Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ФИТОТОКСИНЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM BERK. И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ СЕПТОРИОЗА

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ФИТОТОКСИНЫ ГРИБА SEPTORIA NODORUM BERK. И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ СЕПТОРИОЗА"

А-Зоз-ГЗ

ПХУЛАГСТВИШАЯ ШНИССИЯ СОВЕТА НИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ГЛАВНОЕ НАУЧНО- ПГОЮЮЛСТЕЕШОЕ УПРАВЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ВОЕСОШШМ НАУЧНО ИОСЛЕЛОВАТ ЕУН^СКИЯ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

На права* рукописи

БОЧАРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

УДК 579. 64: 581. 2+632. 4

ФИТОТОКСИШ ГРИБА SEFTORIA NODORUM B£RK. И КХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ СЕПТОРИООА

(06,01,11 - зашита растений от вредителей и Оолееией)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

ГОЛИЦННО 1991

Райота выполнена в Научно-исследовательском сельскохо-

■■ с<0:

¿яйственном институте Главагробиопрома при Госкомиссии Совета Министров СССР по продовольствию и вакупкам.

Научный руководитель: кандидат биологических наук.

доцент Г. И. КОШЛЬСШЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А, И, Уинов

кандидат сельскохозяйственных наук М. К Ваеецкая

Ведущее учреждение - Северо-Кавказский научно-исследовательский институт Фитопатологии

, Защита диссертации состоится 1992 г.

в /У часов на заседании специализированного совета [всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии.

Отзыв на автореферат просим направлять в двух экземпляра* по адресу: 143050, Московская область. Одинцовский район, а/а Вальиие Вязе»«, ВНКИФ. специализированный совет К, 120.66.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕНИИФ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь спе циалиаированнл го совета,

И. Н. Яковлева

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, траление зерновых культур селто-риоэоы наблюдается во многих странах мира. Проведенные в нашей стране исследования показали встречаемость этого заболевания на значительной территории СССР, при этом одним из основных возбудителей является гриб Septoria nodorum Berk. (Васецкая'и. ■ др., 1083; Супрун, 1990; Хасанов, 1090). Потери урожая, вызываемые заражением шпеюшы септориоаок, могут достигать 30-40Х (Mittermeier, Hoffman, 1985>.

Известно, что многие фитопатогегшые микроорганизмы способны продуцировать физиологически активные вещества, играющие значительную роль в процессе патогенеза. Такими факторами па-тогенности являются ферменты (Collroer, Keen, 1966), гормоны (Daly, Knoche, 1976) н токсины (Daly et al., 1983; Mitchell, 1981). Дм некоторых патогенов Сила найдена корреляция, между патогеиаоотыз и образованием токсинов к показана высокая специфичность действия последних в отношении растения-хозяина (Seheffer, Livineston. 1S84). •

При изучении возбудителя септориоза Septoria nodorum Berk, в чистой культуре также были выделены вещества с фитотоксичныш свойствами. Это - охрации (Bousquet, Skajennikoff, 1974), сеп-торкн (Devys et al., 1678) н некротический токсин (Kent, Strobel, 1976). Однако многие вопросы относительно.их роли в патогенезе септориоза до конца еда не раскрыты. Не установлено, в частности, существует ли взаимосвязь медду патогенностью иао-лятов гриба септория и способностью их к синтезу фитотоксинов, как влияют условия культивирования гриба на токсинообрааованиэ и возможно ли использование токсинов в селекции растений пшеницы на иммунитет к септориозу. В этой связи изучение фитотонси-нов у гриба S. nodoruei и их роли в патогенезе септориоза представляет большой научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Цель» наших исследований являлось изучение токсинообразоваяия у природных изолятов гриба Septoria fwdorum Berk., выведенных на территории Казахстана, к его роли в процессе патогенеза септориоза.

В задачи исследования входило;

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧ 'ЛЯ БИБЛИОТЕКА Моск. (BJ)- a-.'-ss*. академии

- г -

- изучение качественного состава и биологической активности токсичных метаболитов, продуцируемых грибом 5. nodorum;

- отработка методов препаративного выделения фитотокеинов гриба S. nodorum;

- анализ зависимости токсииообразования от происхождения изо-лятов гриба 5. nodorum и условий их культивирования;

- поиск возможной связи между патогекностьо изолятор гриба S. nodorum и образованней фитотоксинов;

- проверка специфичности токсического действия метаболитов гриба септория и возможности использования их для оценки сортообразцов пшеницы на устойчивость к сепгориоэу;

- изучение роли фитотоксичнщс метаболитов в реакции взаимодействия патогена и растения-хозяина.

Научная новизна работы. Впервые проведено изучение образования фитотоксинов у природных югаммов гриба S. nodorum, изолированных с пораженных растений пшеницы на территории Казахстана. Из культуральной среды гриба выделены препаративно и изучены пять фитотоксичных метаболитов; ФГ-1, ФГ-2, ФГ-З, ОТ-4 и ФГ-б. в том числе один (5Т-4), не описанный ранее. С помощью жидкостной хроматографии высокого давления проанализирована ва-висимость токсинообразования от природы изодяТа гриба и условий его культивирования. Впервые показано, что высокопатогенные природные изолдты 176 Б, 101 Д, 638 Б и 85-254 отличаются повышен кой способностью к продуцированию фитотоксинов, Слабопато-геаные изодяты 143 Г и 25 Д уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов. Установлено, что при прорастании спор наблюдается усиленный синтез фитотоксинов и секреция юс в окружающую инкубационную среду. Опьягами с чистыми препаратами фитотоюакнов выявлена неспецифичность кх действия на растения пшеницы. Высказано предположение, что обнаруженные фитотоксины гриба S. по-dortun, хотя и являются хозяин-иеспецифичньыи, могут играть вполне определенную роль в процессе патогенеза сес^ориоэа, особенно на самых ранних его этапах.

Практическая ценность работы. В результате исследований подобраны условия к разработана схема выделения токсинов из культуры гриба Septoria nodorum Berk. Выделены фитотоксшш, которые могут быть использованы в работе при селекции растений на

'- з -

устойчивость с помощью культура клеток и тканей. Препараты фи-тотоксинов переданы в Институт молекулярной биологии и биохимии АН КааССР для изучения их действия на культуру кяеток пшеницы и отбора устойчивых к еепториозу линий.

■Разработаны "Штодиха определения фитотоксинов гриба Septena nodorum Berk, с помощью тонкослойной хроматографии" и "Методика количественного определения фитотоксинов гряб^ Septena nodorum Berk, с помощью жидкостной хроматографии высокого давления", которые могут использоваться специалистами в области фитопатологии, молекулярной биологии и биохимии иммунитета растений.

На основе получении* данных составлены "Рекомендации яо направленному синтезу фунгицидов, предназначенных для борьбы с еепториоаоы".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференции молодых ученых во ВККИФ (1986), научно-теоретической конференции НИСХЙ (1988), VIII конференции по споровым растениям Средней Азии я Казахстана (Ташкент, 1689). II Всесоюзном совещании по фмзиолого-биохимическим основам иммунитета сельскохозяйственных растений к грибным болезням (Уфе, 1990). ' Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 179 страницах машинописного текста, включает 22 таблицы и 13 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 4 глав собственных .исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Список литературы включает.169 источников, в той числе 130 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали природные иаоляты гриба Septoria nodorum Berk., рааличаквдиеся по происхождению, патогенности и морфолого-культуралъным признакам, полученные из лаборатории "Биологии септориальных грибов" НИСХИ.

Культуру гриба выращивали иа жидкой и агаризованной модифицированной среде фриза и твердой картофельно-декстрозной сре-

де в течение 14 и 21 суток. Для выделения фитотоксинов готовили зтилацетатныэ экстракты среды культивирования, мицелия, покоя пойся и прораставши* пикноспор гриба.

Проращивание спор проводили в течение 20 часов в среде TBK (Dunkle, Allen. 1971).

Дхя обнаружения биологически активных веществ экстракты среды культквирования и мицелла разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Пятна, от печенные на хроматограыме под УФ--светом (Е54 нм), вновь экстрагировали этилацетатом и проверяли на биологическую активность с помощью биотеста, в качестве которого использовали семена пшеницы Саратовская £9.

Идентификацию фитотоксинов осуществляли по ■ качествен»* реакциям (реактив Фолина-Чиокальто и хлорное желеэо), величине Rf в различных системах разделения и УФ-спектрам поглощения.

Для наработки, фнтотоксинов использовали препаративную ТСХ и разделение их на колонке с LH-20 сефедексом.

Количественное определение фнтотоксинов в этилацетатном экстракте проводили с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на хроматографе система "Gold" (Beckmari) по разработанной нами методике.

Биологическую активность и специфичность действия выделенных препаратов фитотокскнов научали с использованием в опытах семян пшеницы Саратовская Саратовская 36, Саратовская 46 (восприимчивые к септориоау), Артур и Castan (относителько устойчивые) » ячмене Еайиевек, риса Kan to-51 н мала Победа 104.

Способность фитотоксинов вызывать у растений симптомы поранения, характерные для септориова, определяли в опытах о интактными и изолированными листьями шпениш Саратовская 29.

О действии фитотоксинов на мембраны растений судили по выходу антоцианов иа дисков свеклы, помещенных в растворы фитотоксинов (Методы экспериментальной кинологии, 1982).

Результаты исследований обрабатывали математически. Вычисление среднего арифметического (М> и средней квадратнческой сшибки (ш) - проводили по формулам, описанным Р.Х Кармолмевш (1971). Корреляционный анализ проводили по программ "Statistical Graphics System" (USA;, 1085-1066) для персонального кошью-тера IBM PC/AT,

■ • - 5 -РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖШЖЕ

Выделение ■ очистка и идситификацн'я фитотоксичных метаболите» возбудителя септориоаа тиеяицы. Шрвш предварительные эксперименты показали, что при культивировании гриба S. nodorum в течение 21 суток на жидкой питательной среде 5риза в Heft происходит накопление ((«тотоксичных компонентов. Фильтрат куль#у-ралъаой среда, вызывал подавление роста корней и коле опт иле Я пшеницы, фи разведении среды культивирования водой в соотношении 1:1 и 1:4 ингябируящкй эффект сохранялся, котя естественно и веско ль ко снижался.

В связи с этим были проведены более детальные исследования.

Для выделения биологически активных веществ использовали ;этилааетатнне экстракты культуральной жидкости и мицелия. При выборе оптимальных условий разделения экстракта и выделения метаболитов была проведена работа с несколькими системами растворителей: хлороформ - этилацетат (5:1), петролейный эфир - этил-ацетат (1:1) х бензол - уксусная кислота (3:1).

При разделении суммарного зтилацетатного экстракта культу-тральной среды изолята 83-6 гриба S. nodorum с помощью ТСХ в указанны; системах растворителей было обнаружено от 11 до 13 компонентов. Наиболее четкое раа деление и выделение фитотокси-:ческих веществ происходило в системе хлороформ - дтилацетат (5:1), которая и Quia выбрана в качестве основной для дальнейшей работы.

Сравнительное изучение качественного состава ; метаболитов мицелия и культуральной среды кэолята йэ-б гриба S. nodorum показало. что они близки между собой, хотя в среде обнаружено 12 компонентов, а в ккцелиальном материале - 11.

Из данных, представленных на рис.1, видно, что экстракт культуралыюя среды содержит в своей составе вещества, иягиби-рущке рост как корней, так к колеоптилей пшеницы. Наиболее активные метаболиты сосредоточены в воках с RT 0,00-0,25; 0.2Б--0,43; 0,60-0,80 и 0,60-1,00. Реют корней они подавляли на 17,0; 14,0; 14,3 и 29.ЭХ, а колеоптилей - на £0,5? 9,6; 19,4 И 25,22 соответственно. Основная часть метаболитов, входящих в

1Л

Э 63-6

90

во

[РЧР"

ы ез-6

№1

П

Э 85-254

100 90

60

70

60

и

и

и 65-254

О 0.4 1,0 0 0,4 1,0 0 0.4 1,0 0 0,4 1,0

корень колеолтиль корень колеоптиль

Рис. X Гистограммы биологической активности метаболитов изолятов гриОа г.поаогиш , выделенных из иульту-ральноЯ среды О) и мицелия (М) с помощь о ТСХ

перечисленные воны, обладала фиолетовой и голубой флуоресценцией в УФ-свете. Среди веаэств, выделенных из мицелия гриба, достаточно высокая биологическая активность обнаружена у метаболитов на вовы о ИТ 0,41-0,61, обладаниях вдеднотелесноя и светло-голубой окраской в УФ-свете. Рост корней и колеоптилей пшеницы они подавляли на 19,0 м 17,92 соответственно (рис.1). Другие еоны обнаруживали чслабую биологическую активность, что, возможно, связано с нивкой концентрацией входящих в состав этих зон метаболитов вследствие секреции их в культуралъную среду.

При использовании изолата 85-254 анализ этилацетатвых экстрактов с помощью одномерной ТСХ позволил выявить в среде 13, а в мицелии - в метаболитов, различавшихся по ЯГ, окраске в видимой свете и флуоресценции в УФ-свете. Определение их биологической активности показало, что наибольшей 4мтотоксической активностью в акстракте кульгуральной среди обладают метаболиты с ЯГ 0,76-1.00 (рис.1). Вещества, присутствующие е этой зоне, ин-гибпровали рост корней й колеоптилей пшеницы на 75,8 и 44,4Х соответственно. Подавление роста проростков тиеикда элюатами из других зон было аначетелько слабее.

Более высокая биологическая активность обнаружена у метаболитов, экстрагированных из ющелиахьной массы гриба. Как видно из рис Л, токсическое действие ка рост проростков пшеницы оказывали вещества, присутствуйте практически во всех зонах хроматограммл. Наиболее сильное ингиОирушие действие на рост корней оказывали вещества нэ зон с РГ 0,64-1,00 (43,11), 0,28-0,44 ( 38,61) н 0,13-0,26 (30.ах). Рост колею птидей при этом уменьвался на 24,3-26,8*.

Подобные данные в отношении метаболитов гриба септория были получены и в опытах с экстрактами культуральной среды и мицелия нэолятов 538 Б, 76 Д. 83-30. 143 Г и 25 Д.

Многократные опыты по экстрагированию биологически активных веществ из мицелиалъной массы и среди культивирования различных иэолятов гриба септория позволили нам остановиться на 6 метаболитах, свойства которых были изучены более детально. Выделенные метаболиты были обозначена как фитотокскны (®Г) -4Т-1. ОТ-2, <И-3, ФТ-4 и ФТ-5. Из данных, представленных в табл. 1, видно, что эти вещества в значительной степени разлица-

- в -

шея мелау собой по окраске в видимом и флуоресценции в УФ-лве-те, величине (?Г для трех систем растворителей, изменению окраски при обработке хроматограым проявляющими реагентами н УФ-спектрам поглощения.

По изменению окраски пятен при опрыскивании хроматографы реактивом Фалина-Чиокальто четыре ((мтотоксина, а именно ФТ-1, ФГ-Е, фг-Э и ФГ-б, можно отнести к классу фенольных соединений (табл.1). Это подтверждается и реагащей с хлорным железом. Обработка хроиатограммы совместно перекисью водорода и раствором хлорного железа позволяет выделить фенольныв веяеетва, относящиеся к группе куыаринов или кзокуиаринов. Три фитотоксина (ФГ-2, ФГ-3 и ФГ-5) показали положительную реакцию при проведении специфического определения кумариков.

Необходимо также отметить, что выделенные фитотоксины чувствительны к воздействию света УФ-спектр фитотоксинов, выдержанных в течение двух суток при комнатном освещении, полностью изменялся. Также изменялась и флуоресценция в УФ-свете у ФГ-1, ОТ-2 и ФГ-5 - дополнительно к основному появлялось фиолетовое свечение.

Все выделенные фитотоксины хорово ' растворит в этиловом спирте, этиладатате и хлороформе. В воде хорош растворяется только ФГ-4, слабо - ФГ-3 и ФГ-5, не растворяются - ФГ-1 и ФГ-2.

Работами французских исследователей было установлено, что одним из фитотоксинов гриба септория является меллеин - вещество .изокуизрквдвой природы, дахицее вишевую окраску с (Речуэ вС а1., 1974), Сопоставление полученных нами характеристик выделенных метаболитов гриба септория позволяет ОТ-Б отвести к меллеину, а ФГ-3 - к одному из его производных.

Среди выделенных веществ два (ФТ-1 и ФГ-2) имеют лимон-но-желтую окраску в видимом свете, абсорбируют а уф-свете и проявляются под действием хлорного железа, то есть ведут себя подобно септорину, второму из известных фитотоксинов возбудителя септориоаа (Оечуз еЪ а!., 1076). Однако, в отличие от сеп№ рина, выделении« вещества раствориш в хлороформе и имеют крис-> техническую, а не аморфную форму. Поэтому трудно сказать, является лиодно из указанных векств септорином. Не исключено, что в процессе выделения к очистки вещества изменяют свои

Таблица 1

Характеристики фитотокеичньа метаболитов гриба &>р1ог1а помогши Вегк.

Зито- Окраска КГ в системе* Максимум* поглощения Изменение окраски под действием:

токеин видишй | УФ-с вет 1 2 3 Сии) и ГеСЦв

свет метанол этанол Фолина- 502 мета- +12 РеС1з

Чиокадьто ноле (водн.)

ОТ-1 лишкда- те«носерая 0,21 0,52 0.64 205, 333 206. 331 ск^яя ' желто- -

келтая 2Э7, 364 коричневая

ФГ-2 лимонно- текшее рая 0,34 0,45 0,6О 226, 300, зеленая коричневая желто-

иелтая 366 коричневая

«т-з голубая 0,34 0,41 0,53 243, 313 245, 316 синяя пурпуровая пурпуровая

ФГ-4 фиолетовая 0,55 0,35 0,51 242, 305 243, 306 - - -

«•-5 - голубая 0,83 0,63 0,73 га, 313 245, 315 синяя пурпуровая ПурнурОВЛЯ

Примечание: * - 1 - хлороформ - этилацетат, 5:1

2 - петролейний эфир - этиладатат. 1:1

3 - бензол - уксусная кислота, 3:1 (-) - окраска отсутствует

- 10 -

вюяста», так как чувствительны к воздействию света.

ГЬка не удалось с помощь» качественных реакций определять к какому классу соединений относится фитотоксин ОТ-4. При ис-польвовании указанных выше проявляющих реагентов окраска данного вещества не изменялась. Среди описанных в литературе фкто-токсиков гриоа септория веиества, подобного ФТ-4, не встречается.

Таким образом, в процессе работы из культуры гриба S. nodo-rum были выделены пять веществ, обладащих фиготоксической активностью, к проведена их идентификация.

Для выполнения дальнейших исследований был необходим метод, позволяя®!» определить точное содержание фитотоксинов в суммарном экстракте. Используя в качестве метчиков препараты фитотоксинов, выделенные в процессе работы, нами была разработана методика их разделения и количественного определении с по-моюю жидкостной хроматографии высокого давления. № представленной хромзтограмде (рис.2) видно, что с помогаю данного Метода можно довольно четко разделить все S фитотоксинов. При разработке методики такжг установлено, что в суммарном экстракте Присутствует микофеноловая кислота (1ЯЙ), которая ранее была Обнаружена в культуральной среде гриба септория (Devys et al.. i960).

Препарат нвное_м по дуче ние., фитотоксинов гриба S. nodortim. Применение фитотоксииов для научения характера взаимоотношений между возбудителем септориоэа и растением-хозяином требует наработки ИХ В препаративных количествах, что в свою очередь вызывает необходимость иметь больше объемы Культуральной среды и как минимум в 3 posa до льве по отношению к количеству среды этилацетета В свяви а «ИМОылк проведены опыты по лиофкльному высушиванию культуральной среды и использованию сухого концентрата в качестве источника фитотоксинов.

Установлено, что при лиофнливации фитотоксическая активность метаболитов сохраняется. Однако длительной и многократной экстракцией ; не удается достичь полного извлечения фитотоксинов иа лиофилиаированной среды. Лучше, как показали эксперименты, перед экстрагированием сухой материал среды разводить в минимальном количестве воды или исходную культуральную жидкость

АЕСОВЦИЯ

Р^Зч? Разделение фитотоксиша нэ кульгуральной жидкости грибй сйл'Гория с помочью *кл,К!зстас1й хром&тйгрйфиа

концентрировать в 3-4 раза, не добиваясь полного высушивания.

Экстракция среды зтилацетатом приводит к извлечению крон» фитотоксинов и других веществ. При разделении экстракта на тонкослойной хроматограмме значительное количество окрашенных веществ остается на старте, прочно связываясь с сидик&гелем и затрудняя разделение. Особенно много таких веществ в экстракте мицелия. Для удаления их целесообразно использовать колонку с сухим силикагелем для адсорбционной хроматографии. При нанесении экстракта на колонку (0.9x5,0 см) и пропускании через нее этилацетата фитотоксины выходят с первыми 50 мл, а темноокра-юенные пигменты остаются на колонке,

теле очистки суммарного экстракта приступали к выделении фитотоксинов. В процессе работы была составлена схема препаративного получения 5 фитотоксинов из культуральноя лмдкооти гриба S. nodorum. осноьные этапы которой представлены на рис. 3. Дня очистки 4Т-1, ФГ-4 и W-5 сочетали хроматографию в различных системах разделения, а для 5Т-2 и ФТ-3, имеющих близкие величины Rf, применяли колонку с LH-20 сефаяексом. Ситотокоины ФГ-1, ФГ-2, iT-4 и ФГ-5 удается получить в порошкообразном состоянии, а СТ-3 - только в виде маслянистого остатка. Полученные фитото-ксины хранили в холодильнике при температуре с до использования в дальнейшей работе.

фи разделении на колонке смеси компонентов ФГ-2 и ФГ-Э произошло деление ST-2 на две фракции. Одна фракция содержала собственно ФГ-2, а другая - вещество, которое обзначили как сер. 0,34, Содержание итого вещества учитывали при проведении количественного анализа при изучении вопросов, связанных с ток-синообразоаанием гриба септория.

Изучение токсниообразования у гриба Septoria nodorum Berk. Известно, что на образование фитотоксинов при выращивании гриба в чистой культуре оказывает влияние состав среды и условия культивирования (Dasgupta, 1086). Исходя их этого, мы провели анализ синтеза фитохоксиноз при культивировании гриба S. nodorum на различных средах в условиях климатической камеры (свет) и термостата (темнота). В данном опыте использовали иэо-лят 85-254 гриба S. nodorum.

Результаты экспериментов показали, что гриб S. nodorum уяв

Культурам нал годкость

| довести £01 наШ до рй 6,0 Экстракция этклацетатом

* | выпарить под вакуумом при температуре М6*С Маслянистый осадок

растворить в этилацетате, очистка на колонке с сухим силикателеи для адсорбционной хроматографии Препаративная 1СХ, хлороформ-этилацегат, 5:1

обнаружение 8 УФ-свете (254 нм) --,

«-1, ВТ 0,16-0,21 (абсорбирует, серый)

ФГ-4, И1 0,55-0,60 (фиолетовый)

I

ФГ-5, КГ 0,65-0,90 (голубой)

ФГ-2 и ФГ-3 РГ 0,34-0,39 (серо-голубой)

ЭЛГЮИРОВАТЬ ЭТИЛАЦЕТАТОЫ

т

Концентрировать; - Препаративная ТСХ-

Сеяэол-уксусная кислота, 3:1 «Г-1, № 0,64

петролейный эфнр-этилацетат, 1:1 «-4, ИГ 0,25-0,30 ФГ-5, 0,68-0,80

Выпарить до сухого остатка; У^матография иа колонке с Ш-20 сефздексом, растворитель - этанол; препаратиеная ТСХ, б&нзол -уксусная кислота, 3:1 4Т-2, ЕГ 0,60 «Г-3, 0,53

Рис, 3 Сгеиа препаративного выделения фитотоксиное гриба 5. гкхйгит из культуралькой среды

в течение 14 суток способен продуцировать весь комплекс фито-токсинов, которые обнаруживаются и в среде культивирования, и в мицелии. В зависимости от условий выращивания (темнота или сеет) и состава среды наблюдалось различное соотношение между количеством фитотоксинов в культуральноя среде и в мицелии. Установлено, что в условия* климатической камеры секреция Фитотоксинов в среду повышается, однако при этом снижается количество СТ-Е. Наибольшее количество фитотоксинов образуется при выращивании культуры гриба на жидкой модифицированной среде Фриза.

13а основании полученных данных при проведении дальнейших исследований культуру гриба выращивали на жидкой среде Фриза в термостате.

Изучение фсзкояогин л ¡биохимии фитопатогенных микроорга-кизиэв показало, что их способность к продуцированию ферментов, "витаминов, токсинов и других физиологически активных веществ во многом определяется природой штамма или изолята. Для некоторых патогенов установлено существование прямой зависимости патоген-шостм от образования токсинов (Lepoivre, 1682).

Идя того, чтобы установить каким образом связаны патоген-«ость и токсинообразованне у гриба S. nodorum, были взяты 6 иво-аятов, различающихся по происхождения и морфолого-культуральным ■признакам, и проведено сравнительное изучение. Среди выбранных е .опыт иэолатов 17В Е, Б38 Б, 101 Д и 85-254 относятся к высо-тешаггогеиным, а25Ли143Г-к слабопатогенным.

Подученные данные показывают, что природные иэоляты гриба септорив продуцируют все определяемые фитотоксины, но значительно -различаются между собой по их количеству. Так, меньше всего о&равуется ФЕ-1, разницы в содержании которого между высоко- а слабопатогенными иэолятами практически нет (табл. 2)., Во довода ®Г"3 и ®Т-4 шжш сказать, что эти токсины в значительных исэятгегствак *крисугствуют в среде как высоколатоге н ньгх <176 !В, ЪЗВ В и 85-264), так и слаболатогенного маолята 143 Г. В отношен ни дву« других фитотоксинов - W-2 а ОТ-5. можно сказать, что а телом ъысокопахогенные иэоляты образуют ж z -больших количества*, чем слаОопатогенные (за исключение« яюояята 86-254 по ФГ-г). ■ ' '

Таблица 2

Содержим» фкгагаксиков в среде культивирования и шшедик различных изолятов гриба Б. гюйогудт

(иг/г сухого мицелия)

Иаодвт Зитотоксииы сер. 0,34 ОД

«Г-1 ОТ-2 ет-з ФГ-4 «Т-5

Культура» ная среда *

176 Е 0,03840,017 0,555+0,127 0,68910,203 0,224+0,061 0,480+0,163 0,196+0.084 0,022+0,007

101 Д 0,034+0,004 0; 195+0,124 0,33851,075 0,072+0,022 0,212+0,116 0,032+0,007 0,014+0,004

538 В 0,026+0,015 0,257+0,028 0.238+0,037 0,577+0,122 0.054+0,026 0,078+0,006 0,013+0,001

85-264 0,023+0,019 0,048+0,030 0,534+9,186 0,469+0,179 о;080+0,ооз 0,116+0.029 0,054+0,037

143 Г 0,020+0,008 0,034+0, Ю1 0,476+0,103 0,381+0,076' 0,023+0.004 0,031+0,007 0,043+0,015

25 Д 0,028+0,003 0,120+0,023 0,080+0,031 0.076+0,030 0,026+0,016 0,016+0,004 о,оое+о,(ю§

Инцелий

176 В 0,009+0.001, 0,018+0,001 0,021+0,002 0,019+0,001 0,348+0,233 0.078+0,005 0,001+0,000

101 л . 0,001+0,000 0,008+0,001 0,026+0,001 0,005+0,000 0,032+0,001 0,014+0,000 0,001+0,000

538 Б 0,016+0,006 0,070+0,015 0,014+0,002 0.039+0,007 0,040+0,016 0,095+0,052 0,001+0,001

86-254 0,007+0,003 0,006+0,001 0.019+0,006 о,оег+о,оо5 0.016+0,006 0,010+0,005 0,001+0,000

143 Г 0,009+0,004 0,014+0,003 0,057+0,003 0,067+0,002 0.016+0,004 0,036^0,021 0,008+0,001

05 Д 0,011+0,003 0,00251,001 0.003+0,001 0,003+0,001 0,006+0,003 0,0055), ООО 0,0001+0,00

- le -

На основании подученных данных можно сказать, что патоген-ность гриба септория не зависит от образования какого-либо одного Фктотоксина, Учитывая изменчивость и легкую приспосабливаемое« возбудителя септориоэа к изменяющимся условиям внешней среды, можно предположить, что важным для патогенности является сам «Такт присутствия фитотоксииов в культуре гриба, взаимодействующего с растением-хозяином.

Необходимо также отметить, что содержание фитотоксииов в мицелии было значительно ниже, чем в культуральной среде (табл. 2). Ito-видимому, это объясняется тем. что синтез Фитотоксииов сопровождается активной экскрецией их в среду, что мо-)«ст «меть большое значение в процессе патогенеза септориоэа.

В предыдущих опытах мы использовали 14- и 21-суточную культуру гриба S.nodorum. При этом установлено, что с увеличением всграста культуру от 14 до 21 суток повидается количество фитотоксииов, накапливахщкхся в культурадьной среде,

Еместе с тем, хорошо известно, что для успешного развития патогена в растении очень важен начальный этап, связанный с прорастанием спор, Исходя из этого, мы попытались определить фитотоксины в пикноспорах гриба S. nodorum, находящихся в состоянии покоя, и при их прорастании.

Аяалнэ показал, что у высокопатогенного изолята ITS Е в опорах присутствуют все Б фитотоксияов, 'а у изолята 85-254 -ФГ-3 и 5Т-4. У сяаОопатогеиного изолята 25 Д в пикноспорах обнаружены ФТ-Э, W-4 и ФГ-б.

При прорастании спор в течение £0 часов наблюдается значительное увеличение количества все* фитотоксииов и их накопление в среде инкубации, в том числе и тех, которые в покояеихея спорах не обнаружены. Это говорит о том, что в процессе прорастания спор гриба S. nodorum происходит усиленный синтез фитотокси-нов и их экскреция в окружающую среду. Этот процесс, вероятно, имеет место и при прорастании спор гриба септория в инфекционной капле на поверхности растений.

Изучение роли фитотоксинов гриба септория в реакции взаимодействия патогена и растекии-хозяина, при изучении биологической активности фпотоксннов ш установили, что кнгибнрование роста проростков пшеницы наблюдается при концентрации 100 мг/д

и усиливается с увеличением концентрации.

Следуюиим этапом наших исследований било определение специфичности действия выделенных фктотоксиноа гриба S. nodoumw Данные, представленные в табл.3, показывают, что ингибиру*щее действие фитотоксшюв на рост корней проявляется достаточна хорош; как на восприимчивых, так н на относительно устойчивых к септориоэу сортах шгеницы. Существенной разницы в реакции указанных групп сортов не обнаружено. Ив 5 фктотоксинов ваибодьвей ингкбирутаей активностью обладаю ФТ-1 и ФГ-6.

Фитотокскны также вызывают вадердау роста корней ячменя к риса и практически не влияют на рос^ проростков маша.

Аналогичные данные получены и по действию фитотоксинов на рост колеоптилей.

Ревультаты проведенных исследований позволяют нам сделать вакЛЕчеиве о веспецифическом характере действия выделенных фн-тотоксинов гриба септория. В связи с этим, они, по-видимому, не могут быть использованы для оценки оортообраацов твеницы на устойчивость к септориоэу.

После определения специфики действия фитотоксиюв гриба : S. nodorum встает вопрос об юс участии в проявлении симптомов заболевания. Для ответа ев а тот вопрос были поставлены эксперименты, в которых иктактныв растения я изолированные листья пве-икцы обрабатывали чист)*» растворами фитотокскнов <200 мг/л), а также совместно со споровой суспенаией возбудителя септорноаа.

Доведенные исследования показали, что ни один из фито-гоксинов не вызывает каких-либо видима симптомов поражения, характерных для сеиториова. В то же врем, добавление в споровую суспенвив фитотоксинов ФТ-1, ФТ-2 и ФГ-5 приводило К увеличению степени поражения инокулированных растений ппеницы (рис.«,

; ; Другой опыт, в тоторм двухнедельные проростки пшеницы по-ыенаш в растворы фитотокскнов, показал, что под действием .ФГ-1» ФГ-2 к 4Т-Б происходит пожелтение и усыхааие листьев по -сравнению с контролен. ф* атом отмечено, что к концу опыта количество растворе в контрольном варианте было в 2-3 раза меньше,: чек в о гая то. На основании этого можно предположить, что 'фяготомсшш каким* то обравоы алия от на процессы водкогй обмена

Таблта 3

Влияние фитотокс-ивов гриба 5.пойогип па рост юркея различных культур (мина, в £ к контролю)

Концен- Ляеякца Ячмень Рис

ток- трация саратов- Саратов- Саратов- АРТУР СаэЬап Байяеиек КатЛо-51 Избе да 104

син (иг/л) ская 29 ска* 36 ская 46

«-1 100 96,3+1,а 82,4+8,3 79,1+4.2 00,4+11,1 93,2+9.2 106,2+ 6,9 85,5+6,6 90,8+4,3

200 80,1+2,6 91,0+3,8 72,4+3,9 91,6+ 4,8 90,8+2,5 ' 100,6+ 2,6 36,0+3.6 90,2+3,9

ФГ-2 100 83,3+2,0 84,0+2,2 90,1+2,8 94,6+ 4,4 ег.г+зл 95,2+ 5,0 76,8+3,4 110,9+2,2

200 61,412,8 80,7+2,6 81,2+1,7 89.7+ 2,6 75,8+3,1 81,7+ 6.2 62,2+8,6 114.5+3,5

ет-з 100 • 95,9+2,7 96,3+2,7 108,6+1,4 97.6+ 1,8 89,0+5,1 94,6+ 2.5 74,6+8,7 92,9+7,0

200 92,4+3,6 96,1+1,0 .90,8+5,8 97,9+ 6,8 84,2+7,0 103,2+16,4 79.1+3.2 86,3+1,8

«-4 100 ео,в+г,1 78,7+3.2 80,7+6,6 85,7+ 1,5 83,3+2.2 67,7+ 2,8 49,2+6,0 104,8+4,9

200 47,2+1,1 64,0+5,0 66,3+6,2 76,9+ 9,4 65,0£2,1 48,0+ 1,6 32.2+4.0 97.3+2,8

«Г-5 100 75,9+3,2 92,2+0,6 92,5+5,2 78.1+ 3,1 72.7+3,2 49,2+ 1,4 29,1+1.6 в6,8+5,4

гоо 61,8+1,8 77,«+3,6 71,1+3.0 .Б5.Р+ 4,2 62,1+3,2 . 28,8+ 2,2 5,0+0.0 98,3+3,6

рее тений.

Последним этапом в этой цепочке исследования Оыхо изучение действия фитотоксинов на изолированные ткани растений. Дм этого диски из ткани корнеплода свеклы помещали в растворы фитотоксинов. Результаты опыта, представленные в табл. показывают резкое увеличение оптической плотности растворов под действием ФГ-1 и ат-2. Наблюдаемое усиление выхода антоцканов свидетельствует о карукнии проницаемости клеточных мембран. Ив исключено, что подобное действие фитотокенны оказывают и на проницаемость меьбран клеток пшеницы.

Таким обрезом, на основании полученных данных мояно сделать заключение, что выделенные 4мтотоксины гриба Septorta nodorum Berk, являются хозяин-неспецифнчнмм, Эти вецэстаа ве являются первичными детерминантами, необходимыми для возникновения болезни. В то je время фктотонсины играя? вашую роль в патогенезе септориоза. так как способствуют развитию заболевания при поражении грибом взрослых растений пшеницы и при заражении семян, ннгнбируя их прорастание и рост проростков.

-so-

ar

Рий,4 влняяи0:|}|я0т0ксив0в ва.степень поражения рас-• . тенкй методы. «нокулнрованньи споровой с?с-'^ -'- -' Ъенвией гриба S, nodorum (иэолят 65-264) í' '

Таблица л

У' Влиянвд фЙото|«;имв £гю^огия1 яа выход антоциаяов ткавбя свекхы Seta vulgaris

, ед. оптической плотвостн

. Контроль :

•V «-4.V.UV

0.36 ± 0.04

1,ез ♦ о.го

1.3B+ 0.02 0,36 t 0.CÛ 0.4S + 0,04 0,45 t 0,06

- 21 -ВЫВОДЫ

1. Проведенные исследования покавали, что природные изо деты возбудителя септориоза пвеницы гриба Septoria nodorum Berk. (83-6. 83-30. 538 Б, 176 E. 143 P. 25 Д. 101 Д, 86-254, 78 Д) при культивировавим их в течение 14-21 суток на модифицированной среде Орива продуцируют метаболиты, обладающие <итотокснч-ньми свойствами.

2. Изучены условия экстракции, очистки и фракционирования фототекекнов нв культуральной среды н мицелия гриба S, nodorum о сомовью тонкослойной, препаративной и колоночной хроматографии. Установлено, что лучшее раеделение фитотоксинов происходит в системе хлороформ - этклацетат (5:1). Для дальнейшей очистки могут быть использованы системы петролейньй ефмр - зтилацетвт (1:1) и бензол - уксусная кислота (3:1). На основе полученных данных разработаны схеш препаративного выделения фитотоксинов гриба S. nodorum не культуральной среды и методика их количественного определения с поме идо жидкостной хромотогр&Пт высокого давления.

3. Из культуральной среды грибе s. nodoru» выделены ореоа-ративно н неучены пять фитотоксичных метаболитов: ОТ-1, ®Т-2, ОТ-3, ОТ-4 и ФГ-5, равличаодкхся по величине RT, окраске я видимом свете, флуоресценции в ультрафиолете, способности «вменять окраску под действием хлорного жедева, максимумам поглечения, рвстворшюстн.

Do своим свойствам W-S и ЗТ-З Оливки соответственно 4итотоксину меллещу я одному ю его производных, ФТ-1 и «-2 -септорину. фкрода ОТ-4 ве установлена. -

4. Сиит»а фитотоксинов наблюдается при культквированнк гриба ' S. nodorun на шю! и агариаоваявой питатель ной сред» «риаа, а так» картофельно-декстровном агаре как в термостате (темнота), так к в климатической камере (16-часовой фотопериод). Однако яабор <итотоксино», их соотношение в обяем комплексе я содержат» каадого ж sua в кульгуралыдо среде и мицелкн в авачжгельвой степени аавиемт от природа мволята и условий его кульпшфоваим. '

6. Пэкавано. «о вмеокооатогеняые природные яваагтм ITS К,

101 Д. 538 Б и 65-254 гриба S. nodorum отличаются повышенной способностью к продуцированию фитотоксино», в том числе ŒT-2 (176 Е, 101 Д, 533 Б), ФГ-3 (17В Б, 85-254), ОТ-4 ( 538 Б, . 06-254) И ФГ-5 (176 Е, 101 Д, 538 Б, 85-254).

Слабопатогенвъе иэодяты 25 Д к 143-Г уступают им и по способности к синтезу фитотоксинов.

6. Еьявлено, что' пикноспоры высокопатогенного изолята. 176 S содержат весь набор фитотоксинов, а слабопатогенного 25 Д - ФГ-Э, ФТ-4 и ОТ-б. При прорастания спор наблюдается усиленный синтез всех фитотоксинов и их секреЦйя в окружающую ин- -кубадаонну» среду. Не исключено, что подобный процесс мояет ' происходить и во время прорастания спор на листьях растений пшеницы.

7. В остах с очищенными препаратами 4*гг ©токсинов установ- . лено, что наиболее сильное ингибиругаее действие на рост корней : и колеоптилей пвеницы оказывают' ФГ-5 и ФГ-4, Подавление роста корней наблюдается при концентрации 50 мг/л и усиливается с' увеличением концентрации. Токсическое по отношению к проросткам пшеницы действие метаболита ФГ-3 выражено слабее и практически не изменяется о увеличением концентрации. Из ФГ-1 и ФГ-2 четкие ингибврушке свойства проявляются только у метаболита ФГ-2. ;

в. ИагиСируюиие свойства фитотоксинов - проявляется достаточно хорояо как на восприимчивых (Саратовская 29, Саратовская 36, Саратовская 46), 'так и на относительно устойчивых (Артур, . Castan) к септориову сортах пшеницы. Существенной раввицы в ре-акшш укааанных сортов на фитотоксины ее обнаружено.

Показало, что фитотоксины способна в той или иной степени подавлять рост проростков не только пшеницы, па которой паразитирует гриб ¿.nodoru», но и других сельскохоеяйстветшх культур, таких как ячмень и рис.

Препараты ^гтотоксииов, продуцируема грибом S. nodorum, при нанесении ях на растения или изолированные листья пшеницы не способны вызывать внешние симптомы заболевания, характерные для септориова. Вместе"'с тем установлено, что фитотоксины, особенно OT-i, ШГ-2 и ФГ-6^ при добавлеахж их;В споровую суспензию могут повышать степень поражения ияокудированных растений.

Помешяме двухнедельных проростков шве ниш в растворы фи-

- гз -

тотоксинов приводит к полелтенил и увяданию листьев.

Под действием фитотоксинов, особенно ФГ-1 и ФТ-2, происходит увеличение проницаемости мембран в тканях свеклы.

10. Полученные данные дахгг возможность сделать заключение, что обнаруженные к выделенные из среды культивирования гриба S. nodorum физиологически активные вещества { ФГ-1, ФГ-2, ОТ-З, ФТ-4 и ФГ-5) являются хозяин-неспецифическими фнтотоксинами, игравдими вполне определенную роль в процессе патогенеза септориоэа, особенно на самых ранних его этапах.

Список райот, опубликованных по теме диссертацию

1. КоОыдьский Г.К , Бочарова ЕЕ Изучение тонсинообраво-вапия у различных изолятов гриба Septorla nodorum Berk. // Вопросы защиты сельскохозяйствеиных растений и животных от болезней: Об. научных трудов НИСХИ,. Ч. I. -Алма-Ата, 1989, -С. 7б~в0.

2. Кобшц>ский Г. И., Бочарова Б. В. Фктотоксичные метаболи- -ты, продуцируемые различными изолятами гриба Septorla nodorum Berk. // Тезисы докладов VIII конференции по споровш растениям Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1989, - С. 143.

3. Иобылъский Г, И., Бочарова Е. Е Фитотокстш гриба Septorla nodorum Berk. и их возможная роль в пагогенеае септо-риова // Вестник сельскохоа яйст ве иной науки Казахстана, - Алма-Ата, 1909. - N.7. -С. 40-41.

4. Бочарова Е. Е . Кобыяьский Г. И. витотоксины гриба Septorla nodorum Bark. // визкодаго-биохимические и геветико-селекционные основы иммунитета сельскоховяйственнх растений к грибным болезням: Тезисы докладов научно-практической конференции. - Уфа, 1900 (в печати).

В.* Кобыльский Г.И., Бочарова Е.В. О природе фитотоксинов гриба Septorla nodorum'Berk, и возможности использования их в селекции пленицы // IX Всзсоюеное*совещание по ижуншету. Тезисы докладов. - Моек, 1001. -Т. 2. -С. 200-201.

Полгаоано в начата 20.12.91. Заказ 644 Формат,- бОаЭОДб : Тираж НО

. Иосква, Типография ВАСГ-ИЛ