Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фитотоксины гриба SEPTORIA NODORUM BERK и их роль в патогенезе септориоза

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Фитотоксины гриба SEPTORIA NODORUM BERK и их роль в патогенезе септориоза"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ГЛАВНОЕ НАУЧНО ПРОИЗВОДСТВЕНШЕ УПРАВЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕНШСТИ

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

БОЧАРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

УДК 579. 64: 581. 2+632. 4

ФИТОТОКСИНЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM BERK. И ИХ ЮЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ СЕПГ0РИ03А

(06.01.11 - защита растений от вредителей и болезней)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Голицыно - 1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском сельскохозяйственном институте ГлавагроСиопрома при Госкомиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

доцент Г. И ЮБШЬСКИЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. М. Умнов

кандидат сельскохозяйственных наук ,. К Н. Васецкая

Ведущее учреждение - Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии

Защита диссертации состоится " Л#. »Л 1992 Г. в часов на заседании специализированного совета Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии.

■ Отзыв на автореферат просим направлять в двух экземплярах по адресу: 143050, Московская область, Одинцовский район, а/о Большие Вяаемы, ВНИИФ, специализированный совет К. 120.66.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИФ.

Автореферат разослан "

0 19£Р^-.

Ученый секретарь специализированного совета, И. Н. Яковлева

кандидат биологических наук

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поражение зерновых культур септо-риоаом наблюдается во многих странах мира. Проведенные в нашей страде исследования показали встречаемость этого заболевания на значительной территории СССР, при этом одним из основных возбудителей является гриб Septoria nodorum Berk. (Васецказг'и. др., 1983; Супрун, 1990; Хасанов, 1990). Потери урожая, вызываемые заражением пшеницы септориозом, могут достигать 30-407, (Mlttermeier, Hoffman, 1985)-.

Известно, что многие фитопатогенные микроорганизмы способны продуцировать физиологически активные вещества, играюще значительную роль в процессе патогенеза. Такими факторами па-тогенносги являются ферменты (Colimer, Keen, 1986), гормоны (Daly, Knoche, 1976) и токсина (Daly et al., 1983; Mitchell, 1984). Для некоторых патогенов была найдена корреляция, между патогенностыо и образованием токсинов и показана высокая специфичность действия последних в отношении растения-хозяина (Scheffer, Livingston, 1984). •

При изучении возбудителя септориоза Septoria nodorum Berk, в чистой культуре также бшш выделены вещества с фитотоксичными свойствами. Это - охрацин (Bousquet, Skajennikoff, 1974), сеп-торин (Devys et al., 1978) и некротический токсин (Kent, Strobel, 1976). Однако многие вопросы относительно их роли в патогенезе септориоза до конца еще не раскрыта Не установлено, в частности, существует ли взаимосвязь между патогенностыо изо-лятов гриба септория и способностью их к синтезу фитотоксинов, как влияет условия культивирования гриба на токсинообразование и возможно ли использование токсинов в селекции растений пшеницы на иммунитет к септориозу. В этой связи изучение фитотоксинов у гриба S. nodorum и их роли в патогенезе септориоза представляет большой научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Цегыо наших исследований являлось изучение токсинообразования у природных изолятов гриба Septoria nodorum Berk., выделенных на территории Казахстана, и его роли в процессе патогенеза септориоза.

В задачи исследования входило:

- изучение качественного состава и биологической активности токсичных метаболитов, продуцируемых грибом S. nodorum;

- отработка методов препаративного выделения фитотоксинов гриба S. nodorum;

- анализ зависимости токсинообрааования от происхождения изо-лятов гриба S. nodorum и условий их культивирования;

- поиск возможной связи между патогенностью изолятов гриба S. nodorum и образованием фитотоксинов;

- проверка специфичности токсического действия метаболитов гриба септория и возможности использования их для оценки сортообразцов пшеницы на устойчивость к септориозу;

- изучение роли фитотоксичных метаболитов в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение образования фитотоксинов у природных штаммов гриба S. nodorum, изолированных с пораженных растений пшеницы на территории Казахстана. Из культуралыюй среды гриба выделены препаративно и изучены пять фитотоксичных метаболитов: ФГ-1, ФТ-2, ФГ-3, ФГ-4 и ST-5, в том числе один (ФГ-4), не описанный ранее. С помощью жидкостной хроматографии высокого давления проанализирована зависимость токсинообразования от природы изоляТа гриба и условий его культивирования. Впервые показано, что высокопатогенные природные изоляты 176 Е, 101 Д, 638 Б и 85-254 отличаются повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов. Слабопатогенные изоляты 143 Г и 25 Д уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов. Установлено, что при прорастании спор наблюдается усиленный синтез фитотоксинов и секреция их в окружающую инкубационную среду. Опытами с чистыми препаратами фитотоксинов выявлена неспецифичность их действия на растения пшеницы. Высказано предположение, что обнаруженные фитотоксшш гриба S. nodorum, хотя и являются хозяин-неспецифичными, могут играть вполне определенную роль в процессе патогенеза септориоза, особенно на самых ранних его этапах.

Практическая ценность работы. В результате исследований подобраны условия и разработана схема выделения токсинов из культуры гриба Septoria nodorum Berk. Выделены фитотоксины, которые могут быть использованы в работе при селекции растений на

устойчивость с помощью культуры клеток и тканей. Препараты фи-тотоксинов переданы в Институт молекулярной биологии и биохимии АН КазССР для изучения их действия на культуру клеток- пшеницы и отбора устойчивых к септориозу линий.

• Разработаны "Методика определения фитотоксинов гриба Septoria nodoruin Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" и "Методика количественного определения фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления", которые могут использоваться специалистами в области фитопатологии, молекулярной биологии и биохимии иммунитета растений.

На основе полученных данных составлены "Рекомендации по направленному синтезу фунгицидов, предназначенных для борьбы с септориозом".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференции молодых ученых во ВНИИФ (1985), научно-теоретической конференции НИСХИ (1988), VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1989), II Всесоюзном совещании по физиодого-биохимическим основам иммунитета сельскохозяйственных растений к грибным болезням (Уфа, 1990). : Публикации. 1Ь материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 179 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы и 13 рисунков. .Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Список литературы включает.169 источников, в том числе 130 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта исследований использовали природные изоляты гриба Septoria nodorum Berk., различающиеся по происхождению, патогенности и морфолого-культуральным признакам, полученные из лаборатории "Биологии септориальных грибов" НИСХИ.

Культуру гриба вырввдвали на жидкой и агаризованной модифицированной среде Фриза и твердой картофедыю-декстрозяой сре-

дв в течение 14 и 21 суток. Для выделения фитотоксииов готовили этилацетатные экстракты среды культивирования, мицелия, покоящихся и прорастающих пикноспор гриба.

Проращивание спор проводили в течение 20 часов в среде TBN (Dunkle, Allen, 1971).

Для обнаружения биологически активных веществ экстракты среды культивирования и мицелия разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Пятна, отмеченные на хроматограмме под УФ--светом (254 нм), вновь экстрагировали этилацетатом и проверяли на биологическую активность с помощью биотеста, в качестве которого использовали семена пшеницы Саратовская 29.

Идентификацию фитотоксииов осуществляли по качественным реакциям (реактив долина-Чиокальто и хлорное железо), величине Rf в различных системах разделения и УФ-спектрам поглощения.

Для наработки, фитотоксииов использовали препаративную ТСХ и разделение их на колонке с LH-20 сефадексом.

Количественное определение фитотоксииов в этилацетатном экстракте проводили с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на хроматографе системы "Gold" (Beckman) по разработанной нами методике.

Биологическую активность и специфичность действия выделенных препаратов фитотоксииов изучали с использованием в опытах семян пшеницы Саратовская 29, Саратовская 36, Саратовская 46 (восприимчивый к септориозу), Артур и Castan (относительно устойчивые), ячменя Байшешек, риса Kanto-51 и маша Победа 104.

Способность фитотоксииов вызывать у растений симптомы поражения, характерные для септориоэа, определяли в опытах с интагаными и изолированными листьями пшеницы Саратовская 29.

О действии фитотоксииов на мембраны растений судили по выходу антоцианов из дисков свеклы, помещенных в растворы фитотоксииов (Ызтоды экспериментальной микологии, 1982).

Результаты исследований обрабатывали математически. Вычисление среднего арифметического (Ц) и средней квадратической ошибки (ш): проводили по формулам, описанным P. X. Кариолиевьы (1971). Корреляционный анализ проводили по программе "Statistical Graphics System" (USA; 1985-1986) для персонального компмН тера IBM PC/AT.

• ; - 5 -РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Еыделение. очистка и идентификация фитотоксичных метаболитов возбудителя септориоза пшеницы. Шрвые предварительные эксперименты показали, что при. культивировании гриба S. nodorum в течение 21 суток на жидкой питательной среде Сриза в ней происходит накопление фитотоксичных компонентов, йильтрат культу-, ральной среды вызывая подавление роста корней и колеоптилёй пиеяищ. При разведении среды культивирования водой в соотношении 1:1 и 1: 4 ингибируюшлй эффект сохранялся, хотя естественно я несколько снижался.

В связи с этим были проведены более детальные исследования.

Для выделения биологически активных веществ использовали зтадацетатные экстракты культуральноЯ жидкости и мицелия. При выборе оптимальных условий разделения экстракта и выделения метаболитов была проведена работа с несколькими системами растворителей: хлороформ - этилацетат (5:1), петролейный эфир - этил-ацетат (1:1) и бензол - уксусная кислота (3:1). '

При разделении суммарного этилацетатного экстракта культу; ральной среды изолята 83-6 гриба S. nodorum с помощью ТСХ в указанных системах растворителей было обнаружено от 11 до 13 компонентов. Наиболее четкое разделение и выделение фитотокси-:ческих веществ происходило в системе хлороформ - этилацетат (5:1), которая и была выбрана в качестве основной для дальнейший работы.

Сравнительное изучение качественного состава : метаболитов мицелия и культуральной среды изолята 83-6 гриба S. nodorum показало, что они близки меаду собой, хотя в среде обнаружено 12 компонентов, а в мицелиальноы материале - 11.

Из данных, представленных на рис.1, видно, что экстракт культуральной среды содержит в своем составе вещества, ингиби-рующие рост как корней, так и кояеоптклей пшеница Наиболее активные метаболиты сосредоточены в вонах с Rf 0,00-0,25; 0,25-0,43; 0,60-0,80 и 0,80-1,00. Рост корней они подавляли на 17,9; 14,0; 14,3 И 29,82, а колеоптилей - на 20,5; 9,6; 19,4 и 25,22 соответственно. Основная часть метаболитов, входящих в

lA

lTI

tJ

Э 63-6

100. 90 60

DTP

1.1 63-6

10090

80

70

60 50

40

30

20

rtil

100 90

80

70

60

U

U

Э 85-254

M 85-254

Bf

0 0,4 1,0 0 0,4 1,0 0 0,4 1,0 0 0,4 1,0

корень колеолтиль ' корень колеоптиль

Рис. 1 Гистограммы биологической активности метаболитов изолятов гриба S.nodorum , выделенных из культу-ральной среды (Э) и мицелия (М) с помощьв ТСХ

перечисленные воны, обладала фиолетовой и голубой флуоресценцией в УФ-свете. Среди веществ, выделенных из мицелия гриба, достаточно высокая биологическая активность обнаружена у метаболитов из зоны с № 0,41-0,61, обладающих бледнотелесной и светло-голубой окраской в УФ-свете. Рост корней и колеоптилей пшеницы они подавляли на 19,0 и 17,92 соответственно (рис.1). Другие зоны обнаруживали чслабую биологическую активность, что, вое-можно, связано с низкой концентрацией входящих в состав этих вон метаболитов вследствие секреции их в кудьтуральную среду.

При использовании изолята 85-254 анализ этилацетатных экстрактов а помощью одномерной ТСХ позволил выявить в среде 13, а в мицелии - 8 метаболитов, различающихся по ИГ, окраске в видимом свете и флуоресценции в УФ-свете. Определение их биологической активности показало, что наибольшей фитотоксической активностью в экстракте кудьтурадьной среды обладают метаболиты с К- 0,76-1,00 (рис.1). Вещества, присутствующие в этой зоне, ин-гибировади рост корней и колеоптилей пшеницы на 76,8 и 44,47. соответственно. Подавление роста проростков пшеницы элюатами из других зон было значительно слабее.

Более высокая биологическая активность обнаружена у метаболитов, экстрагированных из минеральной массы гриба. Как вид-'но йэ рис.1, токсическое действие на рост проростков пшеницы оказывали вещества, присутствующие практически во всех зонах хроматограммы. Наиболее сильное ингибирупдие действие на рост корней оказывали вещества из зон с ЯГ 0,64-1,00 (43,1%), 0,28-•-0,44 ( 38.6Х) и 0,13-0,28 (ЗО.ЗХ). Рост колеоптилей при этом уменьшался на 24,3-26, вХ.

Подобные данные в отношении метаболитов гриба септория были получены и в опытах с экстрактами культуральной среды и мицелия изолятов 538 Б, 78 Д, 83-30, 143 Г И 25 Д.

Многократные опыты по экстрагированию биологически актив- ' ных веществ из мицелиальной массы и среды культивирования различных изолятов гриба септория позволили нам остановиться на б метаболитах, свойства которых были изучены более детально. Выделенные метаболиты были обозначены как фитотоксины (ФГ) -ФГ-1, ФГ-2, ФГ-3, ФГ-4 и ФГ-5. Из данных, представленных в табл. 1, видно, что эти вещества в значительной степени раздича-

- б -

югся между собой по окраске в видамэм и флуоресценции в У ^-свете, величине КГ для трех систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограмм проявляющими реагентами и УФ-спектрам поглошэния.

По изменении окраски пятен при опрыскивании хроматографы реактивом Фолина-Чиокадьто четыре фитотоксина, а именно ФТ-1, ФГ-2, ФГ-3 и ФГ-б, можно отнести к классу фенольных соединений (табл.1). Это подтверждается и реакцией с хлорным железом. Обработка хроматограммы совместно перекисью водорода и раствором хлорного железа позволяет выделить фенольные вещества, относящиеся к группе кумаринов или изокуыаринов. Три фитотоксина (ФГ-2, ФТ-3 и ФТ-5) показали положительную реакцию.при проведении специфического определения кумариков.

Необходимо также отметить, что выделенные фитотоксины чувствительны к воздействию света. УФ-спектр фитотоксинов, выдержанных в течение двух суток при комнатном освещении, полностью изменялся. Также изменялась и флуоресценция в УФ-свете у ФГ-1, ФГ-2 и ФТ-5 - дополнительно к основному появлялось фиолетовое свечение.

Все выделенные фитотоксины хорошо ' растворимы в этиловом спирте, зтилацетате и хлороформе. В воде хорошо растворяется .только ФГ-4, слабо - ФГ-3 и ФТ-5, не растворяются - ФГ-1 и ФГ-2.

Работами французских исследователей было установлено, что одним из фитотоксинов гриба селтория является меллеин - вещество .изокутриновой природы, дающзе вишневую окраску с РеС1^ (Оеууэ е1 а1., 1974). Сопоставление полученных нами характеристик выделенных метаболитов гриба септория позволяет ФТ-5 отнести к меллеину, а ФГ-3 - к одному из его производных.

Среди выделенных вевдств два (ФГ-1 и ФГ-2) имзюгг лидан-но-желтую окраску в видимом свете, абсорбируют в УФ-свете и проявляется под действием хлорного железа, то есть ведут себя подобно септорину, второму из известных фитотоксинов возбудителя септориоаа (йеууэ et а1., 1978). Однако, в отдичке от септо-рина, выделенные вещества растворимы в хлороформе и имеют кристаллическую. а не аморфную форму. Поэтому трудно сказать, является ли одно из указанных вевэств еепторююм. Не исключено, что в процессе выделения к очистки вещества изменяет свои

Таблица 1

Характеристики фитотоксичных метаболитов гриба БерЪопа пос1огит Вегк.

4«то-токсин Окраска КГ в системе* Максимумы поглощения (ны) метанол этанол Изменение окраски под действием:

видимый свет У®-свет 1 2 3 реактива Фолика- Чиокальто 17. ЯсСЛ^в 50£ метаноле 0,52 +17. ГеС1 з (водн.)

ФГ-1 лимонно- тешюсерая 0,21 0,62 0,64 296, 333 296, 331 синяя желто- -

желтая коричневая

ФГ-2 лимонио- темносерая 0,34 0,46 0,60 297, 364 226, 300, зеленая коричневая желто-

желтая 366 коричневая

ФГ-3 голубая 0,34 0,41 0,53 243, 313 245, 315 синяя пурпуровая пурпуровая

ФГ-4 фиолетовая 0,55 0,25 0,51 242, 305 243, 306 - - -

ФГ-5 - голубая 0,83 0,68 0,79 241, 313 245, 315 синяя пурпуровая пурпуровая

Примечание:* - 1 - хлороформ - зтилацетат, 5:1

2 - петролейный эфир - этилацетат, 1:1

3 - бензол - уксусная кислота,' 3:1 (-) - окраска отсутствует

- 10 -

свойства, Так как чувствительны к воздействию света

НЬка не удалось с помощью качественных реакций определить к какому классу соединений относится фитотоксин Ф1-4. фи использовании указанных выше проявляющих реагентов окраска данного вещества не изменялась. Среди описанных в литературе фитотоксинов гриба септория вещрства, подобного ФГ-4, не встречается.

Таким образом, в процессе работы из культуры гриба Б. гххЗо-гит бит выделены пять веадзств, обладающих фитотоксической активностью, И проведена их идентификация.

Для Выполнения дальнейших исследований был необходим метод, позволяющий определить точное содержание фитотоксинов в суммарном экстракте. Используя в качестве метчиков препараты фитотоксинов» выделенные в процессе работы, нами бьаа разработана методика ш разделения и количественного определения с помощью жидкостной Х}»мар1ографии высокого давления. На представленной хроматограше (рис.2) видно, что с помощью данного метода можно довольно четко разделить все 5 фитотоксинов. При разработке методики также установлено, что в суммарной экстракте присутствует микофеноловая кислота (ШК), которая ранее была Обнаружена Ъ культуральной Среде гриба септория (&аууз е1 а1., 1080).

Препаративное получение фитотоксинов гриба Б. посЬгцт. Применение фитотоксинов для изучения характера взаимоотношений между возбудителем септориоэа и растением-хозяином требует наработки их в препаративных количествах, что в свою очередь вызывает необходимость иметь большие объемы культуральной среды и как минимум в 3 роза больше по отношению к количеству среды этилацетета. В евяэй о этим С№4 проведены ошлы по лиофильному высушиванию культуральной среды и использованию сухого концентрата в качестве источника фитотоксинов.

Установлено, что при лиофилизации фитотоксическая активность метаболитов сохраняется. Однако длительной и многократной экстракцией . не удается достичь полного извлечения фитотоксинов аз лиофилизированной среды. Лучше, как показали эксперименты, перед экстрагированием сухой материал среды разводить в минимальном количестве воды или исходную культуральную жидкость

АБСОРБЦИЯ

й!й\й Разделение фитотоксиноэ из культуральной жидкости гриба сблтсркя С помощью жидкостной хроматография

концентрировать в 3-4 раза, не добиваясь полного высушивания.

Экстракция среды зтилацетатом приводит к извлечению кроме фитотоксинов и других веществ. При разделении экстракта на тонкослойной хроматограмме значительное количество окрашенных веществ остается на старте, прочно связываясь с сидккагелем i затрудняя разделение. Особенно много таких веществ в экстракт« мицелия. Для удаления их целесообразно использовать колонку < сухим силикагелем для адсорбционной хроматографии. При нанесении экстракта на колонку (0,9x5,0 см) и пропускании через не« этилацетата фитотоксины выходят с первыми 50 мл, а темноокра-шенные пигменты остаются на колонке.

После очистки суммарного экстракта приступали, к выделени» фитотоксинов. В процессе работы была составлена схема препаративного получения 5 фитотоксинов из культуральной жидкости гриба S. nodorum, основные этапы которой представлены на рис. 3. Uns очистки ФГ-1, ФТ-4 и ФТ-5 сочетали хроматографию в различию системах разделения, а для ФГ-2 и ФТ-3, имеющих близкие величины Rf, применяли колонку с LH-20 сефадексом. йитотоксины ФГ-1, ФГ-2, ФТ-4 и 4Т-5 удается получить в порошкообразном состоянии, а ФТ-3 - только в виде маслянистого остатка. Подученные фитотоксины хранили в холодильнике при температуре +4® С до использования в дальнейшей работе.

При разделении на колонке смеси компонентов ФГ-2 и ФГ-£ произошло деление ФГ-2 на две фракции. Одна фракция содержала собственно ФГ-2, а другая - вешэство, которое обзначили Kai* сер. 0,34. Содержание этого вещества учитывали при проведении количественного анализа при изучении вопросов, связанных с ток-синообразованием гриба септория.

Изучение токсинообразования у гриба Septoria nodorum Berk.

Известно, что на образование фитотоксинов при выращивании гриба в чистой культуре оказывают влияние состав среды и условия культивирования (Dasgupta, 1086). Исходя их этого, мы провели анализ синтеза фитотоксинов при культивировании гриба S. nodorum на различных средах в условиях климатической камерц (свет) и термостата (темнота). В данном опыте использовали изо-лят 85-254 гриба S. nodorum.

Результаты экспериментов показали, что гриб S. nodorum уже

Культуралькая жидкость

| довести 20% ИаОН до рН 6,0 Экстракция этилацетатом

) выпарить под вакуумом при температуре < Маслянистый осадок

растворить в зтилацетате, очистка на колонке с сухим силикагедем для адсорбционной хроматографии Препаративная ТСХ, хлороформ-зтилацетат, 5:1

обнаружение в УФ-свете (254 нм) --

46 °С

ФГ-1, И" 0,16-0,21 (абсорбирует, серый)

ФГ-4, И* 0,55-0,60 (фиолетовый)

I

ФГ-5, ЯГ 0.85-0,90 (голубой)

ФГ-2 и ФГ-3 КГ 0.34-0.39 (серо-голубой)

I

а

ЭЛЮНРОВАТЬ 31 КЛАДЕТ А1 ОМ

Концентрировать; -Препаративная ТСХ-

бензол-уксусная кислота, 3:1 ФГ-1, К- 0,64

петролейныа зфяр-зтилацетат, 1:1 ФГ-4, ИГ 0,25-0,30 ФГ-5, ЯГ 0,68-0,80

4

Выпарить до сухого остатка; Хроматография на колонке с Ш-20 сефадексом, растворитель - этанол; препаративная ТСХ, бензол -уксусная кислота, 3:1 ФГ-2. КГ 0,60 ФГ-3, КГ 0,53

Рис. 3 Схема препаративного выделения фитотоксинов гриба Б. гсхЗогигп кз культуральной среды

в течение 14 суток способен продуцировать весь комплекс фитотоксинов, которые обнаруживаются и в среде культивирования, и в мицелии. В зависимости от условий выращивания (темнота или свет) и состава среды наблюдалось различное соотношение между количеством фитотоксинов в культуральной среде и в мицелии. Установлено, что в условиях климатической камеры секреция фитотоксинов в среду повышается, однако при этом снижается количество ФГ-2. Наибольшее количество фитотоксинов образуется при выращивании культуры гриба на жидкой модифицированной среде Фриза

На основании полученных данных при проведении дальнейших исследований культуру гриба выраиивали на жидкой среде Фриза в термостате.

Изучение 'физиологии ж ^биохимии фитопатогенных микроорганизмов показало, что их способность к продуцированию ферментов, гвнтадатов, токсинов и других физиологически активных веществ во мог ом определяется природой штамма или изодята. Для некоторых ¡патогенов установлено существование прямой зависимости патоген-шести от образования токсинов (Lepoivre, 1982).

Для того, чтобы установить каким образом связаны патоген-иость и токпикообразоЕание у гриба S. rtodorum, были взяты 6 иао-штов, различающихся по происхождению и морфолого-культуральным ¡признакам, и проведено сравнительное изучение. Среди выбранных ® .опыт иаодятов 176 Е, Б38 Б, 101 Д и 85-254 относятся к высо-жопатогешшм, а 25 Д и 143 Г - к слабопатогенным.

'Полученные данные показывают, что природные изоляты гриба септория продуцируют все определяемые фитотоксмш, но значительно .различаются между собой по их количеству. Так, меньше шсего образуется ФТ-1, разницы в содержании которого между высоко- Ii слабопатогенными изолятами практически нет (табл. Z). Шо ¡поводу ST-3 да W-4 можно сказать, что эти токсины в значи-тедышк ■'количествах присутствуют в среде как высокопаюгенных (176 !Е, ®33 'Б >и 85-254), так и слабопатогенного изолята 143 Г. В отношении двух других фитотоксинов - ФГ-2 и ФГ-5, можно сказать, что ® -целом ъысокопатогенные изоляты образуют их г 'больших количествах, чем слабопатогенные (за исключением «золота 85-254 по ФГ-2).

Таблица 2 .

Содержание фатотоксинов в среде культивирования и мицелии различных изолятов гриба 5. по<3огит

(мг/г сухого мицелия)

Вводят Фитотоксины

ФТ-1 ФГ-2 ФГ-3 ФГ-4 ФГ-5 сер. 0,34 МФК

Культуральная среда

176 Е 101 Д 538 Б 85-254 143 Г 25 Д

176 Е 101 Д 538 Б 85-254 143 Г 25 Д

0,038+0,017 0,034+0,004 0,026+0,015 0,023+0,019 0,020+0,008 0,028+0,003

0,009+0,001. 0,001+0,000 0,016+0,006 0,007+0,003 0,009+0,004 0,011+0,003

0,555+0,127 0,195+0,124 0,257+0,028 0,048+0,030 0,034+0,011 0,120+0,023

0,018+0,001 0,008+0,001 0,070+0,015 0,006+0,001 0,014+0,003 0,002+0,001

0,589+0,203 0,338+0,075 0,238+0,037 0,534+0,186 0,476+0,103 0,080+0,031

0,021+0,002 0,026+0,001 0,014+0,002 0,019+0,006 0,057+0,003 0.003+0,001

0,224+0.061 0,072+0,022 0,577+0,122 0,469+0,179 0,381+0,076 0,076+0,030

Мицелий 0,01,9+0.001 0,005+0,000 0.039+0,007 0,022+0,005 0,067+0,002 0,003+0,001

0,480+0.163 0,212+0,118 0,054+0.026 0,080+0,003 0,023+0,004 0,026+0,016

0,348+0,233 0,032+0,001 0,040+0,016 0,016+0,006 0,016+0,004 0,006+0,003

0,196+0,084 0,032+0,007 0,078+0,006 0,116+0,029 0,031+0,007 0,016+0,004

0,078+0,005 0,014+0,000 0,095+0,052 0,010+0.005 0,036+0,021 0,005+0,000

0.022+0,007 0,014+0,004 0,013+0,001 0,054+0,037 0,043+0,015 0,005+0,002

0,001+0,000 0,001+0,000 0,001+0,001 0,001+0,000 0,008+0,001 0,0001+0,00

I

- 16-

На основании полученных данных можно сказать, что патоген-ность гриба септория не зависит от образования какого-либо одного фитотоксииа. Учитывая изменчивость и легкую приспосабливаемое^ возбудителя септориоза к изменяющимся условиям внешней среды, можно предположить, что важным для патогенности является сам факт присутствия фитотоксинов в культуре гриба, взаимодействующего с растением-хозяином.

Необходимо также отметить, что содержание фитотоксинов в мицелии было значительно ниже, чем в культуральной среде (табл. 2). По-видимому, это объясняется тем, что синтез фитотоксинов сопровождается активной экскрецией их в среду, что может шлэть большое значение в процессе патогенеза септориоза.

В предыдущих опытах мы использовали 14- и 21-суточную культуру гриба Б. помогши. При этом установлено, что с увеличением возраста культуры от 14 до 21 суток повышается количество фитотоксинов, накапливающихся в культуральной среде.

Вместе с тем, хорошо известно, что для успешного развития патогена в растении очень важен начальный этап, связанный с прорастанием спор. Исходя из этого', мы попытались определить фитотоксины в пикноспорах гриба 3. пойогит, находящихся в состоянии покоя, и при их прорастании.

Анализ показал, что у высокопатогенного изолята 176 Е в спорах присутствуй! все 5 фитотоксинов, 'а у изолята 85-254 -ет-Э и ©1-4. У сдабояатогеняого изолята 25 Д в пикноспорах обнаружены ФГ-3, ФГ-4 и ФГ-5.

При прорастании спор в течение 20 часов наблюдается значи-• тельное увеличение количества всех фитотоксинов и их накопление в среде инкубации, в том числе и тех, которые в покоящихся спорах не обнаружены. Это говорит о том, что в процессе прорастания спор гриба Б. пойогит происходит усиленный синтез фитотокеи-. нов и их экскреция в окружающую среду. Этот процесс, вероятно, имеет место и при'прорастании спор гриба септория в инфекционной калле на поверхности растений.

Изучение роли фитотоксинов гриба септория в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина. При изучении биологической активности фитотоксинов мы установили, что ингибнрование роста проростков пвеницы наблвдается при концентрации 100 мг/д

и усиливается с увеличение« концентрации.

. Следушлм этапом наших исследований было определение специфичности действия выделенных фитотоксшюв гриба Б. пологий. Данные, представленные в табл.3, показывают, что ингибирукоее действие фитотоксквов на рост корней проявляется достаточно Хорог» как на восприимчивых, так и на относительно устойчивых к септориоэу сортах пшеницы. Существенной разницы в реакции указанных групп сортов не обнаружено. Ив 5 фитотоксшгав наибольшей шгибирушей активностью обладают ФГ-4 и ФТ-5.

Фитотоксины тагаээ вызывают задержу роста корней ячменя п риса и практически не влияют на рост; проростков маша.

Аналогичные данные получены и по действию фитотоксинов на рост гсолеоптилей.

Результаты проведенных исследований позволяют нам сделать заключение о неспецифическом характера действия выделенных фн-тотоксинов гриба септория. В связи с эти«, они, по-видимому, не могут быть использованы для оценки сортообразцов псешщы на устойчивость к септориозу.

После определения специфики действия фитотоксшюв гриба ■ 3. пойогшя встает вопрос об их участии в проявлении скитзмов заболевания. .Для ответа на этот вопрос были поставлены эксперименты, в которых интактиие растения и изолированные листья пае-ницы обрабатывали чистыми растворами фятотокеинов (200 иг/л), а .такмз совместно со споровой суспензией Еозбудителя септориоэа.

Цроведешшэ исследования показали, что ни один из фототоксинов не вызывает каких-либо видимых симптомов поражения, характерных для-септориоэа. В то та время, добавление в споровую суспензии фототоксннов ЭД-1, ФГ-2 и ФГ-5 приводило к увеличения степени порзкения гагокулированных растений пшеницы (рис. 4).

Другой опыт, в которм двухнедельные проростки пшеницы поме пали в раствори фототекекяов, показал, что под действием .ФТ-1, ФТ-2 и ОТ-6 происходит пояэлтениэ и усыхввие листьев по сравнении с контролем. При этой отмечено, что к концу опыта количество раствора в контрольном варианте Сило в 2-3 раза иень-сз,- чем в опытных. На основании этого >.»яно предположить, что фггготогаипы кагаш-то образом влияет на процессы водного обмена

Таблица 3

Влияние фитотоксинов гриба 3.пос1огит на рост корней различных культур (длина, в £ к контролю)

Фито- Концен- Пшеница Ячмень Рис Ыаж

ток- трация Саратов- Саратов- Саратов- Артур СазСап Вайшетек КагЛо-51 Пэбеда 104

син (мг/л) ская 29 ская 36 ская 46

ФГ-1 100 93,3+1,9 92,4+8,3 79,1+4.2 90,4+11,1 93,2+9,2 105,2+ 6,9 85,5+6,6 90,8+4,3

200 ев,1+2,5 91,0+3,8 72,4+3,9 91,6+ 4.8 90,8+2,5 ' 100,6+ 2,6 36,0+3,6 90,2+3,9

ФГ-2 100 83,3+2,0 84,0+2,2 90,1+2,8 94,6+ 4,4 82,2+3,1 95,2+ 5,0 76,8+3.4 110.9+2,2

200 61,4+2,8 80,7+2,6 81.2+1,7 89,7+ 2.6 75,8+3,1 81,7+6,2 62,2+8,6 114,5+3,6

ФТ-3 100 - 95,9+2,7 96,3+2,7 108,6+1,4 97.6+ 1.8 89,0+5,1 94,6+ 2,5 74.6+8,7 92,9+7,0

200 92,4+3,6 96,1+1,9 .90,8+5,8 97,9+ 5.8 84,2+7.0 103,2+16,4 79,1+3,2 86,3+1,8

ФГ-4 100 60,6+8,1 78,7+3,2 80,7+5,6 85,7+ 1,6 83,3+2,2 67,7+ 2,8 49.2+5.0 104,8+4,9

200 ■47,2+1,1 64.0+5,0 66,3+6,2 76,9+ 9,4 65,9+2,1 48,8+ 1.6 32,2+4,0 97,3+2,8

ФГ-5 100 75,9+3,2 92,2+0,6 92,5+5,2 78,1+ 3.1 72,7+3,2 49,2+ 1,4 29,1+1,5 96,8+5,4

200 61,8+1,8 77,8+3,6 71,1+3,0 55,0+ 4.2 62,1+3,2 . 28,8+ 2,2 5.0+0.0 98,3+3.5

- Iii -

растений.

Последним этапом в этой цепочке исследований было изучение действия фитотоксинов на изолированные ткани растений. Для этого диски из ткани корнеплода свеклы помещали в растворы фитотоксинов. Результаты опыта, представленные в табл. 4, показывают резкое увеличение оптической плотности растворов под действием ФГ-1 и ФГ-2. Наблюдаемое усиление выхода антоцианов свидетельствует о наруиении проницаемости клеточных мембран, fíe исключено, что подобное действие фитотоксины оказывают и на проницаемость мембран клеток пшеницы.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать заключение, что выделенные фитотоксины гриба Septorta nodorum Berk, являются ховяин-неспецифичными. Эти вещества не являются первичными детерминантами, необходимыми для возникновения болезни. В то же время фитотоксины играют важную роль- в патогенезе септориоза, так как способствуют развитию заболевания при поражении грибом взрослых растений пиеницы и при заражении семян, ингибируя их прорастание и рост проростков.

т

к : 1

Рно,4 Валяние фитотоксивов на .степень поражения растений: Пшеницы, инокулированных споровой суспензией гриба З.пойогит (изолят 85-254) г '

Таблица 4

Влиини? фатогокс яков Я посЮгшп на выход шггоцианов , кз тканей свеклы 8е1а уи1еапз

■ Вариант '.

ед. оптической плотности

.Контроль -. «Т-1 «Г-2

вг-з «г-*/.:: 0Г-5 , -

0.35 ¿ 0,04 1,63 + 0,20 1,32+0,02 0.36 +0.03 0,46 + 0,04 0,45 +0,05

- 21 -ВЫВОДЫ

1. фоведекнш исследования показали, что природные изоля-?ы возбудителя септориоза пшеницы гриба Septoria nodorura Berk. (83-6, 83-30, 538 В, 176 Е, 143 Г, 26 Д, 101 Д, 85-254, 78 Ю при культивировании их в течение 14-21 суток на модифицированной среде ¡Гриза продуцируют метаболиты, обладающие фитотоксич-ными свойствами.

2. Изучены условия экстракции, очистки и фракционирования фитотоксинов из культуральной среды и мицелия гриба S, nodorum о помощью тонкослойной, препаративной и колоночной хроматографии. Установлено, что лучшее разделение фитотоксинов происходит в системе хлороформ - этилацетат (5:1). Дяя дальнейшей очистки могут быть использованы системы петролейяый эфир - этилацетат (1:1) и бензол - уксусная кислота (3:1). Ка основе полученных данных разработаны схема препаративного выделения фитотоксинов гриба S. nodorum ив культуральной среды и методика их количественного определения с помощью жидкостной хроиатографии высокого давления.

3. Из культуральной среды гриба S. nodorura выделены препаративно и изучены пять фитотоксичных метаболитов: ОТ-1, ФГ-2, ФТ-3, ФТ-4 и ФГ-5, различаюидасся по величине Rf, окраске в видимом свете, флуоресценции в ультрафиолете, способности изменять окраску под действием хлорного зге лева, максимумам поглощения, растворимости. '

По своим свойствам ФГ-5 и ФГ-З Слизки соответственно фэтотоксину меллекау я одному из его производных, ФГ-1 и ОТ-2 -септорину. Природа ФГ-4 не установлена. •

4. Синтез фитотоксинов наблюдается при культивировании гриба" S. nodorum на жидкой н агаризованной питательной среде Spuaa, а таю» картофэльпо-декстрозном агаре как в термостате (темнота), так и в климатической камере (1б-часовоЯ фотопериод), Однако набор фитотоксинов, их соотновэние в обдам комплексе и содержание каждого кз них в культуральнрй среде и иицелии в значительной степени зависит от природы шзолята и условий его культивирования.

5. Показано, что вшогопатогевные природные изоляты 176 Е,

101 Я, 538 В и 85-254. гриба 5. посЬгит отличаются повышенной способностью к продуцированию фитотоксинов, в том числе ФГ-2 (176 Е, 101 Д, 538 Б), ФГ-3 (176 Е, 85-254), ФГ-4 (638 Б, 85-254) И ФГ-Б (176 Е, 101 Д, 538 Б, 85-254).

Слабопатогенные изодяты 25 Д и 143 Г уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов.

6. Выявлено, что' пикноспоры высокопатогенного иэолята . 176 Е содержат весь набор фитотоксинов, а слабопатогенного 25 Д - ФГ-3, ФГ-4 и ФГ-5. При прорастании спор наблюдается усиленный синтез всех фитотоксинов и их секреция в окружающую ин- ■ кубационяую среду. Не исключено, что подобный процесс может происходить и во время прорастания спор на листьях растений пшеницы.

7. В опитах с очищенными препаратами фитотоксинов установлено, что наиболее сильное ингибирувдее действие на рост корней :

. и колеоптилей пшеница оказывают' ФГ-5 и ФГ-4. Подавление роста : корней наблюдается при концентрации 60 мг/л и усиливается с увеличением концентрации. Токсическое по отношению к проросткам пяеницы действие метаболита ФГ-3 выражено слабее и практически не изменяется с увеличением концентрации. Из ФГ-1 и ФГ-2 четкие ингибируюкие свойства проявляются только у метаболита ФГ-2. :

8. Ингибиружщие свойства фитотоксинов -проявляются достаточно хорошо как на восприимчивых (Саратовская 29, Саратовская ■ 36, Саратовская 46), так и на относительно устойчивых (Артур, Са^ап) к септориозу сортах пшеницы. Существенной разницы в реакции указанных сортов на фитотоксины не обнаружено.

■ Показано, что фитотоксины способны в той или иной степени подавлять рост проростков не только пшеницы, на которой паразитирует гряб Б.пос1огшя, но и других сельскохозяйственных культур, таких как ячмень и рис. •

9. Препараты фитотоксинов, продуцируемых грибом 3. пойогш», при нанесении их на растения или изолированные листья пшеницы не способны вьеывать внешние симптомы заболевания, характерные для сапториова. Шесте'с тек установлено, что фитотоксины, осо бенно ФГ-1, ФГ-2 и ФГ-6;- при добавлении их/в споровую суспензию могут повывать степень поражения инокулированных растений.

Шменение двухнедельных проростков пшеницы в растворы фи-

- 23 -

тотоксинов приводит к пожелтению и увяданию листьев.

1Ьд действием фитотоксинов, особенно ФГ-1 и ФГ-2, происходит увеличение проницаемости мембран а тканях свеклы.

10. Полученные данные дают возможность сделать заключение, что обнаруженные и выделенные из среды культивирования гриба S. nodorum физиологически активные вещества ( ФГ-1, ФГ-2, ФГ-3, ФГ-4 и ФТ-5) являются хозяин-кеспецифическими фиготоксинами, играющими вполне определенную роль в процессе патогенеза септо-риоза, особенно на самых ранних его этапах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кобыльский Г. И., Бочарова Е. Е Изучение токсинообразо-вания у различных иэолятов гриба Septorla nodorum Berk. // Вопросы защиты сельскохозяйственных растений и животных от болезней: Сб. научных трудов НИСХИ, 4 1. -Алма-Ата, 1989. -С. 75-80.

2. Кобыльский Г. И., Бочарова Е. а Фитотокскчные метаболиты, продуцируемые различными изолятами гриба Septorla nodorum Berk. // Тезисы докладов VIII конференции по споровым растениям Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1989. - С. 143.

3. Кобыльский Г. ¡Í., Бочарова Е. В. Фитотоксины гриба Septoria nodorum Berk, и их возможная роль в патогенезе септо-риоэа // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. - Алма-Ата, 1989. - N. 7. -С. 40-41.

4. Бочарова Е. В., Кобыльский Г. И. Фитотоксины гриба Septorla nodorum Berk. // Сизиолого-биохимичесгаю и генетико-се-лекционные основы иммунитета сельскохозяйственнх растений к грибным болезням: Тезисы докладов научно-практической конференции. - Уфа, 1990 (в печати).

5.' Кобыльский Г. И., Бочарова Е. В, О природе фитотоксинов гриба Septoria nodorum Berk, и возможности использования их в селекции шаеницы // IX Всесоюзное совещание по иммунитету. Тезисы докладов. - Шнек, 1991. -Т. 2. -С. 200-201.

Подозсяно в печать 20.12.91. Заказ 644 Формат, 60x90/16 ;. Тирах НО

; Москва. Тквдграфйя ВАСХ-Ш