ПАТОГЕННОСТЬ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ [НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ПШЕНИЦЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM (BERK.) BERK.]

Кобыльский, Геннадий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
ПАТОГЕННОСТЬ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ [НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ПШЕНИЦЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM (BERK.) BERK.]
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ПАТОГЕННОСТЬ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ [НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ПШЕНИЦЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM (BERK.) BERK.]"

ЗйУЗГ

На правах рукописи

КОБЫЛЬСКИЙ Геннадий Иванович

ПАТОГЕННОСТЬ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ [НА ПРИМЕРЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕПТОРИОЗА ПШЕШ1ЦЫ -ГРИБА SEPTORIA NODORUM (BERK.) BERK.\

06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Филиале Государственного научного учреждения Тамбовского научно-исследовательского института сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук "Среднерусской научни-иссчедовательской фитопатологической станции"

Официальные оппоненты академик РАСХН, доктор биологических наук

профессор Соколов Михаил Сергеевич

доктор биологических наук, профессор Дьяков Юрий Таричанович

доктор биологических наук, профессор Мазин Валентин Викторович

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовате хьский институт фитопатологии РАСХН

Зашита состоится 2005 г в часов

на заседании Диссертационного совета Д 220 043 04 при Российском государственном аграрном университете - МСХА им К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, И-550, Тимирязевская ул , 4е), Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА им К А Тимирязева

Автореферат разослан ¿О б/г 2005 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

профессор ___* ' ^ ® В Исаичев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дейтеромицеты (Deuteromycetes) или несовершенные грибы чрезвычайно широко распространены в природе. Многие из них паразитируют на высших растениях. К возбудителям болезней сельскохозяйственных культур, оказывающим наиболее существенный вред производству, относятся грибы pp. Botrytis Mich., Verticillium Nees, Rinchosporium, Trichothecium Lk, Piricularia Sacc., Cercosporella Sacc., Cladosporium Link, Alternaría Nees, Helminthosporium Lk: Fr., Drechslern Ito, Bipolaris, Curvularia Boed, Fusarium Lk: Fr. (порядок гифомицеты), p. Colletotrichum Sacc. (порядок мелан-кониальные) и pp. Phoma sp., Phomopsis Sacc., Ascochyta Lid. и Septoria Fr. (порядок сферопсидальные).

Возбудители септориозных пятнистостей пшеницы — грибы p. Septoria в настоящее время насчитывают свыше 10 видов. Среди них наиболее часто на посевах встречаются S. tritici Rob. et Desm. и S. nodorum Berk Первый из них поражает, в основном, листья, а второй - колос, хотя практически S. nodorum Berk, способен поражать все надземные органы. Оба вида часто можно обнаружить на одних и тех же полях и даже растениях (Соколов и др., 1998).

В 1987 г. на европейской территории бывшего СССР 50 - 80% случаев возникновения массовых пятнистостей на пшенице было вызвано поражением её септориозом (Супрун, 1990). Сильное развитие септориоза на посевах пшеницы отмечено на Алтае и в Северном Казахстане (Васецкая, Столяров, 1988), в Сибири (Лебедева, 1984; Кашуба, 1989), на Северном Кавказе (Фиссюра и др., 1996; Чуприна и др., 1997) и в Украине (Дубиневич, 1971; Гонтаренко и др., 1998). Особенно широкое распространение септориоз получил с середины 80-х и начала 90-х годов (Новожилов, 1996), став доминирующим заболеванием на посевах озимой и яровой пшеницы (Павлюшин и др., 2005). Показано, что в благоприятные для развития болезни годы септориоз вызывает снижение урожая зерна на 10 - 20, а в некоторых случаях до 30 - 50 %(Дымина, 1997; Гонтаренко и др., 1998).

Приведенные данные говорят о том, что септориоз относится к числу широко распространенных и опасных по экономическим последствиям болезней зерновых культур. Основными методами борьбы с данным заболеванием являются создание и внедрение в производство устойчивых сортов пшеницы и синтез новых эффективных и экологически безопасных химических средств защиты посевов. Решение данных вопросов сдерживается рядом причин, одной из которых является слабая изученность природы патогенности возбудителей этого заболевания. Из литературы известно, что детерминантами патогенности ряда бактерий и грибов могут служить ферменты (Tapp, 197j, Бренчу к, 1977),

ЦНБМСХА ' ]

фОНД "auuuftS пыхо"-,™^,!

№

токсины (Tapp, 1975, Йодер, 1984, Асада, 1985, Дурбин, 1985), гормоны (Tapp, 1975, Пегг, 1984, Косуге, Комаи, 1985) и другие биологически активные соединения Сведения подобного тана в отношении грибов р Septoria ограничены, поэтому проведение исследований, направленных на изучение пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как возможных биохимических факторов патогенности S nodorum Berk является актуальным и имеет большое научное общебиологическое и прикладное значение

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было изучение физиочого-биохимической природы патогенности 5 nodorum Berk как теоретической основы направленного поиска новых средств химической защиты растений и создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи • изучить динамику роста и спору тяции 5 nodorum Berk, в чистой культуре, выявить зависимость их от состава питательной среды (источники азота и углерода, ростовые факторы и т д ) и проанализировать взаимосвязь между физиологической специализацией S nodorum Berk и его патогенностью,

•выяснить способность S nodorum Berk к мутационной изменчивости, создать дтя экспериментальных целей коплекцию морфологических и контрастных по патогенности мутантных штаммов гриба и изучить физио-чогические особенности некоторых из них,

•проследить за динамикой активности пектолитических и цетиолочити-ческих ферментов, синтеза индолилуксусной кистоты (ИУК) и фитотоксинов в процессе роста S nodorum Berk в чистой ку7ьтуре, провести анализ взаимосвязи между патогенностью гриба и способностью его к продуцированию ферментов, фитотоксинов и ИУК,

•изучить полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гадролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов, а также у слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S nodorum Berk.,

•выявить особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в системе ' растение - хозяин - патоген" в процессе развития болезни,

•изучить действие экзогенных ферментных препаратов, фитотоксинов и фитогормонов на характер взаимоотношений патогена и растения - хозяина,

•разработать схему взаимодействия на уровне пекто- и цечлюлолити-ческих ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК) между возбудителем септориоза - грибом S nodorum Berk и растениями пшеницы

Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования пектолитических и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогор-монов как возможных факторов патогенности возбудителя септориоза пшеницы - гриба S. nodorum Berk. Эксперименты выполнены с использованием не только природных изолятов, но и конрастных по патогенности мутантов S. nodorum Berk, впервые полученных на основе изолята 85-254. Впервые с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления удалось количественно оценить способность S. nodorum Berk, к синтезу фитотоксинов и ИУК при выращивании его в чистой культуре.

Установлено, что культура гриба S. nodorum Berk, обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов, продуцирует ряд фитотоксичных метаболитов и фитогормоны, в частности, ИУК. Максимальная активность полигалактуроназы, комплекса целлюлаз и ксиланазы приходится на 5-7 сутки роста гриба, то есть на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции сопровождается снижением активности ферментов и увеличением количества ИУК с 1,5 до 6,7 нг/г сырой массы. При прорастании пикноспор резко повышается активность ферментов, возрастает содержание фитотоксинов и ИУК, одновременно усиливается секреция их в окружающую инкубационную среду.

Впервые показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты S. nodorum Berk обладают и более высокой активностью гидролитических ферментов, особенно полигалактуроназы и ß-глкжозидазы, а также повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Между патоген-ностью мутантов S. nodorum Berk, и способностью их к синтезу ИУК обнаружена обратная корреляционная зависимость.

Впервые представлены данные сравнительного анализа активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы у слабо- и высокопатогенных мутантов S. nodorum Berk, доказывающие преимущества последних по числу изоферментов эстеразы, ß-глюкозидазы, кислой фосфатазы и пероксидазы.

Впервые с использованием восприимчивого и относительно устойчивого к сехггориозу сортов пшеницы исследованы особенности динамики активности и изоферментного спектра некоторых гидролаз и пероксидазы, а также содержания ИУК в процессе развития болезни у растений, инфицированных слабо- и высокопатогенным мутантами S. nodorum Berk Показано, что и в данном случае различия между слабо- и высокопатогенным мутантами и пре-

имущество последнего сохраняются, особенно в опытах с восприимчивым к септориозу сортом пшеницы

В экспериментах с изучением действия экзогенных гидролаз, фитоток-синов и фитогормонов на растения впервые доказано, что экстракты ферментов из мицечия S nodorum Berk вызывают на листьях повреждения, характерные для септориоза Фитотоксины, напротив, не способны вызывать подобных внешних симптомов, однако при добавлении в споровую суспензию повышают степень поражения инокулированных растений пшеницы, а при поступлении через корни влияют на транспирацию и водный обмен Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S nodorum Berk, в значительной степени снижает развитие септориоза

На основе полученных результатов и данных литературы предложена схема взаимодействия возбудите чя септориоза - гриба S nodorum Berk и растений пшеницы

Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов

• создана колтекция мутантов гриба 5 nodorum Berk (свыше 30 штаммов), различающихся по морфолого-кутьтуральным признакам и патогенно-сти,

• выделены фитотоксины гриба S nodorum Berk, которые могут быть использованы в работах по селекции пшеницы на устойчивость к септориозу с помощью культуры клеток и тканей,

• разработаны схема препаративного выделения токсинов из культуры гриба 5 nodorum Berk 'Методика определения фитотоксинов гриба S nodorum Berk с помощью тонкослойной хроматографии" и ' Методика количественного определения фитотоксинов гриба S nodorum Berk с помощью жидкостной хроматографии высокого давления',

• составлены "Рекомендации по направленному синтезу фунгицидов предназначенных для борьбы с септориозом'

Основные положения, выносимые на защиту:

• наиболее патогенные природные изоляты и мутанты гриба S nodorum Berk обладают и более высокой активностью пекголитических и целлюлолитических ферментов, особенно полигалактуроназы (i—0,67) и ß-глюкозидазы (г=0,70),

• высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изоляты гриба S nodorum Berk, превалируют по количеству продуцируемых септорина и меллеина (охрацина), суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секретируемых фитотоксинов над слабопатогенными штаммами.

• между патогенностью гриба S. nodorum Berk и способностью его к синтезу и секреции фитогормона ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость;

• схема взаимодействия возбудителя септориоза - гриба S. nodorum Berk и растений пшеницы, предложенная на основе полученных результатов и данных литературы.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научно-теоретических конференциях НИСХИ МСХ СССР (пгг Гвардейский, 1981,1983,1988 ), VIII научной конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана (Ташкент,1989 ), научно-теоретической конференции Среднеазиатского НИИ фитопатологии МСХ СССР ( Ташкент, 1989 ), I и II Всесоюзном совещаниях по физиолого - биохимическим основам иммунитета с.-х. растений к грибным болезням (Уфа, 1988, 1990 ), заседаниях научно-технического совета при ВНИИ фитопатологии МСХ СССР (Голицыне, 19801991), бюро Отделения защиты растений Россельхозакадемии (Москва, Санкт-Петербург, Голицыно, 1992-2002), IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям (Минск, 1991 ), III (Санкт-Петербург, 1993 ) и IV (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений, научно-методическом совещании по селекции яровой пшеницы, посвященном 110-летию А.П. Шехурдина (Саратов, 1996), V и VI международных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999, 2001), международной научно-практической конференции "Биологизация защиты растений: состояние и перспективы" (Краснодар, 2000), I съезде микологов (Москва, 2002), I Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано — 50 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, заключения, выводов, списка литературы и 36 стр. приложения. Работа изложена на 360 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 78 рисунками. Библиография включает 384

источника, в том числе 227 на иностранных языках.

* * *

Исследования выполнены в 1979-1999 гг. по планам НИР, утвержденным МСХ СССР, и программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН. Место проведения экспериментов: НИСХИ МСХ СССР (ныне Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан НИСХИ, п.г.т. Гвардейский) и Среднерусская Н.-И. фитопатологическая станция РАСХН (ныне Филиал ГНУ Тамбовского НИИСХ РАСХН «Среднерусская Н.-

И фитопатологическая станция») В выполнении отдельных разделов работы принимали участие M H Васецкая, Г В Кобыльская, В Д Борзионов, А А Ач-метов, Е В Бочарова, H M Герцог и Е Г Дорохова, которым автор выражает искреннюю благодарность

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Биологические и физиолого-биохимнческие факторы па-тогенности дейтеромецетов (обзор литературы)

В обзоре литературы освещено современное состояние проблемы пато-генности дейтеромицетов, паразитирующих на растениях Проанализированы и обобщены экспериментальные данные, полученные различными авторами при изучении распространения, видового состава, вредоносности, жизненных цик-тов, биологической специализации и патогенности представите чей дейтеромицетов - грибов р Septoria Рассмотрен механизм заражения растений дейтеро-мицетами Особое внимание в обзоре уде юно критическому анализу результатов исследования ферментов, фитотоксинов и фитогормонов как воп-южных биохимических факторов патогенности

Глава 2. Материалы и методы исследовании

В качестве объекта исстедований в работе использовали природные изо-ляты гриба S nodorum Berk и полученные на их основе мутанты

Кутьтуру гриба в зависимости от цели эксперимента выращивали в стационарных условиях в термостате или в климатической камере "Sherer" с освещенностью 12-15 тыс люкс и 16-час фотопериодом при температуре 22 24°С Питатечьной средой служил картофечьно-декстрозный агар (КДА) с добавлением томатного сока (200 г/л) и CaCOj (0,5 г/т) В опытах использовали также синтетическую глициновую среду, жидкую и агаризованную среду Фриза (Bousquet et al, 1980), жидкую питатечьную среду Чапека с добавлением гид-ролизата казеина, свободного от витаминов, и перловую крупу При изучении специфических потребностей в факторах роста в среду для кутьтивирования 5 nodorum Berk включали минеральные компоненты по Ричардсу (Richards, 1951), 20 г D-глюкозы и 20 г агара "Difco" на 1 т среды Ростовые факторы вводили по схеме, предтоженяой Холлидеем (Захаров и др, 1980) Кроме того, в работе были использованы агаризованные среды Чапека-Докса, минимальная и синтетическая (Kruger, Hoffman, 1978)

В опытах по индуцированной изменчивости S. nodorum Berk, в качестве источника УФ-лучей применяли лампы БУВ-ЗОП. Для получения мутантов использовали и химические мутагены: нитрозо-1-метилмочевину (НММ) и N-метид-М-нитро-М-нитрозогуанидин (НГ).

Споры гриба S. nodorum Berk выделяли из биоматериала, полученного на перловой крупе, проращивали в колбах Эрленмейера на среде TBN, содержащей 0,01% Твина-20 в Са/К-фосфатном буфере, pH 7,0 (Maheshwari et al., 1967) и 10"4 н-нониловый спирт (Dunkle, Allen, 1971), через 18-20 ч осаждали центрифугированием и использовали для анализов.

Патогенность природных изолятов и мутантов S. nodorum Berk оценивали на изолированных листьях (Пыжикова, Карасёва, 1985), а также на растениях пшеницы в фазу 2-3 листьев. Последние выращивали в вазонах (по 15-20 шт. в каждом), в климатической камере "Sherer" при 16-час. фотопериоде и освещённости 15-20 тыс. люкс. На 14 сутки после инфицирования проводили учёт степени поражения растений. В полевых условиях растения инокулировали в фазу колошения по методике М.Н. Васецкой и др. (1983).

Содержание белка в культуральной жидкости, в экстрактах из мицелия и спор S. nodorum Berk, а также из листьев пшеницы определяли по Лоури (Lowri et al., 1951). Количество Р„ при анализе кислой фосфатазы учитывали по методу Лоури и Лопез в модификации Хонда (Гавриленко и др., 1975). Активность кислой фосфатазы, кроме того анализировали по методике, описанной М.А. Ту-кеевой (1977). Определение активности эстеразы проводили по В.В. Чигрину и др. (1976), р-глюкозидазы - по методике, предложенной Е. Onogur (1978), РНК-азы - по Martinez-Honduville (1975), а пероксидазы - по методу А.Н. Бояркина, описанному Б.П. Плешковым (1976).

Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов анализировали в экстрактах из мицелия (Гусева, 1980). В качестве субстрата для поли-галактуроназы, эндо-ß-l ,4-глюканазы (или Сх-целлюлазы,) и ксиланазы использовали соответственно 1%-ные растворы пектина, Na-КМЦ и 2%-ный раствор ксилана. Активность экзо-ß-1,4-глюканазы (или Срцеллюлазы) определяли по количеству глюкозы (Курзина и др., 1980), образующейся в реакционной смеси, содержащей в качестве субстрата хлопковое волокно. Об активности ß-глюкозидазы Судили по интенсивности окраски нитрофенола, образующегося в результате гидролиза р-нитрофенил-р-О-глюкопиранозида (Родионова и др., 1966).

Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле, pH 8,9 (Маурер, 1971) и в 7,5%-м геле в щелочной (pH 8,9) системе Орнстейна и Дэвиса (Методы эксп. микол., 1982) в пластинах на приборе GE-4 фирмы "Pharmacia" (Швеция).

Окраску гелей для определения изоферментного спектра эстеразы вели по модифицированному нами методу, описанному В В Чигриным и др (1976) Изоферменты кислой фосфатазы выявляли по методу Adams, Joly (1980), описанному Е В Левитес (1986), с некоторыми изменениями В качестве субстрата для выявления ß-глюкозидазы использовали а-нафтил-Р-О-глюкопиранозид (Жданов и др, 1978) С целью определения изоферментного спектра пероксида-зы гели инкубировали в 6 мМ растворе о-дианизидина, приготовленном на 0,1 M ацетатном буфере, pH 6,0 (Yamamoto et al, 1978)

Для сравнения легкорастворимых белков и изоферментов различных изо-лятов вычисляли коэффициент сходства (Кс) по формуле, предложенной В Ф Гальченко и А И Нестеровым (1981), и коэффициент различия (Кр) по формуле, приведенной в своей работе И А Можиной и др (1986)

Для изучения качественного состава и биологической активности фито-токсичных метаболитов 5 nodorum Berk использовали этилацетатные экстракты среды культивирования, мицелиальной массы и спор гриба (Bousquet et al, 1980) Биологически активные вещества разделяли методом одно- и двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках ' Silufol UV-254 ' в системах растворителей хлороформ-этилацетат, 5 1 (Devvs et al, 1980), петролейный эфир-этилацетат, 1 1 (Bousquet, SkajenmkotT, 1474), бензол-уксусная кислота, 3 1 (Берестешшй и др , 1479) Обнаруженные таким образом метаболиты гриба S nodorum Berk проверяли на биологическую активность с помощью биотеста на семенах пшеницы Саратовская 29 Количество фитотоксинов в пробах определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления по разработанной нами методике

Фитогормоны первоначально исследовали, используя комплексный метод, разработанный Г1В Власовым и др (1979) Для обнаружения гиббере л ли-нов использовали ферментный тест по Джонсу и Варнеру (Гродзинский, Грод-зинский, 1973) с некоторыми изменениями (Кобыльский и др, 1974, Кобыльей™, Письменов, 1974, 1976) Анализ свободных ауксинов и ингибиторов роста проводили по методам, предложенным В И Кефали и др (1973) и Е H Арте-менко и др (1973) О наличии ауксинов на хроматограмме судили по приросту отрезков колеоптилей пшеницы (Полякова, 1979) Содержание ИУК в исследуемых объектах определяли по методу, предложенному A M Умновым и др (1984) с помощью жидкостного хроматографа системы " Gold" ("Beckman")

Обработку растений пшеницы (фаза 2-х листьев) фитогормонами проводили за сутки до инокуляции и в момент инокуляции Учет количества образовавшихся пикнид на листьях (в расчете на 1 мм*) проводили под МБС-9 с окуляр-микрометром, а длину гиф проросших спор S nodorum Berk измеряли под микроскопом МБИ-6

Результаты исследований обрабатывали математически. Подсчёт среднего арифметического значения и стандартного отклонения проводили по формулам, изложенным Р.Х. Кармолиевым (1971). Наименьшую существенную разность между вариантами опытов (НСР) определяли по Б.А. Доспехову (1979). Корреляционный анализ осуществляли, используя программу "Statistical Graphics System" (USA; 1985-1986) для персонального компьютера IBM PC/AT.

Глава 3. Изучение биологических особенностей возбудителя сеп-ториоза пшеницы - гриба Septoria nodorum Berk.

Для выяснения природы патогенности S. nodorum Berk и получения данных, позволяющих моделировать поведение патогена в процессе взаимодействия его с растением-хозяином, прежде всего были изучены динамика роста и споруляции гриба в чистой культуре, зависимость данных процессов от различных источников азота, углерода и специфических факторов роста, присутствующих в питательной среде, а также наличие и степень проявления у.патогена физиологической специализации.

3.1. Рост и споруляция гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре. Культивирование гриба на КДА в климатической камере при температуре 20° С и 16-час. фотопериоде показало (Кобыльский, Ахметов, 1989), что с момента инокуляции чашек Петри споровой суспензией и до 10 суток накопление биомассы идет по логарифмической кривой (рис. 1).

3,2-,

-г 90'

+ 80 а

В это время гриб обладал максимальной удельной скоростью роста, с 10 по 16 сутки она снижалась до нуля, а затем принимала отрицательные значения. Появление спор отмечалось на 3-5-е сутки роста 0 2 4 6 8 10 12 14 16 гриба. Резкое уси-

Рис. 1. Изменение логарифма биомассы (I) и спо- ление спорулирую-руляции (II) гриба S. nodorum Berk (изолят 78 Д) при щед способности выращивании его в чистой культуре патогена происхо-

дило на 7-е, а достижение максимума - на 10-е сутки. Увеличение продолжи-

те тьности выращивания гриба до 14 суток, как правило, приводило к снижению количества спор

Таким образом, рост гриба S nodorum Berk, при культивировании его на плотной питатетьной среде подчиняется законам роста простой периодической культуры (Перт, 1978) Полученные при этом показатечи удельной скорости роста (2,0-2,2% ч ') позволяют отнести данный гриб к числу медленнорастущих патогенов

Выращивание гриба на средах с различными ростовыми факторами по Холлидею (Захаров и др , 1980) показало, что достаточно активный рост гриба наблюдается во всех вариантах опыта Диаметр колоний колебался в зависимости от состава среды и изолята в предетах от 29,5 до 67,5 мм Наиболее интенсивная спорутяция гриба наблюдалась на средах, содержащих такие компоненты, как аденин, гипоксантин, другие пуриновые и пиримидиновые основания и ряд аминокислот, в том чисче глицин и лейцин

Таблица 1 Влияние состава питатетьной среды на рост и спорутяцию гриба S nodorum Berk

И з о 1 я т ы

Среда

538 Б

72 Г

Диаметр Число колоний, спор, мм шт 106

Диаметр Число спор, колоний, | шт 106 мм

Ричардса без источника

Чапека - Докса

Минимальная

Синтетическая

азота аспарагин метионин

1изин

тирозин

треонин

гчицин

изолейцин

гипоксантин

22-35 13,41 32-35

11-23 1,41 23-26

11-15 3,94 25-30

12-20 11,34 | 30-34 11-13 10,78 14-16 24-30 51,56 31-44 16-18 4,69 23-32

13-14 4,50 33-35 20-33 4,87 17-25 19-23 12,19 26-33 11-24 9,94 I 19-28

37,88 7,12 8,94 6,75 5,00 53,72 11,44 14,91 12,00 31,31 19,22

НСРо5=2,6 1 Sx=5 2% .

НСР05—4,1

Sx-S.l %

Увеличение количества вносимых в среду аминокислот до 0,425 г/л по азоту, т.е. приравнивание их к 2 г аспарагина, позволило более четко решить вопрос об эффективности каждой аминокислоты и их взаимозаменяемости в качестве источника азота. Было выяснено, что наибольшую спорулирующую способность изоляты гриба S. nodorum Berk проявляют при введении в среду глицина (табл. 1). Эффективность аспарагина была в 1,4 (изолят 72 Г) и в 4 раза (изолят 538 Б) ниже. Влияние таких аминокислот, как лизин, тирозин, треонин и изолейцин было еще слабее. Причем лизин и изолейцин усиливали споруля-цию только у изолята 72 Г, а тирозин и треонин - у 538 Б. Гипоксантин также оказывал стимулирующее действие на споруляцию одного из изолятов, а именно изолята 72 Г, однако и он уступал по эффективности глицину и аспарагину. Споруляция обоих изолятов S. nodorum Berk на средах Чапека-Докса, минимальной и синтетической (Krüger, Hoffmann, 1978) была значительно ниже.

Естественно, что изучение роли источника углерода и его концентрации на споруляцию гриба проводилось с использованием именно глициновой среды. Нами установлено, что S. nodorum Berk может эффективно использовать в качестве источника углерода не только глюкозу (или сахарозу, как в среде Чапека-Докса), но и галактозу и раффинозу. Однако споруляция гриба в случае замены глюкозы в среде на данные углеводы при концентрации 5 г/л снижалась на 26,5-29,5 %. Преимущество глюкозы, как видно из табл. 2, сохранялось и при использовании более высоких концентраций (15,20 и 25 г/л).

Таблица 2. Влияние источников углерода и их концентрации на споруляцию изолята 25 Д гриба S. nodorum Вегк.(шт. 106)

Источники Концентрация, г/л Средние по

углерода 5,0 15,0 20,0 25,0 углеводу

Глюкоза 77,74 146,92 95,87 97,63 104,50

Галактоза 57,20 95,83 78,69 41,04 68,20

Раффиноза 54,85 55,67 . 40,28 44,13 48,70

Средние по

концентрации, НСР05= 10,2 63,30 Sx= 6,6 % 99,50 71,60 60,90 НСРо5 = 8,17

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее эффективным источником азота для роста и споруляции S. nodorum Berk в синтетических или полусинтетических средах является глицин. Установлено, что глюкоза в качестве источника углерода в отличие от данных, полученных Ри-чардсом (Richards, 1951), на изученных изолятах S. nodorum Berk в 1,5 раза эф-

фективнее галактозы Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает

3.2. Физиологическая специализация гриба S. nodorum Berk, и пато-генностъ. В отношении возбудителя септориоза вопрос о физиологической специализации и наличии рас до сих пор еще не решен Имеющиеся на сегодня данные, с одной стороны, говорят о существовании определенной взаимосвязи между сортами пшеницы и изолятами S nodorum Berk. (Allmgham, Jackson, 1981), а с другой, напротив, не позволяют разделить штаммы гриба на физиологические расы и биотипы (Knstiansson, 1974, Griffiths, Ао, 1980, Bronmmann, 1968, Ruftyetal, 1981)

Учитывая важность дифференциации S nodorum Berk по патогенности, были поставлены эксперименты, в которых исследовали физиологическую специализацию 25 изолятов гриба с использованием 12 различных сортов пшеницы Причем опыты ставили не только в теплице, но и в полевых устовиях Установлено, что все отобранные изоляты S nodorum Berk в условиях тетины проявляют высокую патогенность на сортах пшеницы Степень поражения растений колебалась от 24,1 до 89,5% Различия в средних значениях патогенности у изоаятов 5 nodorum Berk на наборе сортов практически не были обнаружены ни в одном из опытов

В полевых условиях, напротив, наблюдалась вполне определенная дифференциация изолятов по пагогенности Наиболее высокопатогенными на наборе сортов в целом проявили себя изоляты 176 Е (47,9%), 538 Б (48,8" о), 83-30 (49, 1%), 101 Д (50,8%) и 810 В (57,2%) Изоляты 25 Д, 143 Г, 71 Е и 154 Г поражали сорта пшеницы в среднем на 23,3-34,7% Различия между изолятами наблюдались и на отдечьных сортах

Таким образом, проведенные исследования показали, что все испытанные изочяты S nodorum Berk, различающиеся по происхождению и морфолого-культуральным признакам, обладают потенциально высокой патогенностью и вирулентностью, проявление которых во многом определяется климатическими факторами в период от инокуляции растений до обнаружения болезни В жестких полевых условиях юга Казахстана (высокая температура, низкая относительная влажность воздуха и т д ) степень поражения растений снижалась, при этом четче прослеживались различия в патогенности между изолятами как на наборе сортов, так и на каждом их них в отдельности В более оптимальных для заражения растений условиях теплицы патогенность всех изолятов значительно повышалась, а различия между ними, напротив, сглаживались

Ученые Западной Андалузии на основании своих наблюдений пришли к выводу, что физиологическая, межвидовая и внутривидовая специализация у S trihci и S nodorum вообще отсутствует (Mann, Aguirre, 1986) А устойчивость.

обнаруживаемая у некоторых сортообразцов к S. nodorum и S. tritici, по мнению авторов, является неспецифической. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что S. nodorum Berk действительно если и обладает, то обладает слабо выраженной физиологической специализацией.

Глава 4. Мутационная изменчивость и патогенность гриба

Septoria nodorum Berk.

Для дейтеромицетов мутационная изменчивость является одним из основных факторов эволюции. Именно она обусловливает появление в природе большого количества новых биотипов, рас и форм грибов, различающихся мор-фолого-культуральными, физиологическими и биохимическими признаками (Левитин, 1977, 1983, 1986; Мацкевич, 1981). Не исключено, что подобный спонтанный формообразовательный процесс идет и в популяции S. nodorum Berk

4.1. Морфолого-культуральные особенности и патогенность мутантов гриба S. nodorum Berk. Проведённые эксперименты показали, что размах изменчивости S. nodorum Berk под влиянием УФ-лучей определяется в основном природой изолята, а не дозой (продолжительностью) облучения. Наибольшее количество морфологически изменённых вариантов было получено у изолятов 83-30 (11) и 259 Г (12). По 7-8 мутантов было выявлено у изолятов 390 Е, 154 Г, 25 Д и 83-150 , а у изолятов 323 Е, 83-6 - всего 2 и 3 мутанта соответственно.

Характерной особенностью большинства обнаруженных мутантов является их лабильность, неустойчивость. Стабильные мутанты удалось получить только из изолятов 390 Е, 25 Д, 83-150 и 154 Г. Все они, за исключением телесно-светло-коричневого карлика, проявляли более высокую патогенность, чем исходные изоляты. Так, степень поражения листьев у пшеницы сорта Артур 71 при инокуляции её изолятом 390 Е была 43,5%, а его мутантом - 90%. Изоляты 83-150 и 154 Г поражали листья на 53,8 и 49,6%, а их черно-зелёный и серо-оливковый мутанты- на 90,0 и 78,6% соответственно. Патогенность изолята 25 Д (58,8%) и его мутанта (51,2%) была практически одинаковой.

При облучении спор изолята 85-254 УФ-светом нами было выделено семь морфологических типов или форм. Причем в большинстве случаев доминировал оливково-песочный вариант, характерный для исходной формы изолята 85-254. За ним следовали оливково-песочный с розовым ободком (18,5-50,0%) и черный (15,4-30,5%) варианты. На долю болотно-оливковых, горчично-оливковых, серо-черных и темно-розовых вариантов приходилось всего по 0,78,5%.

При обработке суспензии спор НММ в рассевах полностью отсутствовали розовато-телесные, розовато-лиловые и оливковые гладкие с розовым ободком варианты На фоне же основных оливково-песочных колоний резко выделялись оливково-черные (37,7-48,5%) Отмечено появление одиночных мышино-серых (2 6-3,5%) и горчичных (1,9-3,4%) колоний Обработка споровой суспензии НГ приводила к появлению значительно большего количества морфологически измененных вариантов с самыми различными цветовыми оттенками, которые чаще всего формировали колонии складчатого типа, приподнятые над поверч-ностью среды на 0,5-1,0 см

Всего из изолята 85-254 5 nodorum Berk t, помощью физического (УФ-лучи) и химических (НММ, НГ) мутагенов получено 28 мутантов (Кобыльский, Герцог, 1991) Установлено, что большинство мутантов являются активно спо-рулирующими Наиболее сильная споруляция отмечена у мутантов 85-254'5, 85-254/15, 85-254/21 и 85-254/27 (от 1 10" до 4 10")

Из числа мутантов, характеризующихся относительно стабильными свойствами, были сформированы две основные группы, представляющие несомненный интерес для дальнейших исследований Это слабопатогенные (85-254/2, 85-254/8, 85-254/13) и высокопатогенные (85-254/15, 85-254/23 и 85-254/27) мутанты Стабильность отобранных мутантов была подтверждена в экспериментах не только с восприимчивым (Саратовская 29) но и с относительно устойчивым к септориозу (Castan) сортом пшеницы Слабопатогенные мутанты не вызывали образования на листьях сорта Саыап характерных для заболевания пятен (табл 3) Высокопатогенные штаммы поражали и этот сорт, однако, степень поражения листьев была ниже, чем у сорта Саратовская 29, особенно при использовании мутанта 85-254/23

Таким образом, всего в результате экспериментов получено свыше 30 мутантов S nodorum Berk Для изучения физиолого-биохимической природы патогенности были отобраны шесть, три из которых (85-254/2, 85-254/8, 85254/13) обладают слабой (степень поражения пшеницы Саратовская 29 - 4 59,8%) и три (85-254/15, 85-254/23, 85-254/27) - высокой патогенностью (степень поражения этого же сорта - 63,0-82,0%)

4.2. Физиологические особенности мутантов гриба S. nodorum Berk, и их роль в адаптации патогена к условиям существования. Патогенность испытанных мутантных форм S nodorum Berk при всех значениях температуры и продолжительности влажной камеры, за редким исключением, была выше, чем у исходных природных штаммов гриба (рис 2) Наиболее четкие различия в патогенности проявлялись при температуре 6°С и 24-час продолжительности влажной камеры, т е в более экстремальных условиях

Прорастание пикноспор и рост гиф при температуре 6СС у природных

Таблица 3. Патогенность мутантов 5. nodorum Berk, на восприимчивом и относительно устойчивом к септориозу сортах пшеницы

Мутант Степень поражения, %

Саратовская 29 Castan

1-го листа 2-го листа 1-го листа 2-го листа

Слабопатогенные

85-254/2 9,8+0,7 1,0+0,03 Одиночные пятна Одиночные пятна

85-254/8 4,5+0,06 1,0±0,01 Пятен не выявлено Пятен не выявлено

85-254/13 5,2+0,7 0,8+0,06 Пятен не выявлено Пятен не выявлено

Высокопатогенные

85-254/15 82,0+4,5 63,0±1,6 40,2+2,1 10,0+0,06

85-254/23 63,0+3,7 30,0+4,2 19,5+0,3 1,2+0,04

85-254/27 78,6+4,5 61,0+3,4 28,0+3,0 15,4+0,90

штаммов были подавлены, особенно у штамма 390 Е. С повышением температуры данные процессы активировались и достигали максимума при 20-30°С. У мутантов даже при низкой температуре прорастание пикноспор достигало 69,792,3 %. С повышением температуры оно возрастало на 7,7-17,6 %. Рост гиф у мутантов был также более интенсивным.

Высокая пластичность мутантов была обнаружена и при изучении зависимости прорастания пикноспор и роста гиф от рН среды (инфекционной капли). Показано, что у мутантов в отличие от природных штаммов прорастание спор идет активно и при низких значениях рН, поэтому подъема при рН выше 6,0 - 6,4 не наблюдалось. Рост гиф у мутантов гриба также был более активным, причем при всех значениях рН. Наиболее четкая картина получена на мутанте штамма 390 Е.

Проращивание спор гриба в растворах сахарозы, взятой в качестве осмо-тика, также показало определенные преимущества мутантов в сравнении с природными штаммами. Так, у мутанта, выделенного при УФ-облучении штамма 390 Е, прорастание спор при всех значениях концентрации сахарозы было выше и изменялось от 68,3 до 82,7 %. У штаммов 83-150 и 154 Г при концентрации сахарозы 0,9 и 1,0 М, что соответствует осмотическому давлению 30,4 и 35,2 атмосфер (Гродзинский, Гродзинский, 1973), прорастание спор уменьшалось в 2 - 3 раза, а у соответствующих мутантов оно оставалось без изменений.

100 80 60 40 20 0

Z loo

= 80 ю

„ 60 i s

ÜÜ 20 я

=- 0

390 E, 24 ч

10 15 20 25 30

83-150, 24 ч

100 80 60 40 20 ^ 0

зГ

<D 100 -1

о 80 ■

о 60 -

Н 40 -

35 20 -

а 0 -

390 E, 48 ч

О 5 10 15 20 25 30

0 5 10 15 20 25 30

83 150 48 ч

10 15 20

—i—

100 80 -60 -40 -20 -0 -

154 Г, 24 ч

0 5 10 15 20 25 30

100 -80 60 40 -20 -0

154 Г, 48 ч

°С

-Г 1 ■ 1-!-Г" !—'■■ j

0 5 10 15 20 25 30

НСРо s Для частных средних - 23,5, Sx - 6,3%

Рис 2 Патогенность природных изолятов S nodorum Berk и их мутантов в зависимости от условий инокуляции растений пшеницы

Условные обозначения —природный изолят, -о—о- мутант, 24 и 48 ч - продолжительность влажной камеры

Рост гиф у мутантов в данных опытах также был выше, чем у природных штаммов. ■ ■ '

Таким образом, проведенные исследования показали, что мутанты, выделенные из рассевов УФ-облученной споровой суспензии гриба S. nodorum Berk., отличаются по ряду показателей от исходных природных штаммов. В частности, пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре б-30°С, они более приспособлены к изменению pH среды, устойчивы к высокому осмотическому давлению. Эти и другие физиологические особенности, по-видимому, способствуют проявлению у мутантов S. nodorum Berk, более высокой патогенности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды.

Глава 5. Пектолнтические и целлюлолнтические ферменты гриба

Septoria nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы

По имеющимся данным, внедрение проростковых трубочек S. tritici Rob. et Desm. в ткани растений в большинстве случаев идет через устьичную щель, реже - через клетки эпидермиса (Пересыпкин, Коваленко, 1981), a S. nodorum Berk. — непосредственно через периклинальные клеточные стенки эпидермиса (Karjalainen, Lounatmaa, 1986). В работе Zinkernagel a. Riess, (1987), выполненной также с применением электронного сканирующего микроскопа, признаков прямого проникновения S. nodorum Berk в эпидермальные клетки обнаружить не удалось. Авторы, однако, не отрицают такую возможность, отводя определенную роль на этом этапе ферментам.

Действительно, трудно себе представить, что процесс внедрения S. nodorum Berk происходит без участия гидролаз. В связи с этим для нас представляло особый интерес исследовать роль пекто- и целлюлолитических ферментов как возможных факторов патогенности данного гриба.

5.1. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в процессе роста гриба S. nodorum Berk. в чистой культуре. Показано, что динамика активности пекто- и целлюлолитических ферментов тесно связана с процессами роста и развития S. nodorum Berk, на КДА (Ахметов, Кобыльский, 1989). Установлено, что максимум активности изученных гидролаз приходится, в основном, на 5-7-е сутки, т.е. на экспоненциальную фазу, характеризующуюся наиболее высокой удельной скоростью роста и переходом гриба к продуцированию спор. Прекращение роста и достижение максимума споруляции (10-е сутки) сопровождалось снижением активности ферментов.

Анализ активности ферментов показал, что S nodorum Berk, в процессе роста не только синтезирует (судя по изменению активности), но и усиленно секретирует пектолитические, целлюлолитические ферменты и ксиланазу в окружающую инкубационную среду

5.2. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов и патогенность гриба S. nodorum Berk. Установлено, что высокая патогенность природных изотятов и мутантов (рис 3) S nodorum Berk, как правило, сопровождается и более высокой активностью ферментов Корреляционный анализ, проведенный на основе полученных данных, подтвердил существование между патогенностью 5 nodorum Berk и активностью пектолитических и цепюлоли-тических ферментов прямой зависимости Особенно тесная связь обнаружена между патогенностью и активностью полигалактуроназы (г = 0,67), ß-глюкозидазы (г - 0,70) и Ci-цепюлазы (г ~ 0,66) В значительно меньшей степени патогенность

5,0 -|

Сч-цет Ci-цел ß-mo Ксит

Рис 3

зависела от С„-цепюлазы (г ~ 0,34) и капан азы (г 0,47)

Механизм проникновения патогена в ткани растений начинается, как известно, с процесса прорастания спор Поэтому нас, естественно, интересовало различаются та по ак-

Удельная активность пектолитических. целлюлолитических ферментов и ксиланазы у слабо - тивности ферментов (85-254/8) и высокопатогенного (85-254/15) мутантов покоящиеся споры, гриба S nodorum Berk, культивируемых на жидкой выделенные из куть-среде Чапека (5 - суточная культура) ТУРЫ природных изо-

тятов и мутантов S

nodorum Berk, и как изменяется активность пекто- и целлюлолитических ферментов на ранних этапах их прорастания

В результате проведенных экспериментов установлено, что высокопатогенный природный изолят 176 Е значительно превосходит с табоггатогенный изолят 25 ДЖ по активности С,-целтюлазы и ксиланазы в покоящихся спорах, а также - полигалактуроназы, Ci—целлюлазы и ксиланазы у прорастающих спор Прорастание пикноспор сопровождалось усиленной секрецией белка и фермен-

тов в среду инкубации. Однако и в этом случае при практически равной активности внеклеточных Ci - целлюлазы и ß - глюкозидазы более патогенный изо-лят 176 Е превосходил изолят 25 ДЖ по активности полигалактуроназы и кси-ланазы.

Близкие результаты при изучении динамики активности пекто- и целлю-лолитических ферментов в процессе прорастания спор были получены и у контрастных по патогенности мутантов (рис. 4). Показано, что у высокопатогенных мутантов активность полигалактуроназы, ß - глюкозидазы и С, - целлюлазы также, как правило, выше активности данных ферментов, выделенных из спор или культуральной среды слабопатогенных мутантов. Подтверждение участия пекто- и целлюлолитических ферментов в самых ранних этапах инфекционного процесса и их связи с патогенностью возбудителей болезни можно найти и в работах с другими патогенами (Sudo et al., 1973; Davet, 1976; Verhoeff, 1978; Koller et al., 1982; Wattad et al., 1997; Dumas et al., 1998).

5.3. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в системе "растение-хозяин-патоген". Проведенные нами исследования показали (рис. 5), что высокопатогенный мутант в отличие от слабопатогенного на ранних этапах патогенеза (3-е суток) вызывает подавление в листьях восприимчивого сорта пшеницы Саратовская 29 активности пектолитических и целлюлолитических ферментов, за исключением Сг целлюлазы. И только на 7-е сутки оба мутанта вызывали усиление активности полигалактуроназы, Сх- целлюлазы и ß-глюкозидазы , а на 10-е сутки - и Сг целлюлазы

На относительно устойчивом к септориозу сорте пшеницы Castan различия между высоко- и слабопатогенным мутантами были выражены менее чётко. Мутант 85-254/15 на ранних этапах патогенеза снижал, а мутант 85-254/8 не влиял на активность Ci-целлюлазы в листьях при практическом равенстве изменений в активности Сх-целлюлазы, ß-глюкозидазы и ксиланазы. Активность полигалактуроназы при этом снижалась в листьях в 2,5 и 4,5 раза. На поздних этапах патогенеза при равенстве активности Сх- и Ci-целлюлазы, активность полигалактуроназы, ß-глюкозидазы и ксиланазы в листьях, инфицированных высокопатогенным мутантом, была соответственно в 3,0; 1,4 и 1,6 раза выше, чем в варианте со слабопатогенным мутантом.

Одним из критериев участия ферментов, продуцируемых патогенами, в механизме инфицирования растений является способность их при экзогенном применении вызывать у растений повреждения, характерные для самого возбудителя болезни. Так, обработка стеблей и листьев растений томатов частично очищенными пектинлиазой и полигалактуроназой V. albo-atrum приводит к проявлению симптомов заболевания, включая образование гелей в сосудах

20 18 16 14 12 10 8 6 4

□ 85-254/2 Ш 85-254/27

III

I и II — соответственно покоящиеся и прорастающие в течение 20 ч споры III - среда прорастания

Пг С«-цел Ci-цет 10 ß-глю Ксиланаза

Рис 4 Удельная активность пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в спорах слабо- (85-254/2) и высокопатогенного (85254/27) мутантов гриба S nodorum Berk и в среде их прорастания

0,7-1

Полигалактуроназа

Р - глюкозидаза

С, - целлюлаза

ю о н и

Ксиланаза

1.4 1,21,00,8 -0,6 -0,4 -ОД -0,0

Время после инокуляции, сут

Рис. 5. Изменение активности пектолитических, целлюлолитических ферментов и ксиланазы в листьях восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29, инфицированных слабо-(85-254/8) и высокопатогенным (85-254/15) мутантами гриба 5. пос1огит Вегк

I—I - контроль га- 85-254/8 Ш- 85-254/15

(Cooper, Wood, 1980) По нашим данным, ферментные препараты, вылеченные из мицелия S nodorum Berk, при нанесении их на листовую поверхность вызывали повреждения, характерные для септориоза Обработка растений раствором СаСЬ, способного ингибировать активность эндо- и экзополигалактуроназы грибов V albo-atrum и F oxysporum f sp fycopersici (Cooper, Rankin, 1978, Buescher, Hobson, 1982), не только подавляла действие ферментных препаратов, но и в значитетьной мере снижала степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S nodorum Berk

Все jto позволяет высказать предположение о преимущественно энзима-гическом пути проникновения гриба S nodorum Berk в ткани растения-чозяина и о большой роли пекто- и целтюлолитических ферментов в процессе патоге неза в цепом

Глава 6. Изоферменты некоторых гидролаз и оксидоредуктаз гриба Septoria nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы

В микологии и фитопатологии изоферменты широко испотьзуются в качестве высокочувствительных биохимических маркеров при исследовании расового состава, структуры популяций и изменчивости различных фитопатоген-ных грибов (Николаева и др , 1972, Супрун и др , 1986, Можина и др , 1986 Терехова, 1988, Терехова, Рочев, 1989, Терехова и др , 1991, Дьяков, 1998)

В задачи наших исследований входило изучить полиморфизм бет ков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов слабо- и высокопатогенных мутантов гриба S nodorum Berk, а также в системе ' растение-чозяин-патоген"

6.1. Полиморфизм белков и изозимный спектр некоторых гидролаз и оксидоредуктаз у природных изолятов и мутантов гриба S. nodorum Berk. Исследования показали, что количество белковых зон в электрофоретическом спектре гриба варьирует от 22 до 47 в зависимости от изолята Полосы имели Rf в пределах от 0,01 до 0,97 Коэффициент сходства между изолятами колебался в пределах 34,0-78,6%

Белковый препарат, выделенный из природных изолятов S nodorum Berk, содержал от 11 до 21 изоферментов эстеразы, от 2 до 5 - пероксидазы и от 3 до 8 изоферментов ß-глюкозидазы Изоляты гриба в значительной мере различались между собой по спектрам изоферментов

Сравнительное изучение изоферментного состава у некоторых природных изолятов S nodorum Berk и полученных на их основе мутантов показало, что электрофоретический спектр эстеразы наиболее значительным числом зон

представлен у изолята 154 Г (22 зоны) и его мутанта (23 зоны). И у изолята, и у мутанта были обнаружены свои специфические зоны ферментативной активности: пять зон у изолята 154 Г и пять - у мутанта (Rf 0,25-0,26; 0,37-0,38; 0,740,75; 0,86 и 0,95). В спектрах кислой фосфатазы были обнаружены 2 специфические зоны у изолята 83-150 и 4 - у мутанта (с Rf 0,05-0,06; 0,22 и Rf 0,09; 0,39-0,41; 0,52-0,54; 0,84 соответственно), а также 1 - у изолята 85-262 и 3 зоны у его мутанта.

Учитывая более высокую патогенность мутантов можно предположить, что по крайней мере некоторые из обнаруженных у них изоферментов могут выполнять функции маркеров патогенности.

6.2. Активность некоторых гидролаз и оксидоредуктаз, изоферменты и патогенность гриба S. nodorum Berk. В ходе исследований у мутантов, выделенных из изолята 85-254 S. nodorum Berk, было выявлено от 9 до 18 изоферментов эстеразы, от 5 до 12 изоферментов ß-глюкозидазы, 2-3 - кислой фосфатазы и от 1 до 4 изоферментов пероксидазы. Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), ß-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) было обнаружено у высокопатогенных мутантов. Возможно это связано с тем, что в целом все высокопатогенные мутанты, помимо пекто- и целлюлолитических ферментов, характеризуются повышенной активностью пероксидазы. Существование связи между патогенностью и полиморфизмом белков и ферментов подтверждают и данные, полученные при исследовании рас 1 и 2 F. oxisporum f. sp. spinaciae, различающихся по патогенности (Madhos-ingh, 1980). Подобные данные были получены и нами при исследовании мутантов F. graminearum и F. sporotrichiella (Кобыльский и др., 1991). Наибольшее число изоферментов эстеразы (17) в спектре также было отмечено у высокопатогенного мутанта 760/6 F. sporotrichiella.

Споры S. nodorum Berk, как выяснилось в дальнейших исследованиях, помимо пекто- и целлюлолитических ферментов, обладают достаточно высокой активностью ряда других гидролаз. Так, удельная активность эстеразы у покоящихся спор природных изолятов S. nodorum Berk, колебалась от 0,7 до 3,87 мкМ/мг белка, кислой фосфатазы - от 0,19 до 0,85, ß-глюкозидазы — от 0,08 до 1,35 мкМ/мг белка, РНК-азы - от 2,30 до 4,56 усл. ед./мг белка. Показано, что пикноспоры слабопатогенного изолята 25 Д обладают минимальной активностью практически всех изученных ферментов Для изолята 147 Е, напротив, была характерна высокая активность изученных гидролаз, особенно кислой фосфатазы, ß-глюкозидазы и РНК-азы. При прорастании спор изолята 25 Д активность РНК-азы возрастала в 1,2 раза. Активность кислой фосфатазы у слабопатогенного мутанта при этом усиливалась в 2,0 раза, а у высокопатогенных мутантов - в 2,5 - 13,5 раз.

Процесс прорастания спор дейтеромицетов, кроме того, сопровождается изменениями и в составе изоферментов Так, в изоферментном спектре РНК-аз Aspergillus clavatus найден стадиоспецифичный фермент, который присутствовал в покоящихся конидиях и исчезал при прорастании (Иванова, Полякова, 1982) Прорастание спор S nodorum Berk, по нашим данным, также было тесно связано с изменениями в изоферментных спектрах В частности, в эстеразном спектре спорового материала мутантов (рис 6) обнаружено 12-15 (покоящиеся споры) и 10-16 зон активности (прорастающие споры) Следует отметить, что наименьшее число изоферментов в спектре (12 - у покоящихся спор, 10-у прорастающих) было обнаружено у слабопатогенного мутанта, тогда как у высокопатогенных мутантов число изоферментов эстеразы колебалось от 14 до 15 у покоящихся и от 13 до 14 - у проростаюших спор Обращает на себя внимание то, что у высокопатогенных мутантов индивидуальных чиний в спектре и покоящихся, и прорастающих спор было больше

I II I II I II I II I II

Рис 6 Изоферментные спектры эстеразы у покоящихся (I) и прорастающих (II) спор природного изолята 85-254 гриба S nodorum Berk и его мутантов

Изозимный спектр пероксидазы у мутантов был значительно беднее эсте-разного и содержал от 2 до 4 изоферментов Причем максимальное чисто изоферментов у покоящихся (3) и прорастающих (4) спор было обнаружено также у высокопатогенных мутантов

Изменения в составе изоферментов в процессе прорастания спор S nodorum Berk, по-видимому, свидетельствуют не только об усилении или ос-

лаблении активности соответствующих ферментов, но и о избирательной секреции некоторых изоферментов из прорастающих спор в инкубационную среДУ

6.3. Изменение активности н изоферментного спектра кислой фосфа-тазы, ß-глюкозидазы и пероксидазы в системе "рлстение-хозянн-патоген".

Инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшеницы Саратовская 29 сопровождалось снижением на 47,7-55,3% активности ß-глкжозидазы на ранних этапах и усилением ее активности в 2,7-3,2 раза на более поздних этапах патогенеза Активность пероксидазы при этом значительно возрастала на всем протяжении опыта, особенно при инфицировании спорами высокопатогенного мутанта S nodorum Berk Отмечены различия в действии слабо- и высокопатогенного мутантов гриба и на активность кислой фосфата-

1ы

На относительно устойчивом к септориозу сорте пшеницы Castan высокопатогенный мутант 85-254/15 в отличие от слабопатогенного 85-254/8 не влиял на активность ß-глюкозидазы и оказывал более значительное стимулирующее воздействие на активность пероксидазы По характеру действия на кис-iyjo фосфатачV слабо- и высокопатогенные мутанты S nodorum Berk были близки друг к другу

Инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 S nodorum Berk, приводило к изменениям и в изоферментных спектрах как гидролаз, так и окси-доредуктаз Однако и в данном случае влияние высокопатогенного м\танта было бо lee шачительным особенно в отношении ß-глюкозидазы (чпию изоферментов уже через 7 суток вместо 2 достигало 4) и эстеразы На сорте Castan существенных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов на изоферментный спектр ß-глюкозидазы, кислой фосфатазы и эстеразы не было выявлено В то же время высокопатогенный мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12-0,15 Кроме того, под влиянием мутанта повышалась активность некоторых из изоферментов

Г л а в а 7. Фитотоксины гриба Septana nodorum Berk, и их роль в патогенезе септориоза пшеницы

У некоторых фитопатогенных грибов между патогенностью и способностью их к синтезу токсинов обнаружена корреляция и, кроме того, показана высокая специфичность токсинов к растению-хозяину (Иодер, 1984, Пегг, 1984, Дейли 1985) В связи с этим представляет интерес изучение токсинообразова-ния и у возбудителей септориоза пшеницы, которые, как следует из ряда работ

французских исследователей (Bousquet, Skajennikoff, 1974; Devys et al., 1980; Bousquet et al., 1980; Devys et al., 1980), также способны синтезировать фито-токсичные метаболиты. Им удалось обнаружить и выделить такие вещества, как охрацин, септорин, некоторые производные дигидроизокумарина и др. Однако до сих пор многие вопросы, связанные с продуцированием токсинов и их ролью у S. nodorum Berk., остаются еще не выясненными.

7.1. Выделение, очистка и идентификация фитотоксинов гриба S. nodo-rum Berk. В результате проведенных нами экспериментов установлено, что S. nodorum Berk в процессе роста на жидкой питательной среде Фриза синтезирует вещества, способные оказывать ингибирующее действие на рост корней и колеоптилей пшеницы. Выделенные из мицелиальной массы и среды культивирования различных изолятов S. nodorum Berk фитотоксины (ФТ) в значительной степени различались между собой по окраске в видимом и флуоресценции в УФ-свете, величине Rf для трёх систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограмм проявляющими реагентами и УФ-спектрам поглощения.

Анализ полученных характеристик позволил отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину - веществу изокумариновой природы, дающему вишнёвую окраску с FeCb (Devys et al., 1974), a ФТ-3 — к одному из его производных. Среди выделенных веществ два (ФТ-1 и ФТ-2) имели лимонно-жёлтую окраску в видимом свете и абсорбировали в УФ-свете, а также проявлялись под действием хлорного железа, то есть вели себя подобно септорину, второму из фитотоксинов возбудителя септориоза (Bousquet et al., 1980).

С помощью жидкостной хроматографии высокого давления достигнуто чёткое разделение всех фитотоксинов. Одновременно оказалось возможным определить вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34) и микофеноловую кислоту, которая ранее была обнаружена в культуральной среде S. nodorum Berk (Devys et al., 1980).

Для выделения и наработки фитотоксинов на основе полученных данных была составлена схема, позволяющая препаративно получать все 5 фитотоксинов из культуры гриба S. nodorum Berk (рис. 7). Кроме того, разработаны "Методика определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk с помощью тонкослойной хроматографии" (Кобыльский, Бочарова, 1999) и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба S. nodorum Berk с помощью жидкостной хроматографии высокого давления" (Кобыльский и др., 1999).

7.2. Зависимость токсинообразования от условий культивирования гриба S. nodorum Berk. Установлено, что гриб S. nodorum Berk в течение 14 суток способен продуцировать весь комплекс фитотоксинов. Однако их количество в значительной мере зависит от условий выращивания. Так, в культу-

Довести 20% ЧаОН до рН Ь,0, трижды проэкстра-

_ гировать равным объемом этилацетата

Этилацетатный экстракт I

| Выпарить под вакуумом при температуре +46 °С _4__

Маслянистый осадок

Растворить в минимальном объеме этилацетата, очистить на колонке с сухим силикагелем, элюент-этил-_ацетат_

Этилацетатный экстракт

Выпарить под вакуумом, перерастворить в минимальном количестве этилацетата Препаративная ТСХ (хлороформ-этилацетат, 5 1, обнаружение в УФ-свете)

Рис 7 Схема препаративного выделения фитотоксинов гриба S nodorum Berk

ральной среде все 5 фитотоксинов были обнаружены только при культивировании гриба на жидкой среде Фриза в камере искусственного климата. В мицелии весь комплекс фитотоксинов зафиксирован при выращивании гриба в термостате как на жидкой, так и на агаризованной среде Фриза, а также — в условиях освещённости на КДА.

7.3. Фитотоксины и патогенность гриба S. nodorum Berk. Показано, что высокопатогенные природные изоляты 101 Д, 176 Е и 538 Б гриба S. nodorum Berk отличаются повышенной способностью к продуцированию (рис. 7.4) и секреции (рис. 7.5) фитотоксинов. Изоляты 25 ДЖ и 143 Г, обладающие слабой патогенностью, уступали им и по способности к синтезу фитотоксинов.

Высокопатогенные мутанты по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксинов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитотоксинов (ФТ-2, ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) также превалировали (за некоторыми исключениями) над слабопатогенными мутантами. По литературным данным, наличие чёткой корреляции между образованием токсина и патогенностью обнаружено при изучении изолятов Ceratocystis ulmi — телеоморфы гриба Graphium ulmi Schwarz (Takai et al., 1983). Предполагается, что патогенность Cochliobolus victoriae — телеоморфы гриба Helminthosporium victoriae также обусловлена токсином, а именно викторином (Wolpert et al., 1995).

Установлено, что споры гриба S. nodorum Berk, даже находящиеся в состоянии относительного покоя, обладают вполне определённым запасом фитотоксинов. С началом прорастания спор синтез (или предположительно высвобождение из связанного состояния) фитотоксинов и секреция их в инкубационную среду резко активизировались. Более патогенный изолят 176 Е в отличие от слабопатогенного 25 Д характеризовался полным набором фитотоксинов в покоящихся спорах, более активным синтезом и высоким содержанием ФТ-5 в прорастающих спорах, а также более активной секрецией и накоплением ФТ-5 и сер. 0,34 в среде. Суммарное содержание (прорастающие споры + среда) фитотоксинов ФТ-5 и сер. 0,34 у изолята 176 Е было в 2,0 и 1,6 раза соответственно выше, чем у изолята 25 Д. Преимущество высокопатогенных штаммов гриба £ nodorum Berk в синтезе и секреции фитотоксинов на ранних этапах прорастания спор было подтверждено и в экспериментах с мутантами, различающимися по патогенности.

7.4. Фитотоксины гриба S. nodorum Berk, и их роль в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина. Из всех испытанных фитотоксинов наиболее сильное ингибирующее действие на рост корней и колеоптилей пшеницы Саратовская 29 оказывали ФТ-4 и ФТ-5. Подавление роста корней наблюдалось уже при концентрации 50 мг/л и резко усиливалось с увеличением

0,9 1

08 ■

07 -

О 0,6 -

05 -

2 04 -

и* 03 ■

3 02 -

SÜ

Z 0 1 -

5 0 -

О 40 -

Z1 * 6 -

-е-

- 28 -

«3

2 4 -

С. 1

20 J

1 6 -

1,2 -

0,8 -

04 ■

оо--

ФТ-!

ФТ-2

ФГ-3

ФТ-4

00 4

ФГ-5

сер 0,34

Микофеноловая кистота

Рис 8 Содержание фитотоксинов (ФТ) в мицелии слабо-(143 Г, 25 Д) и высокопатогенных (176 Е, 101 Д, 538 Б) природных изолятов гриба 5 nodorum Berk

9 8 7 6 -5 -4 -3 -2 -1 О

'□143 Г ,025 Д |0 176 Е '0101 Д IШ 538 Б

ФТ-1

ФТ-2

ФТ-3

ФТ-4

7 -| б ■ 5 -4 3 2

1 н о

ФТ-5

I 1 Ьяя

сер.0,34

jfL

Микофеноловая кислота

Рис. 9. Содержание фитотоксинов (ФТ) в среде культивирования сла-бо-(143 Г, 25 Д) и высокопатогенных (176 Е, 101 Д, 538 Б) природных изоля-тов гриба S. nodorum Berk.

концентрации Подобное действие фитотоксин ФТ-5 оказывал и на рост коле-оптилей

Все фитотоксины, за исключением ФТ-1, проявляли ингибирующий эффект как на восприимчивых, так и на относительно устойчивых к септориозу сортах пшеницы, а также на ячмене и рисе Кроме того было показано, что фитотоксины при нанесении их на изолированные листья или интактные растения пшеницы не способны вызывать внешние видимые симптомы поражения, ха-рактериные для септориоза Все это говорит о том, что фитотоксины S nodorum Berk, не обладают специфичностью действия в отношении растения-хозяина

Вместе с тем было установлено (рис 10), что фитотоксины, особенно ФГ-1, ФТ-2 и ФТ-5, при добавлении их в споровую суспензию повышают степень поражения первого листа инокулированных растений пшеницы на 34,9, 42,3 и 31,2% соответственно (степень поражения в контроле - 46,4%), а при поступлении через проводящие сосуды - влияют на транспирацию и водный обмен В связи с чем можно предположить, что фитотоксины гриба S nodorum Berk действуют непосредственно на мембраны клеток и тем самым способствуют развитию септориоза на листьях пшеницы О том, что такое предположение оправдано, говорят данные, полученные в нашей лаборатории аспират ом

Рис 10 Влияние фитотоксинов при совместном их применении с инокулюмом гриба S nodorum Berk на степень поражения растений пшеницы Саратовская 29 септориозом

CZ3 - Иноку люм Ol - Инокулюм+ФТ-1 Е23 - Иноку люм+ФТ-2 ^ - Инокулюм-ФТ-3 ЕШ - Инокулюм-ФТ-4 KS1 - Инокулюм-ФТ-5

E.B. Бочаровой (1992). В опытах с дисками из тканей свежей свёклы Beta vulgaris было показано, что наиболее значительное влияние на проницаемость клеточных мембран оказывают фитотоксины ФТ-1 и ФТ-2, под действием которых выход антоцианов в раствор усиливался в 4,7-3,7 раза по сравнению с контролем.

Глава 8. Фитогормоны как возможные факторы патогенности гриба Septoria nodorum Berk.

К началу нашей работы над данным вопросом сведения о роли фитогор-монов в процессах патогенеза различных болезней растений были весьма ограничены (Tapp, 1975; Пегг, 1984; Косуге, Комаи, 1985), а по септориозу вообще отсутствовали. Поэтому, в первую очередь необходимо было, хотя бы на уровне биотеста, установить, могут ли возбудители септориоза и, в частности, S. nodorum Berk, продуцировать фитогормоны. И только на основе полученных данных решать задачи, относящиеся к анализу взаимосвязи между патогенно-стью S. nodorum Berk и способностью гриба к синтезу ИУК.

8.1. Синтез фитогормонов в процессе роста гриба S. nodorum Berk, в чистой культуре. Проведенные с применением биотеста исследования показали, что гриб при культивировании его на КДА способен продуцировать не только фитотоксины, но и фитогормоны, в частности, ИУК. Полученные данные были подтверждены с помощью современного инструментального метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что при культивировании природного изолята S. nodorum Berk в чистой культуре уже через 3 суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК в культуре возрастало в 2,2 раза, а на 10-е, т.е. к моменту максимума спорогенеза, - в 4,5 раза и достигало величины 6,7 нг/г.

Одновременно с синтезом ИУК, наблюдалась активная секреция гормона в окружающую среду. Установлено, что в среде 3-суточной культуры природного изолята S. nodorum Berk, содержится 14,5 нг ИУК, что в 10 раз превышает уровень ее в мицелии. На 7-е сутки количество секретируемой ИУК увеличивалось в 1,4, а на 10-е - в 1,7 раза. По литературным данным (Vasjuk, Andrianova, 1994), максимальное содержание ИУК в культуре грибов р. Septoria составляет 933 нг/г сырой массы. Оно определяется видом гриба, природой изолята и, естественно, условиями культивирования патогена (Васюк и др., 1996).

8.2. Синтез ИУК и патогенность гриба S. nodorum Berk. На контрастных по патогенности мутантах экспериментально доказано, что между патоген-ностью гриба S. nodorum Berk и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость (рис. 11,

12) Подобные данные были получены в работе с изолятами гриба р Fusarium вылеченными из семян кукурузы (Manka, 1980) Наиболее интересные данные, подтверждающие существование определенной связи между ИУК и вирулентностью, были зафиксированы на бактериях (Liu et ¿1, 1982, Kosuge et al, 1985, Косуге Комаи, 1985)

Возраст культуры, cvr

Рис 11 Динамика содержания ИУК в мицелии слабо (85-2М 2, 85254/8,85-254/13) и высокопатогенных (85-254/15,85-254/23,85-254/27) мутантов гриба S nodorum Berk при выращивании их на жидкой среде Чапека

Установлено, что свежевыде ленные из пикнид S nodorum Berk споры природного изолята содержат 16 6 нг ИУК на г сырой массы Среди слабопатогенных, и среди высокопатогенных мутантов встречались формы как с повышенным, так и с пониженным содержанием ИУК В среднем особых различий в количестве ИУК в ' покоящихся" спорах мутантов, различающихся по патоген-ности, не обнаружено

Через 20 часов прорастания спор ИУК присутствовала уже не только в самих прорастающих спорах, но и в инкубационной среде, в которой они находились это время По суммарной ИУК (споры+среда) слабо- и высокопатогенные мутанты практически не отличались между собой Однако в эти первые часы инкубации споры высокопатогенных мутантов (за исключением 85254/27) превосходили по содержанию ИУК споры слабопатогенных мутантов, значительно уступая им по секреции ИУК во внешнюю среду Это говорит о том, что обратная корреляционная зависимость между патогенностью гриба S nodorum Berk и способностью его как к синтезу, так и секреции ИУК, обнару-

женная у 3-, 7- и 10-суточной культуры патогена, у прорастающих спор действительна только лишь в отношении секреции ИУК из спор в кулыуральную среду.

120

и 100 -

X 80 -

£ 3

s Обо -

s г

03 « 40 -

в- ч 20 -

и 0 -

□ 85-254/2 Ш 85-254/27

□ 85-254/8 Ш 85-254/15

Ш 85-254/13 Ш 85-254/23

10 3 7 10

Возраст культуры, сут

Рис. 12. Динамика содержания ИУК в среде культивирования слабо -(85-254/2, 85-254/8, 85-254/13) и высокопатогенных (85-254/15, 85-254/23, 85254/27) мутантов гриба S. nodorum Berk

Интересно, что присутствие ИУК в спорах характерно и для биотрофных грибов. Так, значительные количества ИУК были обнаружены в уредоспорах стеблевой ржавчины (Умнов и др., 1978), при прорастании которых запасенный в них ауксин выделялся в культуральную среду (Умнов и др., 1984). Количество ИУК в уредоспорах, проросших спорах и среде, на которой прорастали споры, колебалось от 40 до 100 нг/г сырого веса (Wiese, Grambov, 1986).

8.3. Динамика содержания ИУК в системе "растение-хозяин-патоген", Изучение динамики содержания ИУК в листьях растений восприимчивого (Саратовская 29) и относительно устойчивого к септориозу (Castan) сортов пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk., дало возможность установить некоторые различия как между сортами пшеницы, так и между мутантами гриба S. nodorum Berk., используемыми в опытах. Показано, что инфицирование растений пшеницы Саратовская 29 уже на третьи сутки приводит к повышению содержания ИУК в листьях на 13,6 (высокопатогенный) - 81,8% (слабопатогенный мутант). На 7-е и 10-е сутки после инокуляции количество ИУК в листьях возрастало в 1,5-2,5 и 1,6-3,2 раза соответственно (рис. 8.6). Причем наиболее сильные изменения в содержании ИУК наблюдались при инфицировании растений слабопатогенным мутантом.

Саратовская 29

Castan

□ контроль И 85-254/8 ЕЭ 85-254/15

7 10 3 7

Время после инокуляции, сут

г!

Рис 13 Динамика содержания ИУК в листьях восприимчивого ( Саратовская 29 ) и относите 1ЬНО устойчивого ( Castan ) к септориозу сортов пшеницы, инфицированных слабо-( 85-254/8 ) и высокопатогенным ( 85-254/15 ) мутантами гриба S nodorum Berk

На сорте СаЫап были получены менее четкие данные На первом этапе под влиянием инфекции наблюдалась тенденция к снижению количества ИУК в листьях по отношению к контролю, на 7-е сутки был отмечен небольшой подъем, а к концу опыта содержание ИУК увеличивалось на 20,0-33,3% (рис 13) Достоверных различий в действии слабо- и высокопатогенного мутантов 5 nodorum Berk на синтез ИУК не было обнаружено Полученные нами результаты согласуются с литературными данными (Чкаников и др , 1990, Хайрулин и др, 1993)

8.4. Влияние экзогенных фитогормонов на прорастание спор, рост гиф и развитие септориоза у растений пшеницы, инфицированных S. nodorum Berk. Известно, что ИУК, НУК, индол-3-масляная кислота, 2,4 Д и ки-нетин угнетают или замедляют прорастание спор Р oryzae и формирование ап-прессориев при прямом контакте гриба с веществом (Kleiner, 1983) Высокие концентрации ИУК подавляли развитие Р gramims f sp tritici (Grambov,

Tücks, 1979), а пассирование F. culmorum на средах, содержащих этиленпроду-цент этрел, приводило к ингибированию мицелиального роста, споруляции и прорастания спор (Michníewicz, Rozej, 1991; Michniewicz, 1992).

Наши исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk, показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор, ингибирует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК и кинетин в концентрации 10-25 мкг/мл также подавляли рост гиф на 22,9-44,7 и 16,8-33,1% соответственно. Дальнейшее увеличение концентрации этих гормонов, как и в варианте с ГК, не приводило к усилению эффекта. В случае с АБК слабый ингибирующий эффект проявлялся только при концентрации 50 мкг/мл. С увеличением концентрации АБК до 75 и 100 мкг/мл наблюдалось значительное подавление роста гиф S. nodorum Berk.

Экзогенные фитогормоны могут оказывать значительное воздействие на поражаемость растений различными болезнями (Митрофанов, Чекуров, 1983; Левин, 1984). Причем данный эффект не обязательно связан с непосредственным влиянием фитогормонов на патоген. В результате проведенных нами исследований установлено, что предобработка растений пшеницы сортов Крестьянка, Кутулукская (восприимчивые) и Castan (относительно устойчивый к сеп-ториозу) фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk. снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона его концентрации и сорта пшеницы на 12,2-65,1%. Наибольший эффект наблюдался при обработке растений кинетином, за ним следовали ИУК, ГК и, наконец, АБК. Показано, что фитогормоны изменяют тип реакции сортов на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов на примере фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk изучены некоторые биологические и биохимические особенности дейтеромицетов, которые могут непосредственно или опосредованно влиять на проявление ими патогенных свойств.

Установлено, что S. nodorum Berk, прекрасно растет как на природных, так и на синтетических питательных средах, не испытывает потребности в каких-либо специфических факторах роста, обладает слабо выраженной (широкой) физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью. Все это способствует лучшей адаптации гриба к условиям внешней среды и проявлению им высокой патогенности.

Показано, что наиболее патогенные природные изоляты и мутанты 5 nodorum Berk обладают и более высокой активностью пектолитических и цел-люлолитических ферментов, особенно полигапактуроназы и В-глюкозидазы Они превалируют над слабопатогенными штаммами по количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов, а также по количеству декретируемых в инкубационную среду фитотоксинов Между патогенностью гриба S nodorum Berk и способностью его к синтезу и секреции ПУК во внешнюю среду обнаружена обратная корреляционная зависимость

Экспериментально даказано, что ферменты (прежде всего пекто- и цел-люлолитические), фитотоксины и ИУК, продуцируемые S nodorum Berk, принимают непосредственное участие не только на начальных этапах инфицирования растений пшеницы, но и на протяжении всего процесса патогенеза септо-риоза вплогь до начала споруляции гриба и проявления на листьях видимых симптомов поражения Все это дает основание к заключению, что исследованные нами ферменты, фитотоксины и фитогормоны действительно являются факторами патогснности гриба S nodorum Berk, хотя и выполняющими по всей видимости, различные функции

Можно предположить, что ферменты, естественно, выполняют, прежде всего, инвазивные функции, а ИУК и фитотоксины - регуляторные Действительно, ферменты, как известно, непосредственно участвуют в разрушении к\-гикулы (кутиназа, нсспецифические эстеразы), а также в деполимеризации, гидролизе полисахаридов клеточных стенок (полигалактуроназа. /3-глюкозидаза, С|- и С„-целтюлазы, ксиланаза) ИУК является основным элементом в системе гормональной регуляции у растении (Полевой, i486), а фитотоксины, го штературным данным, участвуют в системе мембранной регуляции Они оказывают значительное влияние на проницаемость мембран (Лялин и др , 1980), окислительное фосфорилирование (Bousquet et al, 1980) и работу устьиц (Bousquet et al, 1976)

Обобщая собственные экспериментальные и литературные данные, можно предложить следующую гипотетическую схему взаимодействия гриба S nodorum Berk и растения-хозяина (рис 14) Споры гриба S nodorum Berk оседают на поверхность листьев растений, закрепляются с помощью комплекса веществ, в том числе гликопротеинов, входящих в состав слизи, и при соответствующих условиях влажности и температуры начинают прорастать

Прорастание спор сопровождается активным синтезом и секрецией из спор в инфекционную каплю гидролитических ферментов, фитотоксинов и фи-тогормонов, в частности, ИУК Находящиеся в составе ферментов кутиназа и неспецефические эстеразы разрушают кутикулу Затем ИУК локально проникает через эпидермис растения-хозяина и включает мембранный механизм дейст-

Рис 14. Схема взаимодействия S. nodorum Berk, с растениями пшеницы на ранних этапах патогенеза

вия ауксина на растительные клетки (Полевой, 1986, Шишова, 1999) В результате работы данного механизма активируется Ca*4" -канал и работа !Г-АТФазы, что в конечном счете приводит к закислению за счет ионов клеточных сте нок, вытеснению из них Ca'1" и активации ферментов Последнее приводит к разрыхлению и размягчению клеточных стенок, что делает их более уязвимыми со стороны пекто и целлюлолитических ферментов гриба Наблюдающееся затем локальное разрушение клеточных стенок обеспечивает проникновение ростковых трубок S nodorum Berk, внутрь клетки Одновременно через образовавшиеся отверствия в клетку попадают и фитотоксины, которые, как известно, самостоятельно не могут проникать в ткани растений

Представленная схема разработана для случая активного проникновения патогена через клеточные стенки обычных эпидермальных клеток в ткани растений с помощью пекто- и целлюлолитических ферментов Особенно она, по-видимому, применима для так называемых пузыревидных клеток (клеток растяжения), которые характерны для эпидермиса злаков и других однодольных (Эсау, 1469) По данной схеме, на наш взгляд, может происходить заражение и перезаражение клеток растения-хозяина патогеном и в случае первичного его проникновения не через клеточные стенки эпидермиса, а через устьица

Из приведенной схемы видно, что основная роль фитотоксинов, ее ш учесть их свойства описанные выше, сводится к подавлению защитных механизмов растения-хозяина, то есть - обеспечению второго этапа патогенеза

В дальнейшем (7-е и 10-е сутки) лидирующие позиции снова занимают фитогормоны и (Ьерменты К этому моменту в листьях растения-хо ¡чипа (восприимчивый сорт) значительно возрастает содержание ИУК и повышается активность пекто- и целлюлолитических ферментов, а возможно, и других гидро-лаз Если учесть, что грибы р Septoria способны к продуцированию и цитоки-нинов (Васюк и др, 1996), то тем самым создаются все необходимые предпосылки к изменению метаболизма растения-хозяина и обеспечению оптимальных для роста и развития патогена условий

Распространение патогена по тканям растения-хозяина обеспечивается, на наш взгляд, тем же ферментативно-гормональным механизмом, который используется при первичном внедрении гриба С той лишь разницей, что при перемещении гиф межклетно (без захода в клетку) вполне достаточно, по-видимому, одного ферментативного аппарата

Представленная схема или модель взаимодействия возбудителя септорио-за — гриба S nodorum Berk и растений пшеницы на уровне пекто- и целлюлолитических ферментов, фитотоксинов и фитогормонов (ИУК), разработанная на основе результатов собственных исследований и данных литературы, может

служить теоретической основой направленного поиска новых средств химической защиты посевов пшеницы от септориоза.

Кроме того, данная модель, особенно с учетом реакции сорта Castan на патоген, может быть использована и для создания устойчивых к септориозу сортов пшеницы. Одним из наиболее вероятных путей решения этой задачи является, на наш взгляд, использование фитотоксинов, продуцируемых S. nodorum Berk., в биотехнологии и клеточной селекции в качестве селектирующего фактора. С целью проверки данного предположения препараты фитотоксинов были переданы нами в Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина. Получены предварительные положительные результаты, позволяющие судить о действии фитотоксинов на клеточные культуры различных сортов пшеницы. Подобные данные были получены и другими авторами (Гирко и др., 1993; Keller et al., 1994).

ВЫВОДЫ

1. Среди дейтеромицетов, паразитирующих на растениях, возбудители септориоза — грибы p. Septoria занимают одно из ведущих мест. На культурных и дикорастущих злаках число видов и форм Septoria достигает 17. Они поражают пшеницу, рожь, ячмень, овес и другие культуры. Из видов Septoria, обнаруженных на пшенице, наиболее часто встречаются S. nodorum Berk и S. tritici Rob. et Desm. Септориоз распространен повсеместно, однако особенно сильное развитие его на озимой и яровой пшенице наблюдается в СевероЗападном, Центральном, Центрально-Черноземном регионах, в Сибири, на Северном Кавказе, в странах Балтии и в Украине. Высокая патогенность грибов р. Septoria в сочетании с высокой вредоносностью и отсутствие устойчивых сортов приводят в благоприятные для развития болезни годы к снижению урожая зерна на 10-20 и даже - 30-50%.

2. Впервые проведены комплексные исследования природы патогенности одного из основных возбудителей септориоза - гриба S. nodorum Berk Изучение динамики роста и споруляции S. nodorum Berk на КДА показало, что в первые 10 суток с момента инокуляции гриб растет с максимальной скоростью. С 10 по 16 сутки удельная скорость роста снижается до нуля, а затем принимает отрицательные значения. Переход гриба к генеративной фазе своего развития и резкое усиление спорулирующей способности патогена происходит на 5-7, а достижение максимума на 10 сутки. Гриб растет, спорулирует и сохраняет патогенность при выращивании его не только на природных, но и на синтетических питательных средах. Потребность в каких-либо дополнительных факторах роста патоген не испытывает.

3 Природные хорошо спору тирующие изоляты S nodorum Berk., как правило, обладают высокой патогенностью, характеризуются слабо выраженной физиологической специализацией и, напротив, ярко выраженной мутационной изменчивостью В процессе исследования спонтанной и индуцированной изменчивости S nodorum Berk, выделено свыше 30 морфологических мутантов Показано, что пикноспоры мутантов обладают повышенной энергией прорастания при температуре 6-30°С, они более приспособлены к изменению pH среды и устойчивы к высокому осмотическому давлению Эти и другие физиологические особенности способствуют проявлению у мутантов S nodorum Berk более высокой патогснности и являются основой для лучшей адаптации патогена к условиям внешней среды

4 Установлено, что культура гриба S nodorum Berk обладает активным комплексом пектолитических и целлюлолитических ферментов Максимум их активности приходится на экспоненциальную фазу (5-7 сутки), характеризующуюся наиболее высокой удетьной скоростью роста патогена и переходом его к продуцированию спор Прекращение роста и достижение максимума спору-тяции сопровождаются снижением активности ферментов При прорастании спор гриба активность ферментов, напротив, резко повышается Одновременно усиливается секреция их в окружающую среду

5 Между патогенностью S nodorum Berk и активностью пектолитиче-ских и целлюлолитических ферментов выявлена определенная корреляция Показано что наиболее патогенные изоляты и мутанты гриба обладают и более высокой активностью ферментов, особенно, полигалактуроназы (г 0 67) и 13-глюкозидазы (г О 70) Экстракты ферментов из мицелия S nodorum Berk при нанесении их на листовую поверхность способны вызывать повреждения, характерные для септориозч Обработка растений раствором СаС1< не только подавляет действие ферментных препаратов, но и в значительной мере снижает степень развития септориоза на изолированных листьях растений пшеницы, инфицированных S nodorum Berk

6 Наибольшее количество изоферментов эстеразы (18), ß-глюкозидазы (12), кислой фосфатазы (3) и пероксидазы (4) обнаружено также у высокопатогенных мутантов S nodorum Berk Показано, что процесс прорастания спор S nodorum Berk сопровождается изменениями как в белковом спектре, так и в составе изоферментов В частности, число изоферментов эстеразы в спорах уменьшается с 14-15 (покоящиеся) до 13-14 (прорастающие), а у пероксидазы, напротив, - увеличивается с 3 до 4

7 Гриб S nodorum Berk способен продуцировать целый ряд фитоток-сичных метаболитов Выделенные из мицелия и среды культивирования фито-токсины (ФТ) в значительной степени различаются между собой по физико-

химическим свойствам. Анализ полученных данных позволяет отнести ФТ-5 с голубой флуоресценцией к меллеину (охрацину), ФТ-3 - к одному из его производных, а ФТ-1 и ФТ-2 - к септорину. Кроме того, в составе физиологически активных метаболитов гриба обнаружены микофеноловая кислота и неиденти-фицированное серое вещество с Rf 0,34 (сер. 0,34).

8. Высокопатогенные мутанты, как и высокопатогенные природные изо-ляты гриба S. nodorum Berk., превалируют по количеству продуцируемых ФТ-2 и ФТ-5, суммарному количеству всех обнаруженных в мицелии фитотоксичных метаболитов и по количеству секретируемых в инкубационную среду фитоток-синов (ФТ-2 и ФТ-5, сер. 0,34 и микофеноловая кислота) над слабопатогенными штаммами. Исследование динамики содержания фитотоксинов в спорах в процессе их прорастания подтвердило выявленную закономерность.

9. Фитотоксины S. nodorum Berk не способны при нанесении на изолированные листья или интактные растения вызывать симптомы поражения, характерные для септориоза. Однако при добавлении их, особенно ФТ-1, ФТ-2 и ФТ-5, в споровую суспензию степень поражения инокулированных растений пшеницы повышается на 31,2-42,3%.

10. При выращивании S. nodorum Berk в чистой культуре уже через 3-е суток в мицелии обнаруживается 1,5 нг ИУК в расчете на грамм сырой массы. На 7-е сутки количество ИУК возрастает в 2,2 раза, а на 10-е, то есть к моменту максимума спорогенеза, - в 4,5 раза и достигает величины 6,7 нг/г сырой массы. Одновременно с синтезом ИУК идет активная секреция гормона в окружающую инкубационную среду. Проведенные на контрастных по патогенности мутантах исследования показали, что между патогенностью гриба S. nodorum Berk, и способностью его к синтезу и секреции ИУК во внешнюю среду существует обратная корреляционная зависимость.

11. Исследования влияния экзогенных фитогормонов на культуру гриба S. nodorum Berk и характер взаимодействия его с растениями пшеницы показали, что гиббереллин (100 мкг/мл) подавляет прорастание пикноспор гриба, ин-гибирует рост гиф в длину (10-100 мкг/мл), влияет на формирование пикнид и их продуктивность. ИУК, кинетин (10-25 мкг/мл) и АБК (50-100 мкг/мл) также подавляют рост гиф. Предобработка растений пшеницы фитогормонами с последующим инфицированием их S. nodorum Berk снижает развитие септориоза в зависимости от типа фитогормона, его концентрации и сорта пшеницы на 12,2-65,1%. Фитогормоны изменяют тип реакции на патоген в сторону уменьшения, влияют на размеры некротических пятен на листьях и вызывают тенденцию к снижению числа пикнид в расчете на единицу площади.

12. Существенные различия между слабо- и высокопатогенными мутантами обнаружены и при исследовании системы "растение-хозяин-патоген".

Показано, что инфицирование растений восприимчивого к септориозу сорта пшенииы Саратовская 29 высокопатогенным мутантом в оттичие от слабопатогенного практически не вызывает на начальном этапе патогенеза каких- либо изменений в содержании ИУК, индуцирует снижение в листьях активности пекто- и целлюлолитических ферментов и, напротив, повышение активности кистой фосфатазы и, особенно, пероксидазы С развитием болезни количество ИУК в листьях возрастает Повышается активность полигалактуроназы, С,-целлюлазы и ß-пюкозидазы (7 сутки), а затем и Сгцелтотазы Значительное усиление активности пероксидазы, которое наблюдалось уже через 3-е суток, сохраняется на всем протяжении опыта Отмечены изменения и в изофермент-ньгх спектрах как гидролаз, так и оксидоредуктаз Однако и в данном случае влияние высокопатогенного мутанта было более значительным, особенно в отношении ß-пюкозидазы и эстеразы

13 Инфицирование S nodorum Berk, относительно устойчивого к септориозу сорта Gastan только к концу опыта повышало уровень ИУК в шстьях на 20 0-33,i°o Достоверных различий в действии слабо и высокопатогенного му-танточ на синте i ИУК, динамику активности пекто- и целлюлолитиче^ких ферментов a также изоферментный спектр ß-пюкозидазы, кистой фосфатазы и jc-теразы не обнаружено Более значительное усиление активности пероксидазы под влиянием высокопатогенного мутанта было отмечено и на данном сорте Кроме тою мутант уже на 3-й сутки после инокуляции вызывал появление в спектре пероксидазы дополнительного 10-го изофермента с Rf 0,12 0,15

14 Пол\-ченные экспериментальные данные дают основание считать, что исследованные нами пекто- и целлюлолитеческие ферменты, фитотокснны и фитогормоны (ИУК) действительно являются факторами патогенности гриба S nodorum Berk выполняющими в процессе инфицирования как инвазивные (ферменты) так и регуляторные (ИУК, фитотоксины) функции

15 Выявленные в результате изучения физиолого-биохимической природы патогенности S nodorum Berk закономерности и предложенная схема взаимодействия патогена и растения-хозяина могут служить теоретической основой для разработки стратегии защиты посевов пшеницы от септориоза, включающей в себя целенаправленный синтез новых высокоэффективных химических соединений, способных блокировать факторы патогенности гриба, и создание устойчивых сортов Одним из наиболее вероятных путей решения задачи по выведению невосприимчивых или толерантных к септориозу сортов пшеницы является использование в качестве селектирующего фактора фитотоксинов, продуцируемых S nodorum Berk, в сочетании с методами биотехнологии и клеточной селекции

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кобыльский, Г.И. Ингибирование гидроксиламином пероксидазы и образования продуктов окисления ИУК, способных вступать в комплекс с РНК / Г.И. Кобыльский, В.В. Полевой, Г.П. Акимова II Известия СО АН СССР. Серия биол. -мед. наук. - 1969. - вып.1. - № 5. - С. 86-89.

2. Кобыльская, Г.В. Пероксидаза, ауксин-оксидаза и рост растений / Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыльский // Биол. исследования. - Элиста, КГУ. 1973. - С. 38-57.

3. Кобыльский, Г.И. К вопросу о роли мембран в реакции растений на ауксин / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Вопросы экол. и физиол. раст. -Элиста, КГУ, 1974. - С. 101-106.

4. Кобыльский, Г.И. Влияние гиббереллина на секрецию а-амилазы половинками семян пшеницы / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Вопросы экол. и физиол. раст. - Элиста, КГУ. 1974. - С. 122-125.

5. Кобыльский, Г.И. Активность и изоферментный состав а-амилазы, секретируемой половинками семян различных сортов пшеницы под влиянием гиббереллина / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов, В.И. Куля // Вопросы экол. и физиол. раст. - Элиста, КГУ, 1974. - С. 126-130.

6. Кобыльский, Г.И. Влияние гиббереллина на активность а-амилазы в алейроновом слое семян пшеницы / Г.И. Кобыльский, А.Н. Письменов // Материалы к изучению культурной и дикорастущей флоры Калмыкии. - Элиста, КГУ, 1976.-С. 148-151.

7. Кобыльский, Г.И. Биохимические факторы устойчивости растений пшеницы к ржавчинным болезням / Г.И, Кобыльский // Тезисы докл. научно-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. И. - пгт. Гвардейский, 1981. - № 1605. -С. 20-24.

8. Кобыльский, Г.И. Изменение активности полигалактуроназы у гриба Septoria nodorum Berk, в процессе роста его на плотной питательной среде / Г.И. Кобыльский, A.A. Ахметов // Тезисы докл. научно-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. И. - пгт. Гвардейский, 1981. - № 1605. - С. 25-26.

9. Кобыльский, Г.И. Влияние источников азота и углерода на рост и спо-руляцию гриба Septoria nodorum Berk при выращивании его в чистой культуре / Г.И. Кобыльский, М.Н. Васецкая, Г.В. Кобыльская и др. // Тезисы докл. науч-но-практич. конф. НИСХИ МСХ СССР, ч. II. - пгт. Гвардейский, 1984. - № 2148.-С. 10-16.

10. Борзионов, В.Д. О возможности прогнозирования устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине по содержанию некоторых белков в зерне / В.Д. Борзионов,.Г.И. Кобыльский // Вопросы защиты с.-х. растений и животных от болезней, ч. I. - Алма-Ата, Вост. отд. ВАСХНИЛ, 1989. - С. 30-31.

11. Кобыльский, Г.И. Гидролитические ферменты фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk I. Рост, споруляция и содержание белка в культуре гриба

/ Г И Кобыльский, А А Ахметов // Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I - Алма-Ата, Воет отд ВАСХНИЛ, 1989 - С 61-68

12 Ахметов, А А Гидролитические ферменты фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk II Активность полигалактуроназы, эндо- и "жзо - ß - 1,4 -пюканаз, ß - глюкозидазы и ксиланазы в культуре гриба / А А Ахметов, Г И Кобыльский // Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I -Алма-Ата, Воет отд ВАСХНИЛ, 1989 - С 68-75

13 Кобыльский, Г И Изучение токсинообразования у различных изолятов гриба Septoria nodorum Berk / Г И Кобыльский, Е В Бочарова // Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I - Алма-Ата, Воет огд ВАСХНИЛ, 1489 - С 75-80

14 Кобыльский, Г И Полиморфизм белков гриба Septoria nodorum Berk. / Г И Кобыльский, Г В Кобыльская, О Б Боровая и др // Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I - Алма-Ата, Воет отд ВАСХНИЛ, 1989 - С 80-83

15 Кобыльский, Г И Изоферментный состав эстеразы и кислой фосфата-1ы V некоторых изолятов гриба Septoria nodorum Berk и их мутантов / Г И Кобыльский, Г В Кобыльская, О Б Боровая и др Н Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I - Алма-Ата, Воет отд ВАСХНИЛ, 1989 - С 83-87

16 Герцог, НМ Выделение и регенерация протопластов из мицелия гриба Stptoriu nodorum Burk / Н М Герцог, Г И Кобыльский, Г В Кобыльская

Вопросы защиты с -х растений и животных от болезней, ч I - Алма-Ата, Воет отд ВАСХНИЛ 1489 - С. 87-89

17 Ахметов А А Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов у различных изолятов гриба Septoria nodorum Berk / А А Ахметов, I И Кобыльский // Тезисы докл VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана - Ташкент, 1989 - С 126

18 Кобыльский, Г И Фитотоксичные метаболиты, продуцируемые раз личными изолятами гриба Septoria nodorum Berk / Г И Кобыльский, Е В Бочарова // Тезисы докл VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана - Ташкент, 1989 - С 143

19 Ахметов, А А Влияние источников углерода на активность гидролитических ферментов у фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk / А А Ахметов, Г И Кобыльский //Вестник с-х науки Казахстана - 1989 - №6 - С 83-84

20 Кобыльский, Г И Фитотоксины гриба Septoria nodorum Berk и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы / Г И Кобыльский, Е В Бочарова // Вестник с -х науки Казахстана - 1989 - N° 7 - С 40-41

21 Кобыльский, Г И Биосинтез индолилуксусной кислоты фитопатоген-ным грибом Septoria nodorum Berk. / Г И Кобыльский, О А Алипбеков, Н М Герцог // Вестник с -х науки Казахстана - 1990 - № 8 - С 37-39

22 Кобыльский, Г И Активность и изозимный спектр некоторых ферментов у мутантов грибов - возбудителей фузариоза зерновых / Г И Кобыль-

ский, Г.В. Кобыльская, Е.Г. Дорохова // Вестник с.-х. науки Казахстана. -1991. -№ 6. -С. 44-48.

23. Кобыльский, Г.И. Морфолого-культуральные особенности мутантов гриба Septoria nodorum Berk / Г.И. Кобыльский, Н.М. Герцог // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 1991. - № 8. - С. 53-57.

24. Кобыльский, Г.И. О природе фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, и возможности использования их в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Г.И. Кобыльский, Е.В. Бочарова // IX Всесоюзное совещание по иммунитету растений к болезням и вредителям: Тезисы докл., том II. - Минск, 1991. - С.200-20К

25. Герцог, Н.М. Участие индолилуксусной кислоты в патогенезе гриба Septoria nodorum Berk / Н.М. Герцог, В.Д. Борзионов, Г.И. Кобыльский // Иммунитет сельскохозяйственных культур к возбудителям грибных болезней. -М., 1991.-С. 36-40.

26. Кобыльский, Г.И. Изменение активности и изозимного спектра некоторых ферментов у инфицированных растений восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы / Г.И. Кобыльский, Г.В. Кобыльская // III съезд Всерос. о-ва физиол. раст.: Тезисы докл., т. 6. - СПб., 1993. — С. 614.

27. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1994 год /Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова И Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1994 год. - М., 1994. - С. 48-55.

28. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1992 - 1995 годы /Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1992 - 1995 годы. - М., -

1995.-С. 55-61.

29. Кобыльский, Г.И. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1992 - 1996 годы / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1992 - 1996 годы. - М.,

1996.-С. 85-102.

30. Кобыльский, Г.И. Природа фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk и возможности использования их в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Г.И. Кобыльский // Проблемы селекции яровой пшеницы: Тезисы докл. научно-метод. коорд. совещания по селекции яровой пшеницы, 9-10 июля 1996 г. - Саратов, 1996. - С. 17-18.

31. Кобыльский, ГЛ. Отчёт о НИР Среднерусского филиала ВНИИ фитопатологии за 1997 год / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1997 год. - М., 1997. - С. 47-52.

32. Кобыльский, ГЛ. Отчет о НИР Среднерусской Н.- И. фитопатологи-ческой станции за 1998 год / Г.И. Кобыльский, В.В. Плахотник, В.П. Судникова // Отчёт о работе отд. защиты раст. РАСХН за 1998 год. - СПб., 1998. - С. 81 -88.

33. Кобыльский, Г.И. Фитогормоны и патогенность возбудителя септо-риоза пшеницы - Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский // Пятая междунар.

конф "Регуляторы роста и развития растений" (29 июня - 1 июля 1999 года) Тезисы докл , ч II М , 1999 - С 324

34 Кобыльский Г И Методика определения фитотоксинов гриба Septana nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии / Г И Кобыльский, Е В Бочарова - М, 1999 - 7 с - Деп в ВИНИТИ РАН 09 06 99 № 1868 - В99

35 Кобыльский, Г И Методика количественного определения фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk с помощью жидкостной хроматографии высокого давления / Г И Кобыльский, В Д Борзионов, Е В Бочарова - М, 1999 -8с - Деп в ВИНИТИ РАН 09 06 99 .Vs 1869-В99

36 Кобыльский, Г И Физиолого-биохимические факторы патогенности возбудителя септориоза пшеницы - Septona nodorum Berk / Г И Кобыльский // IV съезд Всерос о-вафизиол раст • Тезисы докл ,т 1 - VI, 1999 - С 223-224

37 Кобыльский, Г И Изменение активности пектолитических и целлю-лолитических ферментов у инфицированных растений восприимчивого и относительно устойчивого к септориозу сортов пшеницы / Г И Кобыльский, А А Ахмегов, Г В Кобыльская // IV съезд Всерос о-ва физиол раст Тезисы докл , т 1 -М, 1999 - С 223-224

38 Кобыльский, Г И Влияние фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk на растения пшеницы / Г И Кобыльский, Е В Бочарова // IV съезд Всерос о-ва физиол раст Гезисы докл , т 1 - М, 1999 - С 223

39 Кобыльский, Г И Первые итоги работы / Г И Кобыльский // Защита и карантин раст - 2000 - .Vo 8 - С 46

40 Кобыльский, Г И Физиология и биохимия патогенности гриба Septoria nodorum Бык - возбудителя септориоза пшеницы / Г И Кобыльский // Вестник зашиты растений - ВИЗР, СПб - Пушкин, 2000 - № 1 - С 103

41 Кобы )ьский, Г И Иммунологические методы со ¡дания устойчивых к болезням сортов сельскохозяйственных культур / Г И Кобыльский, В В Пла-хотник, В П Судникова и др // Принципы, критерии и технологии стабилизации фитосанитарного состояния агроэкосистем Основные итога исследований ВИЗР, ВНИИФ, ВНИИБЗР, ДВНИИЗР и СНИФС за 1946-2000 гг - РАСХН, Отд защиты раст - СПб , 2000 - С 66-71

42 Кобыльский, Г И Регуляторы роста защищают зерновые культуры от болезней / Г И Кобыльский, В П Кратенко, М Н Васецкая, В В Чекмарев // Arpo XXI 2001 -.NM-С 12-13

43 Кобыльский, Г И Физиологические особенности мутантов гриба Septoria nodorum Berk и их роль в адаптации патогена к условиям существования/ Г И Кобыльский//Сельскохозяйственная биология -2001 - № 5 - С 95-100

44 Кобыльский, Г И Влияние ионов Са:* на поражение растений пшеницы септориозом / Г И Кобыльский, Г В Кобыльская, А А Ахметов // Биоло-ги-зация защиты раст состояние и перспективы - Материалы докл междунар научно-практ конф 18-22 сентября 2000 г, Краснодар, ч I - Краснодар, 2001 -С 79-80

45 Кобыльский, Г И Влияние фитогормонов на поражение растений пшеницы Septoria nodorum Berk / Г И Кобыльский, Г В Кобыльская // VI Ме-

ждунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях" (2628 июня 2001 г): Тезисы докл.-М„ 2001,-С. 39.

46. Кобыльская, Г.В. Влияние гормонов на прорастание спор и рост гиф у фитопатогенного гриба Septoria nodorum Berk.! Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыль-ский // VI Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях" (26-28 июня 2001 г): Тезисы докл.- М., 2001.- С. 164.

47. Кобыльская, Г.В. Активность пектолитических и целлюлолитических ферментов у мутантов гриба Fusarium graminearum Schwabe / Г.В. Кобыльская, Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов.- Тезисы докл.,- М., 2002,- С. 187.

48. Кобыльский, Г.И. Фитотоксины и патогенность возбудителя септо-риоза пшеницы - гриба Septoria nodorum Berk / Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов.- Тезисы докл.,- М., 2002,- С. 187-188.

49. Кобыльский, Г.И. Фитогормоны и их возможная роль в патогенезе септориоза пшеницы / Г.И. Кобыльский // Современная микология в России: Первый съезд микологов,- Тезисы докл.,- М., 2002.- С. 188.

50. Кобыльский, Г.И. Физиолого-биохимические механизмы взаимоотношений растений пшеницы с возбудителем септориоза - грибом Septoria nodorum Berk. / Г.И. Кобыльский, Г.В.Кобыльская // Первая Всерос. конф. по иммунитету раст. к болезням и вредителям,- Научные материалы.- СПб., 2002.-С. 30-31.

Зак. 627.

Объем 3,0 печ. л.

Тираж 100 экз.

. Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ — МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Информация о работе

Кобыльский, Геннадий Иванович
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 06.01.11

Автореферат

Похожие работы