Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства гумус-фенолоксидазных комплексов

ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Свойства гумус-фенолоксидазных комплексов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОМ

Факультет почвоведения

на правах рукописи

ГУЛЬКО АЛЕКСАНДР ЕФИМОВИЧ

СВОЙСТВА ГУМУС-ФЕНОЛОКСИДАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ

03. 00. 27 - почвоведение

Автореферат лиесертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в лаборатории почвоведения Института биологии Банкирского научного центра УрО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Ф. X Хазиев

Официалные оппоненты:

доктор биологических наук Д. С. Орлов

кандидат сельскохозяйственных наук Б. М. Когут

Ведущее учреэдек««: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН (Пувдно)

Защита диссертации состоится " /■> " 1994». в /О

на ааседанш1 специализированного совета при МГУ (К 053.05.16) по адресу: 119899, Москва. Ленинские горы, факультет почвоведения МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета

почвозедения МГУ

Автореферат разослан " /) " К19941.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Г. Е Мотузова

Актуальность проблемы. Участие почвенных ферментов в реакциях трансформации органических и неорганических веществ в почве в настоящее время не вызывает сомнений. Исторически сложилось так, что чисто утилитарный подход к почве как к средству сельскохозяйственного производства наложил соответствующий отпечаток на выбор объектов и методов почвенной энзимологии. Изучение почвенного плодородия как способности почвы обеспечивать растения необходимым комплексом условий их произрастания вызвало к жизни необходимость углубленного изучения гидролитических процессов в почве. На протяжение длительного этапа времени большее внимание уделялось почвенным гидролазам. В значительной мере эта тенденция сохраняется и сейчас. Однако, по нашему мнению, существует 3 группы обстоятельств, демонстрирующих необходимость изменения существующего положения вещей. 1. Воспроизводство почвенного плодородия связано с накоплением, воспроизводством и сохранением гумуса. Есть мнение, что роль оксидоредуктаз в процессах биогенеза гумуса весьма значительна. 2. Оксидоредуктазы принимают участие в окислении и детоксикации различных ксенобиотиков, попадающих в почву во все больших и больших количествах. 3. Значительная часть реакций, которые являются частью почвообразовательного процесса, происходит с участием оксидоредуктаз, "работающих" как на стадии выветривания породы, так и на более поздних этапах.

Очевидно, что меньиая изученность окислительных процессов в почве отнюдь не означает их меньшую значимость. Настоящая работа является нашим скромным вкладом в изучение почвенных оксидоредуктаз. Ферменты пероксидаза и полифенолоксидаза заинтересовали нас в первую очередь в связи с тем, что являются потенциальными биокатализаторами реакций гумусообразования.

Дели и задачи исследований. Цель исследований, описанных в настоящей работе, состояла в изучении фенолоксидаз почв и гумусовых препаратов. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи.

1. Изучить возможность образования комплекса "гуминовая кис-лота-пероксидаза" в условиях in vitro и охарактеризовать активность и свойства такого комплекса.

2. Изучить возможность комллексирования предварительно выде-

ленной и очищенной грибной полифенолоксидазы с почвенной гуминовой кислотой и охарактеризовать активность и свойства гумус-полифеиодоксидазного комплекса

3. Экстрагировать из почвы активный гумус-фенолоксидазный комплекс и сравнить его свойства со свойствами полученных in vitro гумус-ферментных систем.

4. Изучить закономерности годовой динамики почвенной фено-локсидазной активности и ее статистические связи с некоторыми показателями гумуснсго состояния почвы.

Научная новизна диссертации. Традиционно основным методологическим приемом, используемым для изучения гумус-ферментных комплексов, является выделение их из различных сред (в т.ч. почвы) и изучение определенного набора параметров. характеризующих эти свойства. Нами использовался другой подход - сравнение свойств искусственных и естественных гумус-ферментных систем с использованием как для тех, так и для других, одинаковых условий определения активности и одинакового набора изучаемых свойств: локализация ферментов на молекулах гуминовых кислот, влияние рН и температуры на активность и стабильность, кинетические характеристики. Установлено, что принципиальных различий в активности и свойствах искусственных и нативных гумус-фенодоксидазных комплексов не существует. Впервые с использованием данных кинетического анализа предпринимается попытка обьяснения молекулярных механизмов иммобилизации фенолоксидаз на ГК и проявления их активности. Впервые метод гель-фильтрации использован для изучения характера и степени иммобилизации ферментов на ГК. Показано, что ферменты локализованы в строго определенных молекулярно-массовых фракциях ГК. Впервые вопрос о роли фенолоксидаз в биогенезе и минерализации гумусовых веществ обсуждается с использованием данных полевых и лабораторных экспериментов. Показано, что традиционный взгляд на пероксидазу как Сиокатализатор минерализации гумуса нувдается в пересмотре или дополнительном обсуждении.

-Апробация -диссертации.. Основные положения диссертации докладывались на 3 Всесоюзном Симпозиуме "Биодинамка почв" (Таллинн/ 1988), на Межрегиональной научной конференции молодых.ученых

"Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1989), на X научной конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ (Москва, 1989), на Всесоюзной коференши "Гуминовые вещества в биосфере" (Москва, 1990), на Всесоюзной конференции "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 5 работ, 2 работы в печати.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, ¿Г глав, заключения, выводов и списка литературы (106 наименований, в т.ч. 50 иностранных авторов). Обьем ntpramsi составляет 119 страниц, в т.ч. 10 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы.

В соответствии с системно-экологической концепцией ферментативной активности почв (Хазиев, 1982) обобщены и проанализированы литературные данные о продуцировании, иммобилизации и активности ферментов пероксидаза и полифенолоксидаза. Пероксидаза продуцируется в почву корнями растений и микроорганизмами, однако преимущество в продукционном процессе принадлежит корням растений (Ку-товая, 1984; Петерсон, Периг, 1984; Петерсон с соав., 1986; и др.). Основным источником продуцирования полифенолоксидазы в почву являются микроорганизмы, в частности почвенные грибы (Муха, Поспелов, 1988; Мирчинк, 1988; Mayaudon, Sarcar, 1975; Leonowlcz, Bollag, 1987; и др.). Оба фермента существуют в почве как в свободном состоянии, так и в форме органо-минеральных ферментных комплексов ( Петерсон, Курыляк, 1982,1983; Bol lag et al., 1987; Nissenboum, Serban, 1987; Claus, Fllip, 1985; и др.). Фенолокси-дазы при попадании в почву приобретают повышенную устойчивость к инактивируюиим влияниям среды, таким как протеолиз, кислотно-щелочная и температурная инактивация (Serban, Nissenboiun, 1986; Sarcar et al, 1989; etc.). Явление повышенной устойчивости к инактивирухщим факторам авторы объясняют тем, что ферменты из

~Ч -

свободного состояния переходят в связанное, иммобилизуясь на различных носителях (Березин с соав., 1977), в том числе глинистых минералах (Claus, Fi lip, 1988) и гумусовых кислотах (Бергулева, Глушенко, 1983; Маеько, Галушко, 1989; Ruggiero, Radogna, 1987, 1988; и др.). Установлено, что фенолоксидазы могут катализировать реакции окислительной полимеризации фенольных производных (Martin, Haider, 1980; Sarcar et al., 1988; Lenowlcz et al., 1984; Simmons et al, 1988; etc.), что исключительно важно с точки зрения изучения гумификационного процесса.

Глава 2. Объекты и метода исследований

Все исследования, описанные в настоящей работе, выполнены на типичном черноземе Предуральской степи. Для выделения гуминовых кислот и гумус-ферментных комплексов использовали почвенные образцы из пахотного горизонта (0-20 см). Определение фенолоксидаз-ной активности почвы и некоторых показателей гумусного 'состояния проводили в рамках многолетнего полевого опыта, заложенного для изучения влияния удобрений на сьойства типичного чернозема при различных системах обработки почвы в севообороте. Применяли следующие виды удобрений: навоз (60 т/га в начале ротации и 10 т/ га ежегодно); солома гороховая и пшеничная (3 т/га ежегодно); N60P60K60

Ферментативную активность фенолоксидаз и гумус-фенолокси-дазных комплексов определяли по прописи Wortington (1979). Фено-локсидазную активность почвы определяли по Л А. Карягиной и Н. Л. Михайловской (1986). Препараты гуминовых кислот выделяли по общепринятым методикам (Орлов, Гришина, 1981). Экстракцию гу-мус-фенолоксидазных комплексов проводили с использованием элементов методик выделения и очистки гумус-ферментных комплексов, описанных в литературе.

Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием общепринятых и оригинальных программ на ПК IBM PC.

Глава 3. Взаюодействие пероксидааы с гумкновой кислотой

Цри добавлении гуминовых кислот к раствору фермента наблюдалось снижение его активности. Нами было предположено, что сниже-

ние активности происходит вследствие связывания молекул фермента и ГК. Для осаждения ферментов, иммобилизованных на ГК, в среду добавлялся протаминсульфат. По разнице между первоначальной активностью и активностью супернатанта после внесения ГК и прота-минсульфата определялась доля связанного фермента. Она составляла в зависимости от концентрации ГК в смеси от 4 до 28 %. Добавление в реакционную среду СаС12не приводило к снижению пероксидазной активности в присутствие ГК - связывания не происходило. Наблюдаемое явление свидетельствует о существовании катионообменных взаимодействий. когда Са конкурирует с ферментом за связывание с соответствующей функциональной группой ГК и, как следствие, подтверждает возможность существования ионной связи между молекулами пероксидазы и ГК. Для решения вопроса о том, с какой молеку-лярно-весовой фракцией ГК связывается фермент в процессе иммобилизации решено было использовать метод гель-фильтрации. В результате проведения раздельной и совместной хроматографии ГК, чистой пероксидазы, гумус-пероксидазного комплекса и совмещение хрома-тографических профилей и профилей пероксидазной активности ( рис. 1) показано, что большая часть ферментных молекул в процессе иммобилизации закрепляется в высокомолекулярной фракции ГК. Пик меньшей активности совмещался с пиком выхода белка. _ Это может свидетельствовать о грех обстоятельствах. 1. Часть фермента иммобилизована на низкомолекулярной фракции ГК 2. В хроматографируе-мой смеси имеется часть свободных ферментных молекул. 3. В процессе элюирования буфером с высокой ионной силой часть ферментных молекул, связанных с ГК непрочными ионными связями, высвобождается. Большая же часть молекул пероксидазы прочно связана с ГК ко-валентными связями.

При изучении влияния рН на активность комплекса "ГК-перокси-даза" (рис.2 А) обнаружено, что оптимум активности гумус-ферментного комплекса сдвинут в щелочную сторону по сравнению с оптимумом активности чистого фермента. Такое явления характерно для ферментов, иммобилизованных на полианионных носителях. Кроме того, при крайних (неблагоприятных) значениях рН активность комплекса оказалась выше, чем активность чистого фермента в таких же условиях. Профиль активности гумус-ферментного комплекса был шире, чем профиль активности чистого фермента, что объясняется, по-

Рисунок 1. Гель-ср::.льтрация ГК (а); чистой псроксэдаэы (б);

комплекса "ГК-порокеидаза"; иерокепдазная акт ив-ност.1, фракция (г).

Р;:сунок 2. pH-npc.ilакгииюста гумус-¿5р:.х-й7йога коып'л-к-с а (1); ч'."Л'ого (1ир;.-«?;гга (''■). Л - :

скотома; Б - с:!"'.'';:.!."'.

видимому, эффектом экранирования активного центра белка функциональными группами ГК. Иначе говоря, ГК "защищает" фермент от кислотно-щелочной инактивации.

Изучение влияния температуры на активность гумус-пероксидаз-ного комплекса показало (рис 4), что чистый фермент инактивиро-вался при t 60-70°С, а иммобилизованная перогссидаза сохраняла активность даже при 70 и 80°С. Когда нагретые препараты охлаждали до температуры оптимума, оказалось, что чистый фер^энт практически не восстанавливает прежней активности, чего нельзя сказать о комплексе "ГК-пероксидаза". Таким образом, иммобилизация перокси-дазы на ГК предохраняет фермент от температурной инактивации и делает ее частично обратимой.

Измерение кинетических констант чистой и иммобилизованной пероксидазы показало, что значение Км гумус-пероксидазного комплекса выше, чем значение К„чистого фермента. Значения VH/tx для свободной и связанной пероксидазы одинаковы. Это 'свидетельствует о том, что в наблюдаемых условиях ГК, конкурируя со специфическим субстратом пероксидазы за связывание с функциональными группами активного центра молекулы фермента, может выступать в роли неспецифического субстрата.

Глава 4. Езаююдэйстшкз полифенолоксадазы с гуминовой кислотой

Для изучения свойств иммобилизованной на ГК полифенолоксида-зы мы использовали фермент из культуры гриба Alternarla Alternata При определении субстратной специфичности полученного препарата обнаружилось, что наибольшую активность он проявлял по отношению к о-фенилендиамину - тому же субстрату, который использовался в опытах с пероксидазой. Ферментный препарат проявлял также пероксидазную активность. При смешивании полифенолоксидазы с ГК в связанное состояние переходило около 60% фермента. Добавление СаС1гтак же, как в опытах с пероксидазой, препятствовало образованию комплекса фермента с ГК

Гель-фильтрация гумус-полифенолоксидазного комплекса показа-ла(рис. 3), что наибольшее количество фермента находится в низкомолекулярных фракциях ГК, а высокомолекулярная фракция ГК вовсе не содержит фермент. Несмотря на высокую ионную силу элюирухщего

Zt:.,

'/и

л

сч

\

so

N

S)

50

У

Г/40А ,

VC/I ^д

50

¿"0 ""

Ригу:т; 3. 1Т. (е.); r.o:.mei:ea "ГК-поллфэтл

окендои (tí); тмийяолиюндаанзя шяшшость !Ípa;«::í! (ц).

Г>4 -'.г.

1С

>,о .-■С

<с

-íl

L'iJt

IIJUl

V

. м i .ькЦ

f]i

м

К! С

п

ЧС 5С 1С К SO 9V

Т'

.':;.-!!с;: ■!. Екшюе температура на активность частого фермента ( □ ); искусственного гумус-Ферментного коы-

ил .тли ( Н ). л ■■ п-.'риксилазнм система, Е - по-J!:I.;>:H енлемн.

А

раствора, гумус-полифенолоксидазный комплекс в процессе хроматог-рафирования не разрушается, что может означать наличие прочных ковалентных связей в комплексе "ГК-фермент".

При измерении кинетических характеристик полифенолоксидазных реакций обнаружилось, что наблюдаемая картина соответствует ферментативной кинетике реакций с участием конкурентного ингибитора, когда под его влиянием не изменяется, а К^ реакции в присутствие ингибирующего агента увеличивается по сравнению с К^ реакции без ингибитора (рис.7).

Изучение влияния рН на активность полифенолоксидаэы и гумус-полифенолоксидазного комплекса показало (рис. 2Б), что оптимум чистого ферментного препарата находился в области рН 6.9, а оптимум гумус-ферментного комплекса - 7.0-7.1. Наблюдаемая картина почти полностью совпадает с той, которая имела место в опытах с пероксидазой. В кислой области рН активность гумус-ферментного комплекса была ниже, чем активность чистого фермента. В области рН > 7.О активность чистого фермента снижалась с большей скоростью, чем активность гумус-ферментного комплекса Температурная инактивация гумус-фенолоксидазного комплекса также наступала медленнее, чем инактивация чистого фермента (рис. 4). Таким образом, комплектование полифенолоксидаэы с ГК предохранияет ее от температурной и кислотно-щелочной инактивации.

Глаза 5. Выделение из почбы гуминовых кислот, сблздакпу« фоколоксцдазной активностью.

Приступая к решению задачи об экстрагировании из почвы активного гумус-фенолоксидазного комплекса, мы столкнулись с проблемой выбора эффективного экстрагента. Проанализировав литературные данные по этому вопросу, мы обнаружили, что не существует оптимальной методики экстракции, так как различные авторы используют разные экстрагенты для разных почв, определяют активность различных ферментов с использованием множества методик. Однако, использование слабощелочного раствора пирофосфата натрия в ряде работ позволяло добиться высокого выхода органического вещества с наименьшими потерями активности фермента. Поэтому нами был использоган также пирофосфат натрия. Процедура выделения И очистки гумус-фэнолоксидазных комплексов типичного чернозема

Гасунок 5". [Схема выделения гумус-фэаолоксидазнаго комплекса типичного чернозема.

Расуаок 6. гг.ъ-ъидьтрацт гумшювой -kiiczotu (А), комплекса ";-:г;г,п:о1ая т:с^ота-пот1еиолокс',\дага" (Б) :¡ 1:0-т.лп.огхшдагюая сйсгпвность фржшгЛ (EL

представлена на рисунке 5.

Экстрагированный из почвы гумус-ферментный препарат проявлял как пероксидаэную, так и полифонолоксидазную активность. Измерение активности препарата при различных концентрациях субстрата и непосредственная запись кинетики реакций с помощью самописца свидетельствуют о том, что образование и распад фермент-субстратных комплексов и высвобождение продуктов реакций происходит по закону Михаэлиса-Шнтен. Анализ полученных кинетических констант позволяет предполагать, что иммобилизация фенолоксидаз на гуминовых кислотах сопровождается ингибированием ферментов, носящим характер конкурентного. Ситуация, аналогичная той, которая возникала при изучении свойств искусственных гумус-фенолоксидазныу комплексов, может означать, что ферменты связываются с молекулами ГК за счет функциональных групп активного центра. Результаты, наблюдаемые при изучении влияния температуры и рН на активность почвенного гумус-ферментного препарата, в обвдх чертах повторяют картину, имевшую место в опытах с искусственными гумус-пероксидазной и гу-мус-полифенолоксидазной системами.

Гель-фильтрация почвенного гумус-фенолоксидазного препарата и анализ фракций на ферментативную активность показали (рис. 6), что комплекс является достаточно стабильным и не разрушается в процессе элюции. Пероксидаза иммобилизована преимущественно в высокомолекулярной фракции ГК, а полифенолоксидаэа - в низкомолекулярной. Изучая локализацию этих ферментов при иммобилизации in vitro, мы наблюдали подобный характер закрепления этих ферментов.

Глава 6. Пероксидааная м полифеиолоксмдааная активность типичного чернозема

Изучая ферменты в отрыве от среды, в которой они действуют, мы понимали искусственность модели по отношению к обьекту, ради которого она создается. Измерение фенолоксидазной активности почвы - логическое продолжение методологической схемы, принятой в работе. Однако методические сложности и соображения системологи-ческого - характера. заставили нас отказаться от продолжения изучения и сопоставления свойств фенолоксидаз впряду""фермент"- гумус-ферментный комплекс - фермент в почве". Изменение свойств почвенных ферментов мы исследовали, используя влияние агроэкологических

Рисунок 7. Расчет кинетических нюнстант пэчеонпш гумус

::олоксидазних коыплексов (3) в сравнении с чистыми ферментат (1) и искусственнш;: гумус-Фар-ментнти кзмплэксат (2). Метод ипз-кекег-Еигк. А - лероксидазная система; В - система.

Результат расчетов кинетических констант: А.

(1) 0.112 МГ/МЛ; V мхх, ~ 54.2 у. ед.

(2) Км- 0.171 МГ/МЛ; - 53.7 у. ед.

(3) Км- 0. 355 иг/мл; Ум к - 54. 0 у. ед.

(1) Км- 0. 057 ОТ/МЛ; ЧмЛ* =■ 11. 8 у. ед.

(2) К„~ 0. 104 мг/ил; Уыих - 1?. 1 у. ед.

гт - 1 Г. 0 у. ел,

В.

факторов, таких, как удобрения и агротехника, полагая при этом, что в таком случае мы имеем дело с макрокритериями, характерными для макросистем.

Енесение органических удобрений всех видов и форм оказывало стимулирующее действие на интенсивность и направленность процессов окисления фенолов в почве. Наибольшее повышение активности фенолоксидаз найолюдалось в опытах с внесением наЕоза в дозе 10 т /га езкегодно. Увеличение активности ферментов в опытах с внесением органических удобрений, по всей видимости, связано с субстратной индукцией как продуцирования ферментов в почву, так и их активности.

Двухфакторный дисперсионный анализ влияния удобрений и последействия культур на изменения фенолоксидазной активности показал, что изменения в варьировании показателей пероксидазной и полифенолоксидазной активности обусловлены, главным образом,совокупным влиянием внесения удобрений и последействия культур в севообороте. Отдельное влияние факторов о общем варьировании было невысоким. В таблице 1 представлены результаты расчетов силы влияния факторов и коэффициенты их достоверности на 5%-ном уровне значимости.

Таблица 1• Показатели силы влияния факторов А (воздействие удобрений); Б (последействие культур); АБ (совокупного влияния факторов)

Сила влияния факторов Ошибка силы влияния факторов ФЕРМЕНТ -------------------------------------------------------

А Б АБ ЪБ

Пероксидаза 0. 210 0.131 0. 591 3.59 3.30 31.3

Полифенолоксидаза 0.106 0.118 0. 424 0.94 3.61 12.0

В литературе по почвенным фенолоксидазам существует

прйотиворечие; суть которого сводится-к следующему.__Одни авторы

(Чундерова,1970; Марданова с соав., и др.) склонны приписывать пероксидазе и полифенолоксидазе разнонаправленную роль в процес-

сах трансформации орагнического вещества почвы, а именно - синтез гумусовых веществ катализируется полифенолоксидазой,. а.распад и минерализация OB - пероксидазой. Другие авторы (Martin, Haider, 1980; Sarcar, 1988; etc.) утверждают, что и тот и другой ферменты катализируют синтез гумусовых веществ. Описанное противоречие имеет место не столько в предметной, сколько в методологической части. Первые данные получены в полевых опытах, где изучалась активность почвы, а вторые - в моделях в условиях in vitro. Не ставя под сомнение ни те, ни другие результаты, мы сопоставляли изменение показателей гумусного состояния почвы и ее фенолоксидазной активности. Результаты такого сопоставления представлены в таблице.

Невысокая корреляция между активностью фенолоксидаз и содержанием общего гумуса обьсняется тем, что активность ферментов -показатель значительно более стабильный, чем содержание гумуса. Отрицательная корреляция между содержанием подвижных форм гумуса и активностью ферментов вызвана, вероятно, тем, что появление подвижных форм гумуса связано с разложением гумусовых ветеств, а активность фенолоксидаз, как будет показано ниже, отрицательно коррелирует с этим процессом.

Таблица 2. Корреляционный анализ фенолоксидазной активности и показателей гумусного сосотояния почвы

Показатель Пероксидаза Полифенолоксидаза

г sr tr г Sr tr

Гумус общий 0. 44 0.52 0.85 0. 51 0. 50 1. 02

Гумус лабильный -0. 51 0. 50 1.02 -0.60 0. 45 1. 30

Гумус воднорастворимый -0. 68 0.42 1.62 -0. 74 0.37 2. 00

С микр. биомассы 0.35 0.58 0.60 0.67 0.42 1. 60

С - СО -0. 86 0. 30 2.87 -0. 61 0. 49 1. 42

®0(с пероксидазой) 0. 82 0.33 .' 2. 48 - -

г - коэффициент корреляции; 5Г- ошибка коэффициента корреляции; t критерий существенности коэффициента корреляции, t табл. - 2.05.

-J6-

Низкая корреляция С микробной биомассы с пероксидазной активностью и высокая корреляция с полифенолсксидазной активностью подтверждает литературные данные об источникках продуцирования фенолоксидаз в почву. Высокая отрицательная корреляция между пероксидазной активностью почвы и ее дыханием свидетельствует о том, что пероксидазные реакции и минерализационные процессы никак не сопряжены. Более того, высокая достоверная корреляция между активностями пероксидазы и полифенолоксидазы свидетельствует о том, что ферменты в наблюдаемых условиях работают одноналрвленно. Вполне вероятно, чт!о "предметом" их деятельности является не разложение и минерализация гумусовых веществ, а их синтез.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам изучения активности и свойств фенолоксидаз почв и гумус-фенолоксидазыных комплексов можно сделать следующие выводы.

1. Пероксидаза и полифенолоксидаза могут образовывать устойчивые комплексы с ГК почвы в условиях in vitro. Стабильность и активность таких комплексов обеспечивается ионными и ковалентными связями медду молекулами фермента и ГК Пероксидаза иммобилизована в основном в высокомолекулярных фракциях ГК, а полифенолоксидаза - в низкомолекулярных.

2. В результате иммобилизации на ГК происходит некоторое снижение активности фенолоксидаз, однако повышается их устойчивость к термической и кислотно-щелочной инактивации.

3. Кинетические характеристики реакций, катализируемых иммобилизованными фенолоксидазами, свидетельствуют о том, что в процессе иммобилизации ГК по отношению к ферментам выступает одновременно в трех качествах: а)продукта фенолоксидазных реакций; б)иммобилизующего агента; в)неспецифического субстрата.

4. Принципиальных различий между свойствами искусственных и почвенных гумус-фенолоксидазных комплексов не существует. Общие тенденции сохраняются независимо от некоторых различий в уровнях величин, характеризующих эти свойства. На основании этих наблюдений можно сделать заключение о существовании единого механизма формирования и фунуционирования фенолоксидазной активности почвы.

5. Изменения в уровнях фенолога:идазной активности почвы обусловлены, главным образом, совокупным влиянием внесения органических удобрений и последействия культур в звеньях севооборота Внесение минеральных удобрений не оказывает достоверного влияния на почвенную фенолоксидазную активность.

6. Процессы трансформации органического вещества почвы и синтез гумусовых веществ, скорее всего, связаны с однонаправленным действием фенолоксидазных систем независимо от субстратного типа катализируемых реакций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гулько А. Е. Взаимодействие пероксидазы с гуминозыми кислотами. // В кн.: Тр. X науч. конф. молодых ученых фак. почвоведения МГУ. М. 1989, с. 17-19. Деп в ВИНИТИ 21. 07. 89. , М4884-В89.

2. Хазиев Ф. X , Гулько А. Е. Некоторые свойства гумус-перок-сидазного комплекса. // Почвоведение, 1990, N2, с. 30-36.

3. Хазиев Ф. X, Гулько А. Е. Ферментативная активность почв агроценозов: итоги и перспективы изучения.// Почвоведение, 1991, N8, с. 88-103.

4. Гулько А. Е. Оксидазная активность почвы в севообороте с внесением удобрений. // В кн.: Тез. докл. Всес. конф.: Биология почв антропогенных ландшафтов., Днепрпетровск, 1991, с 64.

5. Хазиев Ф. X , Гулько А. Е. Свойства гумус-ферментных комплексов.// В кн.: Органическое вещество почв Башкирии., 1991, с. 190-200.

6. Гулько А. Е. Выделение из почвы гуминовых кислот, обладающих оксидаэной активностью. // В кн.: Гуминовые вещества в биосфере., М. Наука, 1992, (в печати)

7. Гулько А. Е., Хазиев Ф. X. Фенолоксидазы почв. Продуцирование, иммобилизация, активность.// Почвоведение, 1992, N10, (в печати) .

/

ГП «Принт» Зак. №ЗП Тираж 100 экз.