Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики"

На правах рукописи

Новиков Глеб Вадимович

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННОИ ПОДВИЖНОСТИ РОДОПСИН-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОИНФОРМАТИКИ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 5 АПР 2013

005057918

Пущино, 2013

005057918

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Озолинь Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, лаборатория функциональной геномики и клеточного стресса, заведующий лабораторией.

Ефремов Роман Гербертович, доктор физико-математических наук, профессор. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии РАН, лаборатория моделирования биомолекулярных систем, заведующий лабораторией.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт математических проблем биологии РАН.

Защита диссертации состоится « 16 » мая 2013 г. в 14 ч. 00 мин, на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, Д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Инстшутская, 3.

Автореферат разослан «_» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Сивожелезов Виктор Семенович

кандидат биологических наук

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семи-трансмембранные (7-ТМ) рецепторы играют первостепенную роль в межклеточных коммуникациях, автокринных и паракринных регуляциях клеточных функций, а также в процессах подвижности и адгезии клеток (Wettschureck and Offermanns, 2005). В этой связи, исследование данных белков всегда было одним из основных направлений клеточной физиологии, биофизики и фармакологии. Помимо чисто академического интереса, экспериментальный и теоретический анализ 7-ТМ рецепторов имеет важное прикладное значение. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных средств являются лигандами этих белков (Congreve and Marshall, 2010; Bosier and Hermans, 2007).

Долгое время считалось, что переход рецептора в активное состояние является прямым следствием его взаимодействия с агонистом. Тем не менее, в существующих представлениях о деталях механизма активации этих белков все еще много неясного (Kenakin, 1995; Kenakin and Onaran, 2002). В последнее время стало известно, что этим белкам свойственно выраженное динамическое поведение, благодаря их способности принимать различные конформации in vivo (Kobilka and Deupi, 2007). При этом, находясь в различных подсостояниях, рецептор осуществляет сигнализацию по разным сигнальным каскадам. В этой связи, совершенно необходимо понимание того, какие именно конформации рецептора соответствуют его истинно активному подсостоянию и каким именно путем в конформационом пространстве "движется" рецептор, для достижения этого состояния. В настоящее время для качественного описания функционального поведения мембранных рецепторов существует концепция популяционного сдвига, основанная на модели Моно, Ваймена и Шанже (МВШ) (Canals et al., 2012). Согласно этой концепции для этих белков характерно существование ансамбля структурно-близких подсостояний (конформеров), а так же их непрерывный перебор. При этом, любое внешнее воздействие приводит к стабилизации специфической конформации рецептора, повышая ей статистический вес, относительно исходного ano ансамбля. Таким образом, динамическое поведение рецептора является естественным свойством его пространственной архитектуры (Henzler-Wildman and Kern, 2007). Подобное функциональное поведение, получившее название "функциональной избирательности", опосредует ряд физиологических явлений гормон-активируемых рецепторов (Kenakin, 2002, 2011). Например, определенная доля конститутивной (лиганд-независимой) активности этих белков связана с возможностью их активации в отсутствии агонистов (Milligan, 2003; Costa and Cotecchia, 2005). Экспериментально было показано, что подобное спонтанное поведение может иметь функциональное значение для одних рецепторов, и в тоже же время являться нежелательным фактором для других. Тем не менее, в настоящее время отсутствуют какие-либо представления о структурных особенностях этого явления, а так же до конца остается неясным его функциональное значение.

В настоящее время исследование мембранных рецепторов современными экспериментальными методами связано с рядом методических трудностей (Caffrey, 2003). С другой стороны, существенный прорыв в области расшифровки новых пространственных структур 7-ТМ рецепторов и значительное увеличение вычислительных мощностей, являются убедительными предпосылками для проведения вычислительных экспериментов в среде in silico. В настоящее время, использование методов молекулярного моделирования и структурной биоинформатики позволяет исследовать самые разнообразные функциональные аспекты в белках,

связанные с их конформационной подвижностью. Таким образом, полученные данные могут пролить свет на ключевые аспекты динамического поведения 7-ТМ рецепторов, как в фундаментальном, так и в прикладном плане, способствуя разработке новых лекарственных препаратов.

Целью настоящей работы является исследование спонтанной активации (конститутивной активности) родопсин-подобных рецепторов и взаимосвязи этого процесса с их конформационной подвижностью. Для выполнения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:

1. Провести апробацию метода главных компонент для исследования функционально значимых движений a-спиралей в белках. Исследовать конформационную подвижность двух водорастворимых белков (капьций-связывающего белка кальмодулина, а так же фермента SRC-тирозин киназы), используя их выборки кристаллографических структур.

2. Исследовать структурную подвижность фоторецептора родопсина млекопитающих, а так же трёх гормон-активируемых рецепторов (двух классов p-адренергических, а так же аденозинового А2А рецептора) методом главных компонент, используя выборки пространственных структур этих белков. Провести сравнительный анализ особенностей конформационной подвижности гормон-активируемых рецепторов, относительно контрольной выборки фоторецептора родопсина.

3. Методом молекулярной динамики исследовать структурную подвижность ano формы аденозинового Аза рецептора в окружении ССЦ-вода. Установить корреляцию между наиболее конформационно подвижными областями рецептора, а так же его функциональными особенностями. Методом главных компонент сравнить конформационную подвижность аденозинового рецептора, наблюдаемую на траектории МД, с характером распределения его экспериментальных структур.

4. Методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики исследовать конформационную подвижность ano формы аденозинового рецептора в окружении липиды-вода. Установить взаимосвязь между конформационной подвижностью рецептора и его конститутивной активностью. Изучить корреляцию между крупномасштабными конформационными движениями рецептора, а так же локальной динамикой его отдельных высоко-консервативных остатков.

5. Методом молекулярной динамики исследовать влияние внешних факторов на конформационную подвижность p-2-адренорецептора. Провести сравнение проекций траекторий МД, рассчитанных дтя исследуемого белка в комплексе с различными лигандами (полным и обратным агоиистом), а так же его ano формы.

Научная новизна. В рамках проведенного исследования, используя комплексный подход из методов структурной биоинформатики и молекулярного моделирования, впервые были получены детальные представления о конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов. Было установлено, что динамическое поведение этих белков является естественным свойством их пространственной архитектуры. Методом главных компонент, впервые были выделены функционально-значимые движения из траекторий молекулярной динамики, а так же выборки кристаллографических структур лиганд-активируемых рецепторов. Это позволило напрямую сравнить общую картину конформационной подвижности этих белков, наблюдаемую как на рассчитанной траектории, так и в распределениях известных экспериментальных структур. В результате впервые были установлены общие закономерности структурных движений, наблюдаемые как на траектории МД исследованных рецепторов, так и при сравнении их экспериментальных структур. Кроме того в ходе моделирования лиганд-активированных рецепторов методом молекулярной динамики впервые удалось наблюдать спонтанное движение этих белков, по направлению к их активным подсостояниям, наблюдаемым в кристалле. С другой стороны, на примере р-2-адренорецептора впервые удалось исследовать влияние различных внешних факторов на конформационную динамику этого белка. Таким образом, были подобраны параметры и режимы компьютерной симуляции, позволяющие на относительно непродолжительных траекториях исследовать функционально-значимые движения в 7-ТМ рецепторах.

Практическая значимость. В настоящее время исследования активации родопсин-подобных рецепторов обладают приоритетным значением, благодаря ключевой роли этих белков в области фармакологии. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных препаратов являются лигандами 7-ТМ рецепторов. В этой связи, полученная информация о функционально-значимой конформационной подвижности этих белков может быть использована для разработки новых лекарств или проверки функциональных свойств уже существующих соединений. При этом, анализ конформационных движений рецепторов-мишеней по выделенным степеням свободы может быть особенно полезен, при моделировании комплексов этих белков с различными функциональными классами лигандов. Таким образом, полученные в настоящей работе результаты обладают как фундаментальным, так и прикладным значением.

Личный вклад автора состоит в обзоре имеющихся данных литературы относительно структурно-функциональных особенностей мембранных рецепторов, моделировании пространственных структур этих белков, проведении расчетов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики, обработке, анализе и систематизации результатов, написании статей, а так же докладов на конференциях.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде устных докладов на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012 г.), конференции молодых ученых "Экспериментальная и теоретическая биофизика 2012", а так же на 15, 16 и 17 научных конференциях молодых ученых "Биология XXI века", проводимых в г. Пущино. Работа также докладывалась на внутренних семинарах лаборатории клеточной физиологии ИБК РАН, лаборатории молекулярной динамики института математических проблем биологии, а так же на семинарах кафедры биоинженерии и биоинформатики Биологического факультета МГУ.

Научные публикации. По материалам диссертации было опубликовано 10 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 6.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа (150 страниц) состоит из введения, литературного обзора, описания используемых методов, а так же четырёх глав собственных результатов автора, выводов и списка литературы (214 ссылок). Работа иллюстрирована 57 рисунками и содержит 4 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении сформулированы основные цели и задачи исследования, а так же обоснована его актуальность и практическая значимость. В главе 1 представлен литературный обзор. В разделах 1.1-1.4 приведены общие представлениях о белках, как о макромолекулах с выраженной структурной подвижностью. В разделах 1.5-1.10 содержится информация о родопсин-подобных рецепторах. Изложены современные представления о функциональных и структурных аспектах этих белков, а так же их активации. Кроме того, описаны современные модели функционального поведения данных белков, а так же история их развития. Раздел 1.11 посвящен исследованию активации родопсин-подобных рецепторов методом молекулярной динамики. Подробно описано развитие основных представлений о механизмах этого процесса, на примере различных 7-ТМ рецепторов. Показана область применения метода молекулярной динамики, по отношению к исследованию различных функциональных аспектов данных белков.

В главе 2 даны представления об основных методах исследования белковой динамики. Подробно изложено применение метода молекулярной динамики (МД), а так же анализа главных компонент (Principal components analysis, РСА) для исследования конформационной подвижности макромолекул. Кроме этого, приведены детали расчетов для каждой из исследуемых систем настоящей работы.

В третьей главе приведены основные результаты работы. В разделе 3.1 исследовалась конформационная подвижность двух водорастворимых белков: кальций-связывающего белка кальмодулина (КаМ), а так же фермента- Src-тирозин киназы. Многочисленные экспериментальные и теоретические данные указывают на то, что структурная гибкость в а-спиральных доменах многих водоростворимых белков связана с их функциональными свойствами. В этой связи, пространственная укладка функционального белка должна сочетать стабильность с определенной степенью структурной гибкости. Отталкиваясь от подобных представлений, на первом этапе работы была проведена апробация метода анализа главных компонент для исследования функционально-значимых движений в двух водорастворимых белках, на основании выборок их экспериментальных структур. В результате, конформационную подвижность, наблюдаемую при сравнении рентгеновских структур каждого из исследованных белков, удалось связать с их специфическими биологическими функциями. В обоих случаях конформационная подвижность этих макромолекул была связана с динамикой их отдельных а-

спиралей. При анализе проекций экспериментальных выборок на плоскость первых двух главных компонент были установлены следующие закономерности: по первой главной компоненте экспериментальные структуры группировались, в соответствии с наиболее крупномасштабным движением, связанным с открытием активного центра обоих белков. С другой стороны, вторая главная компонента соответствовала коллективной моде движений, функционально связанных со специфичностью этих белков по отношению к различным субстратам. Таким образом, была показана пригодность метода главных компонент для исследования функционально-значимой подвижности белков, с различными амплитудами движений их а-спиралей.

В разделе 4.2 проводилось сравнительное исследование конформадионной подвижности трёх лиганд-активируемых рецепторов, а так же фотоактивируемого рецептора родопсина млекопитающих. Конформационные движения, наблюдаемые в экспериментальных выборках этих рецепторов, исследовались методом главных компонент (РСА). На рисунке 1 показаны функционально-значимые движения, наблюдаемые в экспериментальной выборке (3-2-адренорецептора, по первым трём главным компонентам.

Рис. I. Исследование структурной динамики Р-2-адренорецелтора методом главных компонент, на основании его кристаллографической выборки.

Было установлено, что движения, наблюдаемые по первой ГК, в большей степени соответствовали подвижности цитоплазматической области шестой а-спирали рецептора. Эти движения были наиболее высокоамплитудными (в зависимости от рецептора, отклонение VI ТМ спирали составляло от 6 до 12 А). С другой стороны, движения, наблюдаемые по второй и третьей ГК, соответствовали флуктуациям внутриклеточных (в особенности 3 ВНП) и внеклеточных петель рецептора, соответственно (Рис.6). При этом, движение третьей внутриклеточной петли (3 ВНП, ГК-2) было более высокоамплитудным (амплитуда отклонений варьировала в различных рецепторах, в зависимости от степени подвижности пятой и шестой спиралей), по сравнению с подвижностью внеклеточной области (ГК-3). В последнем случае наблюдались менее амплитудные флуктуации (амплитуда колебаний ~ 1 А), при выраженной степени коллективности. В функциональном плане, подвижность этой области фоторецептора наименее значима, по

сравнению с гормон-активируемыми рецепторами, в которых за счет динамики внеклеточных петель достигается избирательное связывание этих белков с различными лигандами. Это наблюдение согласуется с величиной изменчивости для каждой из исследуемых выборок рецепторов, которая максимальна в случае аденозинового рецептора и минимальна в родопсине.

На следующем шаге для каждой из экспериментальных выборок рецепторов были получены их проекции на три низкочастотные моды (1-3 главные компоненты) (Рис.2).

Рис. 2. Проекция кристаллографических структур родопсина млекопитающих (красные точки), р-1-адренорецептора (пурпурные точки), аденозинового Аи рецептора (бирюзовые точки), а так же Р-2-адренорецепгора (синие точки) на плоскость первых трех главных компонент (на рисунке обозначены как Мос1е-1, Мо<1е-2 и Мойе-З соответственно). По осям значения цифр соответствуют <СКО> между экспериментальными структурами в ангстремах.

Детальный анализ подобных диаграмм, полученных для каждой исследованной выборки рецепторов, в совокупности с визуальным анализом движений, наблюдаемых по каждой из главных компонент, позволил связать процесс активации этих белков с подвижностью их VI ос-спирали. Во всех исследованных рецепторах это движение наблюдалось по первой главной компоненте (ГК-1), по которой прослеживалось четкое разделение всех активных структур рецепторов, относительно их неактивных форм (рис. 2). С другой стороны, по ГК-2 наблюдалась подвижность внутриклеточных петель данных белков. В случае лиганд-активируемых рецепторов это движение может быть связано с селективностью по отношению к различным й-белкам. Наконец, на основании этой же диаграммы были получены представления относительно подвижности внеклеточных петель. Эта область лиганд-активируемых рецепторов выполняет функцию распознавания лигандов. В последнем случае, наиболее коллективные движения во внеклеточной области рецепторов наблюдались по ГК-3.

На рисунке 3 со стороны внутриклеточного пространства показано сравнение конформационной подвижности исследованных 7-ТМ рецепторов, на основании анализа их рентгеновских структур.

Beta-2-adrenoreceptor Rhodopsin Adenosine Аід receptor

Рис. 3. Сравнение структурной подвижности родопсина (в центре) с Р-2-адренорецептором (слева), а так же аденозиновым А2Л рецептором (справа). Во всех случаях показано пространственное наложение неактивной (показано светлым) и активной (показано красным) экспериментальных структур со стороны внутриклеточного пространства. Римскими цифрами обозначены номера ТМ доменов, а стрелками- направления наиболее крупномасштабных движений отдельных а-спиралей.

Из этого рисунка видно, что движения V и VI a-спиралей наиболее выражены в случае ß-2-адренергического рецептора (рис.3, слева), и наименее выражены в аденозиновом рецепторе (рис.3, справа). Эти закономерности отражаются на полученных проекциях экспериментальных структур, по первой главной компоненте (рис.2, mode-1). С другой стороны, на полученной диаграмме так же прослеживаются основные закономерности подвижности внеклеточной области 7-ТМ рецепторов (рис.2, mode-3). Например, видно, что одна из структур ß-2-адренорецептора (pdb id 3pds), закристаллизованная в комплексе с полным агонистом (в неактивной конформации) по ГК-3 группируется отдельно, относительно прочих неактивных структур данного белка, закристаллизованных с обратными агонистами. Это свидетельствует о структурных различиях во внеклеточных петлях ß-2-адренорецептора (в особенности третьей петли), в зависимости от присутствия различных лигандов в ортостерической области рецептора. Наряду с этим, между двумя активными структурами ß-2-адренорецептора (правый кластер на рис.2, pdb ids 3p0g и 3sn6), подобная дисперсия по ГК-3, напротив, отсутствует, как и в случае фотоактивированных структур родопсина. Это указывает на структурную жесткость внеклеточной области активированных форм 7-ТМ рецепторов, по сравнению с их интермедиатными структурами. В пользу этого, так же свидетельствует наибольшая ширина кластеров интермедиатных и неактивных структур во всех исследованных выборках рецепторов. Несколько иная картина наблюдается в случае экспериментальной выборки аденозинового рецептора (циановые точки на рис.2). Из этого распределения видно, что по ГК-1 все структуры этого белка так же группируются в два кластера, соответствующие его неактивным и частично активным формам. С другой стороны, по ГК-3 одна из частично активных структур Агл рецептора, закристаллизованная в комплексе с более крупным синтетическим агонистом (pdb id 3qak) группируется отдельно от двух других частично активных структур этого белка, закристаллизованных в комплексах с естественным агонистом аденозином, а так же его производным NECA (pdb ids 2ydo, 2ydv). Последнее связано с тем, что более крупный агонист в структуре 3qak стабилизирует специфическую конформацию второй и третьей внеклеточных петель аденозинового рецептора, в отличие от двух других структур этого белка, в которых конформация данной области более сходна с активными структурами ß-2-адренорецептора. Таким образом, на основании

подвижности второй и третьей внеклеточных петель так же можно судить о степени активности 7-ТМ рецепторов.

В разделе 4.3 методом равновесной молекулярной динамики (МД) в потенциальном поле GROMOS исследовалась конформационная подвижность ano формы аденозинового А2Л рецептора в окружении ССЦ-вода. При анализе полученной траектории удалось наблюдать конформационную подвижность исследованного рецептора, в особенности на уровне его внутриклеточных участков V и VI a-спиралей (рис. 4) , а так же второй и третьей внутриклеточных петель (СКО по С-а атомам порядка 8 и 6 Á, соответственно).

Рнс. 4. Пространственная суперпозиция двух конформаций Ä2A рецептора, наблюдаемых на траектории МД. Структуры показаны со стороны внутриклеточного пространства. Слева- светлым цветом показана исходная (неактивная) структура рецептора, а темным- его конформация, наблюдаемая на 35нс симуляции. В данном случае СКО составляет 1.5 А. Справа- светлым цветом показана исходная (неактивная) структура рецептора, а темным- его конформация, наблюдаемая после 50нс симуляции. В данном случае <СКО> составляет - 2.5 А. Кружками выделены области с повышенной структурной динамикой.

Анализ графика усредненных флуктуаций (RMSF, Рис. 5) выявил так же менее заметные колебания во внеклеточной области рецептора. В частности, были установлены колебания порядка 3 Ä во второй и третьей внеклеточных петлях рецептора.

0.7

с

и,-0.5 ¡0.4 0.3

И

ЕХС2

; I

і КАу,

1

!0 í;vt TMD

, , г I

Л; VII тмо

J Ml /

Рис. 5. График усредненных среднеквадратичных флуктуаций (RMSF) для каждого аминокислотного остатка рецептора. Максимумы данного графика соответствуют наиболее структурно подвижным аминокислотным остаткам.

В функциональном плане, повышенная структурная гибкость внутриклеточного сегмента лиганд-активируемых рецепторов может быть связана с их специфичностью, по отношению к различным G-белкам. При этом, общий характер структурной подвижности цнтоплазматической области рецептора имеет сходство с аналогичным явлением, наблюдаемым в случае белков, лишенных пространственной структуры (Intrinsic Unstructured Proteins, ЮР) (Tompa, 2002). Кроме этого, обратимая дестабилизация отдельных элементов полипептидной цепи, расположенных в её наиболее подвижных областях, известна во многих ферментах, а так же моторных белках (Whitford et al., 2007; Vale and Milligan, 2000). Одно из подобных явлений, получившее название конформационного крэкинга, связано с преодолением высоких потенциальных барьеров, при переходе белка из одной конформации в другую (Whitford et al., 2012). В качестве другого схожего явления выступает механизм fly-casting'a, в рамках которого дестабилизация отдельных участков белка связана с его специфичностью, по отношению к широкому спектру партнеров (Shoemaker et al., 2000). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в мембранных рецепторах скорее всего действует комбинация обоих механизмов.

На следующем этапе методом главных компонент было проведено сравнение результатов моделирования аденозинового рецептора с распределением его экспериментальных структур (Рис.6). Анализ подобных графиков позволяет проследить за "движением" рецептора в его конформационном пространстве, используя рентгеновские структуры в качестве "контрольных точек".

1 rooMinat«

Рис. 6. Суперпозиция проекции снимков МД, а так же результатов проекции кристаллографических структур А!д рецептора на первые две главные компоненты. Темные крупные точки соответствуют экспериментальным структурам рецептора, а более светлые • снимкам МД, сделанным, на протяжении рассчитанной траектории, с интервалом в 10 пс.

Из рисунка 6 видно, что траектория "движения" рецептора в конформационном пространстве по траектории МД проходит через два относительно коротко-живущих подсостояния, которые соответствуют его рентгеновским структурам. Таким образом, в ходе компьютерной симуляции рецептор быстро "покидал" область исходной (неактивной, pdb id Зет!) конформации, двигаясь по направлению к активному подсостоянию. Подобное поведение

указывает на существование конститутивной активности этого белка. Наблюдаемая нами конформационная подвижность аденозинового рецептора хорошо согласуется с результатами моделирования процесса инактивации р-2-адренорецептора (Огог е! а1., 2011а). В цитируемой работе авторам удалось наблюдать спонтанную инактивацию этого белка, которая так же сопровождалась его переходом в коротко-живущее (интермедиатное) подсостояние. Это свидетельствует о существовании нескольких биологически-значимых подсостояний лиганд-активируемых рецепторов. В этой связи, активация этих белков является не дву-стадийным процессом, а представляет собой скорее стабилизацию одного из возможных пред-существующих под-состояний.

В разделе 4.4 методом "управляемой" молекулярной динамики исследовалась конформационная подвижность ano формы аденозинового рецептора в липидно-водном окружении. Постановка вычислительных экспериментов проводилось в конформационном подпространстве, которое было геометрически-ограничено небольшим набором низкочастотных мод (ГК 1-3).

Для анализа конформационной подвижности аденозинового рецептора рассчитанная траектория проецировалась на плоскость первой и третьей главных компонент (Рис. 7). При анализе экспериментальных выборок родопсин-подобных рецепторов по этим коллективным модам (ГК 1 и 3) ранее нами наблюдались функционально-значимые движения в их a-спиралях, а так же внеклеточных петлях, соответственно. Из рисунка 7 видно, что на траектории МД (тёмные точки) наблюдалось движение аденозинового рецептора из неактивного (левый кластер экспериментальных структур), по направлению к его активному подсостоянию (правый кластер). На рис. 7 справа показан график этой же проекции, отражающий распределение конформеров аденозинового рецептора по первой главной компоненте. Общий характер бимодального распределения указывает о существовании двух устойчивых подсостояний этого белка (величина <СКО> между конформерами каждого ансамбля не превышает 0.5 Á).

Рис. 7. Слева- суперпозиция проекции снимков управляемой МД, а так же результатов проекции кристаллографических структур рецептора на первую и третью главные компоненты (ГК 1 и 3). Крупные точки соответствуют экспериментальным структурам рецептора, а совокупность мелких точек- снимкам МД, сделанным на протяжении рассчитанной траектории с интервалом в 10 пикосекунд. Справа показана проекция снимков этой же траектории на плоскость первой главной компоненты.

Наблюдаемое на траектории МД спонтанное движение аденозинового рецептора, по направлению к его активному состоянию (Рис. 7) свидетельствует о конститутивной активности этого белка, В работах Кенакина на основании экспериментальных данных было показано, что каждое функциональное подсостояние рецептора следует рассматривать как ансамбль его структурно-близких конформеров (Kenakin, 2002). При этом, плотность конформеров рецептора в интермедиатной области (между его более стабильными под-состояниями) является показателем степени его конститутивной активности (например, агонист-независимому переходу из одного ансамбля в другой). Проведенная пространственное выравнивание конформеров аденозинового рецептора, взятых из обоих кластеров, а так же расчёт RMSF выявили структурные закономерности, схожие с теми, что наблюдались нами ранее при сравнении экспериментальных структур этого белка (Рис.8).

Рнс. 8. Сравнение графиков усредненных среднеквадратичных флуктуаций (RMSF) для каждого аминокислотного остатка аденозинового рецептора, в случае его экспериментальной выборки (синим цветом, обозначено как РСА), а так же моделирования управляемой МД (зеленым цветом, показано как EDA). На рисунке справа показана графическая расшифровка обозначений отдельных элементов вторичной структуры рецептора. Светлым цветом показана структура- в начале моделирования, а более темным, наблюдаемая спустя 100 не моделирования.

Из рисунка 8 видно, что наиболее структурно подвижные области рецептора располагались в его цитоплазматических участках V и VI а-спиралей, а так же второй и третьей внеклеточных петель. Наблюдаемые на траектории МД колебания в а-спиралях рецептора по форме напоминали вибрации (амплитуды колебаний не превышающие 2 А) их внутриклеточных концов. Схожее динамическое поведение в цитоплазматических концах а-спиралей лиганд-активируемых рецепторов наблюдалось так же методом ЯМР (Nygaard et al., 2013; Bockenhauer et al., 2011). Кроме этого, литературные данные указывают на то, что во многих белках передача сигнала может протекать в отсутствии выраженных конформационных изменений, с амплитудами колебаний близкими к тем, что наблюдались нами в вычислительных экспериментах (Cooper and Dryden, 1984; Popovych et al., 2006). В цитируемых работах показано, что аллостерические процессы в белках могут осуществляться за счёт согласованных колебаний боковых групп их аминокислотных остатков. Совокупность этих наблюдений указывает на то, что в мембранных рецепторах флуктуации боковых групп отдельных аминокислот могут быть функционально значимыми. В этой связи, на следующем шаге исследовалась взаимосвязь между конформационными движениями а-спиралей аденозинового рецептора, а так же более локальной динамикой боковых групп его наиболее высоко-консервативных остатков. В частности, был произведен расчет временной эволюции ротамерной изомеризации боковой группы остатка Тгр-

000

so

loa ISO гоо jso зоо

A.i:.-.( I.C.J '| .J„

246 (вращения по двугранному углу х-1, рис. 9), а так же динамики ионного замка (расстояния между боковыми группами остатков Arg-102 из III спирали и Glu-228 из VI спирали, рис. 10, слева).

Рис. 9. Динамика боковой группы остатка Тгр-246, на протяжении траектории МД. Показана зависимость значения двугранного угла х-1 (в градусах, по оси ординат) боковой группы Тгр-246, от времени симуляции (в пикосекундах, по оси абсцисс).

Кроме этого, отдельно анализировалась динамика расстояния между боковыми группами Arg-102, а так же третьего высоко-консервативного остатка Туг-288, локализованного в цитоплазматической области VII спирали (рис. 10, справа). Анализ этих графиков выявил моменты времени, на протяжении которых наблюдались наиболее согласованные структурные изменения в трёх "микро-переключателях".

Tin.с ![*,) Tims lj«t

Рис. 10. Слева показана динамика ионного замка (солевой мостик между остатками Arg-102 и Glu-228), а справа-изменение расстояния между боковыми группами Arg-102 и Туг-288, на протяжении 100нс симуляции. В обоих случаях, по оси абсцисс показано время моделирования в пикосекундах, а по оси ординат- расстояние (Distance, в ангстремах) между полярными атомами боковых групп остатков Arg-102 и Glu-228 (слева), а так же Arg-102 и Туг-288 (справа).

Из рисунка 9 видно, что в ходе моделирования боковая группа Тгр-246 остатка находилась преимущественно в гош конформации (угол Х"1=60). С другой стороны, наблюдалось более динамическое поведение ионного замка, связанное с дестабилизацией этого взаимодействия во второй половине симуляции. Детальный анализ обоих графиков выявил корреляцию между

динамикой ионного замка, а так же подвижностью боковой группы ротамерного переключателя (Тгр-246). Например, кратковременная изомеризация (переключение) боковой группы остатка Тгр-246 из rom в транс форму, наблюдаемая начиная с 54 наносекунды, совпадала по времени с продолжительной дестабилизацией ионного замка. Примечательно, что спустя небольшой промежуток времени, крупный ароматический радикал остатка Тгр-246 ре-изомеризовался в первоначальное (гош) состояние, а заряженная боковая группа Arg-102 образовывала полярное взаимодействие с полярным радикалом остатка Туг-288 (Рис. 10). Подобная перестройка внутримолекулярных взаимодействий рецептора приводила к образованию полярного контакта между его третьей и седьмой спиралями (Рис. 11 и 12).

Рис. 11. Динамика микро-переключателей, наблюдаемая на траектории МД. На рисунке а показано исходное состояние рецептора, а на рисунках Ь и с- его снимки, сделанные по траектории МД в моменты времени 54 и 80 не, соответственно.

Рис. 12. Стабилизация полярного взаимодействия между боковой группой А^-102 (III спираль) и Туг-288 (VII спираль). На рисунке слева показаны ротамерные формы этих остатков в начале, а на рисунке справа- в конце моделирования.

Наблюдаемое согласованное динамическое поведение пространственно-удаленных "микропереключателей" аденозинового рецептора следует рассматривать, как внутреннее свойство его пространственной укладки. Известно, что в районе ортостерической области этих белков обычно присутствует несколько высоко-консервативных фенилаланинов. Ароматические боковые группы этих аминокислот могут играть роль связующего звена (например, посредством 7г-я стэкинг взаимодействий) между внеклеточной и внутриклеточной областями рецептора. В работе Дро методом молекулярной динамики было показано, что эти взаимодействия выполняют роль своеобразного "мягкого сцепления", придавая пространственной архитектуре рецептора "регулируемую" гибкость фгог е1 а!., 2011Ь). Известно, что Связывание различных лигандов

:

Pre-equilibrated

'л

Time=54ns

T¡me=80ns

structure

избирательно влияет на подвижность боковых групп отдельных микро-переключателей (Kobilka and Deupi, 2007). В связи с этим, очевидна необходимость существования связующего регуляторного элемента, для передачи сигнала из ортостерической области рецептора, по направлению к его внутриклеточному сегменту. Таким образом, структурные закономерности наблюдаемые нами в вычислительных экспериментах, подчеркивают аллостерическую природу лиганд-активируемых рецепторов, регуляторный механизм которой предопределен на уровне их пространственной архитектуры.

В разделе 3.5 методом "управляемой" молекулярной динамики исследовалось влияние связывания различных лигандов на конформационную подвижность P-2-адренорецептора. Согласно современным представлениям, лиганды 7-ТМ рецепторов принято условно классифицировать, в соответствии с их влиянием на базовую активность этих белков (Рис. 13).

Рис. 13. Влияние лигандов на базовую активность рецептора. Связывание полных и частичных агонистов опосредует максимальный и суб-максимальный биологический отклик рецептора, соответственно. С другой стороны, связывание обратных агонистов приводит к уменьшению активности рецептора, за счёт снижения уровня его конститутивной активности. Наконец, связывание антагонистов не оказывает прямого влияния на уровень базовой активности рецептора. Картинка взята из работы (Kobilka and Deupi, 2007)

В предыдущей главе нами было показано, что существование спонтанной активности лиганд-активируемых рецепторов связано с их конформационной подвижностью. В соответствии с концепцией Моно Уаймена и Шанже, связывание лигандов должно скорее сдвигать физико-химическое равновесие в предсуществующем ансамбле рецептора, а не приводить к возникновению новых подсостояний в нём (Niesen et al., 2011). Для проверки этого предположения методом молекулярной динамики была проведена серия вычислительных экспериментов. В качестве исходных данных были использованы три модели ß-2-адренорецептора, основанные на неактивной конформации этого белка, наблюдаемой в кристалле (pdb id 2rhl). В первом случае, расчет траектории МД проводился для ano формы рецептора (система 1), в то время как во втором и третьем - для комплексов рецептора с полным (система 2) и обратным агонистом (система 3), соответственно. Эти компьютерные симуляции проводились в геометрически-ограниченном конформационном (основном) подпространстве исследуемого белка, которое было образовано тремя низкочастотными модами (ГК 1-3).

Для исследования конформационной подвижности рецептора рассчитанные траектории проецировались на плоскость первой и третьей главных компонент. При анализе проекции для апо рецептора (система 1) наблюдалось спонтанное "движение" этого белка, по направлению к его активному состоянию (Рис. 14).

1 cwfJirart«

Рис. 14. Слева- проекция снимков траектории МД апо формы P-2-адренорецептора, а так же кристаллографической выборки этого белка на плоскость основного подпространства (ГК 1 и ГКЗ). Крупные точки соответствуют экспериментальным структурам p-2-адренорецептора, а совокупность светлых точек- снимкам МД, сделанным с интервалом в 10 пихосекуцд. Справа- проекция снимков этой же траектории на плоскость первой главной компоненты.

Как и в случае аденозинового рецептора, анализ проекции траектории апо рецептора на плоскость первой главной компоненты выявил характерное би-модальное распределение конформеров этого белка (рис. 14, справа). Это указывает на то, что в апо форме лиганд-активируемые рецепторы существуют в ансамбле нескольких подсостояний. Обращает внимание так же тот факт, что плотность конформеров в интермедиатной области, разделяющей более стабильные подсостояния P-2-адренорецептора выше, по сравнению с распределением, полученным для апо формы аденозинового рецептора (сравните рис. 7 и рис. 14). Это указывает на более высокий уровень конститутивной активности P-2-адренорецептора, по сравнению с аденозиновым рецептором. Результаты экспериментальных и теоретических исследований указывают так же на то, что различным подсостояниям лиганд-активируемых рецепторов соответствуют близкие значения свободной энергии (Kobilka and Deupi, 2007; Nygaard et al., 2013; Deupi and Kobilka, 2007). Таким образом, структурная гибкость этих белков должна обеспечиваться главным образом за счёт низких барьеров между функционально-значимыми подсостояниями, а не за счет большой разницы в свободной энергии между ними. В этой связи, окружающие тепловые флуктуации должны вносить основной вклад в конформационную подвижность этих белков. Таким образом, этот фактор может служить основной движущей силой спонтанных структурных изменений в рецепторе. С другой стороны, структурная гибкость этих белков является необходимым условием обеспечения их "функциональной избирательности" (Kenakin, 2002; Vaidehi and Kenakin, 2010). В этой связи, явление спонтанной активности лиганд-активируемых рецепторов может являться следствием их повышенной конформационной гибкости. С другой стороны, известно, что на

уровне клетки, лиганд-независимая активация лиганд-активируемых рецепторов крайне нежелательна (Costa and Cotecchia, 2005; Bond and IJzerman, 2006; Smit et al., 2007). Например, известно множество заболеваний, связанных с повышенным уровнем конститутивной активности различных рецепторов. В этом случае, клетка должна выступать в роли своеобразного реостата, задача которого сводится к понижению числа спонтанно активированных рецепторов. Для исследования влияния связывания различных лигандов на функциональные особенности (3-2-рецептора было проведено моделирование этого белка в комплексе с полным и обратным агонистом (Системы 2 и 3, соответственно). На рисунке 15 темными точками показана проекция полученной траектории МД для рецептора в комплексе с полным агонистом на плоскость основного подпространства. На этом же графике светлые точки соответствуют проекции траектории МД, рассчитанной для ano рецептора. Из этих диаграмм видно, что присутствие полного агониста в ортостерическом кармане рецептора приводит к значительному перераспределению плотности его конформеров, по сравнению с его ano формой.

0.8,-------.------------------------

-»ÍOÍ во o,s из 1.5 г.о 26 ; 5

L 'O.T.-fc' Jl'!

Рис. 15. Слева показана суперпозиция проекции снимков траектории МД ano формы fi-2-адренорецептора (светлые точки), комплекса этого белка с псшным-агонистом (тёмные точки), а так же проекции кристаллографических структур на первую и третью главные компоненты (ГК 1 и 3) его экспериментальной выборки (крупные точки). Справа показана проекция снимков обеих траекторий МД на плоскость первой главной компоненты.

Характер полученного распределения показывает, что присутствие полного агониста сдвигает равновесие в сторону активного подсостояния рецептора (правый кластер на левой диаграмме рис 15), по сравнению с его ano формой. Из правой части рисунка 15 видно, что присутствие полного агониста в большей степени стабилизирует интермсдиатное подсостояние рецептора, не исключая из его ансамбля конформации, соответствующие неактивному подсостоянию. Это указывает на то, что связывание полных агонистов является необходимым, но недостаточным фактором для стабилизации конформации рецептора, наблюдаемой в его активных рентгеновских структурах (pdb id 3sn6). С другой стороны, при анализе траектории МД, рассчитанной для рецептора в комплексе с обратным агонистом наблюдалась обратная картина (Рис.16).

Рис. 16. Слева- суперпозиция проекции снимков траектории МД ano формы Р-2-адренорецегггора (светлые точки), комплекса этого белка с обратным-агонистом (темные точки), а так же проекции его кристаллографических структур на первую и третью главные компоненты (ГК I и 3) его экспериментальной выборки. Справа- проекция снимков обеих траекторий на плоскость первой главной компоненты, соответствующей наиболее крупномасштабным движениям Р-2-адренорецептора в распределении его структур.

На рисунке 16 темными точками показана проекция траектории системы 3 на плоскость основного подпространства, относительно траектории ano рецептора (светлые точки). Из правой части рисунка 16 видно, что присутствие обратного агониста сдвигает физико-химическое равновесие рецептора по направлению к его неактивному подсостоянию (левому кластеру экспериментальных структур). Наблюдаемое сужение области доступного конформационного пространства указывает на то, что связывание этого лиганда значительно снижает структурную гибкость рецептора. Таким образом, функциональное поведение p-2-адренорецептора непосредственно связано с его структурной подвижностью, а различные внешние факторы стабилизируют отдельные области пред-существующего конформационного пространства. Описанное выше изменение структурной подвижности рецептора, наблюдаемое при его взаимодействии с различными лигандами, имеет важную физиологическую значимость. Например, повышенная концентрация обратных агонистов в различных тканях может являться универсальным механизмом ингибирования спонтанной активности этих белков in vivo. Таким образом клетка выполняет роль своеобразного реостата, регулирующего функциональное поведение мембранных рецепторов через их конформационную подвижность. Иными словами, ансамбль функционально-значимых подсостояний рецептора предопределен на уровне его пространственной архитектуры, и может быть использованы клеткой, в соответствии с ее физиологическими потребностями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведено исследование структурной подвижности родопсин-подобных рецепторов, используя методы молекулярной динамики, в совокупности с биоинформатическим анализом экспериментальных данных. Используя метод главных компонент удалось выделить отдельные коллективные моды движений исследуемых белков, каждая из которых имеет уникальное функциональное значение. Наряду с этим, структурные движения лиганд-активируемых рецепторов, наблюдаемые в ходе вычислительных экспериментов, удалось связать с процессом спонтанной активации этих белков. Было показано, что конститутивная активность этих белков, регистрируемая in vivo, непосредственно связана с их динамической природой, предопределенной в некоторой степени на уровне пространственной архитектуры. Наконец, анализ полученных результатов позволил связать конформационные движения в рецепторах с подвижностью боковых групп их отдельных высоко-консервативных остатков. В последнем случае, была показана роль этих "микро-переключателей" как внутренних регуляторных элементов, стабилизирующих функционально-значимые подсостояния родопсин-подобных рецепторов. Таким образом, были получены детальные представления о наиболее ключевых аспектах активации родопсин-рецепторов с точки зрения их конформационной динамики.

Показанная в работе структурная подвижность лиганд-активируемых рецепторов в литературе нередко сравнивается со своеобразным "конформационным хаосом". При этом, различные внешние факторы, например связывание лигандов, аллостерических модуляторов, а так же влияние специфического окружения (например, липидного состава мембраны, рН, либо концентрации электролитов), значительно ограничивают отдельные конформационные степени свободы, выделяя из них наиболее биологически-значимые. Таким образом, ансамбль возможных подсостояний этих белков предопределен на уровне их пространственной укладки, и отдельные конформации могут быть использованы клеткой, для осуществления специфических функций. Следовательно, функционально-значимая динамика данных макромолекул, наблюдаемая in vivo, может быть эволюционно отобранной посредством естественного отбора, действующего на уровне их пространственной архитектуры.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Методом главных компонент были получены распределения кристаллографических структур двух водорастворимых белков, в соответствии с их функциональными подсостояниями. Получены представленій о функционально-значимых движениях этих белков по отдельным низкочастотным модам (главным компонентам). По первой главной компоненте в обоих белках наблюдались наиболее крупно-масштабные движения (>10 А в случае кальмодулина, и ~ 2.0 Á - в случае фермента), ответственные за связывание этими белками их специфических субстратов. По второй главной компоненте наблюдались более локальные вибрации отдельных a-спиралей (не превышающие по амплитуде 1 А), связанные с точной подстройкой активных центров обоих белков, по отношению к их специфическим субстратам.

2. Методом главных компонент были получены проекции кристаллографических структур родопсин-подобных рецепторов на плоскость первых главных компонент этих белков. По первой главной компоненте все структуры рецепторов группировались в соответствии с движением цитоплазматической области их VI a-спирали (амплитуда 6-12 А, в зависимости от рецептора). Функционально это движение может быть связано с образованием поверхности для связывания молекулы G-белка. По третьей главной компоненте экспериментальные структуры группировались в соответствии с более локальными колебаниями внеклеточных петель (амплитуда колебаний менее 1 Аа). Эти коллективные флуктуации могут быть связаны с открытием ортостерической области рецепторов для связывания лигандов.

3. Методом молекулярной динамики в потенциальном поле GROMOS за 100 наносекунд наблюдалась спонтанная активация аденозинового рецептора. При этом, движение рецептора по направлению к активному подсостоянию сопровождалось подвижностью цитоплазматических концов его V и VI a-спиралей. Таким образом, конститутивная активность рецептора непосредственно связана с его конформационной динамикой, природа которой предопределена на уровне его пространственной архитектуры.

4. Методом молекулярной динамики показано, что конформационная динамика родопсин-подобных рецепторов непосредственно связана с подвижностью их отдельных высококонсервативных остатков. В частности, обратимая изомеризация индольной группы остатка Тгр-246 коррелировала по времени с дестабилизацией ионного замка (солевого мостика между Arg-102 и Glu-228). Кроме этого, стабилизация "активной" конформации рецептора коррелировала со стабилизацией специфического подсостояния ионного-замка, в котором боковой радикал остатка Arg-102 взаимодействовал с боковой группой остатка Туг-288. Эти конформационно подвижные микро-домены являются основой внутреннего регуляторного механизма, стабилизирующего различные функциональные подсостояния лиганд-активируемых рецепторов.

5. Методом молекулярной динамики было исследовано влияние внешних факторов на конформащюнную динамику p-2-адренорецептора. Показано, что связывание различных лигандов стабилизирует отдельные области конформадионного пространства рецептора, наблюдаемого в его ano форме. Таким образом, полный спектр функционально-значимых подсостояний лиганд-акгивируемых рецепторов предопределен на уровне их пространственной архитектуры, а связывание лигандов стабилизирует отдельные области пред-существующего конформационного пространства.

Список работ автора, опубликованных в рецензируемых журналах по теме диссертации:

Новиков Г., Сивожелезов В., Шебанова А., Шайтан К. "Классификация структур родопсинового рецептора современными методами структурной биоинформатики" II Биохимия - 2012 - Том 77, вып. 5, стр. 435-443.

Новиков Г., Сивожелезов В., Шайтан К. "Функционально-значимая конформационная динамика водорастворимых белков " // Молекулярная биология - 2013 - Том 47, вып.1, стр. 167-181.

Новиков Г., Сивожелезов В., Шайтан К. "Исследование конформационной динамики гормон-активируемых мембранных рецепторов методом анализа главных компонент " II Биохимия - 2012 -Том 78, Вып. 4, стр 522-532.

Новиков Г., Сивожелезов В., Шайтан К. " Исследование конформационной динамики аденозинового рецептора методом молекулярной динамики" // Биофизика - 2013 - Том 78, Вып. 4 , стр. -.

Список устных выступлений автора, опубликованных в тезисах конференций:

Новиков Г.В. и Сивожелезов B.C. "Классификация структур родопсинового рецептора современными методами структурной биоинформатики" // Тезисы 15-ой научной конференции молодых ученых "Биология XXI века" (Пущино, 2011 г.) стр. 116

Новиков Г.В. и Сивожелезов B.C. " Конформационная динамика гормон активируемых g-белок сопряженных рецепторов" //Тезисы 16-ой научной конференции молодых ученых "Биология XXI века" (Пущино, 2012 г.) стр. 67

Новиков Г.В. и Сивожелезов B.C. "Исследование конформационной динамики гормон-активируемых мембранных рецепторов методом анализа главных компонент " // Тезисы конференции IV съезда биофизиков России (Нижний Новгород, 2012 г.) стр. 72.

Новиков Г.В и Сивожелезов В.С "Исследование конформационной динамики семи-трансмембранных рецепторов методом молекулярной динамики" // Тезисы международной конференции молодых ученых "Экспериментальная и теоретическая биофизика 2012", стр. 68

Новиков Г.В., Сивожелезов В.С и Шайтан К.В.. " Исследование влияния внешних факторов на конформационную подвижность родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики" // Тезисы 17-ой научной конференции молодых ученых "Биология XXI века" (Пущино, 2013 г.) стр.

Новиков Г.В., Сивожелезов В.Си Шайтан КВ.. "Исследование влияния внешних факторов на конформационную подвижность родопсин-подобных рецепторов методами молекулярной динамики и структурной биоинформатики" // Тезисы конференции VII Московского международного конгресса "БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ" (Москва, 2013 г.).

Список условных сокращений.

7-ТМ - семи-трансмембранный; А - ангстрем;

АГК - анализ главных компонент

ВП- внеклеточная петля;

ВНП- внутриклеточная петля;

ГК- главная компонента;

МВШ- модель Моно-Ваймена-Шанже;

МД- молекулярная динамика;

не- наносекунда;

нм- нанометр;

пс- пикосекунда;

ГТОГФ - 1-Пальмитоил-2-олеил-глицеро-3-фосфат-етаноламин;

СКО- среднеквадратичное отклонение;

ТМ- трансмембранный;

ТМД- трансмембранный домен;

PDB- белковый банк данных (protein data bank);

EDA- Essential Dynamics Analysis ( метод анализа основной динамики);

EDS- Essential Dynamics Sampling (метод перебора основной динамики);

EXC- Extracellular (loop)- обычно служит для обозначения внеклеточных петель рецептора;

GPCR- G-protein-coupled receptors (рецепторы, сопряженные с действием G-белка);

1С - Intracellular (loop) - обычно служит для обозначения внутриклеточных петель рецептора;

РСА - Principal Components Analysis (метод анализа главных компонент);

PC- principal component (главная компонента);

RMSD- среднеквадратическое отклонение (СКО);

TMD- Transmembrane Domain (трансмембранный домен, обычно служит д ля обозначения одной из

а-спиралей рецептора)

Р2-ар- p-2-адренергический рецептор;

Агл - аденозиновый рецептор подкласса Аза;

Благодарности

В первую очередь, автору хотелось бы поблагодарить своего научного руководителя Сивожелезова Виктора Семеновича за оказанную помощь на всех этапах выполнения диссертационной работы. Кроме того, автор выражает огромную благодарность Шайтану К.В. и Шайтану А.К. за помощь в освоении метода молекулярной динамики, а так же написании и публикации статей. Отдельная благодарность выражается Колесникову С.С. за проведение внутрилабораторных семинаров, посвященных вопросам внутриклеточной сигнализации, а так же Балабаеву Н.К. за любезно предоставленный доступ к вычислительному центру ИМПБ. Наконец, автор благодарит своих родителей, а так же друзей за поддержку, оказанную на протяжении проведения работы.

Подписано в печать:

11.04.2013

Заказ № 8341 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новиков, Глеб Вадимович, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт

биофизики клетки РАН

На правах рукописи

04201356063

Новиков Глеб Вадимович

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННОЙ ПОДВИЖНОСТИ РОДОПСИН-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ И СТРУКТУРНОЙ

БИОИНФОРМАТИКИ

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.С. Сивожелезов

Пущина 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................6

Актуальность работы.........................................................................................................................6

Цель и задачи исследования..............................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................................10

1.1. Общие сведенья о белках.........................................................................................................10

1.2. Иерархия белковой структуры................................................................................................12

1.3. Структурно-динамические особенности белка (двугранные углы).....................................15

1.4. Динамические особенности белков........................................................................................16

1.5. Описание 7-ТМ рецепторов, исследованных в настоящей работе.......................................20

1.6. Пространственная архитектура 7-ТМ рецепторов.................................................................22

1.7. Конформационная динамика 7-ТМ рецепторов....................................................................25

1.8. Развитие основных представлений о функционировании 7-ТМ рецепторов......................28

1.9. Общие представления о конститутивной активности 7-ТМ рецепторов.............................32

1.10. Микропереключатели в 7-ТМ рецепторах...........................................................................34

1.11. Исследование активации 7-ТМ рецепторов методом молекулярной динамики...............40

1.11.1. Исследование фотоактивации родопсина.......................................................................40

1.11.2. Исследование структурной подвижности микропереключателей..............................43

1.11.3. Исследование активации гормон-активируемых GPCRs.............................................45

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ДИНАМИКИ...................................................................52

2.1. Метод молекулярной динамики...............................................................................................55

2.2. Метод главных компонент.......................................................................................................59

2.3. Управляемая молекулярная динамика. Метод essential dynamics sampling........................64

2.4. Детали расчетов.........................................................................................................................66

Исследование структурной подвижности Src-тирозин-киназы методом анализа главных

компонент.......................................................................................................................................67

Исследование структурной подвижности 7-ТМ рецепторов методом главных компонент.. 67 Исследование структурной подвижности аденозинового Алл рецептора методом

молекулярной динамики...............................................................................................................68

Моделирование молекулярной динамики Агл рецептора в окружении CCl^-вода.................69

Моделирование молекулярной динамики Агд рецептора в окружении ПОГФ-вода............71

Расчет сдвига РКа для титруемых аминокислотных остатков рецептора...............................73

Моделирование молекулярной динамики аденозинового рецептора в окружении ПОГФ-

вода методом Essential Dynamics Sampling (EDS)......................................................................73

Моделирование p-2-адренорецептора в комплексе с лигандами.............................................76

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................78

3.1. Исследование конформационной подвижности водорастворимых белков методом анализа главных компонент............................................................................................................78

3.2. Исследование конформационной подвижности родопсин-подобных рецепторов методом анализа главных компонент............................................................................................................86

3.3. Исследование конформационной подвижности аденозинового А^л рецептора методом равновесной молекулярной динамики.........................................................................................100

3.4. Исследование конформационной подвижности аденозинового рецептора в окружении липиды-вода методом "управляемой" молекулярной динамики..............................................109

3.5. Исследование влияния связывания лигандов на конформационную динамику р-2-адренорецептора методом "управляемой" молекулярной динамики.......................................127

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................................................136

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.........................................................................................................................137

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................................140

Приложение 1.СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

7-ТМ - семи-трансмембранный; А - ангстремм;

АГК - анализ главных компонент

ВП- внеклеточная петля;

ВНП- внутриклеточная петля;

ГК- главная компонента;

МВШ- модель Моно-Ваймена-Шанже;

МД- молекулярная динамика;

не- наносекунда;

нм- нанометр;

пс- пикосекунда;

ПОГФ - 1-Пальмитоил-2-олеил-глицеро-3-фосфат-етаноламин; СКО- среднеквадратичное отклонение; ТМ- трансмембранный;

ТМ1, ТМ I - первый трансмембранный домен (одна из семи а-спиралей);

ТМД- трансмембранный домен;

PDB- белковый банк данных (protein data bank);

EDA- Essential Dynamics Analysis ( метод анализа основной динамики);

EDS- Essential Dynamics Sampling (метод перебора основной динамики);

EXC- Extracellular (loop)- обычно служит для обозначения внеклеточных петель рецептора;

GPCR- G-protein-coupled receptors (рецепторы, сопряженные с действием G-белка);

1С - Intracellular (loop) - обычно служит для обозначения внутриклеточных петель рецептора;

РСА - Principal Components Analysis (метод анализа главных компонент);

PC- principal component (главная компонента);

RMSD- среднеквадратическое отклонение (СКО);

TMD- Transmembrane Domain (трансмембранный домен, обычно служит для обозначения одной из а-спиралей рецептора) Р2-ар- p-адренергический рецептор; Агл-аденозиновый рецептор подкласса Агд;

Приложение 2.Основные определения.

Обозначение аминокислот. Существует два альтернатиных способа обозначения аминокислотных остатков в 7-ТМ рецепторах. Наиболее традиционный способ- нумерация остатков от N- к С- концу полипептидной цепи. Например, Lys-15, означает остаток лизина в 15 позиции, относительно N-конца. Кроме того, существует альтернативная нумерация, предложенная Баллестеросом и Вейнштейном (Ballesteros-Weinstein nomenclature). Согласно этой номенклатуре, каждому аминокислотному остатку приписывается два номера, разделенных точкой (например, Тгр-6.48). При этом, первое число соответствует номеру а спирали, в которой расположен этот остаток, а второе (двузначное) число отражает степень консервативности данного остатка среди родопсин-подобных 7-ТМ рецепторов. Во втором случае, наиболее консервативный остаток имеет индекс х.50. Таким образом, остаток Тгр-6.48 обозначает высококонсервативный остаток триптофана из VI спирали рецептора. Подобная система удобна для обозначения высококонсервативных остатков в 7-ТМ рецепторах (например, микро-переключателей), имеющих неидентичное положение в полипептидной цепи различных рецепторов. Например, в вышеуказанном примере Тгр-6.48, в случае родопсина соответствует остатку Тгр-275, а в случае аденозинового рецептора- Тгр-265.

Алпостерия- феномен структурного и энергетического сопряжения между пространственно-удаленными участками белка. Например, в случае, когда связывание лиганда в ортостерическом сайте приводит к конформационным изменениям во внутриклеточной области рецептора, считается что два данных участка аллостерически сопряжены.

Множественная эффективность- способность одного рецептора активировать несколько различных молекул-эффекторов, в зависимости от связывания различных лигандов. В этом случае говорят, что рецептор способен осуществлять сигнализацию, по различным путям, переключение между которыми связано со стабилизацией его различных конформаций. Например, сигнализация, в случае p-2-адренергического рецептора может протекать либо через Gs, либо через Gi- белки. В первом случае активация рецептора сопровождается повышением уровня цАМФ, а во втором- его снижением. Существуют рецепторы с более выраженной "множественной эффективностью", в рамках которой связывание различных лигандов активирует принципиально различные пути сигнализации.

Микро-переключатели- высококонсервативные остатки 7-ТМ рецепторов, для которых характерна повышенная степень динамики их боковых групп (ротамерная изомеризация по двугранному углу %-1). Для всех 7-ТМ рецепторов обнаружено, по крайней мере, три подобных структурных элемента: (1) солевой мостик (ионный замок), образуемый остатками Arg- 3.50 (мотив DRY) и Glu - 6.32 из цитоплазматической области третьей, а так же шестой спиралей, соответственно; (2) ротамерный переключатель- высококонсервативный остаток триптофана (Тгр-6.48, мотив CWxP), расположенный в районе лиганд-связывающей области; (3) остаток Туг-7.53 (мотив NPxxY) из седьмой спирали рецептора.

Конститутивная (спонтанная, базовая) активность - доля активного (апо) рецептора, относительно его общей активной фракции, не вызываемая связыванием молекулы агониста.

Ортостерический (лиганд-связывающий) участок- лиганд-связывающая область, обычно расположенная внутри 7-ТМ а-спирального пучка родопсин-подобных рецепторов.

Аллостерический (лиганд-связывающий) участок- лиганд-связывающая область рецептора, расположенная в альтернативной позиции, относительно его ортостерического участка. Лиганды, связывающиеся в этих участках, обычно выступают в роли аллостерических модуляторов.

Отрицательная эффективность- функциональное свойство обратимых агонистов, связанное со снижением уровня конститутиврной активности рецептора, ниже его базового значения.

Функциональные классы лигандов 7-ТМ рецепторов.

Полный агонист- лиганд, связывание которого вызывает максимальный уровень активности рецептора.

Частичный агонист- лиганд, опосредующий суб-максимальный уровень активности рецептора, даже при связывании в насыщающей концентрации.

Обратимый агонист- лиганд, снижающий уровень базовой (конститутивной) активности, до минимального значения.

Нейтральный антагонист- лиганд, не влияющий на базовую ( конститутивную) активность рецептора. Обычно связывание нейтральных антагонистов приводит к стерической изоляции ортостерического кармана рецептора, препятствуя связыванию других лигандов.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Рецепторы, сопряжённые с G-белком (G protein-coupled receptors, GPCRs) относятся к наиболее обширному классу семи-трансмембранных (7-ТМ) рецепторов [1,2]. Известно, что представители этого класса мембранных белков играют первостепенную роль в межклеточных коммуникациях, автокринных и паракринных регуляциях клеточных функций, а также в процессах подвижности и адгезии клеток [3]. В этой связи, исследование 7-ТМ рецепторов всегда было одним из основных направлений клеточной физиологии, биофизики и фармакологии. Помимо чисто академического интереса, экспериментальный и теоретический анализ данных белков имеет так же важное прикладное значение. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных средств являются лигандами этих белков [4, 5]. Поэтому развитие новых методов исследования функциональных аспектов этих белков непосредственно связано с областью разработки новых лекарств.

Долгое время считалось, что переход рецептора в активное состояние является прямым следствием его взаимодействия с агонистом. Тем не менее, в существующих представлениях о деталях механизма активации этих белков все еще много неясного [6, 7]. Например, экспериментально было показано, что антагонисты и обратные агонисты связываются с неактивным рецептором с большей афинностью, чем полные агонисты. Это свидетельствует о том, что связывание лиганда является необходимым, но недостаточным фактором для активации рецептора [8, 9]. Наряду с этим, недавно стало известно, что для 7-ТМ рецепторов характерно выраженное динамическое поведение в условиях in vivo [10]. При этом, находясь в различных подсостояниях, рецептор осуществляет сигнализацию по разным сигнальным каскадам [11]. В этой связи, совершенно необходимо понимание того, какие именно конформации рецептора соответствуют его истинно активному подсостоянию и каким именно путем в конформационом пространстве "движется" рецептор, для достижения данного состояния. В настоящее время для качественного описания функционального поведения мембранных рецепторов существует концепция популяционного сдвига, основанная на модели Моно, Ваймена и Шанже (МВШ) [12, 13]. Согласно этой концепции, для этих белков характерно существование ансамбля структурно-близких

подсостояний (конформеров), а так же их непрерывный перебор. При этом, любое внешнее воздействие приводит к стабилизации специфической конформации рецептора, делая её преобладающей, из числа возможных. Таким образом, в рамках модели МВШ, динамическое поведение рецептора является ествественным свойством его пространственной архитектуры [14, 15]. Подобное функциональное поведение лиганд-активируемых рецепторов, получившее название "функциональной избирательности", опосредует ряд физиологических явлений в этих белках [16, 17]. Например, определенная доля их конститутивной (лиганд-независимой) активности непосредственно связана с возможностью их активации в отсутствии [18]. Экспериментально было показано, что подобное спонтанное поведение может иметь функциональное значение для одних рецепторов, и в тоже же время являться нежелательным фактором для других. Тем не менее, в настоящее время отсутствуют какие-либо представления о структурных особенностях этого явления, а так же до конца остается неясным его функциональное значение.

В настоящее время исследование мембранных белков современными экспериментальными методами сопровождается рядом методических трудностей [19]. Например, для поддержания нативной структуры, а так же функциональных свойств этим белкам требуется наличие их мембранного окружения. С другой стороны, существенный прорыв в области расшифровки новых пространственных структур 7-ТМ рецепторов и значительное увеличение вычислительных мощностей, способствуют внедрению компьютерных методов исследования данных белков в среде ш зШсо. К настоящему времени этими методами широко исследуются разнообразные функциональные аспекты 7-ТМ рецепторов, включая особенности их структурной подвижности. Таким образом, полученные данные могут пролить свет на ключевые аспекты динамического поведения 7-ТМ рецепторов, как в фундаментальном, так и в прикладном плане, способствуя разработке новых лекарственных препаратов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является исследование спонтанной активации (конститутивной активности) родопсин-подобных рецепторов и взаимосвязи этого процесса с их конформационной подвижностью. Для выполнения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:

1. Провести апробацию метода главных компонент для исследования функционально значимых движений a-спиралей в белках. Исследовать конформационную подвижность двух водорастворимых белков (кальций-связывающего белка кальмодулина, а так же фермента SRC-тирозин киназы), используя их выборки кристаллографических структур.

2. Исследовать структурную подвижность фоторецептора родопсина млекопитающих, а так же трёх гормон-активируемых рецепторов (двух классов p-адренергических, а так же аденозинового Ала рецептора) методом главных компонент, используя выборки пространственных структур этих белков. Провести сравнительный анализ особенностей конформационной подвижности гормон-активируемых рецепторов, относительно контрольной выборки фоторецептора родопсина.

3. Методом молекулярной динамики исследовать структурную подвижность ano формы аденозинового А2а рецептора в окружении ССЦ-вода. Установить корреляцию между наиболее конформационно подвижными областями рецептора, а так же его функциональными особенностями. Методом главных компонент сравнить конформационную подвижность аденозинового рецептора, наблюдаемую на траектории МД, с характером распределения его экспериментальных структур.

4. Методамим молекулярной динамики и структурной биоинформатики исследовать конформационную подвижность ano формы аденозинового рецептора в окружении липиды-вода. Установить взаимосвязь между конформационной подвижностью рецептора и его конститутивной активностью. Изучить корреляцию между крупномасштабными конформационными движениями рецептора, а так же локальной динамикой его отдельных высоко-консервативных остатков.

5. Методом "ограниченной" молекулярной динамики исследовать влияние внешних факторов на конформационную подвижность p-2-адренорецептора. Провести сравнение проекций траекторий МД, рассчитанных для исследуемого белка в комплексе с различ