Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование конформационной стабильности и функциональной активности конформеров IgG

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование конформационной стабильности и функциональной активности конформеров IgG"

?Го Ой

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ______

Институт биоорганической химии

УДК 677.112.34

Кравчук Зинаида Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ КОВФОРИАЦИОННОЯ СТАБИЛЬНОСТИ И

ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОНФОР11ВРОВ IeQ

Специально ть 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сон екание ученoft степени кандидата химических наук

Минск - 1995

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси

Научный рукпяпяител,-

кандидат химических наук С.П.Марцев

Официальные оппонентаг

доктор химических наук, профессор Д.И.Метелица, доктор биологических наук А.Д.Милютин

Оппонируняая ..овганиааиия-

Институт фотобиологии АН Беларуси, г.Минск

Защита диссертации состоится нояс/рА. 1095 г. на

заседании совета по защите диссертаций Д 006.22.01 в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу: 220141, Минск, ул. Ходинская, Б/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан.

30 тсм&с&сI

1995 г.

Ученый секретарь совета по защите Диссертаций, кандидат химических нау

-¿¿С2--Н. И. Литвинко

Актуальность проблемы. В настоящее время огромный интерес пыэывают исследования корреляций "структура-конформация" и 'конформация-активность" в белках с целью выяснения принципов стабилизации их пространственной структуры, а также механизмов взаимосвязи первичной структуры, конформации, стабильности и Функциональной активности белковых молекул. Фундаментальной характеристикой конформации служит стабильность; функциональная активность как важнейшая характеристика может существовать не для всех возможных конфоркаций. Для крупных мультидоменнчх (полиглобулярных) белков типа имнуцоглобулинов исследование структурно-Функциональных корреляций затруднено сложным характером взаимосвязей структурных элементов молекулы.

Иммуноглобулины (антитела) - центральные по своей роли молекулы сложно организованной системы иммунитета, благодаря которой распознаются и обезвреживаются чужеродные агенты, поступившие в организм извне или образовавшиеся в результате патологического процесса. Первостепенная роль антител в обеспечении иммунной защиты организма обуславливает актуальность и широкий масштаб структурно-Функциональных исследований иммуноглобулинов. Интерес к этой проблеме дополнительно стимулируется необычайно широкими возможностями их практического применения в иммунофермеитном и радиоиммунном анализах, для цитотоксической иммунотерапии и иммуновизуализации раковых опухолей, а также в научных исследованиях структуры и конформации белков.

Цель работы. Цель данного исследования состоит в установлении корреляций "конформация-активность" в

иммуноглобулине й путем одновременного применения двух подходов: структурно-физического и Функционального. В соответствии с этим в настоящей работе ставились следующие задачи: 1) получение домен-и сайт-специфичных конформационных "зондов" (домен- и сайт-специфичных антител, С1ч компонента комплемента); 2) разработка систем анализа, позволяющих исследовать взаимодействие 1о<3 с конформационными "зондами", в состав которых дополнительк> включены стафилококк,-вый белок А и антиген (Ферритии селезенка человека); 3) исследование параметров термодннамичско» стабильности 1еС в широком диапазоне рИ и температур; 4}

получение конформеров IgG, исследование диапазонов их существования, термодинамической стабильности и функциональной активности.

Диссертационная работа выполнялась в ранках Всесоюзной программы "Средства и методы радиоизотопной диагностики и терапии" (Постановление N 997 Совета Министров СССР от 12.8.1988г.), Республиканской программы "Здоровье" 69.03.Р, а также программы Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь (проект Б10-351).

Научная новизна. Разработан полифункциональный подход к анализу IgG на основе: а) набора" биоспецифических лигандов, а также б) комбинации двухцентровых и конкурентных систем анализа относительной аффинности зондов.

Впервые получен набор термодинамических параметров, описываюцих в широком диапазоне pH и температур конформационную стабильность СН2 домена и молекулы нативного кроличьего IgG в целом, а также ряда конформеров IgG.

Получен не описанный ранее стабильный конформер (интермедиат) IgG, характеризующийся отсутствием третичной структуры СН2 домена при сохранении компактной третичной структуры основного термостабильного блока доменов.

Установлено, что обратимое pH-зависимое разрушение третичной структуры СН2 домена сопровождается необратимыми конформационными изменениями участков контакта этого домена с соседними доменами тяжелой цепи led. Следствием неполной обратимости яв..лется образование ненативного, функционально активного конформера IgG с измененным характером междоменных взаимодействий. Впервые проведена структурная характеристика конформера и показано, что он отличается от нативного IgG ослабленным взаимодействием между СН2 и СНЗ доменами IgG и усилением взаимодействия между СН2 и CHI доменами.

Впервые показано, что изменение контактов СН2 домена с соседними доменами изменяет комплекс эффекторных функций IgG: усиление взаимодействия между CHI и СН2 доменами приводит к увеличению функциональной взаимосвязи между антигенсвязывающими доменами и СН2 доменом IgG, стимулируя связывание Clq компонента комплемента. В то же время снижение степени взаимодействия СН2 и СНЗ доменов снижает сродство ' G к белку й при увеличении

степени экспонирования этого Функционального центра.

Практическая ценность. Данные о конформациониых превращениях иммуноглобулинов и свойствах конформеров антител, ' полученные в работе, имеют прямое отношение к современным нммунобкотехнологиям и моделируют поведение иммуноглобулинов на некоторых их стадиях. В соответствии с этим, результаты работы могут быть использованы для улучшения существующих и разработки новых методов получения антител и их модифицированных производных для практических целей, прежде всего для клинической иммунодиагностики, а такхе д|я применения в качестве реагентов при изучении структуры и конформации белков.

Основные положения, выносимые на ааииту.

1. Разработка полифункционального подхода к анализу 1вО на основе: а) набора биоспецифических лигандов, а также б) комбинации двухцентровых и конкурентных систем анализа относительной аффинности зондов.

2. Индуцирование процессов внутримолекулярных перегруппировок мультидоиениой структуры Тев кролика и получение конформеров 1еС, отличающихся мехдокенными контактами СН2 домена и степенью упорядоченности его структуры.

3. Получение стабильного конформера (интермедиата) 1вО, характеризующегося отсутствием третичной структуры (частичным разворачиванием) СН2 домена и компактной третичной структур«* основного терностпбилыюго блока доменов.

4. Исследование обратимости ря-зависимых изменений третичной структуры СН2 домена и участков контакта этого домена ; соседними доменами тяхелой цепи 1в<3. получение иенлтивного, функционально активного конформера с измененным характерен мехдоменных взаимодействий.

5. Исследование комплекса эФФекторных Функций 1вв и влияния изменения контактов СН2 домена с соседними доменами на функциональную активность.

6. Определение рН-диапазонов необратимых изменений третичной структуры С1Г2 домена и участков контакта мехду СИ2 доменом и соседними доменами мь.одом полифункционального анализа.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на II Всесоюзьой конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990), 8 Кехдуиародисм

конгрессе иммунологов (Будапешт, 1992), 12 Европейском иммунологическом конгрессе (Барселона, 1994), I съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ (4 статьи и тезисы 4 докладов).

об-ьрм работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. В главе 1 приводится обзор литературных данных о структурно-функциональных исследованиях иммуноглобулинов: проведен анализ методов изучения стабильности белков, данных о стабильности и конФормационной подвихности IgG, а также взаимодействия с биоспецифическими лигандами и возможности их использования в качестве конформационных "зондов". В главе 2 представлены результаты исследований, в главе 3 - обсуждение полученных результатов, в главе 4 - экспериментальные методы. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит S3 рисунка и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 176 ссылок.

1. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суммарный IgG выделяли из сыворотки кроликов, иммунизированных ферритином селезенки человека, фракционированием каприловой кислотой и сульфатом аммония. Clq компонент человеческого комплемента выделяли по модифицированному методу Liberties al. (1981).

Протеолиз IgG кролика пепсином проводили при рН 4,5 и соотношении фермент : IgG 1 : 30. Протеолиз IgG кролика папаином осуществляли в 0,1 M натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,01 И цистеин и 0,002 M ЭДТА, при соотношении фермент: IgG 1:30. Протеолиз ллазмином проводили по методу Colomb & Porter (1975).

Коноспецифические антитела к "шарнирной" области и СН2 домену IgG кролика получали аффинной хроматографией IgG барана на иммобилизованных F(ab')a и Кс Фрагментах.

Конъюгирование ферритинспецифичных IgG кролика с пероксидазой хрена осуществляли через окисленный метаперйодатом углеводный компонент Фермента. Биотиновые конъюгаты IgG и Clq были получены методом N-гидроксисук..инимидных. эфиров.

Все исследования - взаимодействия - IgG со специфическими— -----

лнгандами проводились при комнатной температуре в трипликатах. Для графического представления использованы средние значения.

Конкурентное связывание IgG кролика и его фрагментов с анти-IgG барана, моноспецифическими aHTH-F(ab')a и анти-СН2, антигеном и белком А количественно оценивали в иммуноферментнои тесте. Тест основан на использовании иммобилизованного лиганда в качестве реагента, за связывание с которым конкурируют исследуемый IsQ и меченый пероксидазой или биотмном JeQ кролика.

В анализе двухцентрового связывания IgO кролика и его фрагментов с анти-IgG, aHTH-F(ab')а, анти-СН2 и белком А, исследуемые IgG взаимодействовали вначале с лигандом, иммобилизованным на полистироле или микрокристаллической целлюлозе, а затем с меченым лигандом. Взаимодействие IgQ с Cl<¡ компонентом комплемента изучали при использовании IgG или иммунных комплексов, сорбированных на поверхности п ол и стирол ьны х пробирок, к которым прибавляли возрастающие количества биотинилированного Clq.

Обработку IgG растворами с рН в интервале 2-7 проводили следующим образом: раствор белка в концентрации 15-17 мг/мл разбавляли глицин-НС1, цитрат-HCl или цитрат-фосфатным буфером до конечной концентрации 2 мг/мл и, при необходимости, дотитровывали до требуемого значения рН, После инкубации в течение 1,5 ч пгч комнатной температуре раствор диализовали против буфера с данньгч значением рН иди титровали 0,01 М N&OH до требуемого значения рН с последующим диализом.

КД спектры регистрировали на спектрополяриметре JASDO-20 ("Jasco", Япония). Калориметрические измерения проводили в.» дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-1И и ДАСМ-4.

2. ПОЛУЧЕНИИ КОНФОРМАЦИОННЫХ ЗОНДОВ Й РАЗРАБОТКА СИСТЕМ

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО АНАЛИЗА IgG

Цели данного и. следования, кроме общепринятых стандартоп аналитических систем (высокая чувствительность, специфичность, воспроизводимость результатов), предъявляют также ряд особых требований. Анализ исследуемых IgG не должен сопровождаться их

дополнительной модификацией путем химических или физических воздействий и. кроме того, используемые системы анализа должны

молекуле 1в0. Поставленная задача решена путем тщательного отбора возможных конструкций аналитических тест-систем, выбора системы разделения и меченого компонента. Эффективность дискриминации конформационных изменений в в разработанных тест-системах

оценена в модельных экспериментах с использованием кролика, модифицированных по аминогруппам различными реагентами: цитраконовым ангидридом, карбоксикарбоновым ангидридом ДТРА и сукцинимидным эфиром Ра <II) колропорфирина I..

В данном раздела исследований решены следующие задачи:

а) разработан ряд систем анализа связывания антигена (ферритин селезенки человека) с 1ев и проведено сравнительное изучение их аналитических параметров и адекватности полученных результатов;.

б) изучена антигенная структура 1вв кролика и получены моноспецифические антитела к СН2 домену и "шарнирному" пептиду. Сконструированы тест-системы, позволяющие анализировать как изменение конформации исследуемого домена или связывающего центра молекулы (конкурентный анализ}, так и изменение взаимного расположения и/или расстояния между центрами или доменами

быть максимально чувствительны к конформационным изменениям в

(двухцентровый анализ);

РвЬ Анти-|дО

Рис. 1. Схема строения молекулы 1вв 1 олика.

------------в) оптимизирован метод выделения^ выделен и охарактеризован

Clq компонент системы комплемента и разработаны аналитические системы для оценки конформации Clq-связывающего центра в СН2 домене Fс Фрагмента, а такхе для определения степени взаимосвязи СН2 домена с Fab Фрагментом IgG;

г) проведено исследование белка Д как потенциального конформационного "зонда", созданы н исследованы конкурентные и двухцентровые системы анализа взаимодействия белка А с IgG кролика на основе сформированных (стенки пробирок) и суспензионных (микрокристаллическая целлюлоза) твердых фаз.

Направленность действия конформационных "зондов" и схема строения молекулы IgG кролика показаны на рис. 1.

3. КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ IgG

Калориметрические исследования терм о- и рН-стабильности IgQ.

Наиболее полные из проведенных ранее калориметрических исследований IgG кролика выполнены в глицин-HCl буфере, рН 3.5 (Tiachenko et al., 1982). Полученные нами в тех хе условиях кривые термоденатурации полностью совпали с опубликованными ранее. Кривая теплопоглощения IgG кролика при рН 3,5 имеет два пика термоденатурацни - низкоэнтальпийный, с температурой перехода (Тм) 56 °С, и высокоэнтальпийный с Тм=75 °С. K-ik показано ранее, низкотемпературный пик теплопоглочен«я соответствует плавлению СН2 домена. Мы обнаружили, Чло температурный переход СН2 домена полностью обратим и термодинамически независим при нагревании до 58 °С. После предварительного нагрева до 78 °С обраткмость составляла 55?., однако термодинамические подходы могут быть использованы для оценки структурных характеристик белка при частичной обратимости процесса термоденатурации (Shortle, 1989).

Термостабильность IgG далее исследовалась в интервале рН 2-7 в цнтрат-фосфатном буфере. Сравнение результате»

калориметрических исследований, полученных при рН 3,5 в цитрат-фосфатном и в глицинном буферах, показало небольшое смецение (кн 2 °С, до 54 °С) пика теплопоглощения при разворачивании СВЙ домена (рис.<26). Этот пик характеризует конформационный переход СН2 домена мехду двумя . состояниями. Значение Тм дяя

высокотемпературного высокоэнтальпийного пика, который образован перекрывающимися переходами более стабильного СНЗ домена и мультидоменного Fab Фрагмента, снижается до 72°С и, кроме того, появляется дополнительный низкотемпературный переход с Тм 46°С. Этот переход ранее предположительно отнесен к разрушению контакта между СН2 и СНЗ доменами (Zav'yalov et al., 1981; Loseva et al, 1986). В наших условиях денатурационный переход IgG около 46°С был термодинамически независим.

Корректное определение термодинамических параметров на основании функции теплоемкости формально возможно в тех случаях, когда процесс термоденатурации представляет собой переход между двумя состояниями (нативным компактным и развернутым денатурированным) структурного домена. Для разложения Функции избыточной теплоемкости - на элементарные переходы

"калориметрических" доменов мы применили подход, разработанный Privalov & Fillroonov (1978).

Термодинамические исследования в диапазоне рН 2-7 показали, что домены IgG различаются по своей термо- и рН-стабильности. В интервале рН 6,5-7 под оболочкой суммарной кривой термоденатурации, имеющей вид одного ассиметричного пика, в результате деконволюции удается выделить пять индивидуальных кооперативных переходов (рис. 2а). При рН ниже 5,5 происходит декооперация доменов, соглано терминологии Novokhatny et al. (1993). В связи с этим, на кривых плавления появляются пики термоденатурации, соответствующие доменам со сниженной, по сравнению ,с основным калориметрическим блоком доменов, термо- и рН-стабильностью (рис. 26). Переход Т5 принадлежит СН2 домену IgG или его части, в то время как переход Т6 предположительно соответствует разрушению контакта между СН2 и СНЗ доменами. Таким образом, декооперация доменов приводит к Формированию конформера IgG (Na), характеризующегося ослабленным взаимодействием СН2 домена с соседними доменами. Переходы Т5 и Т6 существуют в сравнительно узком диапазоне рН (рН 5-3) и при рН 2,5 уже не наблюдаются (рис. За), что связано с потерей третичной структуры (частичным разворачиванием) СН2 домена IgG. При снижении рН от 7 до 2 показано также снижение энтальпии термоденатурации (ДН) от 3500 кДх/моль до 1830 кДж/моль и интегральной температуры денатурации (Та) с 77°С до 56 °С (тасл. 1). Аналогичная

т- 1 300 ----- а —А

град 200 - I тз \

1 100 _ А К \\Т1

>4 £ О те /' ; V \ У \

К 300 200 - б

а и -

100 • те те ^ГГ У тз тА

30 40 80 ео , 70 80 00 100

Температура, 0 С

Рис. 2. Кривые теллопоглацения кролика в цитрат^-фосфатнан буфере при рН 7 (а), 3,5 (6). Сплавная линия - экспериментальная кривая, пунктирная линия - результат деконволюции.

Ти.'С

Рис. 3. Завиамость Ти элементарных переходов от рН: а-снижение рН от 7 до 2, б-псдаыление рН от 2 до 7.

Табл. 1. Зависимость энтальпии (дН, кДж/моль) и температуры денатурации (Та, °С) 1к<3 кролика от рн.

рн Снижение РН Повышение РН Повторное

от 7 до 2 от 2 до 7 снижение рН

Н Та Н Та Н Та

7 3510*150 76,9 3040» 10 78,2 - _

6, 5 3330« 60 78,2 3070* 70 78,0 3060* 20 76,2

6 3050* 10 78,2 3030*290 78,2 ■г

5, ,6 3480=250 78,3 2590*110 78,3 2500* 10 78,4

& 35701190 77,8 2340*140 78,3 2730* 20 78,2

4, 6 3040« 20 75,2 2110* 10 76,1 1940* 10 76,2

4 2900x154 72,1 2160* Ю 75,6 2180* 40 76,7

3, ,6 25301 60 65,9 2100*160 68,0 2070* 80 68,1

3 2460x130 63,3 1900*210 65,7 2240*100 65.6

2, б 1630x210 60,9 1730*120 61,4 - -

2 18301 40 66,3 • - - - -

Табл. 2. Зависимость изменения свободной энергии Гиббса

1

термоденатурации 1а0 кролика (Дв (26°С), кДж/моль) от рН.

РН Снижение рН Повывение рН Повторное

от 7 до 2 от 2 до 7 снижение рН

7 306*21 258* 4 -

6,6 287* 9 270*10 261* 2

6 246* 1 257*44 -

6,6 320*38 186*17 173* 2

6 281*19 148*21 209* 1

4,6 237* 3 107* 2 84* 1

4 229*22 122* 2 124* 4

3,6 166* 7 126*15 122*10

3 152*16 99*26 140*16

2,6 64*23 82*14 -

2 89* 3 ■ — —

зависимость от рН величин ДН и Та наблюдалась ранее для ряда однодоменных белков (Pri.val.ov А КЬесЫпавЬу! 11, 1974).

Стабильность 1вО характеризуется изменением свободной анергии Гиббса (ДО. Показано, что ДО (26 °С), рассчитанное по уравнению Гиббса-Гельмгольца, снижается в диапазоне рН 2-7 от 306 кДж/моль при рН 7 до 89 кДж/мол. при рН 2 (табл. 2).

Исследование. IkG кролика_пен_вн_2_(конФоридр—ijl. Для

сравнения вторичной структуры IgG в нейтральных и кислых рН регистрировали спектры кругового дихроизма в области 200-250 нм (рис. 46). Наблюдаемое при рН 2 увеличение отрицательной эллиптичности по сравнению с нативным IgG свидетельствует о существенной конформационной перестройке IgG с возможным увеличением содержания упорядоченных элементов вторичной структуры. В присутствии гуанидинхлорида спектр дихроичного поглощения IgG имеет вид, характерный для неупорядоченной структуры, и значительно отличается от спектров иммуноглобулина как при нейтральных, так и при кислых рН.

Кривая теплопоглощения IgG кролика при рН 2 характеризуется наличием максимума телопоглощения при 58 °С (рис. 4а) и значением ДН денатурации 1830 * 40 кДх/моль. Деконволюциоиный анализ обнаруживает четыре одностадийных перехода между двумя состояниями в молекуле IgG при рН 2 (рис. 4а). Совокупность этих данных свидетельствует об особом конформацйонном состоянии IgG г 101, град ■ си1 .диолъ"1

30 40 60 во ГО 80 во ЮО

Температура, °С

Рис. 4. Структур!*!» характеристики ДО кролика при рН 2. а - Кривая теплопоглидения в 0,1 Н цитрат-НС1, рН 2. Сплошная лини* -экспериментальная кривая, пунктирная линия - результат деконволоции. б - спектры и-угового дихроизма ДО в 60 мМ натрий-фоофатнсм буфере, рН 7 (1), 60 мМ фосфат-НС1 буфере, рН 2 (2), и 6 М гуанидинхлориде (3).

при рН 2 (конформер I), характеризующемся частично развернутым СН2 доменом и' компактной третичной структурой основного термостабильного блока доменов.

Исследование_поочегга оанативапии 1ев. Калориметрические

исследования процесса ренативации 1йв и последующая деконволюция экспериментальных кривых позволили установить, что СН2 домен (переход Т5) "ренатурирует" ливь при рН 5,5 в составе основного калориметрического блока (рис. 36, 5). Кооперативный блок, образующий контакт между СН2 и СНЗ доменами (переход Т6 на кривых теплопоглощения нативного 1*0 при рН'3-4,5) (рис. 26, За), по всей вероятности, претерпевает необратимые изменения третичной структуры (табл. 1, рис. 36). Следует отметить различия (гистерезис) хода кривых рН-эависимости ДО при снижении и при повшении рН (рис. в). Стабильность 1вв по критерию ДО в процессе ренативации была в различной степени снижена по сравнению с

Температура, 0 С

Рис. 5. Кривые теплопоглсцения 1вО кролика в процессе рениивации из (Я 2 при рН 7 (а), 3,5 (б); результат декокво.^оции - пунктирная линия.

До, кДж/иоль 360)-—

1

о

js.

Рис, 6. Эавиомость

250

160

изменения свободной энергии Гиббса (AG(25°C)) от fH:

1 - снижение рН от 7 до 2,

2 - поашение рН от 2 до 7,

3 - повторное снижение рН.

60

2

3

4

б

в

7

рН

Иссжеяопанир. катияиого (N\ и_КИСЛОЮОбРйбОТаиНРГО_Шх1

конФормйроя ТаГ, кролика. При рН 7 кривые теплопоглощения как N, так и Ni конфориеров IgG (последний получен инкубацией при рН 2 с последующей ренативацией при рН 7) имеют вид одного

ассиметричного пика с Тм равной 78 °С (рис. 2а, 5а), а ДН термоденатурации составляет 3350 = 210 и 3040 ± 150 кДж/иоль соответственно (табл. 1). Несмотря на большую ширину пика теплопоглощения Ni ксформера IgG, обе формы белка характеризуются равным количеством одностадийных переходов (р^с. 2а, 5а). КД спектроскопия не обнаруживает различий в парамет»ах вторичной структуры меясду N и Ki конформерами IgG при нейтральных рН. При снижении ри калориметрические исследования показяли отсутствие на кривых термоденатурации Ni низкотемпературных 1 пиков, характерных для нативного IgG. Полученный Ni конфорнер IgG сохранял свои термодинамические параметры в течение нескольких месяцев.

Значение AG (25°С) для нативного IgG при рН 7 выие, чем для Ni конформера (306 и 258 кДж/моль соответственно, табл. 2). Код расчетной температурной зависимости AG для нативного IgG выие но всем температурном диапазоне существования конформеров, а та! *е исследованном диапазоне рН (рис. 6). На фоне снижения конформационной стабильности Hi конформера по критерию ДО, обнаружили „величение его термостабильностй по критерию Та (табл. 1). Различия в термостабильности двух форм IgG максимальны при рН 3-5 и практически отсутствуют при рН, близких к нейтральным.

4. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ N и N1 КОНФОРМЕРОВ ДО

Исследования_антигенсвааываюией_активности, в конкурентном

анализе кислотообработанный 1е<3 показал снижение аффинности к антигену приблизительно в 2,5 раза по сравнению с нативным 1сО. Усредненная аффинность 1вв, использовавшегося в. этих исследованиях, имеет порядок 10е М-1.

Исследование изаииог.рйртяия г По ПРОВОДИЛОСЬ В ' ДВУХ

вариантах - в отсутствие антигена и в присутствии ферритина (поливалентный антиген). Установлено, что кислотная обработка не приводит к изменению связывания 1в<3 с С1ч компонентом комплемента в отсутствие антигена (рис. 7а). Иммунные комплексы, в состав Которых входит Их конформер 1в0, взаимодействуют с С1ч в 4 раза более эффективно, чем комплексы с нативным 1е<1 (рис. 76). Соответствующие величины К* составляют 0.8-10в М-1 для нативного 1вв и 3.2- 10е М-1 для конформера N1. Полученные результаты свидетельствуют об усилении функциональной взаимосвязи" между антнгенсвязывающими доменами и СН2 доменом конформера N1 по сравнению с нативным 1вО.

исследование_взаимодействия_конФорнеров-Ш?-с

моноспеииФичоскими антителами к "шарнирному" пептиду и Г.Н2 домену проводилось с помощью двух вариантов тестов - конкурентного, позволяющего оценить конформационные изменения в исследуемом участке молекулы, и двухцентрового - характеризующего не только конформацию определенной части молекулы, но и степень ее экспонированности для двухцентровых взаимодействий.

При взаимодействии ДО с антителами к "шарнирному" пептиду обнаружено, что как в конкурентном, так и в двухцентровом тестах связывание с "антн-шарнирными" антителами снижается для Nх конформера ДО в 1.4 - 1.5 раза по сравнению с N конформером.

Способность N1 конформера ДО к взаимодействию с антителами к СН2 домену не изменилась в конкурентном тесте и незначительно (в°1.3 раза) снизилась в двухцентровом тесте. Это позволяет предполагать наличие некоторых стерических препятствий, возможно, со стороны одного из соседних доменов, на фоне отсутствия каких-либо изменений в самом СН2 домене конформера N1.

а492 А4ва

Рис. 7. Взаимодействие N (1) и N1 (2) конрорнеров 1вв с С1ч ксмпонентсм кс*племента в антиген-незавиомо» (а) и антагензависим« (б) тестах.

а - Биотинилированшй С1я вэажодействовал с конфедерат 1вО, и*»обилизован!Ь*ги на полистиролыых пробирках. (ив. - оптическая плотность при 492 нм. На вставке - определение констант ассоциации для ксифо{меров: N - К, = 0,85-10» М-1, N1 - К* = 0,7-10» М-».

б - Исследуе>ые 1в<3 взаимодействовали последовательно с V»« обили зова нньи антиген о» (ферритин селезенки человека), а затеи с биотинилированным С1я. Константы ассоциации конформеров: N - К. = 0,8 • 10е N1 - 3,2-10» М-*.

Связывание И И »1 конФосмеоов СП стафилококковым белком й— в конкурентном анализе показало приблизительно 4-кратное снижение аффинности белка А к N1 конформеру по сравнению с нативным 1вО (рис. 8а). Однако в двухцентровом тесте показано 4-кратное увеличение максимального связывания белка А с комплексом белок А-1кС(Н1) (рис. 86). Полученные результаты свидетельствуют о наличии конформационных изменений в участке полипептидной цепи между СН2 и СНЭ доменами 1яв, которые приводят к увеличению доступности обоих белок А-связывающих центров в N1 конформере.

ПдЗ], нМ [1дй], нМ

Рис. 8. Связывание N (1) и N1 (2) конфосмеров 1в0 с белксм А. а - Конкурентны/) анализ. N и N1 каформесы конкурировали с биотинилированньм 1вС за связывание с белксм А, »мобилизован»» на микрокристаллической целлюлозе. Результат взаимодействия фиксировался с пек адью сгрептавидин-пероксидазы. Активность связанной пероксидаэы измеряли в присутствии (А) и в отсутствие (Ао) исследуемых На вставке - определение

констант ассоциации для кстфдаеров: N - К»=1,0-10в М"1; N1 - К*=0,25'10в М"1.

б - Двухцентровое связывание. Конфосмеры вза:¡модействовали вначале с белок А-целлюлозой, а затем с белок А-перокодазой. А*в2 - оптическая плотность при 492 нм.

Исследование поотеолиза пла.чмином. Протеолиз кроличьего 1в0 плазнином происходит «путем расщепления участка полипептидной цепи между СН2 и СНЗ доменами с образованием РюЬ и рРс' Фрагментов наряду с короткими пептидами. Мы обнаружили, что глубина расщепления конформера N1 плазмином составляет 69Х; в то же время, только 15% нативного 1е0 расщепляется в тех же условиях. Это подтверждает данные о большей доступности Ферменту зоны контакта СН2 и СНЗ доменов в N1 конформере.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ рН-ДИАПАЗОНОВ НЕОБРАТИМЫХ КОНФОРМАЦИОННЫХ------------------

ПЕРЕХОДОВ

Цель данного раздела исследований состоит в установлении границ диапазона рн, в которых происходят необратимые конформационные изменения, приводящие к образованию конформера Нх. Иными словами, следует установить степень обратимости рН-зависимых конформационных переходов и провести локализаций необратимых изменений с помощью полифункционального анализа.

Изучено взаимодействие 1еС, инкубированных при различных значениях рН в диапазоне рн 2-7, с С1а компонентом комплемента, белком А, моноспецифическими антителами, а также антигеном.

Исследование связняания ТдП с С1о компонентом комплемента показало, что необратимые изменения антигензависимого связывания с С1ч происходят при воздействии растворов с рН ниже 3 (рис. 9, кривая X). Связывающая активность 1гО резко возрастает и в диапазоне рН 2,5-2 достигает 390-440 % по сравнению с нативным 1йО. Несмотря на зависимость этого теста от взаимодействия с антигеном, рН-диапазон перехода и нап твленность изменения Функциональной активности не изменяется при использовании антител с различной аффинностью к ферритину (в диапазоне 107 - 10э М-1).

Взаимодействие; с белком Д. После инкубации при рН ниже 3 в конкурентном анализе наблюдается значительное снижение связывания белка А. Показано также значительное увеличение (до 400 X от активности нативного 1в0) связывающей активности 186 в двухЦентровом тесте (рис. 9, кривая 2). j Взаимодействие г моноспецифическими анти-ТгЯ. Относительно

небольпие различия между N и Их конформерами 1вО при сравнении связывания с анти-"шарнирными" антителами являются результатом нескольких конформационных переходов: вначале при рН, близких к нейтральным (рН 5-7), а затем двухфазных конформационных изменений в диапазоне рН 4-2 (рис. 9, кривая 3).

По данным двухцентрового анализа, только после инкубации 1вв при рН 2 наблюдается Снижение связывающей активности СН2 домена 1в(3 с анти-СН2 на 30% по сравнению с нативным В конкурентном

анализе связывающая активность не изменялась (рис. 9, кривая 4),

Связывание антигена изменяется после инкубации при рН ниже 3. Для низкоаффинных антител связывание антигена уменьпается при

воздействии рН 2 всего на 10 X по сравнению с нативным 1в<5. Для высокоаффинных антител характерно более значительное (в 2,5 раза после обработки рН 2) снижение антигенсвязывающей активности.

Связывание, %

Рис. 9. Взаимодействие специфических лигандов с ЮЗ, инкубированилки при различшх значениях {Я в интервале 2-7: 1 - С1<1 компонент комплемента (антмгензавиомое связывание), 2 - белок А, 3 - анти-К{аЬ')а, 4 - анти-СН2. За 100 X принта ли полумаксимальную величину связывания нативного 1вв при рН 7. Для каждой точки приведено стандартное отклонение от среднего значения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекула иммуноглобулина 0 состоит из 6 пар доменов, соединенных между собой неструктурированными участками лолипептидной цепи, которые обеспечивают потенциальную возможность изменения характера междоменных взаимодействий. Баланс междоменных взаимодействий в такой структуре может оказаться существенным Фактором стабилизации молекулы и регуляции

— функций антител. Однако до настоящего времени не было проведено исследований, показывающих конкретные механизмы модуляции стабильности и Функциональной активности иммуноглобулинов путем изменения взаимодействия между доменами.

В нашей работе исследованы корреляции "конФормация-активность" в иммуноглобулине О кролика на основе комбинации двух подходов. Конформация описана в терминах термо- и рН-стабильности доменов 1«в; активность охарактеризована с помощью полифункционального анализа. с использованием набора биоспецифических лигандов антител. Показано, что стабильность и функциональная активность молекулы Iвв зависят от взаимодействий между доменами.

Конформационная стабильность 1вв охарактеризована на основании термодинамических параметров (ДН, Тм, ДСр, ДО) температурнозависимого разворачивания белка. Проведенные исследования показали, что домены молекулы 1вО кролика значительно различаются по своей рН-стабильности, причем наименее стабильным является СН2 домен. При изменении рН происходит серия согласованных конформационных превращени/ молекулы по

следующей схеме (рис. 10).

При нейтральных и слабокислых рН (рН 7-6,5) представляет собой нативный конформер N. в котором СН2 домен стабилизирован взаимодействием с С-концевым СНЗ доменом Гс фрагмента. В этом конформационном состоянии, по нашим данным, СН2 домен остается наименее стабильным в составе ¡ев, однако независимые переходы этого домена. между компактным и развернутым состояниями > невозможны.

При рН<5,6 происходит ослабление связи (декооперация) доменов в структурном модуле, включающем СН2 домен; формируется конформер условно обозначенный как Ил. Значительное

ослабление взаимосвязи СН2 домена с соседними доменами, прежде всего СНЗ доменом, приводит к тому, что при рН<5 домен СН2 веде* себя как термодинамически независимый от остальной части молекулы и претерпевает обратимые термоиндуцированные переходы между нативным и развернутым состояними.

Последовательная дестабилизация молекулы 1в0 кролика при снижении рН<3 приводит к образованию промежуточного состояния 1в0 (интермедиата I), которое при рН 2-2,5 характеризуется частично

рН 7

N

N.

N

рН 3,5

рН 2

Рис. 10. Схема межасменшх взаимодействий в молекуле кролика при различных рН: N - нативный Ыа - интермедиат, характеризуюсяйся

ослабленмл взаимодействен СН2 дсмена с соседними дсменами; I - интермедиат с частично развернули СН2 д смен см; N1 - конфорчер, полученный в результате воздействия рН 2 и последаквдей ренативации при рН 7.

развернутым состоянием СН2 домена при сохранении компактной третичной структуры блока термостабильиых доменов. Полученный интермедиат может в течение длительного времени существовать при неэкстремальных температурах в достаточно широком диапазоне рН (от рН 2 до 5,5) (рис. 11). ,

Обратный коиформационный переход (реиативация) Хвб из состояния I при повышении рН приводит к формированию третичной структуры СН2 домена при рН>5,5; при эт л контакт с СНЗ доменом не восстанавливается. В результате формируется конформер N1 с измененным характером взаимодействий СН2 домена с соседними доменами 1^(3. Свободная энергия стабилизации конформеров Ни N1 составляет 306 и 258 кДж/моль соответственно (при 25 °С, рН 7). Энергетический барьер между конформерами, ДДв= Л вот»в.ы -ДСст»е,н1 = 48 кДж/модь, . примерно в 20 раз превышает энергию

Тм, "С

Рис. 11. Диаграянз (¡азотх (конроемщионных) состояний 1а<5 кролика. Заштрихованные области - диапазоны существования интернедидта (I) 1^(3 с частично развернутым СН2 дсменси: а - натив>«Л 1аС,, б - ренативация после кислотной обработки. Обозначение киг^огмациошых состояний О-денатуриротанный (развернутый) 1-инте1хедиат (частично развернутая

форма , Н и №.-натив№й № и его кислотоиндуцированный кон{юрнер.

теплового движения (25 °С)н достаточен для существования каждого из конформеров в виде отдельного состояния IgG.

Исследования взаимодействия с биоспецифическими лигандаии, направленными к различным Функциональным центрам IgG в районе СН2 домена и его контактов, наряду с результатами калориметрических исследований, показали, что Nt конформер IgG отличается от нативного IgG перегруппировкой молекулярного окружения СН2 домена. При этом уменьшается степень взаимодействия СИ2 и СНЗ доменов и усиливается взаимодействие между СН2 и CHI доменами. С точки зрения конформационной стабильности такая перегруппировка приводит к двум последствиям: а) стабильность СН2 домена не изменяется, б) стабильность молекулы IgG в целом снижается. С Функциональной точки зрения, конформационный переход нативного IgG в его Ni конформер ведет к увеличению взаимодействия между антигенсвязывающими центрами и Clq-связывающим центром, что

стимулирует взаимодействие с С1ц. Вторым функциональным отличием N1 конформера является увеличение доступности соответствующих центров» локализованных между СН2 и СНЗ доменами, для белка А и плазмина. рн-Зависимые конформационные изменения в участках полипептидной цепи, соединяющих домены, предшествуют или совпадают с диапазонами разрушения третичной структуры доменов. Эти изменения могут носить необратимый характер, в то время как процессы частичного разворачивания и сворачивания СН2 домена полностью обратимы. Первичным центром функционально значимых структурных модификаций- 1в(3, по нашим дг 'ним, является "шарнирный" пептид, соединяющий СН2 и СН1 домены 1ев.

Таким образом, исследованная нами конформационная динамика СН2 домена и его микроокружения в молекуле 1вв приводит к существованию четырех различных конформационных состояний 1вв в различных диапазонах рн. Физиологическое значение этих состояний 1вО определяется возможностью существования сниженных величин рН в локальных участках органов и тканей, а также в различных компартиентах клетки.

Данное исследование рН-зависимых конформационных переходов 1вв и изменения его функциональной активности показывает возможные механизмы регуляции стабильности и Функциональной активности иммуноглобулинов. В качестве структурной основы такая регуляция включает изменения глобальной конформации молекулы 1вО путем изменения взаимодействия основного эффекторного СН2 домена с соседними доменами.

ВЫВОДЫ

1. Разработан полифункциональный подход к анализу 1вО на основе: а) набора биоспецифических лигандов, "зондирующих" конформацию соответствующих Функциональных центров 1а0 в различных доменах и участках контактов м^^ду доменами, а также б) комбинации двухцентровых и конкурентных систем анализа относительной аффинности зондов.

2. Индуцированы процессы рН-зависимых внутримолекулярных перегруппировок мультидоменной структуры 1яв с формированием 4 конформеров 1кв, отличающихся междоменными контактами СИ2 домена и степенью упорядоченности его структуры. Впервые получен набор

термодинамических параметров, описывающих конформационную стабильность молекулы нативного IgG и его конформеров, а также СН2 домена, в широком диапазоне рН и температур.

3. Получен не описанный ранее стабильный конформер (интермедиат) IgG, характеризующийся отсутствием третичной структуры (частичным разворачиванием) СН2 домена при сохранении компактной третичной структуры основного термостабильного блока доменов.

4. рН-зависимое частичное разворачивание СН2 домена обратимо, но сопровождается необратимыми конформационными изменениями участков контакта этого домена с соседними доменами IgG; в результате формируется ненативный, функционально активный конформер IgG. Впервые показано, что данный конформер отличается от нативного IgQ ослабленным взаимодействием между СН2 и СНЗ доменами IgG и усилением взаимодействия между СН2 и СН1 доменами,

5: Изменение контактов СН2 домена с соседними доменами изменяет комплекс эффекторных функций IgG: усиление взаимодействия между СН1 и СН2 доменами приводит к увеличению функциональной взаимосвязи между антигене! 'эывающими доменами и СН2 доменом IgG, стимулируя связывание Clq компонента комплемента. В то se время, снижение степени взаимодействия СН2 и СНЗ доменов снижает сродство IgG к белку А при увеличении степени экспонирования этого функционального центра.

б. Частичное разворачивание СН2 домена IgG происходит в диапазоне рН 3-2. Необратимые рН-завнсимые конформационные изменения в участках контактов СН2. домена и соседних доменов j предшествуют или совпадают с диапазонами разрушения третичной структуры СН2 домена и происходят при рН 5-7 и ниже рН 4.

Основные результаты диссертации изложены в следующие работах:

1. Кравчук З.И., Марцев С.П. Исследование конформационного интермедиата IgG, полученного кислотным воздействием // & сб.: II Всесоюзная конференция "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Тез. докл. Москва. 1990. С. 106.

2. Кравчук З.И., Жоров О.В., Прейгерэон В.А., Захарова Н.А., Шаханина К.Л., Марцев С.П. Взаимодействие IgG кролика с ацти-IgG:

локализация эпитопов и отсутствие иммунореактивности pFc' фрагмента // Биохимия. 1991. Т. 56, N 10. С. 1907-1915.

3. Kravchuk Z., Martaev 6. Stable acid-Induced conformer of rabbit IgG. Differential scanning calorimetry (DSC), proteolysis and ligand-binding studies // In.: 8th International congress of Immunology. Abstracts. Budapest. 1992. P. 18.

4. Martsev S., Kravchuk Z. , Vlasov A., Lunev V., Mel'nikova Ya. pH-Induced unfolding-refoldlng " transitions of mouse monoclonal ' and rabbit antibodies: differential scanning calorimetry, circular di oroiem and functional ttudies // In.: 12th European Immunological Congress. Abstracts. Barcelona. 1994. P. 104.

5. Кравчук З.И., Власов А.П., Ляхнович Г.В., Марцев С.П. Роль мехдоменных взаимодействий в стабилизации молекулы и регуляции Функций антител. Исследование конФормеров IgG с помощью калориметрии и связывания биоспецифических лигандов // I съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков. Тез. докл. Минск. 1994. С. 90.

6. Кравчук З.И., Власов А.П., Ляхнович Г.В., Марцев С.П. Стабильный конформер IgG, полученный кислотным воздействием: исследование с помощью калориметрии, связывания Clq компонента комплемента и моноспецифических анти-IgG .// Биохимия. 1994. Т. 69, N 10. С. 1458-1477.

7. Martsev S.P., Kravchuk Z.I., Vlasov А.P. Large increase in thermal stability of the CH2 domain of rabbit IgG after acid treatment as evidenced by differential scanning calorimetry // Immunology Letters. 1994. V. 43, N 3. P. 149-152.

8. Martsev 8.P., Kravchuk Z.I., Vlasov A.P., Lyakhnovlch G.V. Thermodynamic and functional characterization of a stable IgG conformer obtained by renaturation from a partially structured low pH-induced state // FEBS Letters. 1995. V. 361, N 2-3. P. 173-175.

РЕЗЮМЕ

Кравчук Зинаида Ивановна. Исследование конформационной стабильности и функциональной активности конформеров IgG.

Ключевые слова: иммуноглобулин G, дифференциальная сканирующая калориметрия, конформационная стабильность, взаимодействие доменов, функциональная активность.

Работа посвящена исследованию механизмов стабилизации молекулярной структуры и регуляции Функциональной активности молекулы IgG кролика. Подучен набор конформеров IgG, которые различаются степенью упорядоченности молекулярной структуры основного эффекторного СН2 домена и его контактами с соседними доменами. Проведен термодинамический и функциональный анализ конформеров. Показано, что стабильность молекулы IgG зависит не только от стабильности составляющих ее доменов, но и от характера взаимодейстрий между ними. Установлен один из механизмов регуляции функциональной активности IgG - путем изменения взаимодействий между доменами. Полученные результаты могут быть использованы при разработке иммунодиагностикумов, рекомендуются для внедрения на хозрасчетном Опытном предприятии Института биоорганической химии АН Беларуси.

SUMMARY

Kravchuk Zinaida Ivanovna. Study of conformational stability and functional activity of IgG conformera.

Key words: Immunoglobulin G, differential scanning calorimetry, conformational stability, domain interaction, functional activity.

The work is devoted to the study of mechanisms of stabilising molecular structure and regulation of functional activity of rabbit IgG. A number of IgG conformera were obtained, which differ in the amount of structure in the CH2 domain and in interactions with neighboring domains. Thermodynamic and functional analyses of conformers were carried out.

This study represents the first demonstration for one of the mechanisms of stability modulation and regulation between antibody functional activity via changes in interactions of structurally unaltered domains. The results obtained can be applied for development of immunoassays and are recommended . for use at Self-Supporting Manufacturing Department of the Institute of Bioorganic Chemistry, Minsk.

РЭЗКМЭ

Краучук 31на1да 1ванауна. Даследаванне канфармацыйнай стаб1льнасц1 1 Функцыянальнай актыунасц1 канфармерау IgG.

Ключавыя сдовы: 1мунагхабул1н О, дыферэнцыяльная скануючая каларыметрыя, канфармацыйная стаб1льнасць, узаемадзеянне дамэнау, функцыянальная акгыунасць.

Работа прысвечана даследаванню механ!змау стаб1л!зацы1 иалекулярнай структуры 1 рэгуляцы1 функцыянальнай актыунасц1 малекулы IgG труса. Атрыманы набор канфармерау IgG,' як1а адрозн1ваюцца ступенню уларадкаванасц1 малекуля^лай структуры асноунага эфектарнага СН2 дамэна 1 яго кантактам1 з су седн 1мi дамэнамЛ. Праведзены тэрмадынам1чны 1 Функцыянальны анал1э канфармерау. Паказана, што стаб1льнасць малекулы IgG залехыць не тохьк1 ад стаб1аьнасц1 складаючых яе дамэнау, аже 1 ад характару узаемадзеянняу пам1х 1м1. Устаноулены адз1н з механ1змау рэгуляцы1 функцыянальнай актыунасц! IgG - аляхам змянення узаемадзеянняу лам1ж дамэнам1. Атрыманыв вын1к1 могуць быць выкарыстаны лры раслрацоуцы 1мунадыягностыкумау, рэкамендуюцца для укаранення на гаспадарчаразл1ковым Вопытным прадпрыемстве 1нстытута б1яарган!чнай х!м11 АН Беларус!.