Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов

Сухосырова, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов"

На правах росписи

СУХОСЫРОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

РАЗРАБОТКА БНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛА ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕЙТЕРОМИЦЕТОВ

0J.00.23. - Биотехнология

Автореферат

днссерташш «а соискание ученой степени ' кащвдата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в Научно-исследовательском и учебно-методическом Центре биомедицинских технслогай ВИЛАР

Паучные руководители:

доктор биологических наук, Никитина Зоя Клмовна кандидат биологических наук, Яковлева Маргарита Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Сазыетш Юрий Осипович доктор биологических наук, ст. щуч, сотр. Мшеева Майя Фёдоровна

Ведущее учреждение - Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ

На заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском Научно-исследовательском инспгтуте лекарствешщх и ароматический растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 113216 Москву ул. Грнна-7.

Зшшгга состоится

У/" ^¿^¿¿¿¿2002 г. в

Ьтг-.-А ВИЛАР по адресу: 113216

' 'Л";;

Автореферат ра>

"002 г.

Ученый секретарь V \

диссертациошого совета Д-006.070.01 кандидат сельскохозяйственных наук

ОБ1ЦАЯ50(АРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Изучение различных ферментных систем микроорганизмов и возможности их практического применения является одним из важных направлений в биотехнологии. Выяснение условий образования ферментов микроорганизмами и вопросов, связанных с регуляцией этого биосинтеза, представляет значительный научный интерес. Кроме того, эти биологически активные соединения находят широкое применение в ряде отраслей народного хозяйства, активно используются в медицинской практике и научных исследованиях. К числу таких ферментов относятся энзимы, обладающие коллагенолитической активностью. Они входят в состав лекарственных препаратов, которые применяются для удаления рубцов, келоидов, лечения ожогов, язв. За рубежом разработана технология получения коллагеназы с использованием в качестве продуцента Clostridium histolyticum. К недостаткам этого продуцента следует отнести его патогенность и анаэробность.

В нашей стране до сих пор основным источником получения колла-геназ являются ткани животных. В то же время, получение ферментных препаратов с использованием микроорганизмов, обладает рядом преимуществ: доступность и дешевизна сырья, неограниченность источников получения, относительная простота выделения и очистки целевого продукта по сравнению с тканями животных. Судя по литературным данным, некоторые дейтеромицеты могут синтезировать и секретировать различные протеолитические ферменты. Вместе с тем, до настоящего времени, не был проведен целенаправленный поиск перспективных продуцентов коллагенолитических ферментов среди этих видов микроорганизмов, а также не разработаны биотехнологические подходы их получения.

В связи с этим, целью настоящего диссертационного исследования явилась разработка ^иотехнологических подходрв получения коллагено-

i'rWibrlA}) НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Ыоск, а-гадэшм

им, К. А. Тими:

■I и,-п. т

литических ферментов на основа дейтеромицетов из коллекции НИЦ БМТ.

В задачи настоящего исследования вошли:

1. Отбор штаммов дейтеромицетов - продуцентов коллагенолитических ферментов.

2. Поиск методов консервации и хранения микромицетов, обеспечивающих жизнеспособность и сохранность ферментативной активности.

3.Отработка метода определения коллагенолитической активности ферментов, секретируемых в культуральную жидкость дейтеромицетами.

4. Поиск состава питательной среды для глубинного культивирования дейтеромицетов, обеспечивающей синтез и секрецию коллагенолитических ферментов.

5. Изучение возможности экзогенной регуляции секретирующей способности дейтеромицетов, с использованием а качестве индуктора - коллагена.

6. Разработка методов выделения и очистки коллагенолитических ферментов из культуральной жидкости

7. Изучение некоторых физико-химических свойств полученных ферментных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный комплекс показателей, включающий определение коллагенолитической активности при поверхностном и глубинном культивировании, изучение динамики роста культур и их стабильности при консервации, позволяет проводить среди дейтеромицетов отбор наиболее перспективных штаммов-продуцентов коллагенолитических ферментов.

2. Консервация культур дейтеромицетов на агаризованных средах под минеральным маслом (5°С) с периодическими пересевами 1 раз в 21 месяц обеспечивает 100% выживаемость и сохранность коллагенолитической активности данных штаммов.

3. Предложенный на основе изучения способов экзогенной биорегуляции вариант индукции с введением коллагена в питательные среды для глубинного культивирования и консервации стимулирует секрецию кол лаге-нолитических ферментов микромицетами.

4. Разработанный метод выделения и очистки коллагенолитических ферментов из культуральной жидкости А.Аауиэ позволяет получать электрофоретически гомогенные энзимные препараты, относящиеся к разряду нейтральных, термолабильных металлолротеиназ.

5. Совокупность предложенных биотехнологических подходов, включающих отбор штаммов продуцентов, оптимизацию условий хранения и культивирования, методы выделения и очистки энзимов, может служить основой для создания лабораторного, а в последующем, опытно-промышленного регламентов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов.

Научная новизна. В работе впервые предложен комплекс критериев, позволяющих провести отбор перспективных штаммов продуцентов коллагенолитических ферментов. Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования дейтеромицетов, обеспечивающий синтез ими коллагенолитических ферментов. Показан индуцибельный характер синтеза коллагенолитических ферментов для трех культур микромицетов: А.Аауиэ, Р.сИгуэодепит и Р.дпаеогоэеит. Для А.Аауи$ впервые выявлены оптимальные параметры консервации и условия хранения посевного материала на среде с индуктором для поддержания коллагенолитической активности ферментов на высоком уровне. Разработан оригинальный метод выделения и очистки ферментов, обладающих коллагенолитической активностью из культуральной жидкости А.Аауиз. Впервые охарактеризованы некоторые физико-химические свойства полученных энзимов (оптимум рН, температурная чувствительность, молекулярная масса, влияние ингибиторов, аминокислотный состав).

Практическая значимость. Разработанные биотехнологические подходы позволили определить параметры, на основе которых может быть создана универсальная технология получения ко л л а ге н ол итических ферментов с использованием дейтеромицетов. Проведенные исследования дали возможность осуществить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов из музея культур НИЦ БМТ, синтезирующих коллагено-литические ферменты. Показан индуцибельный характер секреции кол-лагенолитических ферментов микромицетами, на основании чего предложен состав питательной среды при подготовке посевного материала и условия глубинного культивирования. Разработаны методы выделения и очистки энзимов из культуральной жидкости A.flavus до гомогенного состояния, что создаёт предпосылки для получения на их основе новых лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на конференциях "Биомедицинские технологии" (Москва) в 1998,1999, 2000 годах.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 20 таблиц, 2 фотографии и 4 схемы. Работа включает введение, обзор литературы, методический раздел, 3 главы собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы и список литературы, состоящий из 206 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили восемь видов микромицетов из музея НИЦ БМТ: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Pénicillium chrysogenum, Pénicillium citrinum, Pénicillium griseoroseum, Pénicillium janthinellum, Beaveria bassiana.

Использовали следующие методы хранения культур:"!) на агаризо-ванных средах под слоем минерального масла при 5°С: а) среда Чапека; б) модифицированная среда Чапека с заменой сахарозы на равное количество коллагена. 2) на гранулах силикагеля в 10 % растворе глицерина при 5°, 20°, -25", -60°С,

Определение ферментативной активности дейтеромицетов при поверхностном культивировании проводили скрининг-методом (Яковлева М. В., Козельцев В. Л. ,1994).

Культивирование дейтеромицетов в глубинных условиях осуществляли в колбах на качалках при 26°С, Посевным материалом служила суспензия спор семисуточных культур дейтеромицетов (1-4,3x10а спор на 100мл среды), выращенных на поверхности скошенного агара Чапека или модифицированной среды Чапека. Среда для глубинного культивирования включала солевой фон среды Чапека, 0,5% сахарозы и 1,5% коллагена. Для изучения динамики роста дейтеромицетов при глубинном культивировании А. Аауиэ ряд экспериментов проводили, используя со-лерастворимый коллаген (Захарова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А, 1998.).

Определение коллагенолитической активности культуральной жидкости проводили по схеме 1, используя суспензию 1% коллагена в 0.01М фосфатном буфере с 0,2 мкМ СаС12 (рН 7.4). Удельная коллагенопитическая активность рассчитывалась по суммарному количеству свободных а-аминогрупп аминокислот (в мкМ) в пересчете на мкг белка. Степень гидролиза коллагена под действием ферментов вычисляли как долю (в процентах) от суммарного количества образовавшихся свободных а-аминогрупл аминокислот в результате проведения полного кислотного гидролиза субстрата (Захарова Е. А., Яковлева М. Б., Никитина 3. К., Быков В. А., 1999).

Для выделения и очистки фермента из культуральной жидкости ис-

пользовали последовательно гель-фильтрацию на "TOYO PEARL HW-40" и два варианта аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах: коллаген-сефароза 4В или солерастворимый коллаген-сефароза 4В (Захарова Е.А., Никитина 3. К., Яковлева М. Б., Быков В, А., 2000).

Полученные препараты анализировали с помощью диск-электрофореза в ПААГ (Шелудько Н.С. 1975) и аминокислотного анализа (Остерман Л А,1985).

Активность ферментов в различных областях pH определяли, используя 0,01М буферный раствор с

pH: 5,8; 6,4; 7,0; 7,4; 8,0 (Захарова Схема 1. Определение кол-

лагенолитической активности Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б.,

в культуральной жидкости дей- вещикова Е.В., Быков В.А., 2000). теромицвтов.

Для изучения температурной стабильности препараты инкубировали в 0,01 М фосфатном буфере с CaCI2 (0,2мкМ) pH 7,4 в течение 60 мин при температурах: 20°; 30°; 40°; 50°; 60°С, после чего проводили определение активности (Захарова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Вещикова Е. В., Быков В.А., 2000).

Для анализа действия ЭДТА на коллагенолитическую активность ферментов А. flavus использовали поверхностное культивирование на модифицированной среде Чапека, содержащей ингибитор (5x1 0"*М -2х10"2М) (Захарова Е. А., Никитина 3. К., Яковлева М. Б., Вещикова Е. В.. Быков В.А., 2000).

Концентрацию белка определяли методом Lowry О Н., (1951), свободных a-аминогрупп аминокислот - нингидриновым методом (Lee Y.P., 1966), Сахаров - антроновым методом (Arnold W.N., Melellan МЛ/., 1975) Статистическую обработку результатов проводили, используя распределение Стьюдента для малых выборок, данные выражали в виде х ± а (Лакин Г. Ф.,1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Отбор микроорганизмов • продуцентов коллагенолитических ферментов.

При поверхностном культивировании восьми видов дейтеромице-тов на среде с коллагеном культуры P.chrysogenum, P.griseoroseum и A.flavus обладали наиболее высоким индексом лизиса (Табл. 1) и были выбраны для дальнейшей работы.

Таблица 1.

Индекс лизиса и рост биомассы отобранных штаммов при поверхностном культивировании на среде с коллагеном.

Вид Время культивирования, сут. Биомасса, м г/колон и я Индекс лизиса Удельный индекс лизиса *

P.chrysogenum 7 1,65±0,08 2,96±0,23 1,79

14 8,25±0,41 3,48±0,31 0,42

P.griseoroseum 7 0,70±0,04 3,07±0,25 4,39

14 1,00±0,06 3,1510,25 3,15

A.flavus 7 6,60±0,33 2,10±0,17 0,32

14 23,2±1,41 2,40±0,21 0,10

- удельный индекс лиэисэ определяется соотношением индекса лизиса к

количеству биомассы.

Однако корреляции между количеством биомассы и индексом лизиса обнаружено не было, что, вероятно, связано с ограничением доступности коллагена для мицелия всей колонии. На следующем этапе работы исследована коллагенолитическая активность отобранных штаммов при глубинном культивировании (Табл. 2). Показано, что максимальная коллагенолитическая активность, секретируемых дейтеромицетами ферментов была наиболее высокой у А.Аауиэ.

Одним из необходимых требований для использования продуцента в биотехнологии является выбор условий консервации, позволяющих обеспечить стабильность их биохимических свойств.

Показано, что жизнеспособность микроскопических грибов Р.сЬгузодепит и Р.дпзеоговеит при хранении на гранулах силикаге-ля в значительной степени зависела от температурного режима. Установлено, что каждый вид требовал индивидуального подбора условий консервации. А.Яауиз при всех температурах сохранял жизнеспособность и активность секретируемых коллагенолитических ферментов (Табл. 3).

Хранение на агаризованной среде под минеральным маслом при 5°С с периодическими пересевами обеспечивало 100 % выживаемость и стабильность коллагенолитической активности у А.Аауиз, Р.сЬгузодепиш и Р.дп$еого$еит (Табл. 4). Учитывая простоту и удобство последнего метода он был выбран для дальнейшей работы.

Таблица 2.

Максимальная удельная коллагенолитическая активность и степень гидролиза коллагена у отобранных штаммов дей-теромицетов при глубинном культи-

Вид Время культивирования, 7 сут.

УКА, (мкМ/мкг)х10в Степень гидролиза,%

Р. сЬгуаодепит 5,4±0,5 0,01

Р. рпзеогоееит 82,0±4,1 0,21

А Аауив 892,3±53,5 2,24

Таблица 3.

Индекс лизиса дейтеромицетов при поверхностном культивировании на среде с коллагеном через 24 месяца хранения на гранулах силикагеля при различных температурах.

Вид Индекс лизиса культур, 7 сут

Исходный Послех ранения

20 °С 5 "С -25 °С -60 вС

Р.сЬгуэодепит 2,96 1,Э4±0,13 2,2±0,15 *

Р.дпвеогоБеит 3,07 3,88±0,23 5,30±0,43

А.Аауиэ 2,10 2,82±0,14 2,82±0,17 3,65±0,29 2,87±0,14

*- отсутствие роста на среде Чапека.

Таблица 4.

Индексы лизиса дейтеромицетов при поверхностном культивировании на среде с коллагеном, через 22 месяца хранения под слоем минерального масла на среде Чапека (5 °С.)

Вид Индекс лизиса культур, сут.

Исходный, 7 сут. После х ранения

7 14 21 28

Р.сЬгузодепит 2,96 2,20±0,16 2,67±0,18 2,65±0,13 2,25±0,18

Р.дпзеоговеит 3,07 2,40±0,14 2,88±0,17 2,60±0,18 2,25±0,16

А.Аауиэ 2,10 2,05±0,10 2,75±0,19 2,20±0,11 2,1 в±0,15

Таким образом, на основании исследования восьми культур дейтеромицетов с помощью разработанного комплекса показателей А.Аауш был выбран в качестве основной культуры для дальнейших исследований, так как обладал высоким уровнем коллагенолитической активности при поверхностном и глубинном культивировании, значительной скоростью роста и устойчивостью при хранении.

2. Разработка способов повышения коллагенолитической активности дейтеромицетов

Известно, что состав питательной среды для культивирования микроорганизмов может существенно влиять на синтез ими биологически активных веществ. В связи с этим, на следующем этапе работы нами исследовалось влияние состава питательной среды на синтез дейтером и-цетами коллагенолитических ферментов. При глубинном культивирова-

нии микромицетов на среде Чапека не обнаруживалось секреции колла-генолитических ферментов. В дальнейшем была использована питательная среда, содержащая два источника углерода (0,5% сахарозы 1,5% коллагена). При этом предполагалось, что сахароза должна стимулировать рост дейтеромицетов, а коллаген синтез коллагенолитических

ферментов (рис.1).

е; з

л 4 о **

I»

(0 1 *

Время культивирования, сут.

1 - концентрация сахарозы; 2 - удельная коллагенолитическая

активность; 3 - степень гидролиза коллагена Рис. 1. Изменение содержания сахарозы и активность коллагенолитических ферментов, секрвтируемых при культивировании АЛауи$ на модифицированной среде Чапека (0,5% сахарозы и 1,5% коллагена/

Действительно, содержание Сахаров в культуральной жидкости при глубинном культивировании А.Аауиэ уже к третьим суткам снижалось на 95% (рис,1, кр. 1), после чего наблюдалось увеличение секреции коллагенолитических ферментов (рис. 1, кр. 2, 3). Таким образом, частичная замена в среде Чапека сахарозы на коллаген приводила к выраженной индукции синтеза коллагенолитических ферментов.

Для сопоставления динамики синтеза коллагенолитических ферментов с динамикой накопления биомассы A.flavus в глубинных условиях культивирование проводили с использованием солерастворимой фракции коллагена (рис. 2). Показано, что максимальное количество биомассы накапливалось к седьмым суткам роста культуры, в то время как мак-

симальная коллаген ол итическая активность наблюдалась на 10 сутки роста, т.е. в стационарной фазе. Таким образом, выявлен двухфазный характер процесса.

Рис.2 Рост биомассы и активность коллагенолитичвских ферментов, свкретируемых при глубинном культивировании А.Аауиз на модифицированной среде Чапека с солерастворимым коллагеном (0,5% сахарозы и 1,5 % коллагена,), 1 - Рост биомассы; 2 - Удельная кол-лагенолитическая активность; 3 - Степень гидролиза коллагена.

Представленные выше данные о стимуляции синтеза коллагенолитических ферментов при введении в среду коллагена для глубинногс культивирования дейтеромицетов свидетельствует о том, что в данном случае субстрат являлся индуктором. Состав агаризованной среды при хранении микроорганизмов также может существенно влиять на их свойства. Исходя из этого, проводилось сравнительное изучение коллагена литической активности дейтеромицетов при их хранении на различны* средах (с индуктором и без него) (рис. 3 А). Установлено, что после хранения А.Лауиз на среде с индуктором в течение 6, 14 и 21 месяца на блюдалось сокращение сроков ферментации с 7 до 3 - х суток по срав> нению с контролем {среда Чапека). Максимальная коллагенолитическа* активность, секретируемых А.Аауи$ ферментов после хранения на сре де с коллагеном была выше по сравнению с консервацией на стандарт-

О*1 м—I-м——,-

0 2 4 6 8 10 12 14

Время культивирования, сут.

€ месяцев

Ъ 2000

^ О

1 4000

£ 2000

со

1 0

I10000

0 а>

| 8000

I 6000

со с; 5

§ 4000

X !

Ц 2000'

5 1 01

JLrfl.ffl.fkn

14 месяцев

в 1-1 гН ГЪ ги

21 месяц

жЛ

дз

Ял

о 3 4 7 10 14 о 3 4 7 10 14

Время культивирования, сут.

Рис. 3 Коллагенолитичвская активность ферментов, секрети-руемых культурой А. Яашз первого (А) и второго (Б) пассажа, в зависимости от сроков хранения на среде с индуктором и без него О

ной среде в 7,5 раз. При этом с 6 по 21 месяц хранения наблюдалось постепенное увеличение активности коллагенолитических ферментов в опытном варианте. Дальнейшее хранение культуры А.Аауиэ (24 и 25 месяцев) (табл. 5) на среде с коллагеном приводило к постепенному снижению максимальных значений удельной коллагенолитической активности.

Таким образом, показан выраженный индуцирующий эффект коллагена на синтез коллагенолитических ферментов секретируемых

еле хранения на различных

Таблица 5. Максималь- А.Аауив, при использовании белка в капая активность коллагено- честве компонента агаризованной сре-литических ферментов,

секрвтирувмых А. по- Ды при хранении культуры. Определены

оптимальные сроки хранения культуры А.Аауиэ на среде с индуктором (21 месяц). Индуцирующий эффект коллагена был выявлен и для культур Р.с*1гу5одепит и Р.дпвеогозеит.

Как указывалось выше, при хранении дейтеромицетов нами использовались периодические пересевы. В связи с этим представляло интерес выяснить, сохраняется ли индуцирующий эффект при увеличении числа пассажей. Установлено (рис. 3 Б, Табл. 6), что хранение культуры А.Аауцэ второго пассажа в течение 6,14 и 21 месяца на среде с индуктором приводило к дальнейшему увеличению максимального уровня коллагенолитической активности по сравнению с первым пассажем на те же сроки. При этом во втором пассаже, так же как и в первом, хранение А.Аауиз на Таблица 6. Максимальная

средах.

Удельная

Сроки коллагенолитическая

хра- активность,

нения (мкМ/мкг) х106

мес. с индук- без

тором индуктора

21 6576±328 985±68

24 4602±276 833±41

25 3709±212 764±61

среде с индуктором более 21 месяца вызывало некоторое снижение ферментативной активности (Табл. 6).

Полученные результаты дают возможность предложить указанный технологический прием (пассирование на среде с коллагеном) для увеличения коллагенолитической активности микромицетов.

колпагенолитическэя активность ферментов, секрети-руемых культурой А.Яа\л13 после хранения на среде с индуктором в зависимости от пассажа.

Сро- Удельная коллагено-

ки литическая актив-

хране ность, (мкМ/мкг)х10е

ния,

1 пассаж 2 пассаж

мес.

6 920±55 2210±154

14 1080±75 4131±289

21 65761328 10185±509

24 4602±276 9081±454

Рис, 4

3. Разработка методов выделения и очистки коллагенолитиче-ских ферментов из культуральной жидкости А. Л а V не.

Выделение и очистку коллагенолитических ферментов, секретируемых культурой АЛауиэ в культураль-ную жидкость, проводили используя последовательно метод гель-фильтрации (рис. 4) и два варианта аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах (рис 5). Использование в качестве лиганда солераство-римого коллагена позволило значительно увеличить ёмкость полученного сорбента и разделить материал первого пика после гель-фильтрации на три фракции, две из которых обладали колагенолити-ческой активностью.

Предложенная схема очистки дала возможность лолу-24 чить два электрофоретичес-

Объем элюции, мл Рис. 5 Аффинная хроматография материала первого пика после гель-фильтрации на колонке коллаген-сефароза 4В (- - -) и солерас-творимый коллаген-сефароза 4В (—). Стрелками обозначен момент добавления: 1 - фосфатного буфера; 2- фосфатного буфера + 1М ЫаС1; 3-1М СН3СООН; 4-фосфатного буфера. Отрезками обозначены фракции, содержащие коллагенолитические ферменты

1-г- 1 I

20 30 Объем элюции, мл

Гель-фильтрация культуральной жидкости А.Аачиз; 1, 2, 3 -материалы полученных фракций. Отрезком обозначена фракция, содержащая коллагенолитические ферменты

ки гомогенных энзимных препарата с молекулярной массой 21±1,05 кДа и 24±1,2 кДа и степенью очистки в 34 и 69 раза соответственно (рис. 6).

Ь | £ 1 ^ актин (А) (41,7 кДа) [; К ; ^ / тропомиозин (ТМ) (34 кДа)

е".......X-

, 1 ~ . ^ лёгкая цепь миозина 2 (ЛЦ 2)(18.5 кДа)

П „ , .....

I; ; "^лёгкая цепь миозина 3 (ЛЦ 3) (16,5 кДа)

ч.... -

А Б В

Рис. б. Электрофорез в ПААГ материала II и III пиков. А - материал II пика; Б - материал III пика; В - лизат сердечной мышцы.

240000

тс СО

В 2 i* 160000

5 J

га г с ^

5 -о

2 Б « ?

80000

6,0 7,0 8,0 рН

Рис. 7 Коллагвнопитиче-ская активность ферментов при различных значениях рН.

20 40 0 60 Температура, С

Рис. 8 Коллагенолитичес-кая активность ферментов после инкубации при различных температурных режимах.

Коллагенолитическая активность полученных ферментов была минимальна в области кислого значения рН (рис. 7). Смещение рН из кислой области в нейтральную приводило к увеличению активности, а при рН больше 7,4 наблюдалось некоторое снижение активности энзимов.

Выявлена стабильность кол л а ге мол итической активности ферментов в интервале температур от 20° до 30°С (рис. 8). Повышение температуры от 40° до 60°С приводило к резкому снижению уровня ферментативной активности.

Изучение влияния ингибитора металлопротеиназ (ЭДТА) на суммарную коллагенолитическую активность А.Аауиз показало, что увеличение концентрации ЭДТА вносимого в агариэованную среду с коллагеном приводило к снижению роста колонии и уменьшению или полному отсутствию зон лизиса коллагена по сравнению с контролем (рис. 9).

Таким образом, изучение физико - химических свойств полученных % фер ментов позволяет отнести их к разряду нейтральных, ^ термолабильных коллагено-литических металлопротеиназ.

Контроль без добавления ЭДТА

5x1 а4 м

1X1 (Т3 м

бХЮ^М

1X1 о2 м

2х1(Тг М

Рис.9. Влияние ингибитора металлопротеиназ (ЭДТА) на зоны прот&олиза коллагена А. Аауиз (4-е сутки роста).

На основании проведенных исследований предложены основы технологической схемы получения коллагенолитических ферментов с использованием в качестве продуцентов дейтеромицетов (схема 2).

Разработанные на примере культуры А.Аауиэ биотехнологические подходы могут служить основой универсальной комплексной технологии получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов.

Отбор штаммов продуцентов коллагенолитических ферментов

- 1

Хранение штаммов дейтеромицетов на среде с коллагеном под споем минерального масла (5*С)_

Коллагенолитическая активность при поверхностном культивировании

Коллагенолитическая активность при глубинном культивировании

Пассирование на среде с коллагеном (1 раз в 21 месяц)

Глубинное культивирование (модифицированная среда Чапека 0,5% сахарозы + 1,5% коллагена) -1-

Стабильность при хранении (выживаемость, коллагенолитическая ак-_тивность)_

Отделение культуральной жидкости от биомассы, микрофильтрация

Фильтрат культуральной жидкости

Гель-фильтрация TOYO PEARL HW4(

Иммобилизация солерас-творимого коллагена на се-фароэе Аффинная хроматография элюента на полученном сорбенте

Коллагенолитическая активность

Аминокислотный анализ

Электрофорез

| ЛиоФилизация Н Анализ полученных препаратов

Схема 2. Блок-схема получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов в качестве продуцентов.

I. Подготовительные этапы; И. Основные этапы.

ВЫВОДЫ

1. Предложен комплекс показателей, позволяющий проводить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов - продуцентов коллагенолити-ческих ферментов, включающий: определение коллагенолитической активности при поверхностном и глубинном культивировании, изучение динамики роста культур и их стабильности при различных методах консервации.

2. Показано, что из восьми исследованных культур дейтеромицетов микромицет А.Аауиэ имеет высокий уровень коллагенолитической активности при поверхностном и, особенно, при глубинном культивировании, обладает наиболее интенсивным ростом и устойчивостью при хранении.

3. Исследование различных способов консервации культур дейтеромицетов позволило предложить метод хранения на агариэованных средах под минеральным маслом при 5°С с периодическими пересевами раз в 21 месяц в качестве основного, обеспечивающего 100% выживаемость и сохранность энзиматической активности.

4. Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования дейтеромицетов за счет частичной замены сахарозы на коллаген, что обеспечивало секрецию коллагенолитических ферментов микроорганизмами.

5. Установлена возможность экзогенной регуляции секретирующей способности А.Аауиб с использованием в качестве индуктора - коллагена. Обнаружено значительное увеличение активности секретируемых коллагенолитических ферментов (в 7,5 раз) и сокращение сроков культивирования (на четверо суток) после хранения культуры на среде с коллагеном по сравнению с консервацией на среде Чапека. Индуци-бельный характер секреции коллагенолитических ферментов выявлен так же и у других видов дейтеромицетов (Р.сЬгуБодепит и Р.дпаеогоаеит).

€. При хранении A.flavus на агаризованной среде с индуктором

(коллагеном) показано увеличение коплагенопитической активности сек-ретируемых ферментов от пассажа к пассажу.

7. Разработан метод выделения и очистки коллагенолитических ферментов, секретируемых культурой A.flavus, позволивший получить два электрофоретически гомогенных энзимных препарата со степенью очистки в 34 и 69 раза.

8. Изучение физико-химических свойств полученных ферментов позволяет отнести их к разряду нейтральных термолабильных коллагенолитических металлопротеаз.

9. Разработанные на примере культуры A.flavus биотехнологические подходы могут служить основой универсальной комплексной технологии получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Яковлева М.Б., Захарова Е.А., Якунина Л.Н., Никитина З.К., Быков В.А. Исследование жизнеспособности и коллагенолитической активности дейтеромицетов и бактерий. // Биомедицинские технологии. -1996. №3. -С. 84-90.

2. Захарова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З К., Быков В.А. Коллагеноли-тическая активность, синтезируемая некоторыми видами микроорганизмов. /I Биомедицинские технологии. -1998. №10. -С.29-32.

3. Захарова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А. Индуцированный синтез коллагенолитических ферментов, некоторыми видами дейтеромицетов. // Биомедицинские технологии. -1999. №11. - С.157-162.

4. Захарова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Быков ВА Выделение и очистка внеклеточной коллагеназы A,flavus. // Биомедицинские технологии. -2000. №15, - С.49-53.

5. Захарова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Вещикова Е.В., Быков В.А. Некоторые свойства коллагеназ A.flavus.// Биомедицинские техно-

логии. - 2000. №15. - С.54-58.

6. Захарова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К, Быков В.А. Влияние индуцирующего фактора на коллагенолитическую активность А.Аауиэ в зависимости от числа пассажей. // Биомедицинские технологии. -2000. №15. - С.59-65.

Подписано r печать (14,(15,2001 г. Формат 60i9O1/1 í, Гарп»тура Тайме, EjMaia офит па я Л» 1. Печать офсстяяя. Усл. п£ч, л. 2,0. Заказ Л» 145. Тираж 100 зкз,

Ifijartjibfrao «ЭК01Г» 123329, Москва, ул. Ивовая, 2. Лиаеимя ИД N° 03866 от 30.01.2001 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сухосырова, Елена Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Структура и свойства коллагена

1.1.1. Коллаген и его типы

1.1.2. Аминокислотный состав коллагена

1.1.3. Спираль коллагена

1.1.4. Свойства коллагена

1.1.5. Характеристика некоторых типов коллагена

1.2. Методы определения коллагенолитической активности на природных и синтетических субстратах.

1.2.1. Природные субстраты

1.2.2. Синтетические субстраты

1.3. Выделение, характеристика и классификация экскретируемых коллагеназ у различных микроорганизмов.

1.3.1. Коллагеназы из Clostridium histolyticum и Clostridium perfringens

1.3.2. Коллагеназа из Achromobacter iophagus и Cytophage sp.

1.3.3. Коллагеназы из Pénicillium citrinum

1.3.4. Коллагеназы серинового типа выделенные из микроорганизмов

1.3.5. Коллагеназы из Streptomyces и Actinomyces

1.4. Условия культивирования для направленной регуляции биосинтеза коллагенолитических ферментов микроорганизмами.

1.5. Условия хранения микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ. 48 1.5.1. Хранение культур на агаризованных средах.

1.5.2. Хранение культур под слоем минерального масла.

1.5.3. Хранения культур на гранулах силикагеля 53 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследований

2.2. Поддержание культур дейтеромицетов на двух вариантах агаризованных сред

2.3. Методы хранения культур дейтеромицетов

2.3.1. Хранение культур дейтеромицетов на среде Чапека

2.3.2. Хранение культур дейтеромицетов под минеральным маслом на среде Чапека

2.3.3. Хранение дейтеромицетов под минеральным маслом на среде с индуктором

2.3.4. Хранение на гранулах силикагеля в 10% растворе глицерина

2.4. Культивирование дейтеромицетов в глубинных условиях 58 2.4.1. Метод выделения солерастворимой фракции коллагена

2.5. Определение коллагенолитической активности

2.5.1. Скрининг метод

2.5.2. Определение коллагенолитической активности в культу рал ьной жидкости 60 2.5.2. а. Проведение ферментативного гидролиза и определение удельной коллагенолитической активности

2.5.2. б. Определение степени гидролиза коллагена

2.6. Методы выделения и очистки коллагенолитических ферментов

2.6.1. Осаждение этанолом

2.6.2. Гель-фильтрация

2.6.3. Аффинная хроматография

2.7. Характеристика полученных ферментных препаратов

2.7.1. Электрофорез в ПААГ

2.7.2. Активность ферментных препаратов при различных значениях рН

2.7.3. Температурная устойчивость

2.7.4. Влияние ингибитора

2.7.5. Характеристика белковых фракций по аминокислотному составу

2.8. Определение белка по методу Лоури

2.9. Определение количества свободных <х -аминогрупп аминокислот нингидриновым методом

2.10. Определение Сахаров антроновым методом

2.11. Статистическая обработка результатов 68 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. ОТБОР МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

3.1. Определение коллагенолитической активности у различных видов дейтеромицетов 69 3.1.1. Поверхностное культивирование 69 3.1.2 Глубинное культивирование

3.2. Изучение стабильности некоторых видов дейтеромицетов при различных условиях хранения.

3.2.1. Хранение на гранулах силикагеля

3.2.2. Хранение на среде Чапека под слоем минерального масла

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕЙТЕРОМИЦЕТАМИ 78 4.1. Оптимизация условий глубинного культивирования дейтеромицетов

4.2. Оптимизация условий определения коллагенолитической активности в культуральной жидкости при культивировании дейтеромицетов

4.3. Изучение возможности экзогенной регуляции секретирующей способности дейтеромицетов с использованием в качестве индуктора - коллагена

4.4. Зависимость коллагенолитической активности от числа пассажей

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ А.РЬАУив.

5.1. Разработка методов выделения и очистки коллагено-литических ферментов из культуральной жидкости

5.2. Изучение физико-химических свойств полученных ферментных препаратов

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108 ВЫВОДЫ 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИИ

КЛА МБА ПААГ

ТЕМЕД

РР1.С

Рх-РЮРН акриламид биологически активные вещества высокоэффективная жидкостная хроматография (диметиламино-нафталин-сульфонил) коллагенолитическая активность 1Ч,МЛ метилен бисакриламид полиакриламидный гель Ы^.Ы/Ы -тетраэтилэтилендиамин тонкослойная хроматография удельная коллагенолитическая активность сывороточный альбумин человека этилендиаминтетрауксусная кислота ■ацил бычий сывороточный альбумин диэтиламиноэтил

• диизопропилфторфосфат додецилсульфат натрия быстрая жидкостная хроматография картофельно-декстрозный агар - фенилметансульфонилфторид

- (4-фенилазобензилоксикарбонил-1-Рго-1-1еи-01у-1--Рго-О-Агд)

• бензилоксикарбонил

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов"

Актуальность исследования. Изучение различных ферментных систем микроорганизмов и возможности их практического применения является одним из важных направлений в биотехнологии. Выяснение условий образования ферментов микроорганизмами и вопросов, связанных с регуляцией этого биосинтеза, представляет значительный научный интерес. Кроме того, эти биологически активные соединения находят широкое применение в ряде отраслей народного хозяйства, активно используются в медицинской практике и научных исследованиях. К числу таких ферментов относятся энзимы, обладающие колла-генолитической активностью. Они входят в состав лекарственных препаратов, которые применяются для удаления рубцов, келоидов, лечения ожогов, язв. За рубежом разработана технология получения кол-лагеназы с использованием в качестве продуцента Clostridium histolyticum. К недостаткам этого продуцента следует отнести его па-тогенность и анаэробность.

В нашей стране до сих пор основным источником получения кол-лагеназ являются ткани животных. В то же время, получение ферментных препаратов с использованием микроорганизмов, обладает рядом преимуществ: доступность и дешевизна сырья, неограниченность источников получения, относительная простота выделения и очистки целевого продукта по сравнению с тканями животных. Судя по литературным данным, некоторые дейтеромицеты могут синтезировать и секретировать различные протеолитические ферменты. Вместе с тем, до настоящего времени, не был проведен целенаправленный поиск перспективных продуцентов коллагенолитических ферментов среди этих видов микроорганизмов, а также не разработаны биотехнологические подходы их получения.

В связи с этим, целью настоящего диссертационного исследования явилась разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов на основе дейтеромицетов из коллекции НИЦ БМТ.

В задачи настоящего исследования вошли:

1. Отбор штаммов дейтеромицетов - продуцентов коллагенолитических ферментов.

3. Отработка метода определения коллагенолитической активности ферментов, секретируемых в культуральную жидкость дейтеромице-тами.

5. Изучение возможности экзогенной регуляции секретирующей способности дейтеромицетов, с использованием в качестве индуктора -коллагена.

6. Разработка методов выделения и очистки коллагенолитических ферментов из культуральной жидкости АЛауиз.

7. Изучение некоторых физико-химических свойств полученных ферментных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Предложенный комплекс показателей, включающий определение коллагенолитической активности при поверхностном и глубинном культивировании, изучение динамики роста культур и их стабильности при консервации, позволяет проводить среди дейтеромицетов отбор наиболее перспективных штаммов-продуцентов коллагенолитических ферментов.

2. Консервация культур дейтеромицетов на агаризованных средах под минеральным маслом (5°С) с периодическими пересевами 1 раз в 21 месяц обеспечивает 100% выживаемость и сохранность коллагеноли-тической активности данных штаммов.

3. Предложенный на основе изучения способов экзогенной биорегуляции вариант индукции с введением коллагена в питательные среды для глубинного культивирования и консервации стимулирует секрецию коллагенолитических ферментов микромицетами.

Научная новизна. В работе впервые предложен комплекс критериев, позволяющих провести отбор перспективных штаммов продуцентов коллагенолитических ферментов. Оптимизирован состав питательной среды для глубинного культивирования дейтеромицетов, обеспечивающий синтез ими коллагенолитических ферментов. Показан индуцибельный характер синтеза коллагенолитических ферментов для трех культур микромицетов: А.Аауиэ, Р-сИгуводепит и Р.дпзеогоэеит. Для А.АауиБ впервые выявлены оптимальные параметры консервации и условия хранения посевного материала на среде с индуктором для поддержания коллагенолитической активности ферментов на высоком уровне. Разработан оригинальный метод выделения и очистки ферментов, обладающих коллагенолитической ак

10 тивностью из культуральной жидкости А.Аауиэ. Впервые охарактеризованы некоторые физико-химические свойства полученных энзимов (оптимум рН, температурная чувствительность, молекулярная масса, влияние ингибиторов, аминокислотный состав).

Практическая значимость. Разработанные биотехнологические подходы позволили определить параметры, на основе которых может быть создана универсальная технология получения коллагенолитиче-ских ферментов с использованием дейтеромицетов. Проведенные исследования дали возможность осуществить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов из музея культур НИЦ БМТ, синтезирующих коллагенолитические ферменты. Показан индуцибельный характер секреции коллагенолитических ферментов микромицетами, на основании чего предложен состав питательной среды при подготовке посевного материала и условия глубинного культивирования. Разработаны методы выделения и очистки энзимов из культуральной жидкости А.АауиБ до гомогенного состояния, что создаёт предпосылки для получения на их основе новых лекарственных препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сухосырова, Елена Александровна

ВЫВОДЫ

1. Предложен комплекс показателей, позволяющий проводить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов - продуцентов коллаге-нолитических ферментов, включающий: определение коллагенолити-ческой активности при поверхностном и глубинном культивировании, изучение динамики роста культур и их стабильности при различных методах консервации.

2. Показано, что из восьми исследованных культур дейтеромицетов микромицет А.Аауив имеет высокий уровень коллагенолитической активности при поверхностном и, особенно, при глубинном культивировании, обладает наиболее интенсивным ростом и устойчивостью при хранении.

3. Исследование различных способов консервации культур дейтеромицетов позволило предложить метод хранения на агаризован-ных средах под минеральным маслом при 5°С с периодическими пересевами раз в 21 месяц в качестве основного, обеспечивающего 100% выживаемость и сохранность энзиматической активности.

5. Установлена возможность экзогенной регуляции секретирую-щей способности А.Аауиэ с использованием в качестве индуктора -коллагена. Обнаружено значительное увеличение активности секре-тируемых коллагенолитических ферментов (в 7,5 раз) и сокращение сроков культивирования (на четверо суток) после хранения культуры на среде с коллагеном по сравнению с консервацией на среде Чапека. Индуцибельный характер секреции коллагенолитических ферментов

118 выявлен так же и у других видов дейтеромицетов (P.chrysogenum и P.griseoroseum).

6. При хранении A.flavus на агаризованной среде с индуктором (коллагеном) показано увеличение коллагенолитической активности секретируемых ферментов от пассажа к пассажу.

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что коллагенолитические ферменты нашли широкое применение в биотехнологии и во многих областях практической медицины. Как правило, они чаще всего используются в качестве наружных лекарственных средств. В частности коллагеназа весьма эффективна для удаления рубцов, келоидов, ожоговых ран, обморожений, для очистки гнойно-никротических налётов, диабетической гангрене, пролежнях и вяло текущих язвах. Кроме того, коллагеназа нашла применение при трансплантации зубов, в ферментной хирургии для устранения грыжи межпозвонкового диска.

В нашей стране препараты коллагеназы для медицинских целей получают используя поджелудочную железу скота. Кроме того, предпринимаются попытки наладить выпуск ферментного препарата из дальневосточного краба. Получение ферментных препаратов с использованием микроорганизмов обладает рядом преимуществ: доступность и дешевизна сырья, неограниченность источника получения, относительная простота выделения и очистки целевого продукта по сравнению с тканями животных.

Классический продуцент коллагеназ - Clostridium histolyticum, на основе которого разработана технология получения фермента за рубежом, обладает рядом недостатков: патогенность и анаэробность, что усложняет условия работы с этим микроорганизмом.

Несмотря на многочисленные исследования в нашей стране до настоящего времени не найдены перспективные штаммы - продуценты коллагеназ, а также не разработаны методические подходы, обеспечивающие стабильную секрецию энзимов.

В течении ряда лет в НИЦ БМТ проводились работы по созданию музея культур микроорганизмов, основу которых составляет несколько десятков штаммов дейтеромицетов. Представляло интерес провести среди этих штаммов поиск продуцентов коллагенолитиче-ских ферментов. На основе собственных и литературных данных нами разработан комплекс показателей, позволяющий проводить отбор перспективных штаммов дейтеромицетов, включающий определение коллагенолитической активности при поверхностном и глубинном культивировании, изучение динамики роста культур и их стабильности при различных методах консервации.

При поверхностном культивировании музейных штаммов микроорганизмов из коллекции НИЦ БМТ были выбраны три культуры Р.сИгуводепит, Р.дпвеоговеит и А^^ив, которые обладали наиболее высоким индексом лизиса на агаризованной среде с коллагеном.

Известно, что количество биомассы является важной характеристикой интенсивности роста микроорганизмов, определяющей возможность их использования в качестве продуцентов биологически активных веществ. Одновременное изучение индекса лизиса и количества биомассы при поверхностном культивировании отобранных штаммов показало, что наиболее интенсивный рост наблюдался у А.Аауиэ. Вместе с тем корреляционной зависимости между количеством биомассы и индексом лизиса выявлено не было, что вероятно связано с большей доступностью коллагена только для мицелия, который расположен на поверхности питательной среды, доступность же углеродного субстрата для верхнего слоя мицелия ограничена. Следует отметить, что при глубинном росте культуры, когда субстрат доступен для мицелия во всем объеме, могли быть выявлены другие закономерности. В связи с этим на следующем этапе работы представляло интерес проверить активность отобранных штаммов Р-сИгуводепит, Р.дпэеогозеит и А.Аауиэ, при глубинном культивировании.

Показано, что коллагенолитическая активность, секретируемых дейтеромицетами ферментов была наиболее высокой у А.Аауиэ по сравнению с Р.сИгуэодепит и Р-дпвеоговеит (в 165 и 11 раз соответственно). Максимальные значения ферментативной активности и степени гидролиза коллагена для трех исследованных культур были выявлены на 7 сутки культивирования.

Одним из необходимых требований для использования продуцента в биотехнологии является подбор условий консервации, позволяющее обеспечить стабильность и сохранность их биохимических свойств. Из литературных данных известно, что в период хранения микроорганизмов возможны морфологические и биохимические изменения свойств штаммов. Поэтому в процессе хранения культур дейтеромицетов, обладающих коллагенолитической активностью сравнительное изучение выживаемости и секретирующей способности культур может служить тестом для отбора высокопродуктивных штаммов, представляющих интерес для биотехнологических целей. Исследована выживаемость и коллагенолитическая активность трех отобранных штаммов при различных температурных режимах хранения на гранулах силикагеля и под слоем минерального масла на среде Чапека (5°С). Показано, что жизнеспособность микроскопических грибов Р.сЬгуэодепит, Р.дпзеогоэеит при хранении на гранулах силикагеля в значительной степени зависела от температурного режима. Установленно, что каждый штамм требовал индивидуального подбора условий консервации. А.Аауиз при всех температурных режимах сохранял жизнеспособность и активность секретируемых коллагенолитических ферментов. Хранение на агаризованной среде под минеральным маслом при 5°С с периодическими пересевами раз в два года обеспечивало 100% выживаемость и стабильность коллагенолитической активности у А.Аауиэ,

Р.сЬгуэодепипл и Р.дпзеогозеит. Учитывая простоту и удобство последнего метода он был выбран для дальнейшей работы.

На основании исследования восьми культур дейтеромицетов коллекции микроорганизмов НИЦ БМТ с помощью разработанного комплекса показателей микромицет А.Аауиэ был выбран в качестве основного для дальнейших исследований так как обладал высоким уровнем коллагенолитической активности как при поверхностном, так и при глубинном культивировании, значительной скоростью роста и устойчивостью при хранении.

Как известно, состав питательной среды для культивирования микроорганизмов может существенно влиять на синтез ими биологически активных веществ. В связи с этим, на следующем этапе работы нами исследовалось влияние состава питательной среды на синтез дейтеромицетами коллагенолитических ферментов. Наиболее часто используемой средой для культивирования микромицетов является среда Чапека. Однако при использовании данной среды не обнаруживался синтез коллагенолитических ферментов дейтеромицетами. Из литературных данных известно [16, 143, 144, 161], что введение альтернативных сахарозе источников углерода в питательную среду может стимулировать синтез коллагеназ. Апробированная нами питательная среда, содержащая два источника углерода (0,5% сахарозы 1,5% коллагена), способствовала активации синтеза коллагенолитических ферментов. Таким образом, оптимизирован состав питательный среды для глубинного культивирования.

Для сопоставления динамики синтеза коллагенолитических ферментов с динамикой накопления биомассы дейтеромицетами в глубинных условиях, культивирование проводили с использованием солераство-римой фракцией коллагена. Установлена зависимость между накоплением биомассы и активностью синтеза ферментов, секретируемых А.Аауиэ. Показано, что максимальное количество биомассы образовывалась на 7 сутки роста культуры, в то время как максимальная удельная коллагенолитическая активность и степень гидролиза наблюдались на 10 сутки роста, то есть в стационарной фазе. Таким образом, выявлен двухфазный характер процесса.

Известно, что синтез микроорганизмами протеаз [14, 18, 24], в том числе коллагеназ [1-39,143, 161], носит чаще всего индуцибельный характер. Представленные выше данные, о стимуляции синтеза кол-лагенолитических ферментов при введении в среду коллагена для глубинного культивирования дейтеромицетов, свидетельствует о том, что в данном случае субстрат являлся индуктором. Состав агаризо-ванной среды при хранении микроорганизмов также может существенно влиять на их свойства. Исходя из этого, проводилось сравнительное изучение коллагенолитической активности дейтеромицетов при их хранении на различных средах (с индуктором и без). Установлено, что длительность хранения посевного материала на среде с индуктором влияла как на уровень УКА и степень гидролиза коллагена, так и на время достижения максимальных значений ферментативной активности. После хранения А.Аауиэ на среде с индуктором в течение 6, 14, 21, 24 и 25 месяцев наблюдалось сокращение сроков ферментации с 7 до 3 суток по сравнению с контролем (среда Чапека). Коллагенолитическая активность, секретируемых А.-Пауив ферментов после хранения на среде с коллагеном независимо от сроков была выше по сравнению с консервацией на стандартной среде. При этом с 6 по 21 месяц хранения наблюдалось постепенное увеличение активности коллагенолитических ферментов в опытном варианте. Дальнейшее хранение культуры А.Аауив первого пассажа (24 и 25 месяцев) на среде с коллагеном, приводило к постепенному снижению максимальных значений удельной коллагенолитической активности (УКА). Такое снижение возможно связанно с изменением биохимических свойств культуры, так как известно из данных литературы, что при хранении дейте-ромицетов на агаризованных средах под слоем минерального масла были выявлены макро- и микроморфологические изменения культур, проявляющиеся на определенных сроках консервации [30, 70].

Таким образом, показан выраженный индуцирующий эффект коллагена на синтез коллагенолитических ферментов секретируемых А.Аауиэ, при использовании белка в качестве компонента агаризован-ной среды при хранении культуры. Определено оптимальное время хранения культуры А.Аауив на среде с индуктором (21 месяц).

Аналогичные закономерности были выявлены и для культур Р-сИгуБодепит и Р.дпзеоговеит. Введение коллагена в питательную среду при хранении способствовало увеличению активности секретируемых ферментов (в 31,5 и 16,4 раза для культур Р.сЬгуэодепит и Р-дпвеоговеит соответственно) и приводило к сокращению времени ферментации, необходимого для достижения максимальных значений коллагенолитической активности (на одни сутки для Р.дп'зеогозеит и на 4 суток для Р.сИгузодепит).

Таким образом, показан индуцирующий эффект коллагена на синтез коллагенолитических ферментов для всех исследованных культур дейтеромицетов. Обнаружены родовые и видовые отличия в индуцирующем действии коллагена, что свидетельствует о необходимости индивидуального подбора оптимальных условий индукции. Введение коллагена, как основного источника углерода, в агаризованную среду для хранения культур было использовано в дальнейшей работе.

Как указывалось выше, при хранении дейтеромицетов нами использовались периодические пересевы. В связи с этим представляло интерес выяснить, сохраняется ли индуцирующий эффект при увеличении числа пассажей. Установлено, что хранение культуры А.Аауиз второго пассажа в течении 6, 14, 21 и 24 месяцев на среде с индуктором приводило к увеличению максимального уровня УКА и степени гидролиза коллагена по сравнению с первым пассажем на те же сроки. При этом во втором пассаже, так же как и в первом уровень УКА и степень гидролиза коллагена были максимальны через 21 месяц хранения на среде с индуктором. Увеличение продолжительности контакта указанной культуры с индуктором (до 24 месяцев) вызывало снижение активности секретируемых ферментов.

Таким образом, пассирование на среде с индуктором приводило к увеличению ферментативной активности культуры А.Аауиэ. Можно предполагать, что дальнейшее увеличение числа пассажей на среде с индуктором позволит повысить коллагенолитическую активность ферментов, секретируемых этим дейтеромицетом. Полученные результаты дают возможность предложить указанный технологический прием (пассирование на среде к коллагеном) для увеличения коллагеноли-тической активности микромицетов.

На заключительном этапе исследования разрабатывалась схема выделения и очистки коллагенолитических ферментов из культураль-ной жидкости АЛауив и изучались их некоторые физико-химические свойства.

Выделение и очистку коллагенолитических ферментов, секретируемых культурой А.Аауив в культуральную жидкость, проводили используя последовательно метод гель-фильтрации и аффиной хроматографии на синтезированном нами сорбенте, что дало возможность получить два электрофоретически гомогенных энзимных препарата со степенью очистки в 34 и 69 раза соответственно.

Коллагенолитическая активность этих ферментов была минимальна в области кислого значения рН. Смещение рН из кислой об

115 ласти в нейтральную, приводило к увеличению активности, а при рН больше 7,й- наблюдалось некоторое снижение активности энзимов.

Определение температурной зависимости ферментов выявило, их стабильность в интервале температур от 20° до 30°С. Повышение температуры до 40° - 60°С приводило к резкому падению уровня ферментативной активности, что обусловлено, по - видимому дестабилизацией структуры активного центра фермента или частичной его инактивацией.

Изучение влияния ингибитора металлопротеиназ (ЭДТА) на суммарную коллагенолитическую активность А.Аауиэ показало, что увеличение концентрации ЭДТА вносимого в агаризованную среду с коллагеном от 5x1 О^М до 2x10"2М, приводило к снижению роста колонии и уменьшению или полному отсутствию зон лизиса. Таким образом, изучение физико-химических свойств полученных ферментов позволяет отнести их к разряду нейтральных, термолабильных коллагенолитиче-ских металлопротеаз.

На основании проведенных исследований предложены основы технологических приемов получения коллагенолитических ферментов с использованием в качестве продуцентов дейтеромицетов (схема 4).

Схема 4. Блок-схема получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов в качестве продуцентов. I. Подготовительные этапы; П. Основные этапы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сухосырова, Елена Александровна, Москва

1. Агафонов В.А., Анисимов С.И. Способ определения активности коллагеназы. Патент А. С. 1173317 А., СССР. Заявл. 02.03.83. №3578526/28-13, опубл. в. Б. И., 1985., №30. МКИ G01 №33/48.

2. Адамян А.А., Глянцев С.П., Сахаров И.Ю., Саввина Т.В. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica на раневой процесс в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1992. №12. С.660-663.

3. Андреева Е.П., Орехов А.Н., Домогатский Г.А. Иммуноморфоло-гия исследований локализации коллагена I, III, IV и V типов в первичной культуре клеток аорты человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1983. Т.96. №10. С.110-112.

4. Аркадьева З.А. Факторы влияющие на жизненность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения // Биологические науки. 1983. №4. С.93-105.

5. Бабенко Ю.С., Куликова Т.Я. Влияние условий хранения на по-пуляционную изменчивость и активность штамма Streptomyces recifensis var. lyticus // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т.34. №8. С.563—566.

6. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. // М.: Пищ. промышленность. 1979. С. 120.

7. Балаевская Т.О., Соловьёва Н.И., Орехович В.Н. Изучение функциональных групп клостридиопептидазы // Биохимия, 1989, Т.51, №9, С. 1523-1529.

8. Бекер М.Е., Лиепинш Г.К., Райпулис // Биотехнология, М., Агро-пром издат. 1990. С.336.

9. Белецкая Л.В., Дмитриев А.А., Бухова В.П. и др. Коллаген IV типа базальных мембран эпителия кожи при некоторых формах патологии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1987. Т. 103. №5. С.598-600.

10. Белякова Л.А., Лебедева М.К., Налепина Л.Н. Микология и фитопатология. 1975. Т.9. Вып.2. С. 153-158.

11. Бушуева О.А., Кузнецов В.Д. Влияние условий хранения на антибиотическую активность и состав популяции Actinomyces sp. // Антибиотики. 1974. Т. 19. №12. С. 1099-1100.

12. Власова Е.В., Соловьёва Н.И. Простой способ получения высокоактивного препарата коллагеназы // Вопросы медицинской химии 1962. T.VIII, Вып.4., С.424-428.

13. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сери-новой протеиназы Bacillius subtilis шт. 72 // Биохимия 1991. Т.56. Вып.1 С.33-41.

14. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Способ получения коллагеназы // А. С. 4914908/13/0096 от 7.07.91 г.

15. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Коллагенолитическая активность Streptomyces sp. //Микробиология 1992. Вып.4. Т.61. С.629-633.

16. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Патент "Коллагеназа" Per. №95/04309/13 (007872). Приоритет от 3.04.95.

17. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Экзопротеазы синтезируемые Streptomyces lavendulae II Микробиология 1995. Т.64. №4. С.464-465.

18. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Коллагенолитические ферменты синтезируемые микроорганизмами. Обзор. // Микробиология, 1996. Т.65. №3. С.293-304.

19. Дёмина Н.С., Лысенко C.B. Коллагеназа синтезируемая культурой Streptomyces lavendulae // Микробиология 1996. Т.65. №6. С.758-762.

20. Довени Т., Гергий Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М. 1976. С. 165.

21. Доронина Н.В., Дроздова А.Н., Лауринавичус К.С., Троценко Ю.А. Способ хранения микроорганизмов //А. С. 1671682 СССР, МКИ 5С12 №1/100. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР №4711501/13. Заявл. 30.06.89. Опубл. 23.08.91., Бюл. №31.

22. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Способ хранения метилотрофных и гетеротрофных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т.28. №4. С.631-635.

23. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Павлюкова Е.Б., Белозерский М.А. Влияние условий культивирования на образование и секрецию протеаз грибами Alternaria alternata и Fusarium oxysporum. // Микробиология. 1995. Т.64. №3. С.327-330.

24. Егоров Н.С., Аркадьева З.А., Выборных С.Н., Лория Ж.К. Влияние условий хранения на стабильность таксонометрических признаков. // Прикладная биохимия и микробиология. 1980. Т. 16. Вып.5. С.729-733.

25. Емцева Т.В., Лаврова Л.Н., Константинова Н.Д. Влияние условий предварительного культивирования бактерий на их устойчивость и структуру клетки при замораживании и лиофилизации. // Микробиология. 1991. Т.60. №5. С.879-889.

26. Замараева Т.В., Лебедев Д.А. Поперечные ковалентные связи, стабилизирующие коллагеновую структуру. Обзор. // Вопросы медицинской химии 1989, Т.31, Вып.1 С. 10-23.

27. Иванова Н.М., Ходова О.М., Ваганова Т.И. и др. Выделение и свойства сериновой протеиназы Aspergillus oryzae. // Биохимия 1991. Т.56. Вып.1. С.33-41.

28. Иванова П.А. Коллаген и перспективы его использования в технологии лекарственных форм. // Фармация 1990, №1. С.81-83.

29. Игуменов Г.А. Иммобилизация клеток Agrobacterium radiopacter на твёрдых носителях // Микроорганизмы в сельском хозяйстве; Тезисы докладов 4 Всесоюзной научной конференции. Пущино. 20-24 января 1992. С.72-73.

30. Ильина К.А., Касенова A.A. Производство новых микробных препаратов в Казахстане. Алма-Ата: Наука. 1979. Т.25. С.109-112.

31. Истранов Л.П., Истранова Е.В., Сыченикова И.А. Строение, свойства и направление использования коллагена в технологии лекарственных средств // Фармация, 1984. Т.ЗЗ. №5. С.76-79.

32. Канунго М. Биохимия старения // Из-во "Медицина" М. 1982. С.278.

33. Климова O.A., Чеботарёв В.Ю. Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т.128. №9. С.308-313.

34. Климова O.A., Чеботарёв В.Ю. Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: энзимологиче-ские свойства индивидуальных компонентов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т.128. №10. С.391-396.

35. Климова O.A., Чеботарёв В.Ю. Препараты коллагенолитических протеаз беспозвоночных: Биохимические аспекты медицинского и косметологического применения. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т. 130. №7. С.70-75.

36. Ковалёв Л.И., Шишкин С.С., Иволгина Г.Л., Громов П.С., Шайда-ле А.М. Выявление межлинейного полиморфизма белков сердечной мышцы мышей методом двумерного электрофореза // Биохимия 1986. Т.51. №6. С.896-902.

37. Кулаев И.С., Соловьёва Н.И., Калебина Т.С., Нурминская М.В. Обнаружение и характеристика коллагенолитической активности сериновых протеиназ субтилизинового типа // ДАН. 1988. Т.ЗОЗ. №2. С.499-502.

38. Купина Н.М., Герасимова H.A. Характеристика протеолитических комплексов, выделенных из гепатопанкреаса крабов // Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т.35. №3. С.303-307.

39. Лакин Г.Ф. Биометрия М.: Высшая школа. 1980. С. 190.

40. Ландау Н.С., Егоров Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойства протеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima II Микробиология. 1996. Т.65. №1. С.42-47.

41. Левдикова Г.А. Выделение и некоторые свойства коллагеназы Clostridium perfringens// Биохимия 1966. Т.31. Вып.4. С.821-830.

42. Ленинджер А. Биохимия // Из-во "Мир" М., 1974. С.136-137.

43. Лысенко C.B., Дёмина Н.С., Васина C.B. О специфичности действия внеклеточных протеаз из Spertomyces sp. // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т.28. Вып.1. С.33-36.

44. Мазуров В.И. // Биохимия коллагеновых белков. Из-во "Медицина" М. 1974. С.247.

45. Мазуров В.И., Берман А.Е. Современные представления о свойствах и биосинтезе коллагеновых белков. // Физиология и патология соединительной ткани, Новосибирск. 1980. С. 14.

46. Михайлова Р.В., Лобанок А.Г., Сапунова Л.И., Шиманец С.С., Селиванова Н.Ю. Конститутивный и индуцированный синтез экзо-деполимераз микромицетами // Биомедицинские науки. 1990. Вып.4. С. 108-113.

47. Мурас В.А., Житкевич Н.В., Манко И.И., Самойленко В.И. Исследование некоторых функциональных изменений в клетках фито-патогенных бактерий при длительном хранении простыми методами // Микробиологический журнал 1994. Т.56. №1. С.85-90.

48. Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Характеристика коллагеновых фибрилл в процессе их образования // Биофизика, Т.40. №2. С.478-480.

49. Новикова Н.Д., Лебедь Э.С. Методы консервации культур // Антибиотики. 1980. Т.25. №1. С. 16-20.

50. Орлова P.C. Труды Института микробиологии и вирусологии А.Н. Каз. ССР. Алма-Ата: Наука. 1977. Т.22. С.46-50.

51. Остерман Л.А. Аминокислотный анализ // Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. С.515-527.

52. Парамонов Б.А. Климова O.A., Чеботарёв В.Ю. Препараты кол-лагенолитических протеаз беспозвоночных: Экспериментальное изучение влияния на иммунную систему. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т. 129. №6. С.643-645.

53. Петрова И.С. Протеолитические ферменты актиномицетов. // М.: Наука, 1976. С.60.

54. Пушкарёва Е.В., Получение очищенной коллагеназы из фильтрата культуральной жидкости Cl. histolyticum // Пермский НИИвакцин и сывороток. Тезисы докладов итоговой конференции -Пермь, 1985. С. 10-11.

55. Сахаров И.Ю., Глянцев С.П., Литвин Ф.Е., Гордеев В.Ф., Фармакологическое изучение коллагеназы камчатского краба Paralithodes camtschatica // Вопросы медицинской химии. 1994. Т.40. №3. С. 18-20.

56. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Артюков A.A., Кофанова H.H. Очист-. ка и характеристика коллагенолитической протеазы из гепато-панкреаса краба Paralithodes camtschatica // Биохимия. 1988. Т.53. Вып.11. С. 1844-1850.

57. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Влияние денатурирующих факторов на стабильность коллагенолитической протеазы краба // Биохимия 1989. Т.54. Вып.11. С. 1913-1918.

58. Сидякина Т.М. Методы хранения микроорганизмов. // Пущино.1988. С.23.

59. Скородумов Д.И., Костенко Т.С. Современные аспекты диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней животных.//М. 1998. С.6-8.

60. Слабова О.И., Никитин Д.И. Длительная выживаемость и сохранение активности иммобилизованных клеток водородных бактерий // Тезисы докладов 2-й Всесоюзной конференции по анабиозу. 1984. С.96-97.

61. Слабоспитцкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Коллагеноли-тическая активность бактерий рода Bacillus, выделенных из разных экологических источников. // Микробиологический журнал.1989. №6 С.54-56.

62. Слуцкий Л.И., Симхович Б.З. Молекулярная гетерогенность коллагена. // Успехи современной биологии, 1980. Т.89. Вып.1. С.58-73.

63. Слуцкий Л.И. Новое о структурных компонентах соединительной ткани и базальных мембранах. // Успехи современной биологии, 1984. Т.97. Вып.1. С.116-130.

64. Соловьёва Н.И., Балаевская Т.О., Макеева О.С., Орехович В.Н. Выделение и свойства 3-х коллагеназ Cl. histolyticum // Вопросы медицинской химии. 1980. Т.26. №5. С.674-677.

65. Соловьёва Н.И., Балаевская Т.О., Финеогенова М.П., Шибнев

66. B.А. Взаимодействие коллагеназ с некоторыми пептидными субстратами и ингибиторами // Биоорганическая химия. 1994. Т.20. №3. С.303-309.

67. Соловьёва Н.И., Орехович В.Н., Шибнев В.А., Лазарева A.B. Действие коллагеназ Cl. histolyticum на гекса и полипептиды // Биохимия. 1970. Т.35. Вып.З. С.579-584.

68. Таусон Е.Л., Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.С. Регуляция биосинтеза литического фермента и протеиназ у культуры Pseudomonas lytica // Прикладная биохимия и микробиология,1990. T.XXII. С.690-698.

69. Фатеева M.B. VI съезд ВМО: Тезисы докладов. Рига. 1980. Т.7.1. C.3-5.

70. Фатеева М.В. // Методы хранения микроорганизмов. Обзор. // Успехи микробиологии 1983. Вып.18. С. 193-218.

71. Хайдарова Н.В., Руденсая Р.Н., Степанов В.М., Егоров Н.С. Продукция протеиназ в процессе развития культуры Streptomyces thermovulgaris Т-54 // Прикладная биохимия и микробиология,1991. Т.27. Вып.З. С.375-381.

72. Шараев П.Н., Пишков В.Н., Зворыгина Н.Г., Шинкарева Л.Ф., На-польских В.М., Роготнев А.Н., Ибатов А.Д. Определение коллаге-нолитической активности плазмы крови // Лабораторное дело, 1987. №1. С.60-62.

73. Шелудько Н.С. Белковый состав миофибрилл кролика, определенный методом диск-электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия. // Цитология .1975. Т. 17. №10. С.1148-1154.

74. Яковлева М.Б., Козельцев В.Л. Протеолиз коллагена некоторыми видами микромицетов и спорообразующих бактерий. // Прикладная биохимия и микробиология, 1994. Т.ЗО. Вып.1. С.121-126.

75. Arai S., Li Z., Liao L., Cheng M., He L., Yin X., und Heidemann E. Untersuchung der collagenolytischen Aktivitet in einem chinesischen handelsüblichen Bakterienenzym. // Das Leder. 1996. V.3. P.52-56.

76. Areinsol J., Ruhl M., Acrermann R., Schuppan D. Collagen VI regulates normal and transformed mesenchymal cell proliferation in vitro. // Exp. Cell Res 1996. V.228. №2. P.289-291.

77. Arnold W.N., Mellelan M. V. Trehalose and glycogen levels during the initial stage of growth of Candida albicans // Phisiol. Chem. Phys. 1975. V. 7. P.369-380.

78. Asdornnithee S., Akiyama K., Sasaki T. and Takata R. Isolation and characterization of collagenolytic enzyme from Bacillus Licheniformis №22//J. Ferment. Bioeng, 1994. V.78. P.283-287.

79. Ashwood-Smith M.J., FarrantJ. Low temperature preservation in medicine and biology. Ed. by Pitman Press, London, 1980.

80. Axen R., Parath I., Ernback S. Proteins to polysccharides by means cyanogen halides // Nature, 1967. V.214. P. 1302.

81. Ayad S., Marriott A., Morgan K., Grant M. Bovine cartilage types VI and IX collagens. Characterisation of their forms in vitro // J. Biochemistry. 1989. V.262. №3. P.753-761.

82. Barrett A.J., Knight C.G., Brown N.A., A continuous fluorimetric assay for clostridial collagenase and Pz-peptidase activity // J. Biochemistry. 1989. V.260. №1. P.259-271.

83. Barthomeuf С., Pourrat H., Pourrat A. Collagenolytic activity of a new semialkaline protease from Aspergillus niger // J. Fermentation and Bioengineering 1992. V.73. №3. P.233-236.

84. Biondi P.A., Manca F., Negri A., Berrini A., Simonic Т., Suchi C. High-performance liquid chromatography assay of bacterial collagenase//Chromatographia., 1988. V.25. №7. P.659-662.

85. Bleed H.S. Non-specific clevage of collagen by proteinases in the presence of solidium dodecylsulfate // Scand. I. Dent. 1990. V.98. P.235-238.

86. Bleed H.S., Prolenic P. Sodium dodecylsulfate potentiates collagen degradation by proteases from porphyromonas (Bacteroides) gingivalis//FEMS. Microbiol. 1991. V.85. P. 125-132.

87. Boehringer M. Biochemica Cataloque. 1991. P. 108-109.

88. Bond M.D., Auld D.S., Lobb R.R. A convenient fluorescent assay for vertebrate collagenases // Anal. Biochemistry., 1986. V.155. №2. P.315-321.

89. Bond M.D., Van Want. Characterization of the Individual collagenase from Clostridium histolyticum. //J. Biochemistry, 1989. V.23. P.3085-3091.

90. Bosmans J. Methods of preservation of cultures // Mycopathol. et. mycol. appl., 1974. V.53 (1).

91. Bradley S.G. Actinomycete proteasesand their rote in regulation // Biology of Actinomyces / Eds. Okumi Y. et al. Tokyo: Jap. Sci.Soc.Press, 1988. P.261-272.

92. Bride D.I., Choe V., Shaprio I.R., Brodsky B. Altered collagen structure in mouse fail tendon lacking. // J. Mol. Biol. 1997. V.270. №2. P.275-284.

93. Bulleid N., Wilson R., Lees I. Type III collagen. Localisation and partial characterization // J. Biochemistry. 1996. V.317. №1. P.195-202.

94. Burgenson R.E. New collagens, new concepts. //Ann.Res. Cell. Biol. 1988. V.4. P.551-577.

95. Cao M., Niyibizi C., Kavalkovich K., Rizzo C. The Synthesis of type II collagen//J. Biochemistry., 1997. V.328. №1. P.305-310.

96. Chakraborty R., Chandra A.L. Collagenase of a new Streptomycete: its induction and purification // Enzyme and Microbiol. Technology. 1964. V.6 №10. P.462—466.

97. Chakraborty R., Chandra A.L. Taxonomy of a collagenase producing soil streptomycete // Indian J. Microbiol. 1985. V.25. №3. P.114-117.

98. Chakraborty R., Chandra A.L. Regulation of extracellular collagenase production in Streptomyces sp. A14. // Indian J. Exp.Biol. 1987. V.25. №9. P.641-643.

99. Chandler D. Cryopreservation of fungal spores using porous beads // Mycol. Res. 1994. V.98. №5. P.525-526.

100. Chem Y.L., Lu P.J., Tsaj J.H. Collagenolytic activity of crustacean midgut serine proteases: comparison with the bacterial and mammalian enzymes // Comparative Biochemistry and Physiology 1991. V.100. №4. P.763-768.

101. Chen S.Y., Wang L. Efficacy of liquid nitrogen preservation of Bacillus sp. strains V. 23 // ICCC VII: 7th Int. Congr. Culture collection Bieging. Oct. 12-16.1992. C.81.

102. Chon Y.L., Lu P.J., Tsaj J.H. Collagenolytic activity of crustacean midgut serine proteases: comparison with the bacterial and mammalian enzymen // Comparative Biochemistry and Physiology. 1991. V.100. №4. P.763-768.

103. Colowick S.P., Kaplan N.O. Proteolytic Enzymes I I Methods in Enzymology. 1970. V.14. Part B. P.861-872.

104. Costa C.P., Ferreira M.C. Preservacao de microorganismos // Rev. microbiol. 1993. V.22. №3. P.263-268.

105. Crespo A., Duchisne M., Cartwright T. et. at. Monoclonal antibodies against synovial collagenase: use for immunopurification and characterization of the latent and active enzyme // Collagen Rel. Res. 1988. V.1. P.1-10.

106. Curman S., Ballester F., Noelren M. Glomerular basement membrane. Identification of a novel disulfide chains of type IV collagen. // J. Biological Chemistry. 1998. V.273. №5. P.8767-8775.

107. Delaisse J.M., Eeckhout Y., Sear C. Galloway A., McCullagh K., Vaes G. A new synthetic inhibitor of collagenase // Biochemistry and Biophys. Res. Commun. 1990. V.133. №2. P.483-490.

108. Deng S.E., Chen J.H., Xu X.C. Effection preservation of yeast and Actinomyces by tube culture with rubber stopper // ICCC VII: 7th Int. Congr. Culture collection Bieging. Oct. 12-16.1992. C.94.

109. Dive V., Yiotakis A., Nicolaou A., Tuna F. Inhibition of Clostridium histolyticum collagenases by phosphonamide peptide inhibitors // Europ. J. Biochemistry. 1990. V.191. P.685-689.

110. Divles C., Beccon P. La conservation des microorganisms // Cah. ENS. Bana 1990. №7. P.227-277.

111. Draibach I.H., Merkel I.H. Induction of collagenase production in Vibrio B-30 // J. Bacteriol. 1987. V.135. №2. P.521-527.

112. Drake M.P., Davison P.F., Bump S., Smidt F.O. Action of proteolytic enzymes on tropocollagen and insoluble collagen // J. Biochemistry, 1966. V.5. №1. P.301-313.

113. Durcham D.R., Steward D.B., Stellwag E.J. Novel alkaline and heat stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain Gx 6638 // J.Bacteriol. 1987. V.169. P.2762-2768.

114. Ehnis T., Dieterich W., Bauer M. Achondroitin / dermatal sulfate from of CD 44 is a receptor for collagen XIV (undulin). // Exp.Cell Res. 1996. V.229. №2. P.388-397.

115. Eiji Ichishima, Megumi Yamaguchi, Hiroshi Yano, Youhei Yamagata, Kenishi Hirano. Specifity of a New Metalloproteinase from Penicillium citrinum. //Agnic. Biol. Chem. 1991. V. 55(8). P.2191-2193.

116. Eisen A.Z., Eugene A., Bauer M.D., leffrey I.I. Ph. D. Animal and human collagenases // J. Invest. Dermatol. 1970. V.55. №5. P.359-373.

117. Eisen. A.Z., Henderson K.O., Jeffrey. Bradhaw R.A, // A. collagenolytic protease from the hepatopancrease of the fiddler grab., Vca pugilator. Purification and properties // J. Biochemistry 1973. V.12. P. 1814-1822.

118. Eisen A.Z., Jeffrey J.J. An extractable collagenase from erustacean hepatopanereas // Biochim. et biophys. Acta 1996. V.191. P.517-526.

119. Euska J. Vysledky uchovavania microorganizmov lyofilization // Kvas. prum. 1991. V.37. №5. P.136.

120. Fennel D.J. Influence of conditions of storage of microorganisms on saving of cells // Bot. Rev. 1960. V.26. №1. P.79-141.

121. Galas H., Kalusewaka N.J. Proteinases of Streptomyces fradiae. Preliminary characterization and purification // Act a Microbiol. Polonica 1989. V.38. №34. P.247-258.

122. Goodfellow M. et. al. Actinomyces Enzymes // Actinomyces in Biotechnol. Acad. Press. 1988. P.220-283.

123. Graibach J.H., Merkel J.H., Induction of collagenase production in Vibrio B. 30//J. Bacteriol. 1978. P.521-527.

124. Grenier D., Mayrand D. Selected characteris fics of pathogenic and nonpathogenic strains of Bacteroides gingivalis // J. Clin Microbiol. 1987. V.25. P.738-740.

125. Gross J., Hihgberger J. H., Schmitt F. O. Extraction of collagen from connective tissue by neutral salt solutions. // Proc. nat. Acad. Sci USA, 1955. V. 41. №1. P. 1-7.

126. Harihara B.N. The Enzymes // Ed. Y.: Acad. Press. 1960. V.4. P.193-320.

127. Hartung B. Streptomyces als Bildner industriell and diagnostisch bedeutsamer Enzyme //Acta Biotechnol 1989. №2. P. 157-172.

128. Hisano T., Abe S., Wackashiro M., Kimura A., Murata K. Isolation and properties of a collagenase with caseinolytic activity from a Pseudomonas sp. // J. Ferment. Technol. 1989. V.68. №6. P.399-403.

129. Hohenester E., Sasaki T., Olsen B., Timpl R. Crystal structure of the angiogenesi inhibitor endostatin at 1,5 A resolution // EMBO Journal. 1998. V.17. №6. P. 1656-1664.

130. Hurion N., Tromentin H., Keil S. Specificity of the collagenolytic enzyme from the fungus Entomophthora coronata: comparison with the bacterial collagenase from Achromobacter iophagus // Arch. Biochemistry. Biophys. 1979. V.193. №2. P.438-445.

131. Hussein J. Preservation and viability of Azotobacter for more tran ten years // Futon 1990. V.43. №1. P.5-7.

132. Jimenez S.A., Bashey R.I., Benditt M. About methods of storage of some strains of microorganisms in the dried up status on filling materials // Biochemistry and Biophys. 1987. V.78. №4. P. 13541356.

133. Jones D., Pell P.A., Sneath P.H. Maintenance of bacteria on glass beads at -60°C to -70°C. // In Maintenance of microorganism. A manual of laboratory methods. E.D. by B.E. Kirson and J.J.S. Snell, Acad.Press, New York, 1984. P.35-40.

134. Jto T. Cryopreservation (-80°C) of fungal cultures and their transport after defrosting // ICCC VII: 7th IntCongr. Culture collection Bieging. Oct. 12-16. 1992. C.79.

135. Kabadjova P., Vlahov S., Dobrev I. Isolation and some properties of collagenolytic enzymes from Streptomyces candidus 91. // Chem.Technol. 1997. V.50. №2. P.55-98.

136. Kasten M., Burkhardt H., Vonroden H., Rauls S. A spectroscopic collagenase assay using peroxidase-labeled collagen // Anal. Biochemistry. 1989. V.176. №1. P. 108-109.

137. Kato T., Takahashi N., Kuramitsu H.K. Sequence analysis and characterization of the Porphyromonas gingivalis prt C gene, with a novel collagenase activity // J. Bacteriol. 1992. V.174. №2. P.3889-3895.

138. Kawahara H., Kusumoto M., Obata H. Isolation and characterization of a new type of Collagenase Producing Bacterium Bacillus alvei DC-1 // Biosci Biotech, Biochemistry. 1993. V.57(8). P. 1372-1373.

139. Keil-Dlovha V., Miskahi R., Keil B. The induction of collagenase and a Neutral Proteinase by their High Molecular weight Substrates in Achromobacter iophagus//J. Mol. Biol. 1976. V.107. P.293-305.

140. Klimova O.A., Borukhov S.J., Solovyeva T.J. et al. The isolation and properties of collagenolytic proteases from crab hepatopancreas // Biochemistry and Biophys Res. Communs 1990. V.166. P.1411-1420.

141. Kundu A.K., Manna S., Pal N. Purification and properties of a new extracellular collagenase from Aspergillus sclerotiorum // Indian. J. Exptl. Biol. 1974. V.12. P.441-443.

142. Labadie J.G. Isolation of a Collagenolytic Gram Negative Yellow Pigmented Bacterium //Agric Biol. Chem. 1982. V.46. №12. P.2903-2907.

143. Labadie I.G. Synthesis of collagenase by the phytopathogenic bacterium Corynebacterium rathayii. //J. Appl. Bacteriol. 1990. V.69. P.828-833.

144. Labadie I. G., Gaillard B., Potier P. Involvement of the collagenase produced by Corynebacterium rathayii in its adhesion to collagen. // FEMS. Microbiol. Lett. 1991. V.19. P.75-82.

145. Lang L.K., Groth J. Methods for preservation of fungi // Rev. Microbiol -1991. V.22. №4. P.268-272.

146. Lapage S.P., Redwey K.F., Rudge R. Handbook of Microbiology // Eds. A.I. Laskin, H.A. Lechevaller. 1978. V.2. P.743-758.

147. Lecreisey A., Keil Dloucha V., Woods D.R., et. al. Purification stability and inhibition of the collagenase from Achromobacter iophagus // FEBS Letts 1975. V.59. №2. P.167-172.

148. Lee Y.P., Takahashi T. An Improved colorimetric determination of amino acids with the use of ninhydrin. // Analytical Biochemistry 1996. V.14. P.71-77.

149. Lim D.V., Jackson R.J., Pullvongrueniger C.M. Purification and assay of bacterial collagenases // J. Microbiol. Methods. 1993. V.18. №3. P.241-253.

150. Lindy S., Sersa T., Suemalainon K. et al. Hyperchromic effect of collagen indyced by human // J. Europ. Biochemistry. 1986. V.156. P.1-4.

151. Lobanok A., Mikhailova R., Malamene B. Macerating enzymes of bacteria and fungi. // Soviet-Finnish Seminar on Microbial Degration of Lignocellulose Raw Materials. Tbilisi. Oct.29-31. 1985. Puschino. 1986. P.82-94.

152. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol.Chem. 1951. V.193. №1. P.265.

153. Malik K.A. The developments in the maintenance and preservation of phototrophic bacteria. In: Proceedings of the IV. Int. Conf. On Culture collections Brno, Czechoslovakia, July 20-24, Abstracts, 1981. P.15.

154. Malik K.A. A new method for preservation of microorganismus by liquid -drying under anaerobic conditions // J. Microbiol. Meth. 1992. V.14. №4. P.239-245.

155. Matsushita O., Yoschihara K., Natayama S.J., et. al. Purification and characterization of a Clostridium perfringens 120 kDa collagenase and nucleotide sequence of the correspording gene // J. Bacteriol. 1994. V.176. P. 149-156.

156. Mayrand D., Holt S.C. Biology of asaccharolytic blackpigmented Bacteroides sp//Microbiol. Rev. 1988. V.52. P. 134-152.

157. Minachun Z., Longyun S., Xiaoling L., at et. Preservation of Streptomyces griseus in liguid nitrogen study and use in industrialproduction. // ICCC VII: 7th Int. Congr. Culture collection Bieging. 1993. P.83.

158. Mizaki T., Yamada T., Sawada J. Studies on the protease constitution of Aspergillus oryzae // Agnic. Biol. Chem. 1970. V.34. №9. P. 1383-1392.

159. Monboisse J., Labadie J., Goue P. Induction et repression de la synthese de collagenase chez Acinetobacter sp. // Can J. Microbiol. 1979. V.25. P.611-617.

160. Moor S., Stein W.H. Chromatografic determination of amino acids by the use of automathic recording equipment // Methods in enzymology. 1963. V.6. P.819-831.

161. Morihara K., Oka T., Tsuzuki H. Multiple proteolytic enzymes of Streptomyces fradiae production, isolation and preliminary characterization // Biochim. et biophys. Acta. 1967. V.139. P.362-397.

162. Nogano H., To K.A. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bac. subtilis FS-2. // Biosc. Biotechnol. Biochemistry, 2000. V.64. №1. P. 181-183.

163. Nordwing A. Collagenolytic Enzymes. // N.Y.: Acad. Press 1971. P. 155-206.

164. Nordwing A., Jahn W.F. A collagenolytic enzyme from Aspergillus oryzae. Purification and properties // European J. Biochemistry. 1968. V.3 P.519-529.

165. Palubinskas V.l., Yankevich N.B., Yanulaitene K.K. etah Trypsin-like enzyme from Streptomyces 771. Purification and properties of native and immobilized enzyme// Appl. Biochemistry. Biotechnol. 1984. V.9. №3. P.231-241.

166. Park K.B., Lable R.C. Purification and characterization of intracellular proteases of Clostridium perfringens type A II Cañad J. Microbiol. 1991. V.37. P. 19-27.

167. Peszynska-Czoch W. Nordaraki M. Actinomyces Enzymes I I Actinomyces in Biotehnol. // Ed. Goodfellon M. N. Y.: Acad.Press.1988. P.219-283.

168. Peterkofsky B. Bacterial collagenase // Methods in Enzymolodgy / Eds. Cunningham L.W. Frederiksen D.W., N. Y., L. 1982. Part II. V.82. P.453-471.

169. Petersen L., James T. Structure of collagen // Nature Struct. Biol. 1998. V5, №10.

170. Pichlajniemi A., Tamminen M. Type IX collagen and chimeras. // Biotehnol. Newswateh ,1997. №18. P.7.

171. Piez K.A. Collagen chaina, crosslinks and types. // J. Cell Biohem -1993. Suppl 17E. P. 143.

172. Rathi M., Asokan R., In vivo of dermal and tendon type I collagen // Biochemistry. Med. and Metab. Biol. 1989. V.1. P.70-76.

173. Reid G.G., Robl F.T. and Woods D.R. Regulation of extracellular collagenase production in Achromobacter iophagus // Journal of General Microbiology 1988. V.109. P. 149-154.

174. Renko M., Vitable L., Kokoly M., Pokorny M. Streptomyces rimosus extracellular proteases. 4 Trypsin-like protease // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V.31. №1. P.38-41.

175. Rieden K., Kuehn M., Richfer S. Verfahren zur Konservierung von Microorganismen in Polyvinylalkohol // Forschungs Zentrum

176. Biotehnologic, Zentralinstitut fur Microbiologic der Academic der Vessenschaften № 2958123 Заявл. 31.10.86. Опубл. 07.11.90.

177. Ronziere M., Sylvie R., Hartman D., Garrone R. Comparative analysis of collagens Solubilized from human foetal // Biochim. ef Biophys. Protein structurand Mol. Enzymol. 1990. №2. P.195-202.

178. Rosen H.A. Modified ninhydrin colorimetric analysis for amino acids If Arch.Biochemistry. Biophys. 1957. V.67. P. 10-15.

179. Sasagawa Y., Kamio Y., Matsubara Y., Suzuki K., Kojima H., Izaki K. Purification and properties of collagenase from Cytophaga sp. L. 411 strain. // Biosci. Biotechol. Biochemistry., 1993. V.57. P. 1894-1898.

180. Schlage L, Walter K. A rapid and sensitive microassay for bacterial collagenase and other proteolytic activities on collagenous substrates // Biol.Chem. Hoppe-Sealer. 1988. V.369. №5. P.357-363.

181. Schoenlein L.K., Lucon C.M. Survival of fungi preserved by lyophilization after 49 years // Rev. microbial. 1993. V.24. №3. P.207-211.

182. Sehah N., Sharma M., Kirkpatrick A. Gly-Gly containing triplets of Ion stability adjacent to a type III collagen epitope // Biochemistry 1997. V.36. №19. P.5878-5883.

183. Seifter S., Gallop P.M. The structure proteins. // The proteins // Ed. Neurath H. N.Y.: Acad.Press., 1966. V.IV. P.155-161.

184. Seifter S., Harper E. The collagenases // Methods in Enzymology / Eds. Prelman G.E., Lorand L. N.Y., San Francisco: Acad.Press, 1970. V.82. P.649-697.

185. Sela S., SchickJer R., Chet J., Spiegel Y. Purification and characterization of a Bacillus cereus collagenolytic / proteolytic enzyme and its effect on Meloidogyne javanica cuticular proteins. // Erop. J. Plant Pathol. 1998. V.104. №1. P.59-67.

186. Sincha U., Wolz S.A., Lab P.J. Two new extracellular serine proteases from Streptomyces fradial // Ind. J. Biochemistry. 1991. V.323. P.979-984.

187. Smith D. The use of cryopreservation in the ex-situ conservation of fungi // Cryo-Lett. 1998. V.19. №2. P.79-90.

188. Smith M.J., Farrant J. Low temperature preservation in midicine and biology. // Pitman Press, London 1980.

189. Susagawara R., Harper E., Purification and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum // Biochemistry. 1984. V.23. P.5175-5182

190. Takahashi N., Kato T., Kuramitsu H.K. Isolation and preliminary characterization of the Porphyromonas gingivalis prt C gene expressing collagenase activity // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V.84. P. 135-138.

191. Terentiev A.Nn Kadetov V,V, Cryoconservation of the vaccine strain Yersinia pestis EV 76 // Cryo-Lett 1993. V.14. №3. P.177-184.

192. Tioktopulo E.J., Kajava A.V. Denaturation of type I collagen fibrils is an endothermic process accompanied by a noticeable change in the partial heat capacity// Biochemistry 1998. V.37. №22.

193. Tokuyama T. A method for long-term preservation of bacterium Nitrosomonas using silicagel powder // Nipon biseibutsu seitai gakkaiho. Bull. Jap.Soc. Microb. Ecol. 1994. V.9. №3. P.119-123.

194. Tsujibo H., Miyamota K., Hasegawa T., Inamor A. Y. Purification and characterization of two types of alkaline serine proteases producedby an alkalophilic Actinomyces // J. Appl. Bacteriol. 1990. V.69. №4. P.520-530.

195. Van Wart H.E., Steinbrink D.R. A Continuous spectrophotometer assay for Clostridium histolyticum collagenase // Anal. Biochemistry. 1981. V.113. P.356-365.

196. Vguyen Thanh Tong, Tsugita Arika, Keil Dlouha Vera (Purification and characterization of two hing-molecular mass from of Achromobacter collagenase) // Biochemistry et biophys. Acta: Protein Struct, and Mol. Enzymol 1988. V.874. №3. P.294-304.

197. Vitto H.J. Biological mechamism of collagen resorption. // Arch. Biochemistry and Biophys. 1990. V. 192. №2. P.371 -374.

198. Warren C.H., Gray J.A. A simplified culture medium for the production of collagenase // Nature. 1961. V.192. P.755-756.

199. Weingarten H.I., Feder I. // Monsanto Co. Пат.16.01.84. №571227, опубл. 11.02.86. МКИ с 12 Q/38, НКИ 435/23.

200. Weingarten H.I., Martin R., Feder J. Synthetic Substrates of vertebrate collagenase // Biochemistry., 1985. V.24. №23. P.6730-6734.

201. Yang LH., Wu A.P., Tang S,Y. Research on the different methods for preservation of glucoamylase-production Strain // ICCC VII: 7th Int. Congr. Culture Collections Beijing, 1993. P.84.

202. Yiotakis A., Hatgiyannacou A, Dive Y., Toma F. New thiol inhibitors of Clostridium histolyticum collagenase. Importance of the P3' position // Europ. J. Biochemistry. 1988. V.172. P761-766.

203. Zhen-Kun Linh. Long term preservation of Living and pathogenic fungi / ICCC VII: 7 th Int. Congr. Culture collection Bieging. Oct.12-16.1992. P.82.

Информация о работе

Сухосырова, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2002
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка биотехнологических подходов получения коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицетов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы