI.C. Гиббереллиноподобные вещества и биогенные стимуляторы в спорах грибов возбудителей пыльной и пузырчатой головни кукурузы / Л.С. Гуревич // Проблемы онкологии и тератологии растений. - Л.: Наука, 1975. - С. 477 - 482.

37. Гусева, Н.Н. Иммунологические основы селекции хлопчатника на устойчивость к вилту / Н.Н. Гусева.- М.: Колос, 1980,- 240 с.

38. Дейли, Дж. М. Специфичные для хозяев токсины грибов Helmin-thosporum / Дж. М. Дейли // Инфекционные болезни растений: Физиологические и биохимические основы. М.: Агропромиздат, 1985. - С. 222 -242.

39. Деревянкин, А.И. Способы хранения инфекции возбудителей септориоза пшеницы / А.И. Деревянкин // Труды Латв. с.-х. акад.т 1972.- вып. 23.- С. 10-12.

40. Дёрфлинг, К. Гормоны растений. Системный1 подход / К. Дёрфлинг. -М.: Мир, 1985 -304 с.

41. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. М.: Колос, 1979.-416 с.

42. Дубиневич, Б.Н. Септориоз озимой пшеницы / Б.Н. Дубиневич // Бюлл. Мироновского НИИ сел. и сем-ва пшеницы.- Киев, 1971.- вып. 2.- С. 8081.

43. Дурбин, Р.Д. Сайты действия детерминантов болезни и проявление симптомов / Р.Д. Дурбин // Инфекционные болезни растений: Физиологические и биохимические основы. М.: Агропромиздат, 1985. - С. 24 - 33.

44. Дымина, Е.В. От чего зависит развитие септориоза яровой пшеницы / Е.В. Дымина//Защита растений.- 1997.-№ 12.- С. 12.

45. Дьяков, Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков. М.: Изд. дом "Муравей", 1998. - 384 с.

46. Дьяков, Ю.Т. Общая и молекулярная фитопатология: учебное пособие / • Ю.Т. Дьяков, O.JI. Озерецковская, В.Г. Джавахия, С.Ф. Багирова. М.: • Изд. Общество фитопатологов, 2001. - 302 с.

47. Езепчук, Ю.В. Биоммолекулярные основы патогенности бактерий / Ю.В. Езепчук М.: Наука, 1977. - 215 с.

48. Жданов, Ю.А. Выявление р глюкозидаз в полиакриламидном геле с применением синтетических нафтоловых субстратов и различных диа-зониевых солей / Ю.А. Жданов, P.M. Кесслер, Н.Р. Якубова // Физиол. раст. - 1978. - 25, № 6. - С. 1281 - 1287.

49. Жемчужина, Н.С. Характеристика факторов, влияющих на выход и • степень регенерации протопластов Septoria nodorum и Pyricularia oryzae . / Н.С. Жемчужина, А.Б. Соболева // Биол. науки. 1984. - № 3. - С. 102 -108.

50. Закордонец, Л.А.Влияние индолилуксусной ксилоты и триптофана на биосинтез биологически активных веществ у Fusarium moniliforme / Л.А. Закордонец, С.М. Супрун, Л.И. Пустовалова // Микробиол. ж. 1982. -44, № 1.-С. 82 - 84.

51. Захаров, И.А.Мутационный процесс у грибов. / И.А. Захаров, С.В. Ко-вальцова, Т.Н. Кожина и др. Л.: Наука, 1980. - 287 с.

52. Иванова, Г.С. Изменение уровня РНКазных активностей при прорастании спор Aspergillus clavatus / Г.С. Иванова, А.В. Полякова // Ростов. н/Д ун-т., Ростов-н/ Д, 1981, 9 с. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ 11 янв. 1982 г, № 134-82 деп.)

53. Йодер, O.K. Генетический анализ как средство определения роли специфических токсинов и других факторов при заболеваниях растений / Л.К. Йодер // Борьба с болезнями растений: устойчивость и восприимчивость. -М.: "Колос", 1984.-293 с.

54. Караваева, К.А. Определение абцизовой кислоты в растениях с помощью газожидкостной хроматографии / К.А. Караваева, А.А. Беззубов, Н.П. Кораблева//Биохимические методы. М., Наука. - 1980. - С. 185 - 187.

55. Кармолиев, Р.Х. Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии / Р.Х. Кармолиев М.: Колос, 1971. - 288 с.

56. Кашуба, О.В. Видовой состав и вредоносность возбудителей септориоза яровой пшеницы / О.В. Кашуба // Болезни с.-х. культур и борьба с ними в Сибири.- Новосибирск, 1989.- С. 50-55.

57. Кефели, В.И. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота / В.И. Кефели, Э.М. Коф, П.В. Власов, Е.Н. Кислин. - М.: Наука, 1989. - 184 с.

58. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография ( в 2-х томах) / Ю. Кирхнер. -М.: Мир, 1981.

59. Кислин, Е.Н. Индолилуксусная и абсцизовая кислоты в побегах винограда. Количественный подход в анализу / Е.Н. Кислин, В.И. Кефели // Физиология раст.- 1981.-28, №1.-С. 156- 162.

60. Кислин, Е.Н. Асбцизовая и индолил-3-уксусная кислота в культуре корней гороха. Газохроматорафический и хромато-масс-спектрометричес-кий анализ /Е.Н. Кислин, В.А. Богданов, Р.Н. Щелоков и др. // Физиоло- • гия раст. 1983. - 30, № 1. - С. 187 - 194.

61. Клечковская, Е.А. Эколого-биохимическая характеристика Fusarium spp. на озимой пшенице в Причерноморской степи Украины / Е.А. Клечковская // Микол. и фитопатол.- 1999.- 33, № 4.- С. 280-289.

62. Кобыльский, Г.И. Влияние гиббереллина на секрецию а амилазы половинками семян пшеницы / Г.И Кобыльский, А.Н. Письменов // Вопросы экологии и физиол. раст. Элиста, Изд,-во Калм. госуниверситета, 1974.-С. 122- 125.

63. Кобыльский, Г.И. Активность и изозимный спектр некоторых ферментов у мутантов грибов возбудителей фузариоза зерновых / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская, Е.Г. Дорохова // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1991. -№ 6. - С. 44 - 48.

64. Коваленко, С.Н. Источники инфекции возбудителей септориоза пшеницы / С.Н. Коваленко // Интегрирован, защита раст. от вредителей и болезней зерн. и корм, культур.- Киев, 1981.- С. 93-96.

65. Косуге, Т. Регулирование метаболизма при взаимодействии патогена и хозяина с точки зрения влияния патогена / Т. Косуге, Л. Комаи // Инфекционные болезни растений: физиологические и биохимические основы. М.: Агропромиздат, 1985. - С. 185 - 194.

66. Кулаева О.Н. Цитокинины их структура и функция / О.Н. Кулаева. М: Наука, 1973.-264 с.

67. Курзина, J1.B. Метод определения КМЦ-азлой активности целлюлаз / JI.B. Курзина, JI.B. Воробьёва, П.Н. Евтихов, Г.К. Коровинская // Новое в получении и применении ферментов. М.: Колос, 1980. - С. 58 - 63.

68. Кучеренко, Н.Е. Биохимический справочник / Н.Е. Кучеренко, Р.П. Виноградова, А.Р. Литвиненко и др. Киев; "Вища школа", 1979. - 304 с.

69. Лавриченко, М.В. Септориоз яровой пшеницы: методы определения семенной инфекции / М.В. Лавриченко //Микол. и фитопатол.- 1987.- 21, № 2.- С. 171-173.

70. Лебедева, Л.Н. Септориоз яровой пшеницы в Новосибирской обл. и меры борьбы с ним / Л.Н. Лебедева // Автореферат диссерт.канд. биол. наук.-Харьков, 1964.

71. Левин, И.М. Влияние фитогормонов на интенсивность развития бурой ржавчины на изолированных листьях пшеницы / И.М. Левин // Физиол. раст. 1984. - 31, № 2. - С. 356 - 361.

72. Левитес, Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. Новосибирск, Наука, 1986.

73. Левитин, М.М. Генетика несовершенных грибов / М.М. Левитин // Генетические основы устиойчивости растений к болезням. Л.: Колос, 1977. -С. 109-118.

74. Левитин, М.М. Генетические механизмы изменчивости фитопатогенных грибов / М.М. Левитин // Изменчивость фитопатогенных грибов. М.: Колос, 1983.-С. 31-38.

75. Левитин, М.М. Генетические основы изменчивости фитопатогенных грибов / М.М. Левитин. Л.: Агропромиздат, 1986. - 208 с.

76. Лисенко, С.В. Септорюз листя / С.В. Лисенко, C.I. Колом1ець // Захист рослин.-1998.-№ 3.- С.8.

77. Ложникова, В.Н. Определение природных гиббереллинов в растительных тканях / В.Н. Ложникова, Л.П. Хлопенкова, М.Х. Чайлахян // Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов. М.: Наука, 1973. - С. 50 - 58.

78. Максимов, И.В. Гормональный баланс ИУК/АБК в растениях пшеницы при инфицировании септориозом / И.В. Максимов, Ф.М. Шакирова, P.M. Хайруллин, М.В. Безрукова // Микол. и фитопатол. 1996. - 30, № 3. - С. 75 - 83.

79. Маурер, Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. - 271 с.

80. Мацкевич, Н.В. Спойтанная изменчивость и кариология несовершенных грибов / Н.В. Мацкевич. М.: Наука, 1981. - 184 с.

81. Методы экспериментальной микологии Киев, Наукова думка, 1973. -243 с.

82. Методы экспериментальной микологии. Справочник / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская и др., под. ред. В.И. Билай. Киев, Наукова думка, 1982 - 552 с.

83. Митрофанов, Н.Г. Влияние фитогормонов на поражаемость бурой ржавчиной яровой пшеницы / Н.Г. Митрофанов, В.М. Чекуров // Роль фитогормонов в проявлении некоторых признаков у растений. Новосибирск, 1983. - С. 133 - 140.

84. Можина, И.А. Сравнительное изучение популяций Thielaviopsis basicola . (Berk, et Br.) Ferraris. III. Электрофоретические спектры белковых систем / И.А. Можина, В.А. Терехова, Ю.Т. Дьяков // Микол. и фитопатол. -1986. 20, №4. - С. 271 -276.

85. Муромцев, Г.С. Гормоны растений гиббереллины / Г.С. Муромцев, В.Н. Агнистикова. М.: Наука, 1973. - 272 с.

86. Муромцев, Г.С.Основы химической регуляции роста и продуктивности растений /Г.С. Муромцев, Д.И. Чкаников, О.Н. Кулаева, К.З. Гамбург. М: Агропромиздат, 1987. - 383 с.

87. Мюллер, Э.Микология: Пер. с нем / Э. Мюллер, В. Лёффлер.- М.: Мир, 1995.- 343 с.

88. Нгуен Ван Тхань. Обзор видов Septoria Sacc. на злаках в Ленинградской области / Нгуен Ван Тхань // Вестник ЛГУ. Биология.- 1976.- вып. 4.- С. 82-89.

89. Николаева, А.П. Возможности идентификации рас Phytophthora in-festans биохимическйми методами / А.П. Николаева, И.М. Богатых, В.Н. Коростелёва, Д.В. Липсиц // Иммунитет и покой растений. М.: Наука, 1972.-С. 111-120.

90. Нисимура, С. Патологический и эпифитотийный аспекты заражения А1-ternaria в зависимости от специфичности токсина для хозяина // Инфек-ционые болезни раст.: физиол. и биохим. основы. М., 1985. - С. 205 -221.л

91. Новожилов, К.В. Проблемы оптимизации фитосанитарного состояния растениеводства / К.В. Новожилов // С. х. биология. - 1996. - № 5 - С. 28 -38.

92. Номенклатура ферментов: Рекомендации (1972) Международного биохимического союза по номенклатуре и классификации ферментов, а также единицам ферментов и символам кинетики ферментативных реакций (с дополнениями по 1975 г.) //М., 1979.- 322 с.

93. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

94. Пегг Дж. Ф. Роль неспецифических токсинов и гормональных изменений в интенсивности развития болезни // Борьба с болезнями растений: устойчивость и восприимчивость. М: Колос, 1984. - С. 20 - 37.

95. Пересыпкин, В.Ф. Болезни зерновых культур / В.Ф. Пересыпкин.- М.: Колос, 1979.-280 с.

96. Пересыпкин, В.Ф. Развитие Septoria tritici Rob. ex Desm. в тканях листьев озимой пшеницы / В.Ф. Пересыпкин, С.Н. Коваленко // Микол. и фито-патол.- 1981.-15, № 3.- С. 242-245.

97. Плешков, Б.П. Практикум по биохимии растений / Б.П. Плешков. М.: Колос, 1976.-256 с.

98. Подчуфарова, Г.М. Пектал1тычныя ферменты Helminthosporium teres Sacc. / Г.М. Подчуфарова, З.Я. Сярова, В.В. Капмук // Весщ АН Беларуси сер. б1ял. н.- 1994.- № 1.- С. 15-18.

99. Полевой, В.В. Фитогормоны / В.В. Полевой. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. -248 с.

100. Ю.Полевой, В.В. Роль ауксина в системах регуляции у растений / В.В. По- . левой. Л.: Наука, 1986. - 80 с.

101. Ш.Полякова, Е.Н. Выделение, идентификация и количественная оценка содержания индолилуксусной кислоты и некоторых других индольных веществ / Е.Н. Полякова // Методы определения фитогормонов и фенолов в семенах. Л.: Наука, 1979. - С. 12 - 29.1

102. Пыжикова, Г.В. Методика изучения возбудителей септориоза на изолированных листьях пшеницы / Г.В. Пыжикова, Е.В. Карасева // С.- х. биология. 1985. - № 12. - С. 112 - 114.

103. Пыжикова, Г.В. Септориозы зерновых культур. Методические указания / Г.В. Пыжикова, А.А. Санина, Т.И. Курахтайова и др. М.: ВАСХНИЛ, 1988.-58 с.

104. Пыжикова, Г.В. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу / Г.В. Пыжикова, А.А. Санина, A.M. . Супрун и др. М.: ВАСХНИЛ, 1989. - 44 с.

105. Райдер, К. Изоферменты: Пер. с англ. / К. Райдер, К. Тейлор. М: Мир, 1983.- 106 с.

106. Родионова, Н.А. Методы определения целлюлазной активности /Н.А. Родионова, Н.А. Тиунова, Г.В. Фениксова и др.// Прикл. биохим. и мик-робиол. 1966. - 2, №2. С. 197 - 204.

107. Сидорова, И.И. Класс несовершенные грибы (Fungi imperfecti) или дей-торомицеты (Deuteromycetes) / И.И. Сидорова // Жизнь растений. Том 2. Грибы. М.: Просвещение, 1976. - С. 370 - 448.

108. Сидорова, С.Ф. Вертициллёзное и фузариозное увядание однолетних сельскохозяйственных культур / С.Ф. Сидорова.- М.: Колос, 1983.- 157 с.

109. Словарь-справочник фитопатолога. / Под ред. П.Н. Головина.- Москва-Ленинград: Изд-во с.-х. лит., 1959.- 414 с.

110. Созинов, А.А Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции ' / А.А. Созинов. М.: Наука, 1985. - 272 с.

111. Соколов, М.С. Традиционные и новые приемы защиты озимой пшеницы от листостебельных болезней, фитогельминтозов, бактериозов и вирозов / М.С. Соколов, Э.А. Пикушова, Г.И. Левашова //Агрохимия.- 1998.- № 2.- С. 75-87.

112. Супрун, Л.М. Изучение популяций возбудителя фитофтороза картофеля с помощью биохимических маркеров / Л.М. Супрун, И.Н. Рыбакова, В.А. Терехова, Ю.Т. Дьяков // Докл. ВАСХНИЛ. 1986. - № 1. - С. 16 - 19.

113. Супрун, Л.М. Видовая структура возбудителей септориоза пшеницы на • европейской территории СССР в 1987 г. / Л.М. Супрун //Биол. науки.-1990.- №2,- С. 76-80.

114. Тарр, С. Основы патологии растений / С. Тарр. М.: Мир, 1975. - 587 с.

115. Терехова, В.А. Электрофоретические маркеры в изучении изменчивости фитопатогенных грибов / В.А. Терехова // Молекулярная генетика микроорганизмов. М.: Наука, 1988. - С. 24 - 35.

116. Терехова, В.А. Сранительная характеристика мицелиальных изоферментов у изолятов Bipolaris Sorokiniana Shoem. разного происхождения / • В.А. Терехова, М.В. Рочев // Вестник Моск. унив. Сер. биол. 1989. - № • 11.-С. 68 -73.

117. Терехова, В.А. Изучение приморских и краснодарских популяций возбудителя пирикуляриоза риса Pyricularia oryzae Cav. II Электрофорезбелковых систем / В.А. Терехова, А.В. Дарага, Ю.Т. Дъяков // Биол. науки. 1991.-№6.-С. 74-82.

118. Тетеревникова-Бабаян, Д.Н. Общая характеристика септориозов растений, их географическое распространение, вредоносность и принципы мероприятий по борьбе с ними / Д.Н. Тетеревникова-Бабаян. Ереван: Изд-во Ереванского ГУ, 1962.

119. Тетеревникова-Бабаян, Д.Н. Обзор возбудителей септориозов пшеницы в Советском Союзе / Д.Н. Тетеревникова-Бабаян, М.В. Бохян // Биол. журнал Армении.-1967.-20, № 10.

120. Тукеева, М.А. Активность гидролитических ферментов и лизосомальная система в клетках Verticilium dahliae / М.А. Тукеева // Физиол. раст. -1977.-24, №5-С. 941 -947.

121. Тутельян, В.А. Микотоксины (Медицинские и биологические аспекты) / В.А. Тутельян, JI.B. Кравченко АМН СССР. - М.: Медицина, 1985. -320 с.

122. Умнов, A.M. Обнаружение индолил 3 - уксусной кислоты в уредоспо-рах стеблевой ржавчины пшеницы / A.M. Умнов, Е.Н. Артеменко, Д.И. Чкаников // Микол. и фитопатол. - 1978. - 12, № 3. - С. 222 - 226.

123. Успенская, Г.Д. Порядок Сферопсидальные (Sphaeropsidales) / Г.Д. Успенская // Жизнь растений. Том 2. Грибы.- М.: Просвещение, 1976.- С. 424-437.

124. Филимонова, М.В. Содержание физиологически активных веществ (фи-тогормонов) в культуре фитопатогенных грибов рода Botrytis / М.В. Филимонова, М.Н. Талиева // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. - № 4. - С. 540 - 546.

125. Филиппов, В.В. Фитопатогенные грибы poflaVerticillium / В.В. Филиппов, Л.Н. Андреев, Н.В. Базилинская.- М.: Наука, 1980.- 447 с.

126. НО.Фиссюра, Н.И. Возбудители грибной пятнистости пшеницы в основных зерносеющтх зонах Краснодарского края / Н.И. Фиссюра, А.Е. Андронова, В.И. Бессмельцев //Докл. Рос. акад. с.-х. наук.- 1996.- № 1.- С. 9-11.

127. Хасанов, Б.А. Методы дифференциации пятнистостей пшеницы по симптомам и микроскопическим признакам возбудителей / Б.А. Хасанов // Биол. науки.- 1990.- № 2.- С. 153-159.

128. Хасанов, Б.А. Болезни зерновых культур в Северном Казахстане / Б.А. Хасанов, А.А. Выприцкая // XIII Конф. по споровым раст. Средней Азии и Казахстана. Ташкент, 4-6 сент. 1989 г.: Тез. докл.- Ташкент, 1989.- С. 164-165.

129. Хмелевский, Б.Н. Профилактика микотоксикозов животных / Б.Н. Хме-левский, З.И. Пилипец, JI.C. Малиновская и др. М.: Агропромиздат, 1985.-271 с.

130. Чигирев, С.М. Развитие септориоза на посевах яровой пшеницы в Северном Казахстане / С.М. Чигирев, М.Н. Васецкая // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней. Ч. I.- Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989.- С. 40-44.

131. Чигрин, В.В. Изменение активности эстеразы листьев пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной / В.В. Чигрин и др. // Физиол. раст. -1976. -23, №3.

132. Чкаников, Д.И. О роли индолил 3 -уксусной кислоты в патогенезе стеблевой и бурой ржавчины пшеницы / Д.И. Чкаников, Е.Н. Артёменко, С.Г. Гринченко // Физиол. раст. - 1990. - 37, № 3. - С. 591 - 595.

133. Чуприна, В.П.Фитосанитарное состояние посевов на Северном Кавказе / В.П. Чуприна, М.С. Соколов, В.Т. Гончаров й др. // Защита и карантин раст.- 1997.- № 2.- С. 38-39.

134. Шилина, И.А. Биосинтез гиббереллинов грибом Verticillium dahliae Kleb. в условиях культуры / И.А. Шилина // Уч. зап. Владимирского педин та. Сер. физиол. раст. - 1971. - 31 - С. 21 - 24.

135. Шишова, М.Ф. Мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки / М.Ф. Шишова // Автореферат дисс.докт. биол. наук.1. М., 1999-49 с.

136. Шлегель, Г. Общая микробиология. Пер. с нем / Г. Шлегель.- М.: Мир, 1987.-567 с.

137. Шталь, Э. (отв. ред.) Хроматография в тонких слоях / Э. Шталь. М.: Мир, 1965.-508 с.

138. Элланская, И.А. Изучение элементов морфологии грибов. 1.3.3. Класс Deuteromycetes / И.А. Эланская // Методы экспериментальной микологии. Справочник под ред. В.И. Билай.- Киев: Наукова думка, 1982.- С. 5975.

139. Эсау, К. Анатомия растений / К. Эсау. М.: Мир, 1969. - 564 с.

140. Яковлев, А.Г. Выделение и регенерация мицелиальных протопластов Pyricularia oryzae Cav. / А.Г. Яковлев, В.Г. Джавахия // Микол. и фитопа-тол. -15, № 6. С. 472 - 477.

141. Яковлева Н.П. Фитопатология. Программированное обучение / Н.П. Яковлева.- М.: Колос, 1992.- 384 с.

142. Abramson, D. Fusarium species and trichothecene mycotoxins in suspect samples of 1985 Manitoba wheat / D Abramson, R.M. Clear, T.W. Nowicki // Can. J. Plant Sci. 1987. -V. 67.-№3.-P. 611 -619.

143. Ahn, J. H. Chomosomal organization of TOX 2, a complex locus controlling host - selective toxin biosynthesis in Cochliobolus carbonum / J. — H. Ahn, J.D. Walton // Plant Cell. - 1996. - 8, № 5 - P. 887 - 897.

144. Allingham, E.A.Variation in pathogenicity virulence and aggressiveness of Septoria nodorum in Florida / E.A. Allingham, L.F. Jackson // Phytopathology.- 1981.-71, № 10.-P. 1080-1085.

145. Anderson, AJ. Production of plant cell wall degrading enzymes by Phoma . medicaginis f. sp. pinodella / AJ. Anderson, M.I. Powelson // Phytopathology.- 1979.- 69, № 4.- P. 372-375.

146. Arase, S. Some observation on hyphal growth and host responses in leaf-sheath of rice cultivars inoculated with Pyricucaria fungi / S. Arase, M. Ka-tsuta, S. Itoi //Ann. Phytopathol. Soc. Jap.- 1983.- 49, № 5.- P. 698-703.

147. Arora, R.K. Secretion of cytokinins by Helminthosporium turcicum in liquid culture / R.K. Arora, C.L. Mandahar // Acta Phytopatol. Acad. Sci. Hung. -1979.-14,№l-2.-P.7-ll.

148. Atlin, G.N. Gibberella ear rot development and zearalenone and vomitoxin production as affected by maize genotype and Gibberella zeae strain / G.N. Atlin, P.M. Enerson, L.G. McGirr, R.B. Hunter // Can. J. Plant Sci. 1983. -63, №4-P. 847- 853.

149. Auriol, P. Approche biochimique du role des Rhynchosporosides dans la rhynchosporiose de l'Orge / P. Auriol, C. Mazafs, D. Rafenomananjara // Rev. cytol et biol veg. Bot. 1984. - 7, № 3. - P. 219 - 227.

150. Balance, G.M. Molecular aspects of host pathogen interactions in tan spot of wheat / G.M. Ballance, L. Lamari // Can. J. Plant Pathol. - 1998. - 20, № 4. - . P. 425 - 427.

151. Berecket, T. Virulence of Septoria nodorum as affected by passage through detached leaves of wheat and barley cultivars / T. Berecket, T.T. Hebert, K.J. Leonard // J. Phytopothol.- 1990.- 128, № 2.- P. 125-136.

152. Berggren, В. Brunflacksjuka (Septoria nodorum) och svartpricksjuka (Septoria • tritici) pa vete en litteraturover. sikt / B. Berggren // Vaxtskyddsrapp. Kon-sulentavd. vaxtskydd Inst, vaxt-och scogsskydd. Jordbruk.- 1981.- № 19.- 62 s.

153. Bird, P.M. The resistance of wheat to Septoria nodorum: fungal development in relation to host lignification / P.M. Bird, J.P. Ride // Physiol. Plant Pathol.-1981.-19, №3,- P. 289-299.

154. Bottalico, A. Presenza di isolati tossigeni di Alternaria alternata nei frutti di pomodoro e di peperone affetti da nerume / A. Bottalico, A. Logrieco, A. Vis- • conti // Dif. piante. 1989. - 12, №1 - 2. - P. 163 - 168.

155. Bousquet, J.-F. Isolement et mode d'aption d'une phytotoxine produite en culture par Septoria nodorum Berk. / J.- F. Bousquet, M. Skajennikoff // Phytopathol. Z. 1974. - 80, № 4. - S. 355 - 360. '

156. Bousquet, J.F. Variation in metabolite production by Septoria nodorum isolates adapted to wheat or to barley / J-F. Bousquet, A. Kollmann // J. Phytopathol.-1998. -146, № 5 6. - P. 273 - 277. "

157. Bronnimann, A. Prufung der patogenitat einiger Stamme von Septoria nodorum Berk. / A. Bronnimann // Z. Phytopathology.- 1968.- № 2, 2.

158. Bronson, C.R. Genetic control and distorted segregation of T-toxin produc- , tion in field isolates of Cochliobolus heterostrophus / C.R. Bronson, M. Taga, O.C. Yoder // Phytopathology. 1990. - 80, № 9. - P. 819 - 823.

159. Brown, A.G.P. Prospects for control of Septoria / A.G.P. Brown, A.A. Rosielle // J. Agr. West. Austral.- 1980.- 20, № 1.- P. 8-11.

160. Buescher, R.W. Role of calcium and chelating agents in regulating the degradation of tomato fruit tissue by polygalacturonase / R.W. Buesher, G.E. Hobson // J. Food Biochem. 1982. - 6, №3. - P. 147 - 160.

161. Buschbell, T. Charakteristika des Befallsverlaufes von Septoria nodorum an Weizen / T. Btischbell // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. 1988.- № 245.- S. 416.

162. Casgrove, D.J. Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants / D.J. Casgrove // Annu. Rev. Cell and Dev. Biol. Vol. 13.- Palo Alto (Calif.), 1997.-P. 171-201.

163. Cassab, G.I. Plant cell wall proteins / G. I. Cassab // Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. Vol. 49.- Palo Alto (Calif.), 1998.- P. 281-309.

164. Chen, C.Y. Host-pathogen interaction of a fungal biocontrol agent fer Canada thistle: Abstr. Can. Phytopathol. Soc. Annu. Meet., Montreal, 1999 / C.Y. Chen, K. L. Bailey, J.L. Derby et al // Can. J. Plant Pathol.- 1999.- 21. № 2,- ' P. 199.

165. Cheng, Y.-Q. A putative branched chain - amino - acid transsaminase gene required for HC - toxin biosynthesis and pathogenicity in Cochliobolus car-bonum / Y.-Q Cheng, J. - H. Ahn, J.D. Walton // Microbiology. - 1999. - 145, № 12.-P. 3539-3546.

166. Chida, J. Restoration of appressorial penetration ability by melanin precursors in Pyricularia oryzae treated with antipenetrants and in melanin-deficient mutants / J. Chida, H.D. Sister // J. Pestic. Sci.- 1987.- 12. № 1.- P. 49-55.

167. Choi, W. The adenylate cyclase gene MAC 1 of Magnaporthe grisea controls appressorium formation and other aspects of growth and development / W. Choi, R.A. Dean // Plant Cell.- 1997.- 9, № 11.- p. 1973-1983.

168. Ciuffetti, L.M. Standardization of toxin nomenclature in the Pyrenophora tritici repentis / wheat interaction / L.M. Ciuffetti, L.J. Francl, G.M. Bal-lance et al.// Can. J. Plant Pathol. - 1998. - 20, № 4. - P. 421 - 424.

169. Clay, R.P. Isolation and characterization of an endopolygalacturonase from Cochliobolus sativus and a cytological study of fungal penetration of barley /R.P. Clay, C.W. Bergman, M.S. Fuller // Phytopathology.- 1997.- 87, №11.-P. 1148-1159.

170. Cohen, L. The histology of processes associated with the infection of resistant and susceptible wheat cultivars with Septoria tritici / L. Cohen, Z. Eyal // Plant Pathol.- 1993.- 42. № 5.- P. 737-743.

171. Commenil, P. Molecular characterization of a lipase induced in Botrytis cinerea by components of grape berry cuticle /Р. Commenil, L. Belingheri, G. Bauw et al. //Physiol, and Mol. Plant Pathol.- 1999.- 55, № 1.- P. 37-43.

172. Cooper, R.M. Cell wall degrading enzymes of vacscular wilf fungi. III. Passible involvement of endo-pectin lyase in Verticillium wilt of tomato / R.M. Cooper, R. K. Wood // Physiol. Plant Pathol. 1980. - 16, №2 - P. 285 - 300. •

173. Dasgupta, В. Role of toxin secretion by Colletotrichum kapsici on the expression of leaf spot symptoms in betel vine / В., Dasgupta // J. Plant Crops. -1986. 14, №1.-P. 36-41.

174. Davet, B. Production de pectine transeliminase. par les spores du Colletotrichum coccodes (Wallr). Hughes / P. Davet // Ann. phytopathol. 1976. - 8, №1.-P. 25-29.

175. De Wolf, E.D. Vistas of tan spot research / E.D. De Wolf, R.J. Effertz, S. Ali, L.J. Francl // Can. J. Plant Pathol. 1998. - 20, №4 - P. 349 - 370.

176. Devys, M. L'ochracine (melleine), phytotoxine isolee du milien de culture de Septoria nodorum Berk. / M. Devys, J.F. Bousquet, M. Skajennikoff, et M. Barbier // Phytopathol. Z. 1974. - 81. - P. 92 - 94.

177. Devys, M. La septorine nouvelle pyrazine substituee, isolee du mileu de culture de Septoria nodorum Berk chempignon phyyopathogene / M. Devys, J.F. Bousquet, A. Kollmann, M. Barbier // C.R. Acad. Sci Ser. c. 1978. -286. - P. 457 - 458.

178. Devys, M. Dihydroisacoumarines et acide mycophenolique du milieu de culture du champignon phytopathogene Septoria nodorum. / M. Devys, J.F. Bousquet, A. Kollmann, M. Barbier // Phytochemistry. 1980 - 19, № 10. - P. 2221 -2222.

179. Drews, F.W. Untersuchungen zur Kombinierten Schadwirkung von Septoria nodorum Berk, und Macrosiphum avenae (Fabr.) an Winterweizen / F.W. Drews // Tagungsber. / Akad. Landwirtschaftswiss. DDR.- 1988.- 271, № 2,-S. 475-480.

180. Dumas, B. Endopolygalacturonases of Colletotrichum lindemuthianum: Molecular characterization, gene expression, and elicitor activity / B. Dumas, G. Boudart, S. Centis et al. // Phytoparasitica.- 1998.- 26, № 4.- P. 353.

181. Dunkle, L.D. Infection structure differentiation by wheat stem rust ure-dospores in suspension / L.D. Dunkle, P.J. Allen // Phytopathology. 1971. -Vol. 61 - P. 649-652.

182. Dunkle, L.D. Accumulation of host specific toxin produced by Cochliobo-lus carbonum during pathogenesis of maize / L.D. Dunkle, F.A. Cantone, L.M. Ciuffetti // Physiol, and Mol. Plant Pathol. - 1991. - 38, № 4. - P. 265 -273.

183. Enari, T.-M. Production of cellulolytic enzymes by fungi / T.-M. Enari, P. Markkanen // Adv. Biochem. Eng.- 1977- 5, № 1.- P. 1-24.

184. Engelhardt, G. Metabolism of mycotoxins in plants / G. Engelhardt, M. Ruh-land, P.R. Wallnofer // Adv. Food. Sci. 1999. -21, № 3 - 4. - P. 71 - 78.

185. Etebarian, H.R. Some' isozyme patterns of Fusarium culmorium / H.R. Ete-barian, R.D. Wilcoxson, E.L. Stevart et al. // Iran J. Plant Pathol.- 1996.- 32, № 1-2.-P. 9-21.

186. Favaron, F. Differencial absorption and localization of two Selerotinia scle-rotiorum endo-polygalacturonases in soybean hypocotyls / F. Favaron, R. Per-etto, P. Bonfaute et al.// Physiol, and Mol. Plant Pathol.- 1993,- 43, № 5.- P. 353-364. . •

187. Fric, F. Hydrolytic enzymes of underminated and germinated conidia of Ery-siphe graminis f. sp. Holdei Marchal. / F. Fric, G. Woff // J. Phytopathol. -1994. 140, №1. - P. 1 - 10.

188. Gamba, F. M. Inheritance of race specific necrotic and chlorotic reactions induced by Pyrenophora tritici - repentis in hexaploid wheats / F. M. Gamba, L. Lamari, A.L. Brole - Babel // Can. J. Plant Pathol. - 1998. - 20, № 4 - P. 401 -407.

189. Gartel, W. Die Bildung von Appressorien und Penetrationshyphen bei Botrytis cinerea / W. Gartel // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem.- 1981.- № 203S. 316-317.

190. Garten, H.A. The role of cell-wall-degrading enzymes in virulence of Botrytis • cinerea / H.A. Garten, W.O. Breuil, J. Wubbem et al. // Phytoparasitica.-1999.- 27, № l.-P. 65.

191. Gilbert, J. Relationship between environmental variables and the prevalence and isolation frequency of leaf-spotting pathogens in spring wheat / J. Gil- ■ bert, S.M. Woods, A. Tekauz // Can. J. Plant Pathol.- 1998.- 20, № 2.- P. 158- • 164.

192. Gold, S.E. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-dependent protein kinase is required for gall formation in maize / S.E. Gold, S.M. Brogdon, M.E. Mayorga et al. // Plant Cell.- 1997.- 9, № 1.- P. 1585-1594.

193. Grambow, H.J. The differential effects of indole 3 - acetic acid and its metabolites on the development of Puccinia graminis f. sp. tritici in vitro / H.J. Grambow, M.T. Tucks // Can. J. Bot. - 1979. - 57," № 17. - P. 1765 - 1768.

194. Gregory, P. Southern corn leaf blight disease: studies on mitochondrial bio- • chemistry and ultrastucture / P. Gregory, D.E. Matthews, D.W. York et al. // . Mycopathologia. 1978. - 66, № i2. - P. 105 - 112.

195. Griffiths, E. Variation in Septoria nodorum / E. Griffiths, H.C .Ao // Ann. Appl. Biol.-1980.-94, №2,- P. 294-296.

196. Gulati, A. Host parasite relationship in Helminthosporium turcicum - Zea mays complex: involvement of cytokinin - like substances in pathogenesis / A. Gulati, C.L. Mandahar// Indian J. Exp. Biol. - 1986. - 24, № 5. - P. 309 - 314.

197. Halama, P. Variabilite de l'agressivite de Phaeosphaeria nodorum (Septoria nodorum) apres la reproduction sexuee / P. Halama // Meded. Jac. Land- . bauwwetensch. / Univ. Gent.-1993.- 58, № 3 P. 1175-1183.

198. Hardham, A.R. Cell biology of pathogenesis / A.R. Hardham // Annu. Rev. Plant Physiol, and Plant Mol. Biol. Vol. 43.- Palo Alto (Calif.).- 1992.- P. ' 491-526.

199. Harris, D. Survival of the glume blotch rungus on straw treated with herbicides / D. Harris, E. Grossbard // Proc. Brit. Crop. Prot. Conf.- Weeds, Brighton.- 1978.- Vol. 2. P. 603-608.

200. Hart, L.P. Effect of corn genotypes on ear infection by gibberella zeae / L.P. Hart, E. Gendloff, E. L. Rossman // Plant Disease. 1984. - 68, № 4. - P. 296298.

201. Hau, F.C. Preinfectional interactions between Helminthosporium oryzae and resistant and susceptible rice plants / F.C. Hau, M.C. Rush // Phytopathology.-1982.-72. №3.-P. 285-292.

202. Haugen, L.G. Effects of fungicides and cultivar genotypes on populations of Septoria spp. on spring wheat in Minnesota / L.G. Haugen, R.D. Wilcoxson, J.S. Baumer//Plant Dissease.- 1985.- 69, № 2.-P. 162-163.

203. Hargreaves, J.A. A comparison of the reaction sites associated with the resistance of coleoptiles of barley, oats and wheat to infection by Septoria nodorum. / J.A. Hargreaves, J.P.R. Keon // Phytopathol. Z.- 1986.- 115. № 1.-P. 72-82.

204. Hughes, H. Spore surface glycoproteins of Colletotrichum lindemuthianum are recognized by monoclonal antibody which inhibits adhesion to polystyrene ' / H. Hughes, R. Carzaniga, S.L. Rowlings et al. // Microbiology.- 1999.- 145. №8.- P. 1927-1936.

205. Hughes, R.K. Auxin regulation of the response of Phaseolus vulgaris to a fungal elicitor / R.K. Hughes, A. G. Dickerson // Plant and Cell Physiol. 1990. -31, № 5. - P. 667 - 675.

206. Kaur, S. Influence of temperature on the development of blast in rice / S. Kaur, P. Kaur, S.Y. Padmanabhan // Indian Phytopathol.- 1977.- 30. № 4.- P. 544-546.

207. Kaur, M. Studies on pectolytic enzymes of certain fungi causing leaf spot diseases / M. Kaur, K.B. Deshpande // Indian Plytopathol. 1980 - 33, №2. - P. 333 -334.

208. Kema, G. H.J. Genetic variation for virulence and resistance in the wheat -Mycosphaerella graminicola parhosystem. III. Camparative sesdling and adult plant experiments / G. H. J. Kema, C.H. van Silfhout // Phytopathology.-1997.- 87,№3.- P. 266-272.

209. Kent, S.S. Phytotoxin from Septoria nodorum / S.S. Kent, G.A. Strobel // Trans. Br. Mycol. Soc. 1976. - 67. - P. 354 - 358.

210. Keon, J.P.R. A cytological study of the net blotch disease of barley caused by Pyrenophora teres / J.P.R. Keon, J.A. Hargreaves // Physiol. Plant Pathol.-1983.- 22. №3.-P. 321-329.

211. Keon, J.P.R. The response of barley leaf epidermal cells to infection by Septoria nodorum / J.P.R. Keon, J.A. Hargreaves // New Phytol.- 1984.- 98. № 2.-P. 387-398.

212. Kleiner, E.-M. Zum Einflup von Mitteln zur biologischen ProzePsteuerung auf Pathogen Wirt - Beziehungen / E.-M. Kleiner // Beitr. trop. Landwirt and Veterinarmed. - 1983. - 21, № 3. - P. 329 - 339.

213. Koga, H. Ann. Phytopathol. Soc. Jap / H. Koga, T. Kobayashi.- 1982.- 48, № 4.-P. 506-513.

214. Koga, H. Ann. Phytopathol. Soc. Jap / H. Koga, T. Kobayashi, O. Horino.-1982.- 48, №3.- P. 281-289.

215. K611er, W. Role of cutinase and cell wall degrading enzymes in infection of Pisum sativum by Fusarium solani f. sp. / W. КбНег, C.R. Allan, P.E. Kolattu-kudy // Physiol. Plant Pathol 1982 - 20, № 3 - P. 47 - 60.

216. Koller, W. Role of cutinase in the invasion of plants: Pap. IMC' 5: 5th Int. Mycol. Congr., Vancouver, Aug. 14 21, 1994 / W. Koller, F. Trial, D.M. . Parker//Can. J.Bot- 1995.-73, Suppl. 1 Sec.E-H.-P. 1109- 1118.

217. Koric, B. Utjecaj bolesti Septoria nodorum na smanjenje potencijala rodnosti psenice /В. Koric //Glas. zast. bilja.- 1987.- 9, № 12.- P. 425-429.

218. Koric, B. Zastita psenice od napada pepelnice i septorioza u intenzivnoj proiz-vodnji /В. Koric // Glas. zast. bilja.- 1983.- 7, № 9.- P. 349-351.

219. Korjalainen, R. Ultrastructure of penetration and colonizateon of wheat leaves by Septoria nodorum / R. Korjalainen, K. Lounatmaa // Physiol, and Mol. Plant Pathol.- 1986.- 29. № 2.- P. 263-270.

220. Kosuge, Т. p IAA, virulence plasmid in P^eudomonas savastanoi / T. Kosuge, C.J. Palm, S.V. Hutcheson et al.// Plasmids Bacteria. Proc. Conf., Urbana.,

221. May 13 18,1984. - New York; London; 1985. - P. 807 - 813.

222. Kristiansson, B. Skiluader mellan alika isolat av Septoria nodorum / B. Kris-tianson // Nordisk jord brugeforskning. -.1974. 59, 3. - P. 432 - 433.

223. Krupinsky, J.M. Isolates of Stagonospora nodorum from alternative hosts afterpassage through wheat: Abstr. APS Annu. Meet, Albuquerque, N.M., Aug. 610, 1994 / J.M. Krupinsky // Phytopathology.- 1994.- 84, № 10.- P. 1073.

224. Kruger, J. Differenzierung von Septoria nodorum Berk. Und Septoria avenae Frank. R. sp. Triticea F. Tahuson / J. Krtiger, L.M. Hoffmann // Z. Pflanzenkr. und Pflanzenseh. 1978. - 85 (11). - P. 645- 650.

225. Kumar, C.R. Studies on Fusarium will of cotton. II. The role pectolytic / C.R. Kumar, D. Subramanian // Phytopathol. Z. 1979.'- 94, №4. - P. 343 - 356.

226. Laman, L. Toward a coherent model of host pathogen interaction in tan spot . of wheat: An epilogue to the Third International Workshop on Tan Spot of Wheat / L. Laman, J. Gilbert // Can. J. Plant Pathol. - 1998. - 20, № 4. - P. 440 - 443.

227. Lamari, L.Toxin of Pyrenophora tritici repentis: host - specificity, signifi- • cance in disease, and inheritance of host reaction / L. Lamari, C.C. Bernier // Phytopathology. - 1989. - 79, № 7. - P. 740 - 744.

228. Lamari, L. In planta production and antibody neutralization of the Ptr necrosistotoxin from Pyrenophora tritici repentis / L. Lamari, G.M. Ballance, N.P. Orolaza, R. Kowatsch // Phytopathology. - 1995. - 85, № 3. - P. 333 - 338.

229. Larkin, P.J. Eyespot disease of sugarcane. Induction of host specific toxin and its interaction with leaf cells / P.J. Larkin, W.R. Scowcroft // Plant Physiol. - 1981. - 67, № 3. - P. 408 - 414.

230. Le Roux, J. Effek van Septoria nodorum op korrelmassa, korrels per aar, . massa per aar en massa per perseel van lentekoringcultivars in die winterreenstreek van Suid-Afrika / J. Le Roux // Phytophylactica.- 1984.- 16, № 2.- P. 85-88. . .

231. Lebrun, M.H. Resistance of rice to tenuazonic acid, a toxin from Pyrcularia oryzae / M.H. Lebrun, J. Orcival, C. Duchartre '// Rev. cytol. et biol. veg. Bot. 1984. -7, №3.- P. 249-259.

232. Lebrun, M.H. Relationships between the structure and the phytotoxicity of the fungal toxin tenuazonic acid / M.H. Lebrun, L. Nicolas, M. Boutar et al. • // Phytochemistry. 1988. - 27, № 1. - P. 77 - 84.

233. Liu, S.- Т. Agrobacterium Ti plasmid indoleacetic acid gene is required for crown gass oncogenesis / S.- T. Liu, K.L. Perry, C.L. Schardl, C.I. Kado // " Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci. 1982. - 79, № 9. - P. 2812 - 2816.

234. Logrieco, A. Pathogenicity of Fusarium graminearum chemotypes towards corn, wheat, triticale and rye / A. Logrieco, M. Manka, C. Altomare, A. Bot-talico // J. Phytopathology. 1990. - 130, № 3. - P. 197 - 204.

235. Lowry, O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosbraigh, A.L. Farr // J. Biol Chem. 1951. - Vol. 193. - № 2. -P. 265 - 275.

236. Madhosingh, C. Fusarium oxysporum f sp. spinaciae. A biochemical comparison of race 1 and race 2 / C. Madhosingh // Phytopathol. Z. 1980. - 98, № 1. -P. 27-39.

237. Magro, P. Production of polysaccharide degrading enzymes by Septoria nodorum in culture and during pathogenesis / P. Magro // Plant Sci Lett. -1984. - 37, № 1-2. P. 63-68.

238. Maheshwari, R. Physical and chemical factors controlling the development • of infection structures from uredospore germtubes of rust fungi / R. Mahesh- . wari, P.J. Allen, A.C. Hildebrand // Phytpathology. 1967. - Vol. 57 - P. 855 -862.

239. Manka, M. Auxin and gibberellin like substances synthesis by Fusarium Isolates pathogenic to corn seedlings / M. Manka // Acta microbiol. pol. - 1980. -29, №4. - P. 365 -374.

240. Manka, M. Fusaria as pathogens of cereal seedling / M. Manka // Fusarium: Mycotoxins, Taxon and Pathogenicity: Semin, Warsaw, Sept. 8 -10, 1987. -Amsterdam etc., 1989. P. 329 - 355.

241. Marin, S. J.P. Enfermedades del trigo causadas por especies de Septoria en Andalucia occidental / S. J.P. Marin, B.J. Aguirre // An. INIA. Agr.- 1985.28, №2.-P. 119-145.

242. Marin, S. J.P. Biologia у epidemiologia de las septoriasis del trigo en Andalucia occidental / S. J.P. Marin, B.J. Aguirre // Bol. sanid. veg. Plagas.- 1986.12, №2.-P. 313-318.

243. Martinez Honduvilla, M.J. Pine Seed Ribonucleases. I. Preparation and Properties / M.J. Martinez - Honduvilla, C.J. Martinez - Honduvilla // Revista espanola de Fisiologia. - 1975. - 31. - P. 283 - 288.

244. Matsumoto, K. On the relationship between plant hormones and rice blast resistance / K. Matsumoto, Y. Suzuki, S. Mase et al. // Ann. Phytopathol. Soc. Jap. 1980. - 46, № 3. - P. 307 - 314.

245. Mayama, S. The purification of victorin and its phytoalexin elicitor activity in oat leaves / S. Mayama, T. Tani, T. Ueno et al. // Physiol and Mol. Plant Pathol. 1986 - 29, № 1. - P. 1 -18.

246. Mehta, P. Production of pectolytic and cellulolytic enzymes by Alternaria spp. during pathogenesis of tomato fruits / P. Mehta, K.M. Vyas, S.B. Sak-sena // Hindustan Antibiot. Bull. 1974. - 16, № 4 - P. 210 - 214.

247. Michniewicz, M. Wyniki badan nad mozliwoscia stosowania etrelu w zwalc. zaniu fuzariozy w uprawie pszenicy / M. Michniewicz // Acta Univ. N. Co-pernici Biol. 1992. - № 41. - P. 15 -24.

248. Mielke, H. Braunspelzigkeit des Weizens / H. Mielke // Nachrichtenbl. Dtsch. Pflanzenschutzdienst (BRD). 1985.- 37, № 9.- S. 141-142.

249. Mishra, M.M. Enzymatic hydrolysis of cellulose progress and Problems / M.M. Mishra // Indian J. Microbiol. - 1980. - 20 №1 - P. 87 - 94.

250. Michell, Т.К. The cAMP dependent protein kinase catalytic subunit is required for appressorium formation and pathogenesis by the rice blast pathogen Magnapothe grisea / Т.К. Michell, R.A. Dean // Plant Cell. - 1995. - 7 № 11. -P. 1869 - 1878.

251. Mohanty, C.R.Variation of leaf angle and incidence of rice blast disease / C.R. ' Mohanty, S. Gangopadhyay // J. agr. Sci.- 1982.- 98, № 1.- P. 225-227.

252. Money, N.P. Fungus punches its way in / N.P. Money // Nature (Gr. Brit.) -1999.- 401, № 6751.- P. 332-333.

253. Mould, M.J.R. Ultrastructure of the Colletotrichum trifoli-Medicago sativa pathosystem. I. Pre-penetration events / M.J.R. Mould, G.J. Boland, J. Robb // Physiol, and Mol. Plant Pathol.- 1991.- 38, № 3.- P. 179- 194.

254. Mould, M.J.R. Ultrastructure of the Colletotrichum trifoli-Medicago sativa pathosystem. II. Post-penetration events / M.J.R. Mould, G.J. Boland, J. Robb ' // Physiol, and Mol. Plant Pathol.- 1991.- 38, № 3.- P. 195-210.

255. Naito, H. Studies on the mechanisms of infection of rice plants by brown leaf spot / H. Naito // Bull. Tohoku Nat. Agr. Exp. Stat.- 1982.- № 66,- P. 201210.

256. Narania, K. In vitro production of IAA by faive hyphomycetes / К /Narania, S.M. Reddy // Geobios. 1979. - 6, № 6. - P. 260 - 262.

257. Narayana, R. A. Studies on the toxins of Pyricularia spp. / R. A. Narayana, S. Suryanarayanan the phytotoxicity of culture filtrates // Proc. Indian Acad. Sci. - 1975. - В 82, № 3. - P. 77 - 99.

258. Nasraoui, B. Caracterisation et role de la cutinase dans la penetration des • champignons phytopathogenes au travers de la cuticule des plantes / B. Nas-raoui //Bull. rech. agron. Gembloux. 1992. - 27, № 4. - P. 389 - 413

259. Navarre, D. A. Inhibition of the glycine decarboxylase multienzyme complex by the host selective .toxin victorin / D. A. Navarre, T. Wolpert // Plant Cell. - 1995. -7. №4.-P. 453 -471.

260. Neill, S.J. The biosynthesis of abscisic acid in Cercospora rosicola / S.J. Neill, R. Horgan, D.C.Walton, T.S. Lee // Phytochemistry. 1982. - 21, № 1. - P. 61 -65.

261. Nishimura, S. Host-specific toxins and chemical structures from Alternaria species / S. Nishimura, K. Kohmoto // Annu. Rev. Phytopathol. Vol. 21. Palo Alto, Calif., 1983. - P. 87 - 116.

262. Nukina, M. Pyriculariol, a new phytotoxic metabolite of Pyricularia oryzae cavara / M. Nukina, T. Sassa, M. Ikeda et al. // Agr. and Biol. Chem. 1981. - ■ 45, №9.-P. 2161 -2162.

263. Nummi, M. Der Einfluss eines Fusarium Toxins auf die Gersten - Vermal-zung / M. Nummi, M.-L. Niku-Paslova, T.-M. Enari // Brauwissenshaft. -1975.-28, № 5. - S. 130- 133.

264. Onogur, E. Uber ensymatische Aktivitat von Septoria tritici Rob. ex Desm. in Bezug auf Anfalligkeit von Weizensorten / E. Onogur // J. Turkisch Phytopathol. 1978. - 7, № 2-3. - S. 91 - 99.

265. Orolaza, N.P. Evidence of a host specific chlorosis toxin from Pyrenophora tritici - repentis, the causal agent of tan spot of wheat / N.P. Orolaza, L. Lamari, G.M. Ballance//Phytopathology. - 1995. - 85, № 10. - P. 1282 - 1287.

266. Panaccione, D. G. Characterization of the TOX locus of Cochliobolus carbonum / D. G. Panaccione, J.S. Scott-Craig, J.-A. Pocard, J.D. Walton // Phytopathology. 1990. - 80, № 10.

267. Pauvert, P. Les septorioses / P. Pauvert // Phytoma. Def. cult.- 1984.- № 363.-P. 21-22.

268. Pegg, G.E. Endogenous inhibitors in healthy and diseased plants / G.E. Pegg // Physiol. Plant Pathol. 1976. - P. 607 -616.

269. Peltonen, S. Comparison of xylanase production by fungal pathogens of barley wich special reference to Bipolans sorokmianav/ S.Peltonen // Mycol. Res. -1995.-99, №6-P. 717-723.

270. Peng Y.-L., Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae / Y.-L. Peng, J. Shishiuama // Can. J. Bot.- 1988.- 66, № 4.- P. 730-735.

271. Pokacka, Z. Badania nad plamistosciami lisci pszenicy ze szczegolnym uw- ' zglednieniem roli Septoria nodorum Berk./ Z. Pokacka // Pr. nauk. Inst. ochr. rosl.- 1985.- 27, № 2.- P. 5-31.

272. Purushothaman, D. Indole acetic acid synthesis and virulence of different races of Pyricularia oryzae / D. Purushothaman, D. Kandasamy, Raguvathan. // Curr. Sci (India). 1971. - 40, № 5. - P. 113 - 114.

273. Rabenantoandro, Y. p (1 —> 4) glucanohydrolase et anthracnose du melon. Implication dans la pathogeniev/ Y. Rabenantoandro, P. Auriol // С r. Acad, sci. -1995 - D 281, № 5 - 8. - P. 395-398.

274. Rabenautoandaro, Y. Implication of p (1 —> 3) glucanohydrolase in melon antracnose / Y. Rabenautoandaro, P. Auriol, A. Touze // Physiol. Plant Pathol.- 1976/- 8, №3.-P. 313 -324. .

275. Rafenomananjara, D. La relation structure activite d'analogues de rhyn-chosporosides. I. Synthese chimique / D. Rafenomananjara , P.Auriol, C. Ma-zars // Agronomie. - 1983.-3, № 4. - P. 343 - 347.

276. Rambow, M. Befallsentwicklung von Septoria nodorum Berk, in Winter-weizenbestanden / M. Rambow // Nachrichtenbl. Pflanzenschutz DDR. 1989.- 43, № 10.-S. 209-212.

277. Rapilly, F. Pressions de selection exercees par le noyau ou le cytoplasme de l'hote sur l'agressivite d'un parasite necrotrophe de ble: Septoria nodorum Berk. / F. Rapilly, H. Richard, M. Skajennikoff et al // Agronomie.- 1989.- 9, №7.- P. 703-718.

278. Rawn, C.D. Simultaneous changes in the rate and pathways of glucose oxidation in victorin treated oat leaves / C.D. Rawn // Phytopathology. - 1977. -67, № 3. - p. 338 - 343.

279. Reddy, S.R. Synthesis of IAA by some hyphomyceteous fungi / S.R. Reddy, S.M. Reddy // Proc. Indian Nat. Sci. Acad. 1981, - В 47, № 1 - P. 89 - 92.

280. Richards, G. Factors influencing sporulation by Septoria nodorum / G. Richards //Phytopathology. 1951. - 41, № 7. - P. 571 - 578.

281. Roberts, K. Functional architecture of plant cell Walls / K. Roberts, M. McCann, F. Corke et al. // Annu. Rept., 1997 1998 / John Innes Centre and Sainsbury Lab. -Norwich,- 1998.- P. 39.

282. Rouzet, J. Les septorioses du ble / J. Rouzet, G. Eyries // Phytoma.- 1982.-337.-P. 13-16.

283. Rufty, R.C. Variation in virulence in isolates of Septoria nodorum / R.C. Rufty, T.T. Hebert, C.F. Murphy // Phytopathology.- 1981.- 71, № 6.- P. 593596.

284. Saadaoui, E.M. Physiologic specialization of Septoria tritici in Morocco / E.M. Saadaoui // Plout Disease.- 1987.- 71, № 2.-"P. 153-155.

285. Sathiyanathan, S. Involvement of pectolytic enzymes in brown spot disease development inrice / S. Sathiyanathan, P. Vidhyasekaran // Indian Phytopa-thol. 1980. - 33., № 4 - P. 577 - 580.

286. Schilder, A.V. Distribution, Prevalence and Severity of Fungal Leaf and Spike Diseases of Winter Wheat in New York in 1986 и 1987 / A.V. Schilder, G.C. Bergstrom // Plant Desease.- 1989. 73, № 2. - P. 177 - 182.

287. Schltiter K., Septoria. Weizen: Es muB nioht immer Septoria sein. / K.

288. Schliiter, U. Junga // Top agrar.- 1988.- № 5.- S. 52-54.

289. Scott Craig, J.S. Endopolygalaturonase is not required for pathogenicity of Cochliobolus carbonum on maise / J.S. Scott - Craig, D.G. Panaccione, F. Cervone, J.D. Walton // Plant Cell. - 1990. - 2, № 12. - P. 1191 - 1200.

290. Shaner, G. Nomenclature and concepts of pathogenicity and virulence / G. Shaner // Annu. Rev. Phytopathol. Vol. 30, 1992 Polo Alto (Calif.) - 1992.-P. 47-66.

291. Sinha, A.K. A new concept in plant disease control / A.K. Sinha // Sci. and Cult. 1984. - 50, № 6. - P. 181 - 186.

292. Skajennikoff, M. Etudes sur l'agressivite de Septoria nodorum Berk.: Effets des hotes (triticale et ble) et des organes attaques / M. Skajennikoff, F. Rapilly //Agronomie.- 1983.-3, № 2.-P. 131-140.

293. Sladka, О. Study of pectolytic and cellulolytic enzymes in UV mutants of Cercospora beticola Sacc.V / O. Sladka, D. Brillova // Biologia (CSSR). -1978. 33, №3.-P. 209-218.

294. Stopinska, J. Control of growth and development of Ceratocystis fimbriata Ell. et Halst. by plant growth regulators. IV. Ethylene / J. Stopinska, K. Kuik // Bull. Pol. Acad. Sci. 1991. - 39, № 3. - P. 291 - 300.

295. Strelkov, S.E. Induced chlorophyll degradation by a chlorosis toxin from Pyrenophora tritici repentis / S.E. Strelkov, L. Lamari, G.M. Ballance // Can. J. Plant Pathol. - 1998. - 20, № 4. - P. 428 - 435.

296. Strzelczyk, E. Production of cytokinin like substances by Cylindrocarpon destructans (Zins.) Scholt. Isolates pathogenic and nonpathogenic to fir (Abies alba Mill.) seedlings / E. Strzelczyk, M. Kampert // Phytopathol. Z. - 1983. -106, № l.-P. 90-96.

297. Su, M.-Y. Ethylene production by Bipolaris sorokiniana and Curvularia geni-culata on methionine and inorganic salts /М.-Y. Su, C.F. Hodges // Plant Discease. 1989. - 73, № 5. - P. 398 - 401.

298. Sudo, T. Occurrence and some properties of cellulase in the filtrates of co-nidiospores and mycelya of Pyricularia oryzae Cavara / T.Sudo, H. Na-gayama, K. Tamari // Agr. and Biol. Chem. -Л973 a.- 37, №7. P. 1651 -1659.

299. Sudo, T. Partial purification of extracellular cellulase from Pyricularia oryzae and comparison of the elution patterns among varios strains. / T.Sudo, H. Na-gayama, K. Tamari // Agr. and Biol. Chem. 1973 b.- 37, №11. - P. 2535 -2542.

300. Suresh, G Enzyme linked immunosorbernt assay of polygalacturonases incotton plant infected by Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum / G Suresh, R. •

301. Balasubramanian, R. Kalyanasudaram // Z. Pfanzenkrankh. und Pflazenschutz. .1984-91., №2.-P. 122- 130.

302. Suzuki, M. Sythesis of optically active pyriculol, a phytotoxic metabolite produced by Pyricularia oryzae / M. Suzuki, T. Sugiyama, M. Watonabe et al. // Agr. and Biol. Chem. 1986. - 50, № 8. - P. 2159 - 2160.

303. Takai, S. Relationship of the production of.the toxin, ceratoulmin, to synne-mata formation, patogenicity, mycelial habit, and growth of Ceratocystis ulmi isolates / S. Takai // Can. J. Bot. 1980. - 58, № б". - P. 658 - 662.

304. Takai, S. Evidence for the involvement of cerato ulmin, the Ceratocystis -ulmi toxin, in the development of Dutch elm disease / S. Takai, W.C. Rich- . ards, K.J. Stevenson // Physiol. Plant Pathol. - 1983. - 23, № 2. - P. 275 - 280.

305. Thomson, W.J. New products and control strategies for speckled leaf blotch in wheat / WJ. Thomson, J. Sutcliffe, R.E. Gaunt // Proc. 34 th N.Z. Weed and Pest Contr. Conf., Blenheim, Aug. 11 th 13 th, 1981.- Palmerston North, 1981.-P. 192-194.

306. Tomas, A. Cultivar specific toxicity of culture filtrates of Pyrenophora tritici - repentis / A. Tomas, W.W. Bockus // Phytopathology. - 1987. - 77, № 9. - P. 1337- 1340.

307. Tomasovic, S. Problem fuzarijske palezi klasa (Fusarium graminearum (Schw.) Petch.) kod psenice / S. Tomasovic // Glas. zast bilja. 1983. - 7, № 9. -P. 354-357.

308. Tomita, H. Ann. Phytopathol. Soc. Jap / H. Tomita, S. Yamanaka 1983.- 49, №4.-P. 514-521.

309. Umetsu, N. Studies of the effect of tenuazonic acid on plant cells and seed- • lings / N. Umetsu, T. Muramatsu, H. Honda, K. Tamari // Agr. and Biol. • Chem. 1974. - 38, № 4. - P. 791 - 799.

310. Van Caeseele, L. Ultrastructure of the interaction between Pyrenophora teres and a susceptible barley host / L: Van Caeseele, J. Grumbles // Can. J. Bot.-1979.- 57, № 1,- p. 40-47.

311. Vasjuk, V.A. Growth substances of phytopathogenic fungi genus Septoria: . Abstr. 9 th. Congr. Fed. Eur. Soc. Plant Physiol., Brno, 3 8 July, 1994 / V.A. Vasjuk, T.V. Andrianova // Biol. Plant. - 1994. - 36. Suppl. - P. 41.

312. Verhoeff, K. The role of cell wall degrading enzymes in the pathogenesis of Botrytis cinerea in tomato plants / K. Verhoeff // Ann. Phytopathol. 1978. — 10, №2. P. 137 - 144.

313. Wakulinski, W. Phytotoxcity of Fusarium metabolites in relation to pathogenicity / W. Wakulinski // Fusarium: Mycotoxins, Taxon and Pathogenicity: Semin., Warsaw, Sept. 8- 10, 1987. Amsterdam etc., 1989 - P. 257 - 268.

314. Walton, J. D. Deconstructing the cell wall / J. D. Walton // Plant Physiol. . 1994.-104, №4-P. 1113- 1118.

315. Wang, J. Получение неочищенных экстрактов Pyricularia oryzae и определение их токсичности на рисе / J. Wang, W. Xu, Y. Wang // J. Fujian. Agr. Coll. 1988. - 17, № 4. - P. 318- - 327.

316. Wang, Y.Z. Effects of Fusarium graminearum metabolites on wheat tissue in relation to fusarium head blight resistance / Y.Z. Wang, J.D. Miller // Phytop-thol. Z. 1988. 122, № 2. - P. 118 - 125.

317. Wasfy, E. H. Comparative studies on pectolytic and cellulolytic enzyme activities of two isolates of Alterharia porri / E. H. Wasfy, S. H. Michail, H. M. Elarosi, M. A. Salem // Acta phytopathol. Acad, sci hung. 1977. - 12, № 3 -4. - P. 277 - 282.

318. Wattad, E. Pectate lyase of Colletotrichum gloeosporioides attacking avocado fruits: cDNA cloning and involvement in pathogenicity / E. Wattad, D. • Kobiler, A. Dinoor, D. Prusky // Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1997. - 50, № 3. - P. 197-212.

319. Webley D. J. Alternaria toxins in Weather damaged wheat and sorghum in the 1995 - 1996 Australian harvest / D. J. Webley, K. L. Jakson, J. D. Mullins et al. // Austral. J. Agr. Res. - 1997. - 48, № 8 . - P. 1249 - 1255.

320. Wiese, G. Content and metabolism of indole 3 - acetic Acid (IAA) in healthy and rust - infected wheat leaf segments / G. Wiese, H.J. Grainbow // Z. Natur-forsch. - 1986. - с 41, № 11-12. - P. 1023 - 1031.

321. Wolpert, T.J. Molecular features affecting the biological activity of the host • selective toxins from Cochliobolus victoriae/ T.J. Wolpert, V. Macko,W. Acklin, D. Arigoni // Plant Physiol. - 1988. - 88, № 1. - P. 37 -41.

322. Wolpert, T.J. Molecular interactions of victorin and oats: Pap. IMC'5: 5th Int. Mycol. Congr., Vancouver, Aug., 14 21, 1994 / T.J. Wolpert, D.A. Navarre, J.M. Lorang, D.L. Moore // Can. J. Bot. - 1995. - 73, Suppl. 1 Sec. A. -D. - P. 475 - 482.

323. Wolpert, T.J. Identification of the 100-kD victorin binding protein from oats / T.J. Wolpert, D.A. Navarre, D.L. Moore, V. Macko // Plant Cell. 1994. - 6, • №8-P. 1145- 1155.

324. Xue, A.G. Pathogenic variability in Mycosphaerella pinodes in western Canada: Abstr. Can Phytopathol. Soc. Annu. Meet., Winnipeg, July, 1997 / A.G. Xue, T.D. Warkentin, B.D. Gossen et al. // Can. J. Plant Pathol.- 1998.- 20, № l.-P. 132.

325. Yadav, B.S. Secretion of cytokinin like sibsstances in vivo and in vitro by

326. Helminthosporium sativum and their role in pathogenesis / B.S. Yadav, C.L. Mandahar // Z. Pflanze^krankh. und Pflanzenschutz. 1981. - 88, № 12. - P. 726-733.

327. Yamamoto, H. Peroxidase and polyphenoloxidase in relation to the crown rust resistance of oat leaves / H. Yamamoto,H. Hokin, T. Tani // Phytopathol. Z. 1978. - 91, № 3 - P. 193 - 202.

328. Yang, Ge. A polyketide synthase is required for fungal virulence and production of the polyketide T toxin / Ge. Yang, M.S. Rose, B.G. Turgeon,O.C. • Yoder // Plant Cell. - 1996.-8, № 11.- P. 2139-2150.

329. Yun, C.H. The phytotoxic ophiobolins produced by Drechslera oryzae, their structures and biological activity on rice / C.H. Yun, F. Sugawara, G.A. Strobel // Plant. Sci. 1988. - 54, № 3. - P. 237 - 243.

330. Zak, J. Pathogenicity of a gibberellin producing and a nonproducing strain of Fusarium moniliforme in oats as determined by a colorimetric assay for N-acetyl glucosamine / J. Zak // Mycologia. - 1976. - 68, № 1. - P. 151 - 158.

331. Zamorski, C. Problematyka chorob pszenzyta w Polsce / C. Zamorski, M. Schollenberger, B. Nowicki // Zesz. nauk. Rol. / AR Szczecinie.-1997.- 65, № 175, Pt.2.-P. 527-532.

332. Zhang, X. Sensitivity to Ptr Tox A and tan spot infection responses in Ae-gilops / Triticum complex / X. Zhang, Y. Jin // Can. J. Plant Pathol. 1988. -20, №4.-P. 415-418.

333. Zinkernagel, V. Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Infektionss- • trukturen von Septoria nodorum (Berk.) Berk, an Weizen / V. Zinkernagel, F. Riess // Meded. Fac. landbouwwetensch. Rijksuniv. Gent.- 1987.- 52, № 3A.Deel 3.- P. 841-850.

Информация о работе

Кобыльский, Геннадий Иванович
доктора биологических наук
Тамбов, 2005
ВАК 06.01.11

Диссертация

Патогенность дейтеромицетов - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему Патогенность дейтеромицетов ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Патогенность дейтеромицетов"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кобыльский, Геннадий Иванович

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Патогенность дейтеромицетов"

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Кобыльский, Геннадий Иванович

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Кобыльский, Геннадий Иванович, Тамбов

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Патогенность дейтеромицетов
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений