Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические аспекты регенерации растений в культуре клеток и протопластов пшеницы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты регенерации растений в культуре клеток и протопластов пшеницы"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

'То О Л

На правах рукописи

ДЖАРДЕМАЛИЕВ Женис Кадырович

УДК 581.143.6

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И ПРОТОПЛАСТОВ

ПШЕНИЦЫ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент —1994

Работа выполнена в'"'Лаборатории клеточной инженерии Института молекулярной биологии н биохимии им. М. А. Айт-хожнна Национальной Академии наук Республики Казахстан.

Научный руководитель кандидат биологических наук

М. К. КАРАБАЕВ.

Официальные оппоненты:доктор биологических н.аук,

профессор А. Э. ЭРГАШЕВ,

кандидат биологических наук С. А. ДЖАТАЕВ.

Ведущая организация Научно-исследовательский институт

селекции и семеноводства им- Г. С. Зайцева УзСХАН, г. Ташкент.

& £ о & °

Защита состоится с7 » ¿сдл- 1994 г. в -У часов

на заседании Специализированного Совета Д 015.02.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Тащкент-128, ул. А. Кадыри, 7Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан « » ]994 г>

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук,

профессор Ж. САФИЯЗОВ

- 3 -

ОШЯ КАРАЙТЕРКСГПСКЛ РАЕОТН

Актуальность нрс5.та:и Дальнейший прогресс в селекции, сельскохозяйственной биологии н растениеводстве связан с развитием принципиально новых методов и штодологий, внедрением в практику нетрадиционных технологий псвыгзикя продуктивности растений. В наше время, когда значительной части населения Земли не хватает продовольствия,. а из-за экстенсивного типа продукционного процесса ощущается дефицит земельных ресурсов, исследования такого рода приобретают важнейшее фундаментальное и практическое значение. Успехи, достигнутые в передовых направлениях биологии, привели к созданию методов генетического манипулирования и реконструирования клеток, которые в принципе оказались применимы и к растениям. Удалось таюае создать экспериментальные системы, позволяющие получать и поддерживать культуры юзеток высших растений подобно культурам микроорганизмов. Стало возмохшьм применять it растениям высокоэффективные микробиологические .методы и технологии; Так началось развитие клеточной и генетической шигенерии, определивших качзатзеиио новый уровень биотехнологии.

На пути создания клеточных и генных биотехнологий для селекции растений множество проблем. Одно из основных затруднений носит технический характер. Чтобы применить к выспим растениям технологию генетического гзнилулировшш in vitro, необходимы эффгкглнт;? неточные. систеш, позвсшпсда? проводить эти иаяшужщшг я рзг>неркро-вать целью растения. Для многих вадаейшвг сельскохозяйственных растений и, прежде всего аорновшс злаков, эта проблема д&чека от окончательного решети: разработка приемов культура клеток и протопластов пока еш является эмпирической работой. Логическим подходом к преодолении трудностей гекеимесг-ого ^шшулфовдкия вьюшки растениям! является создание фундгнзнтзлвных основ культуры клеток, протопластов к регенерсциа из со: раегешй.

fes я casm. Озпсвгйя WZh- ¡*сй£вдовапт - разребогта методов культивирования клетсн: и протопластов швйшш и регенерации из них растений. Конкретным« задачам! бнлиг' --

I. Изучить реген-з рационную способность палящи з культуре m vitro я оцепить роль генотипа, ешгеиегкческюс особенностей зкспланта и внешней среды.

2. Оценить сошклопааьну*? •гэет.ггсгзжг'ь щэтщм по хозяйственно нон-, HK.i признакам.

. ~ 4 -

3. Разработать способы глубинного культивирования клеток пшеницы получить эмбриогенные клеточные суспензионные кух^туры.

4. Получить делящиеся протопласты и регенерировать из них растения

Научная новизна и практическая данность. Исследованы ростовые : иорфогенетические процессы жизнедеятельности культуры in vitro nme ницы в связи с.созданием эффективных клеточных биотехнологий. Шка заны генетическая обусловленность этих процессов и решавшая рол] условий среды в реализации потенции клетки (генотипа, экепланта) i регенерации растения. Изучены особенности наследования регенераци-онной способности пшеницы и показана ее возможная зависимость с. цитоплазматических и материнских эффектов. Сомаклонадьная изменчивость, обусловленная культурой in vitro, является одним из моиныз способов усиления генетического разнообразия у регенерировании; растений пшеницы, затрагивает различные признаки, в том числе хозяйственно ценные. На основе разработанных методов культуры клеток, регенерации растений и их селекционно-генетических испытаний в различных экологических зонах Казахстана совместно с Кааахским НЮ земледелия выделено около 200 сомаклональных линий пшеницы, используемые в настоящее время в практической селекции. Разработан способ получения эмбриогеяной активно пролиферирущей -"успензионкой культуры клеток пшеницы. Протопласты .из клеток такой суспензии способнь к делению и регенерации растений. Таким образом, созданы клеточные системы, которые могут быть использованы в биотехнологиях для пшеницы, в частности, в клеточной селекции, при соматической гибридизации и генетической трансформаций.

Апробация работы. Материалы диссертации были долодены и представлены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1986); IV (Ашхабад. 1986) и V. (Ташкент, 1991) конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана; Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы, 1388); Международном симпозиуме "Клеточные и генные биотехнологии для зерновых злаков" (/лматы, 1989), Респубда;анской конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алматы, 1989}, VII Международном конгрессе по культуре тканей и клеток растений (Амстердам, Нидерланды, 1990); Всесоюзной конференции по,сельскохозяйственной биотехнологии fЦелиноград, 1991); I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пувдю, 1991); II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993).

Публикация. Основные положения диссертации изложены в 34 печатных работах, из которых 16-дурнальные статьи, 17-тезисы докладов, 1 авторское свидетельство.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 223 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц и 22 рисунка. Состоит из введения, б глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 457 наименований, из них 403 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Каллусогенез и регенерация в культуре in vitro пшеницы

В этой главе представлены результаты исследований, относящихся к периоду 1984-86 гг. Объектами исследования были выбраны пять сортов озимой пшеницы Т. aestivum L.: "Заря", "Кавказ", "Кооператор-ка", "Лотесценс 329" и "Мироновская 808". Каллусы индуцировали на эксплаптах кончиков первичных корней, зрелых и незрелых зародышей, узлов кущения и незрелых соцветий. В качестве основной среды для каллусообразования и регенерации использовали среду Мураеиге и Ску-ra (МС) с модификациями. Показано, что все использованные экспланты легко образуют каллусы. Регенерировать растения удалось из каллусов узлов кущения, незрелых и зрелых зародышей. Наилучшей регенерацион-ной способностью обладали каллусы из незрелых зародышей. В этих опытах решающим условием реализации морфогенных потенций каллусной тканью использованных наш сортов озимой пшеницы явилось состояние дифференцировки клеток исходной ткани. В последующих наших работах было выявлено, что такой "эпигенетический" блок удается преодолеть подбором условий культивирования. \

Глава 2. Генетические особенности каллусообразования и регенерации растений в культуре клеток пшеницы и эгилопса

В этой главе представлены результаты исследований, в которых основное внимание уделено генотипичеекиа особенностям образования каллуса и регенерации из них растений.

Объекты исследования - виде ггиеакцы Т. aestivum (гексаплоид,. мягкая пшеница, сорт "Днепровская 621"), 7. durum. |>тетраплоид„ твердая пшеница, сорт 8043), Т. tírnofeevi Zhuk. ^тетрашювд. дикая, форма) и эгилопо Ае. oylíndrtca В качестве эгсеплаятоэ кспользовааи

- б -

зрелые и незрелые зародыши. Показан очень высоки"! процент образования каллусов на этих тканях (80-100% - на зрелых и 100% - на незрелых зародышах) для всех изученных видов растений. Эти данные позволяют считать, что индукция каллусообразования не зависит от генотипа, а определяется только условиями культивирования. Генетически обусловленность имеет другой показатель - рост сырой массы первичного каллуса (рис.1). Наибольиий прирост каллусной массы был характерен для твердой пшеницы Т. durum. Далее по степени снижения скорости роста каллуса следовали T. aestivum, T. tiirofeevi, Ае. cylindrica. Следует отметить, что по мэре увеличения количеств! пассажей различия между видам:«! по данному показателю становятся менее выраженными. Возможно, это связано с увеличением гекетическо] гетерогенности в популяциях культивируемых ¡слеток и своеобразии) "нивелированием" гекотштческих различий по данному признаку у исследуемых видов. Поэтому не случайно, что генетические особанност] недифференцированного роста клеток мы изучали на первичных каллус-

ных тклнях.

На рис. 2 представлены данные количественного анализа типов кал-лусиых тканей у ксияедуешх генотипов. 80-90% каялусных тканей, сформировавшихся кг вкешзатах из зрелых зародыей, оказались гомогенными. Количество гетерогенных каллусов из зрелых зародышей был: сравнительно небольшим: около. 152: у T. aestiviwi и T. tiirofeevi, 9; у Ае. cylindrica, 7-3 % у Т. durum. Из общзго числа гетерогенны; каллусов лишь половица оказалась способной к стеблевому органогенезу; на большей части остальных из них формировались корни.

Доля гетерогенных каялусных тканей была значительно выше в случае их индукции на зкеплантах из незрелых зародышей. Из общего числа проанализированных каллусов у T. aostiviwi гетерогенными оказались 70%, у 7. duruir. - 30, у T. tiirofeevi - 60, у Ае. cylindrica -50. Стеблевой морфогенез удалось индуцировать на 65% каллусов мягкой пшеницы, 20% - твердой пшеницы, 402 - Т. timofeevi и 30% - Ае. cylindrica. По степени снидеикя регенерационной способности каллус-пух тканей, -как из зрелых, так и незрелых зародышей, исследуемы* виды растений располагаются следующим образом: T. aestivum - Т. tiirofeevi - Ае. cylindrica - Т. durum .

Таким. обраэо î, анализ полученных данных позволяет выявить различия между видами пшеницы л эгилопса по интенсивности роста ';аллу-ça и его ре гене рационной активности. ©та различия, по видимому, отражают генетически обусловленные потенции вида к недифференцирован-

Рис. 1. Рост массы первичных каллусов кз зрелых CI) и незрелых (II) зародышей .1 - Т. aestivum; 2 - Т. durum; 3 - Т. tirofeevi; 4 - Ае. cylindrica Ш оси абсщюс - время культивирования, сутки; По оси ординат - касса каллуса, иг

Ркс. 2. CooTnornrns1? типоз кзлт/соз из эролнх н незрелых oapoRHsgft. а - сбЕ&& число сналшшронапнкг каяяусоэ, %; б - % гошгеннья каллусов; в - % гвтерогвявнх кагвуес©; г - % каллусов, регенерировав-, «ш растеши^ ОсуальнкзобошатаивГ как на рис.!.

ному росту к морфогенезу in vitro. Следует отметить, что мы не обнаружили положительной корреляции между частотой образования каллусов, скоростью их роста и регеверацигсяной активностью. Так, при наиболее интенсивном кадлупообразовакии выход растений-регенерантов у Т. durum сказался самым нгаким. Отсюда следует, что кадлусогенеэ и регенерация растений - это разные биологические явления и, следовательно, методические проблемы. Этс означает, что при индукции кая-дсго процесса необходимо строго, кодходить к подбору условий.

О'ледуюший Э'/ая исследований гено-гивичесюи. особенностей культуры in vitro был яоовяцен изучению регенерации у различных сортов и их гибридов с целью оценки наследуемости этого признака. Объектами били 1.3 сортов и 14 гибридов I. durum, 9 сортов и 14 гибридов Т. aesfcivum. Показано, что гибриды по признаку "скорость pccva каллуса" з большинстве случаев превосходят сорта (явление, подобное гетерозису) иди соответствуют ¿уда),¡у иэ родителей. Характер наследования признают морфогенеза in vitro определяли по степени доминирования (bp). Результата анализа суммированы в табл.1.

• .Таблиц 1.

Тип доминирования показателей регенерацконной способности пшеницы

{ % морфогеяных . I % каллусов, регекерк-

Доминирование ! каллусов | роьавшх растения

i мягкая твердая 1 мягкая тзердая

-1 < hp < 1 50, G 14,3 23,6 42,9

hp - 1 7,1 - • 7,1

hp- -1 14,3

hp > 1 42,9 50,1 64,3 28,6

hp <~1 .... ,. 28.е ' . — 14,2

У гибридов-мягдой пшеница 7г.:.: aesUvur.i по. частоте образования,, морфогениьрс каллусов 50,02 шутейных "генотипов показали промежуточное наследование (-1< hp <1) п 42,92- - сверкдокшировааие (hp >1). Регенеуааиолная свобббнооть у 64, гибридов наследовалась по типу сверхдс1,книрования, огало 30% показали промежуточное наследование. Мо частоте образования морфогенньй каллусов, отраяшдей регенерационный потенциал генотипа, дучшаи сказались "'Прогресо" (69%. морфо-генньгх-каллусов от ободзго числа анализированных), "Sapjaffam" (85Х),

"йетксу" (76%), Алма-Атинская пслукарликсвая (80%). Среди топкросс-ных гибридов лучшими по этому, показателю были "Алма-Атинская полукарликовая х Прогресс" (90%), "йжная х Прогресс" (91%), "Безостая 1 х Прогресс" (91%).

ЛЬ образованию морфогенньк каллусов у полоеичы .изученных гибридов твердой пшеницы Тг. durum отмэчег.о сверхдоминирование. Регене-рационяап активность н 42,92 случаев наследовалась но типу промежуточного доминирования, 28,6% гибридов показа.™ сверхдоминировакие.

Такш образом, полученные данные определенно свидетельствует о генетический обусловленности регвнерационной способности к сложности характера наследования этого признака. ¡Завершая обзор результатов генетического аналнэа npoueccos морфогенеза in vitro, хотелось бы особо подчеркнуть, что генетическая детерминированность р¿генерационной активности культивируемых > клеток в определенном смысле является условной и ни. s'коей мере не означает загоета на воэыок-ность регенерировать растения ь культуре in vitro для тех-или иных генотипов: для физиолога это означаем, что необходим поиск соответствующих условий, скособстсующа экспрессии генов к механизмов корфсгеие&а. Валяость условий культуры наглядно иялкютрируетеь исследованиями по регенерации растений из ечитакщихся кизкототипотент-шд! тканей листа пшеницы, которые изложены в следующей главе.

Глава 3. Влилние условий культивирования на морфогенез in vitro (на примере регенерации растений т листовых тканей пшеницы)

Наиболее удобной с точки зрения полу-.ениа сомаклональнкх вариантов, сохранения летальних я условно-лзтальних форм (альбино-фор-ш, растения с аномазяями ь сбразовашпгрепродуктивмш органов Я др.} в культуре, быстроту и легкости полу»1эшш исходных экснлантов является листовая тгакь. Б то jä вреьи регенерация растений из листа является трудной и пока с-иа нерешенной проблемой. Дело ь том, что применяемые в с^ствуюш;1Х способах регенерация растений воздействия на ткань, обусловленные резкими изменения»?*: фитогсрмоналъ-лого баланса и других факто^в культивирования (условия освещений, концентрация элементов питания и др.), является довольно ¿*естким, приводят к некрозу, снижению регек^рационной способности тканей. Нам удалось: раэработатл способ позьтаяия яивнеслособностя листовых }саллусов и регенерации из них растений. Суть способа заключается в следующем. Кспольэул питательные среды на основе MC, в качестве эк-

спланта берут основание листа, а концентрацию фитогормонов и интенсивность света изменяют ступенчато. Перед высадкой иа регеверациоя-ную среду каллусы, индуцированные при высоких (2-4 иг/л) концентрациях 2,4-Д, постепенно адаптируя® ко все более низким концентрациям этого гормона (от 2 до 0,1 мг/л) и условиям освещения (темно-та-500-1000 люкс). В регенерационной среде ступенчато увеличивают содержание аеатина (от 0,1 до 2 мг/л) при постоянной юэнцентрации ЛУК (0,01 мг/л), повышают интенсивность света от 1000 до 2000 люкс. Для ' укоренения и повыиения жизнеспособности регенерированных побегов ступенчато изменяют в среде для укоренения содержание ИУВ от 0,1 до 0,5 мг/л,, увеличивают освещенность до 4000 люке. Перед высадкой в почву регенераты выдерживают на среде с половинным содержанием солей по МС и повышенной (по сравнению с регенерационной средой) концентрацией ЛУК - .0,1-0,5'мг/л. Таким образом удается более л'онко регулировать ' морфогенегические реакции и адаптационные потенции культивируемых клеток.

Глава 4. Сомаклонажьная изменчивость

Уже на уровне регенерации растений методы культуры клеток вышли из рамок лабораторных разработок в практическую селекцию. Одной иа таких биотехнологий является, сомаклональная вариабельность, в основе которой летат генетические изменения клеток,, штудированные условиями культивирования, и последующая регенерация из лих растений. .Эти изменения могут затрагивать семь® различные стороны-жизнедеятельности клетки и растения, в.том числе, и 'хозяйственно ценные яршшки. И именно с этим. обстоятельством связано практическое использование ехого явления.

За период lS85-áS92,rr. было получено я передано для селекционно-генетических -ксследовшжй в различных эшдагичееких зонах Казахстана свыше 4000. растений-регенератов пдзкзэды. В'результате селекционной работы e.smaí сошашшдаяыш!• вариантами удалоеь выделить около 200 Л1ятй озамой к ■ яровой плвшщы (табл. 2), которае рэ-ттшоваш и угэ йвамьзулхгрж ••; л''/': " ..', ■■

> в качестве.родстеякжак. фщ ■ -„шг «гсочвшм отдельная; хозяйственно цешшх щшчаюз; • ; '

- для ввпосредт.^бшяч): вклшевия в ;ярае.'йч9скай селекционный процесс и доработки go нрвшс сортов разданных агрсэкоткиоз;

- для_/создания изргеншк дааиа,!»', лиыдафуапда яозяйстаешю: ценным

- li -

признакяя

Таблица 2.

Количество созданных сомакдояал/>ньаг линий на основе селекции растеккй-регекзрантоп птажщц Т. аззЦушл (1985-1991 гг.)

Сомаклональкые лшпш

Экологические пушсты --------------------------------

озимая пшеница | яровая пшеница

КазНИИЗ 21 40

Караой 19 12

Красноводопадская ГСС 39 -

Актюбинская Г0СХ30 - 16

Карагандинская ГСОШО - 11

Семипалатинская ГООХОО - 9

Восточно-Казахстанская <ЖС a -

Кустанайский 1ШЖ 1?

Талда-Кургаяеггай ОП с 4

В порядке обсуждения сой£клонал>ЕоЗ конзнщзеоти хотелось бы отметить следуйте. Osero. *кето воэнЕказ* вопрос, в арвя5да&ст-во"еомаклонашюй вартга&м&воеад серел дрзтпша ceoc-~---¡ г"-гр;т»в-кого шшенааш кяездш я раагеиаз,.-* ЧЕккгноет», хтп - — '8-•воУ? Яанйздгезсккз H&pjiirsaa квдущровагь, к г - цсшй

набор зпссгсняьп; и агентов.. 'Ген не ги о--1 *'Г гге-

аадиих лэт локаэкв-звт, 'что morm генетические .„_ pps«™

' ДНК в культура in vitro , в частности мгярйяировгйше'ДНВ. трудао идя' певозмоано вызвать другими ы?тагешш.\гг воёдействкаук. Крс&э того, кгэтк» представляют собой уяяююный спосоЗ сагэкшга без дополнительной ■мутагейной обработки.-.

. Другой стороной расснатргшаешй яро-Згош' является юврос о чей, зоододо лл уиекьяягь или исключить катшлшоеть, ебусяовгекную . культурой in vitm, 'екл является se»' йеиебейзуой-.сшутйясэй. Еру-. •. гимн елова-яз, ко.тьо создать гекзтйчейб?, стаСшгьиуо зкзперкгза-тальиув систему па оспогз кз/льтяьгфуеьш клеток? Ответа ve swi вопроси н&т, а сяя заяяк для.разработки тахкологай'сохрадзшя УШЙДЫШХ • ГвКОТ1ШОа, ГеИНЫХ It КЛЭТОЧЗШХ бКОЯйХНОЖП'ЕЙ и . в.

По яаЕ»му.шен1ПГ'^ сошкгоназаийя аарьабельаость на сегодшетлй дзнь йредставлает больша иатерас с теореунчаскей доза зрэяия, в

частности, для исследования механизмов генетической изменчивости клеток и растений, генетической обусловленности отдельных процессов, их регуляции и т. п., поскольку сомаклоны являются вариациями одного и того лее генотипа и в этом отношении могут быть сравнимы с моногенныыи линиями. Сейчас уж ясно, что хотя сомаклонапьная вариабельность и позволяет существенно повысить генетическую изменчивость растений и, тем самым, возможность отбора, она не представляет собой кардинального решения проблем практической селекции и, тем более, направленного реконструирования растений. Поэтому дгиьнейшее развитие биотехнологии зерновых злаков требует разработки более эффективных клеточных систем, . которые позволили бы осуществлять селекцию на клеточном уровнё, генетические модификацию и реконструирование растений.

Глава 5. Суспензионная культура клеток пшеницы

Технологические приемы на основе культивируемых клеток злаковых растений в подавляющем большинстве ориентированны на использование твердых питательных сред. Однако разработка эффективных клеточных к генных биотехнологий на современном.этапе требует решения ряда методических проблем. Эти проблемы касаются, прежде всего, создания систем, позволяющих осуществлять клеточную селекцию, генетическую трансформация, клонирование. Наиболее перспективной клеточной системой на сегодняшний день являются суспензионные культуры клеток. Клеточные суспензии имеют ряд преимуществ по сравнению с каллусными культурами на твердых средах, как-то: возможность получения однородных клеточных популяций, более строгое и воспроизводимое регулирование, метаболизма и роста клеток; .такая культура в большей степени удовлетворяет требованиям физиолого-бкохимических, молекулярко-бдалогичесгааг'ил'.п.. исслэдеваний - изучения индукции ферментов и связи их с процессами клеточного цикла, экспрессии генов, получения и характеристики ыу'тшаоз и .т. д.

В данной главе ; представлены результаты- наших исследований (1986-1992 гг.} по введению лтешщы и згялолса' в суспензионную культуру (слеток, оптимизации условий выращивания и- оценки ее морфа-генетического потенциала. Зта работа включала несколько этапов, от-ражвдих наши потдаш подучить активно. растудаё, шрфэлогмчош! п генетически стабильные суспензионные едльтуры клеток и регенерировать из них растеши.: Рассцотрз^ аа!шзчктельный этап, в которой

удалось полгать такую культуру (на примере сорта "Казахстанская 4" Т. aestivum).

Каллусы получали из незрелых, зародызей, Для получения суспензии отбирали ярко-желтые глобулярные каллусы с гладкой матовой поверхностью и рыхлой структурой. Для непосредственного переноса в хзткую среду из таких каллусов вычленяли морфогенные участки. 1-2 г каллусной ткани пносили в плоскодонку» колбу (объем 250 мл) с 30 мл жидкой питательной среды. Использовалась питательная среда АА (аминокислотная) с 2,0 мг/л 2,4-Д; 0,2 мг/л кинетина и 0,1 мг/л гиббе-релловой кислоты, pH 5.8. Суспензию культивировали на качалке (120 об/ мш) при 27*1°С на рассеяном свету. СуЛкуяьтивирование проводили не рехэ двух раз в неделя. Через 0-10 месяцев была получена ак-тивнорастущая, мелкоагрегировакная, морфологически однородная сус- , пензионная культура, образованная из клеток меристемсидного типа с плотной цитоплаамой и тонкой клеточной стенкой. -Типичная картина получаемых таким способом суспензий клеток представлена на рис. 3. Для регенерации растений клетки и агрегаты суспензии высевали на агаризованную среду МО с 2,0 мг/л 2,4-Д или платировэли в 1,1%-ную агарозу с теми же компонентами питательной среды и доращивали до образования видимых мшсрокололий. Для образования эмбриогенного каллуса эти микроколонии переносили на среду Ш с 250 мг/л инозита, 300 мг/л гидролизата клзеииа, £00 ш'/д глюгамина, 1Е0 мг/л аспара-гчна, 20000 мг/л сорбита, 1 мг/л 2,4-Д, 0,2 мг/л кинетина (условно обозначенную нами как среда МЗС) и выдерживали в течение 7 дней при температуре 4-6°С. Далее каллусы культивировали при 27° С и освещенности 800-1000 лк. Через 4-6 недель морщенные каллусы переводили на регекерационную среду Ш с 1мг/л ИУК и 1 мг/л эеагина. Частота регенерации в условиях наше; опытов составила 5-10%.

Кривая роста полученной наш суспензионной клеточной культуры при ее непрерывном выращванш приближается к типичной S-образной Форш (рис. 4). В цикле вырадиваниа культуры длительностью около 35-45 дней можно различить латентную, экспоненциальную и стационарную фазы. Для поддержания суспензии в активном состоянии субкультивирование проводили 2 разе, в недела Соотношение объема среды к объему культивируемых клеток, равное 3:1, оказалось наиболее оптимальным для роста суспензии.

Таким образом, нам удалось разработать методические и методологические подходы к получения) суспензионных культур'тотипотентных клеток пшеницы. Эти подходы а принцип» применимы к к другим геноти-

- и -

Рис.3. Суспензионная культура нлеток пшеницы

0.32 -а

0,28 Т

_г 0,24

0,20 з

0,16

0,12 т

о,оа

о со 5.00 10.00

15.00 20.00 25.00 зо.оо 35.00 40.00

время, сут.

Рис.4. Кривая роста суспензионной культур« клеток пшениц«

там пшеницы и зерновым злакам. Указанная возможность следует из то-"О, что'разработанный нами прием Скак, впрочем, и стратегия всей 1аетояс.ей работы), имеет, правде Есего, физиологическую основу.

Глаза G. Изолированные протопласты пшеницу: выделение, культивирование и регенерация растений

Современные подходы генетической реконструкции растений, прежде всего, основаны на технологиях выделения, культивирования и регенерации растений из изолированных протопластов. Именно в отношении тех растительных объектов, для которых разработала система "протопласт-клетка-целое 'растение", пришкен/е катодов in vitro в их селекции оказалось наиболее успейнш. Приыэр тому - представители семейства пасленовых л некоторая -других двудольных растений, для которых генлыэ к клеточная биотехнологии на основе изолированных протопластов являются наиболее лродаотутыул.

Однако для многих- важнейшее сельскохозяйственных культур,- в особенности злаковых, возиожкеети генных и клеточных биотехнологий все ег.э остзктгся кереалоовашыыи. Во многом это связано со слабой разработанностью методов культивирования протопластов, клеток и регенерации из них растений, .ограниченность«) вяаньй об особенностях жизнедеятельности клеток злзковкх в культура я нэханискгах регуляции дгфференцирогки. Пока еще н? определена роль условий культивнрова-. кия, генотипа и аяигвяйгичясгт:'особенностей' исходного зкехтигга в пролифертфуксрй активности протопластов злаковых ргстениД.

■ к началу наших иссдэкобшшй по выделении' - и куаьтивкрэванив протопластов пшеницы в 1985-37 гг. уепеивьзс работ со &даковк<п растениями было сравнительно ¿/емыго. II syoay. времени удалось осущас*-вять деление протопластов :г .- регенерацию -растений для некоторая представителей злаковых," -как-то:'-рко, сахарный тростник, тритчалз, роль," Деление протопластов йпевга?:ti регенерация m mix растений a so сей день остается напЗолев чрудлой зщгчэ&

Работа о ;Я£олирогаян1й<л н^отопязстакй пвэодде ссетойла из трох. этапов, отразагаетх.-ваш. паштет гидегзккл п ^улътнвкрованля яротоп-'ластоз из кэаофялЕа :яяжа, • -.каглтслмг тгигзй я суспензионных квяток пЕэшшй. IÍ -тоябкр -дя.фльтуры■ кем..удагооь• iro- . лучить де^дася-п'ротопяжгьг й рзтюспрб^кгь '^ззтеник.-.'

: Кдоточкую.суспензку гшг выдакнхгл яротоп/гстов •субкудьтяшфо-i-шга. через. З.сттсъ ' 1-3' гргвгз 1Ш5те:> íí клеточных агрегатов •

из та^ой суспензии смешивали со стерильным ферментативным раствором (б мл)содержащим 3,0% Calluíase ТС (Serva); 0,5% Driselase (Sigra); 0,3% Pectolyase (Sigma); 1,0% альбумина; 1,0% CaCÍ22)-Jz0; 0,1% MgSO^HjO; 0,05% KH¿PO^n 0,25 M KC1 яри (pH'5,7). Через б часов инкубирования в темноте на.качалке при 60 об/мин и 27°С протопласты отделяли от »»разрушившихся клеток и агрегатов фильтрованием через металлическую сетку с диаметром пор 50 мкм. Полученную сус-пензш. протопластов Ьтшг&яа 'vi Ферментной сшей раствором ¥-5 (Jvfedgyesy at al. ,1980) ценгриейупфосаапеы в течение 5".мин 'три 200 g. отмытый осадок протопластов ресуелендироЕзли в растворе кз 0,5 М сахарозы и 5 мМ я дактркфутчровали 2-3 мин при 100 g.

Всллкзшие протопласты отбйралл пипеткой и после однократной их.отмывки в солевом раоуворе V,'- б яереясс;«и в среду культивирования.

Протопласты культивировали э 1,5-2,0 ш--'питательной'среды'в пластмассоЕь:.',- чашка:! Петри лрл плотности высева 0,7-2,0 х 1СГ протопластов/мл и 27'С. Через 3 недеда добавляли 1,0 мл свежей питательной среды. Повторное обновленке ереды проводили через 20 суток, при этом'концентрация) осыотнка снижали до 0,4 М.. Для культивирования протопластов среды ЙС, Б5 о 5% глюкозы СВ5Г) и мо' дифчцироаанная . среда. ES (В5Ю. ' В качестве гормонов использовали 2,4-Д и кмнетин. Еиэнеспособность протопластов оценивала ил прижизненным окрашиванием 0,1% раствором 'штиленовой'сини. Частота делений протопластов, определялась как среднее значение 8-кратного" подсчета количества разделиааихс? протопластов от общего числа клеток в ' поле зрения окуляра. Образовавшиеся мккроколонш клеток, обнаружь-, веемые визуально через 7-8 недель,' переносила i;s твердую питательную среду Ш для их дальнейшего культивирования. ■

Результаты наблюдений ва делением протопластов и регенерацией растений представлены на рясунке 5. Явление протопластов начиналось на 5-9-е суиш. При этом яачало деления зависело от плотности протопластов в культивируемой среде: при концентрации 0,7- 1,5x10Jпротопластов б ыл первые деления наблюдали на,8-9-е сутки, & при 2-Sxl0 5npovопластов в мм - через Б-7 суток. Перед делением объем протопластов увеличивается в 2-3 раза На 'i 4-е сутки делящимися оказались более /22 культивируемых протопластов (табл. 3). Около 25% из них образозьиали колонии из 8 и более клеток. Через 30-40 суток культивирования делящиеся клетки формировала агрегаты и далее визуально обнаруживаемые микроколоини. Эти колонии при их переносе на твердые., питательные среды 8а 3-4 недели формировали крупные гроздь-

Регенерация растетт из оуопензттт шеток л ..зо.тро-■ванных из тх протопластов пшеницы Tri ticum aestivum L

евидные каллусы.

Таблица 3.

Количественный учет деления протопластов .пшеницы Гг. aostivum на модифицированной среде Гамборга В5М

Время культивирования

Варианты подсчета клеток 7- ■е сутки 14-е сутки

штук % штук %

Обшэе количество одиночных

клеток и колоний в иоле. зрения

окуляра 59 100 ■ 47. 100

из н их

2-х клеточных колоний •; . 9 15,2 з. 6,4

4-х клеточных колоний , ; 4 6.8 5 10,6

8-и клеточных колоний 0 0 5 .10,6

Колонии из более 8-{£ клеток V 0 0 7 15,0

итого:

Количество разделившихся, -

клеток . ' л: 13 22 20 42,6

'Количество неразделявшихся

клеток 46 78 27 57,4

Для индукции морфогенеза и рзгенерашш растений эти .протокаялу-* сы культввироващ -на • -раегаадьк штатеянш средах,. основу которых , составила среда'. Ш, &ла.шпыташ ещиряш варианты: • '•.'.'

а) базовая рреда Ш с 2,0 мг/л 2, 4-Д (среда МС); . б) среда МЗ о: 1#0 иг/5 8,4-Д, в которой сахароза-замена на глю- ' козу, 30000. ыг/fi' (среда ШР); '.'".' ; . '■.'>'•

в) среда + 150 ¿r/д аосараш» -t ШУДД ,(среда МОЛ);

г) срода К: + 250 иг/л Ш)ЗШ1 + 300 ыг/л гздролйзата казенна +; 2С0 мг/л глетаьглга + 160 ыг/л сспаратина + 20000 ыг/л сорбита 1,0 1.!г/л 2,4-5 + 0,3 иг/а кшехша (МЗС).. •',.:.*

Часть ирогокамусол па клх'пртаедеиаых' • • средах .'.-шстшиаш; ка свет (1000 Лдкс) прл Е7°С, а другую ч?<стъ, прэддз,'. чом серакестн в . зти ss условия, продварттельно ьыдсрдагш; йри: ш:з?йк;йрложтельншг

температурах (5--7°С) в течение 7 суток. Через 4-6 недель культивирования каллусы переносили на регенерадионные среды, в качестве которых применили МО с 1,0 мг/л ИУК и 1,0 иг/л зеатина, а также безгормональную среду Данные частоты регенерации протокаллусов суммированы в таблице 4.

Таблица 4.

Регенерацнонная способность протопластов пшеницы. Влияние условий предкультивированиа лротокаллусов на частоту регенерации (в % от общего количества протокаллусов на среде регенерации)

Среда | Условия предкультявмрования протокаллусов

реге- ! ---------------------------■--------г------------------

рации | среда МС среда Ь5СГ среда MOA среда ШС

i

|обработка

Ш+ЙУК ¡холодом 0,0 12,5 0,0 25,8

-;эеатин ¡

¡без обра-

| 60TIÜI 0,0 7,1 0,0 17,4

---------j----------- М6М | 1 0,0 0,0 0,0 0,0

Как видно из представленных данных, на безгоркональной среде протокаллусы не регенерировали растения. Стеблевой морфогенез наблюдали только на среде МО с гормонами. При этом частота регенерации эависила от условий лредкультивирования яротскаллусов до их переноса на perene рационную среду. Если протокаллусы (формировались на средах МС и УСА, то на регенерационной среде они оказались неспособными к побегообразованию. Регенерация.растений могла происходить на протокаллусах, : предварительно культивированных на среде МО, в которой сахароза была заменена глюкозой и концентрация 2,4-Д спида-на до 1,0 мг/л (среда АКТ). Наибольшей в условиях наших опытов ре-генерационной активностью 'обладали протокаллусы, полученные на более усложненной (по соаЬненню с предыдущей)- среде Ыурасиге-Скуга .среде MCU (см. вше). Стимулирунжре действие на морфог неэ проток-лонов оказывает обработка мккроколонкй низкими положительными температурами. Четвертая часть всех протокшлусов, полученных на среде ШС та предварительно обработанных холодом шкроколошгЛ, рзгенерн-

ровали побеги. Анализ полученных, данных указывает на важную роль в форшровании морфогенных протокаллусов осмотичности среды (в данном случае - за счет сорбита) и температуры (точнее, - смены температур). И повышение осмотического давления среды за счет сорбита, и холодовая обработка клеток, по существу, являются стрессовыми еоэ-действлями. OKaaiteajor ли эти факторы прямое действие на регенерацию через их влияние на экспрессию генов, контролирующих морофгенез in vitro, пока неясно, но то, что онл являются селективными в отношении более жизнеспособных клеток ыеристемоидного типа, может быть более вероятной причиной. Известно, что холодозая обработка каллусов способствует повышению частота регенерации растений, а.повышение осмотического давления среды оказывает неблагоприятное воздействие на паренхимные клетки, при этом шристеыоидные клетки - мелкие, с густой плотной цитоплазмой, - лучше переносят осмотический стресс и получают преимущественное развитие и рост в клеточной по-■ пуляции. •

Завершая эту главу, хотелось бы подчеркнуть, что "лротопласт-ная" проблеш зерновых злаков, особенно в части регенерации растений, все еще- остается одной из сложнейших и до конца не решенных задач клеточной биологии и биотехнологии растений. До сих пор нб удается разработать более или менее универсальные приемы получения делящихся протопластов и регенерации из них растений. Серьезные ра1 боты, в которых достигнута аффективная регенерация растений из протопластов пшеницы, появились в течение последних 4-5 дет и такик публикаций не так у;к и много, что свидетельствует о сложности пррб:-леш. Вэ всех работах, где удалось .добиться регенерации растений Iii! изолированных протопластов пиеницы, источником их выделения явля;-лись эмбриогенные суспензионные культуры клеток. Это указывает я! важную роль в регенерации растений из протопластов фактора детершр-нированности клетки (-ок) к выполнению программы развития (морфоге^ незу), т.е. генотипа. Однако роль генотипа клеток -источника протопластов, нельзя рассматривать в отрыве от условий внешней средь1 : Анализ наши исследований по регенерации растений в культуре eye г пензнониых клеток и протопластов пшеницы ясно показывает, что, ка-г : для получения (селекции) эмбриогенной клеточной суспензии, так л для регенерации растений из клеток и протопластов, определявдзе значение имеет подбор условий. Бообвэ,' надо заметить, что исследование "протопластной" проблеш наиболее отчетливо выявила диалектическое единство генотига и среды (генетики и физиологии): тотипо-

тентиссть клетки сна молекулярном уровне - экопресия генов, контро-лнрущих морфогенез) реализуется в конкретных условиях внешней среды, т. е. при определенном физиологическом статусе клетки и организма Таким образом, долгий спор о том, что важнее для разработки методов культуры клеток и создания на их основе биотехнологий - генотип (генетика) или среда (физиология), - мы решаем в пользу неразрывного единства обоих подходов.

Заогзчеппо

Итак, мы рассмотрели результаты исследований, в которых основное внимание было уделено методам культуры клеток, и протопластов пшеницы. Исторически сложившаяся как попытка выращивания. клеток и тканей, отделенных от целостного растения, изучения проблемы части и целого, культура клеток стала со временем одним из мощных инструментов исследований биологических систем и процессов. Как удз отмечалось, культивируемые клетки позволяют, эффективно решать многие фундаментальные и прикладные проблемы биологин. В последние годы биология культивируемых клеток получила сильнкй импульс благодаря тому, что на ее основе стало возможным развитие важнейших направлений современной биотехнологии - клеточной и генной инженерии. Рассматривая сомаклональнуга вариабельность, № частично затронули один из прикладных аспектов культуры клеток. Дальнейшее разветке исследований, составивших основу настоящей диссертации, будет связано с изучением клеточных и молекулярных процессов жизнедеятельности культуры in vitro и созданием на ж базе эффективных биотехнологий для важнейших сельскохозяйственных растений Казахстана - зерновых злаков. .■••■..

. ВЫВОДУ

1. Разработаны эффективные способы регенерации.растений в культуре соматических клеток зашицы.и эгилопса Показаны генетическая обусловленность регенеращгонной способности, культивируемых клеток и решающая роль условий среды з ее. реализации.

2. На основе, изучения !салдусообразукк.эй! и регенерацконной ait-тивностей различных сорооз я гибридов мягкой и твердой пшениц проведен генетический'анализ этих пршнаков. Выявлено,-• что каллусооб-разование и регенерация. - огдельниз. процессы и могут быть обусловлены различным» геиёгичосяшш-.Шхашякаш. Доказана сложность, ха-ршстера иаследовашш регенеращошюй способности и-определены типы

ее доминирования у ншениц.

3. Сомаклокальная изменчивость, обусловленная культурой in vitro, является одним из шщаых способов увеличения генетического разнообразия у растений, затрагивает самые различные' стороны жизнедеятельности клетки и растений и, тем самым, повышает воэшаиость отбора хозяйственно-ценных форм пшеницу. : Совместно с НазНИИ земледелия выделено 207 сомаклональных линий пшеницы, используемых в настоящее время в практической селекции.

4. Разработай способ получения эмбриогенной активно пролифэри-рующей суспензионной культуры клеток пшеницы, основанный на двух методических приемах: селекция вводимых в жидкую среду клеток на уровне исходного экспланта (источника) и селекция на уровне суспензионной культуры. Способ может быть применим к любому генотипу пшеницы.

Б. У.з клеток эмбрйо^енных суспензионных культур пшеницы получены делящиеся протошв&Ш и регенерированы растения. Разработанный способ позволяет с вшокой частотой (до 25% от общего числа.культивируемых протокаллусоа) получать растения-протоююны.

6. Генотип реализуется в конкретных условиях внешей среды и, только подбирая условия культивирования, можно выявить его погенцк-алыше способности к морфогенезу in vitro.

Career. psfiox, cfly^jsEtoaamisi ко ыазгеркалаи игсеергедве

1. Бутенко Р. Г., Дкардемаякев. Е К., Гаврилова Е й, Каллуоообраэую-щя способаость эксллантов из разных органов различных сортов пшеницы Tritieum aestivum. - Фязиол. раст., . 1S86, т. 33, Н2, с. 350-355. ■

2. Еутенко Р.Т., ®вардемалиев Д. К.', Гаврилова Й Ф. .Регенерация из кадлуекых тканей, полученных иэ разных органов озимой пшеница - «язиол. раст., 1986, т. 33, N5,- с. 837-842,

3. Карабаев IL К. . йардекалкав SL К. .'. . Вутешсо Р. Г., Айтхокин. Я А. Ререаврациокная способность калдускых тканей, индуцированных на эксплантатах из различных органов шеиида а эгдловса. - Новнз наг авлеши биотехнологии. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Рущцно, Наука., 1986, с.184.

•4. Карабаев М. К., Дкардемалкзвй. К., Мтхоййн М А. Регенерата растений из калл„СЕш: тканей, полученных из разных органов разхяч-

; ных видоъ шшшю и эгшюаса. г Штериалк Конференция бкокщз;-ков Средней Aaiiirn Казахстана. • ¿ах&бэд,. Наш, 1986, .с. 186-18?'. •

б Сиатов С. К.. Дкарде«алиев Ж. К., Етшев Р. ?£ Дгэ дифференциация в тканях зародышей пшеницы при каллусообразовашет. - Цитология, 1987, т. 29, N9, с. 1104-1106.

6. Дязрдемалиев Е К, Карабаев МII Получение каллусов из эксплантатов разных органов пшеницы. - Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата, Наута, 1988, " с. 120-125.

7. Дяардемалиев MI'., Карабаев 14К. Получение растений-регенерая-тов из каллусов, шдукировашых из разных органов пшеницы. -Методы молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии растений. Алма-Ата, Паука, 1S88, с. 125-130.

8. Карабаев М. К., Дизрдемалиев Ж. К., Сопабаева Е А,, Курбаков 0.11, Шевченко E.JL, Бегалиев ЕВ., Шэгебаев О.Е Культура in vitro пшеницы. - Всесоюзная конференция по биотехнологии злаковых культур. Тезисы докладов. Алш -Ата, 1988, с. 53.

9. Джардемалиев Н. К.. Курбаков О. й., Валапаяова К. Р., Караб&эв ЯК. Выделение и счистка протопластов пленииы. - Ееесошкая конференция по биотехнологии злаковых культур. Тезисы докладов. ' Алма-Ата, 1988, с. 45-46.

10. Джардемалиев Ж. К , Шевченко Б. Л., Сопабаеза В. А., Карабаев ПК., Шегебаев О. Е Суспензионная культура клеток псенкцы. -Всесоюзная конференция по биотехнологии элгаковых культур. Тезисы докладов. Алю-Ата, 1988, с. б2-ба

11. Карабаев ПК , ¿&яардемаяиев Ж. К , Бзгалиев IIК., Курбакоз О.И., Айтхожин II. А, Культура in vitro лпгешцы. - Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тезисы докладов Международной конференции, Новосибирск, 10S3, с.151-162.'

12. Диардемалиев Н,К.ffinostopoBa Я.Д., Бутекко P.P., • Карабаев Я К., Айтхошв & А. Исследование роста клеточках популяций различных видов пшеницы и эгядопса в еуспеязиоякой культуре. -Еестпкк АН КазСОР, 1988, ¡18, е. 6&-70.

13. Kaliev Д. В., liorova б. Е., Andrianov Б. М., Dzhardeirsaliav Zh. К,

• Ksrabaev МЛС, Zairov S.Z., PiruzianE-S. Organogenesis in

г

t/hsat tissue culture after infection, byi Agrobaoteritim vector system, - ¡/oderrP Problcsrs of. PiT/sicc-Crsmieal Biology and Biotechnology. Aim-Ata, 19S9f p,C5, •

14. Bjardenaliev D.K.; .ОДсЬюэЭДаХдет ЦТ., Harshaav M.11, Butenko Ей.ТЬэ obtaining: of micrccolonios from isolated «teat protoplasts, - ?bdern Froblers of Fiiysieo-Chomfcal Biology and Bio-

- -24 -

technology. Alma-Ata, 1989, p. 73.

15. Karabaev bi. K. , Djardsnaliev J. K., Mukharretkal i ey !i I. Division of protoplasts isolated fi-om cell suspension culture of Triti-cm acstirjm - Piant Tissue and Cell Culture. Abstracts VI Ith International Congress. Amsterdam, 1990, p. 20.

16. Лкгай Г. Л., Иарабаев )l К. , ДзардемалиеЕ ЕЯ, Турпанова Р. К методике выделения протопластов картофеля. - Проблемы теоретической и прикладкой генетики в Казахстане. Алш-Ата, 1990, с. 119-120. .

17. Karabaev М. К., Eogaliev М.К., Djardemaliev O.K. Cell and protoplast cultures of wheat. - 2Cth Meeting of the Federation of European Biochemical Societies. Abstracts. Budapest, Hungary,

1990, p. 323.

18. Карабаев U.K. , Дяардемэадев EH., Бегалиев M. К., Курбаков 0. IL , Сопабаева Б. А. . Шевченко К. Л,- Культура пшеницы in vitro. - Биология культивируемых клеток и биотехнология растений, hiccraa, Наука, 1991, C.252-2ÖÖ.

19. Карабаев М.К , Джардемалнев Ж.К., ДзркзиОгева Г.Т., Шегебаев О, Ш. Изучение генетической обусловленности и наследуемости ;сал-дусообразующей и регенерацнонной способности пиеницы. - Материалы Всесоюзной научной колференуди по сельскохозяйственной биотехнологии. Целиноград, 1991, с. 29-30.

20. Джардекалязв X К., Карабаев UK., Сайб Л. Р. Культура in vitro пшеницы у. кукурузы. - Материалы Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии. Целиноград, 1991, с. 83-87. - .

22. Дхардемалиев ЕК., Ь'угхшлеткалиев М.Т., Карабаев ILK. Исследование роста клеточных популяций различных видов пшеницы и эгилоп-са в суспензионной культуре. - Материалы Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии. Целиноград,

1991, с. 88-89.

23. Карабаев Ы.К., Дяардеыаяиев Й.К., Дарканбаеьа Г.Т., . Вутенко Р. Г. Генетичешсие особенности каллусообразовашя и регенерации растений в культуре клеток пшеницы и эгилспса - Сельскохозяйственная бисяо/ия, 1991, N3, с. 59-75.

24. Карабаев Ы. К. Джардеыздиев Ж. 1С , Сайб- Л. Р. Культура in vitro пшеницы и кукурузы. -V конференция биохимиков Средней Азии и Казахстана. Тевисы докладов. Ташкент, Фан, 1991, с.367.

25. Карабаев Я К., Дгардешлиев X К., Дарканбаева Г. Т.. НЬгебаев

0.11L Виотехнологические подходы в подборе родительских пар при скрещивании пшеницы. - Биотехнология. Алма-Ата, 1991, с. 15-17.

26. Дясардемалиев Ж. К,, Рйрабаев М. К., Мухаметкалкез \L Т., Еутеико Р. Г. Метод получения делящихся протопластов пшеницы. - Биотехнология. Алма-Ата, 1991. с. 17-13.

27. Карабаев М. К. , Шзгебаев О. Ш. , Диардемалиев Ж. II , Лесова X Т., Каниев Б. К. Способ получения сома/слокальных вариантов яровой твердой ашекющ. - Биотехнология. Алма-Ата,. 1991, с. 19-21.

28. Карабаев ¡1 К , Дкардемалнев К. II, Беденко В. П. , Ледяйшота Е А., Сидоренко 0. И. Биотехнологические подходы повышения фотоскнте-тичеекой продуктивности растений. - Биотехнология. Алма-Ата, 1S91, с. 21-23. '

29. Карабазз 14 К., фкардемалиев й. К. Способ регенерации растений т листовых Т1?аней пиеняцы. - Биотехнология. Алма-Ата, 1291, с. 25-20.

SO. Карабаев JL К , Бегалиев М. К., Д?юрдемалиев IK. II Способ регенерации растений пшеницы в в культуре тканей. - Авторское свидетельство СССР H17G1744 от 01.09. 91.

31. Даардемаяиев Ж.К , Карабаев ПК , .Чух&четкадяев М'Г.., Бутенко Р. Г. Деление протопластов, выделенных иэ клеток суспензионной культуры гексаплоидлой пиенкцы 7r;ticum aestivum (L).Физиол. раст., 1992, т.39, HI, о. 135-i42.

32. K?xabaev М. К., Dzhardc-rraiiev Z. К., lAikhametkaiiev Kit., Butenko R. G. Division of protoplasts isolated from cell suspension culture of hexaploid wheat Triticum aestivum L. - Язвестия АН VK, сер. биол., 1992, N 5, с. 3-11.

33. Karabaev M.K., Djardemaliev J.K. , Butenko R.G. Cell and gene engineering of ccreals in Kazakhstan: its state and prospects.

- Biology of plant cell cultures and biotechnology. Abstracts II International conference. Aln-aty, 1993, p.95.

34. Djardemllev J. K. , Karabaev li К, Satibaldiov D. D, Butenko R. & Plant . regeneration from protoplasts isolated frorri cell suspension culture of hexaploid wbeat Triticum aestivum (L>. -

- Biology of plant cell cultures and,biotechnology. Abstracts II International conference. Aliraty, 1993, p.89.

- 26 -

Узбекистон Республикаси Фанлар Академиясининг Микробиология Института III К. Ддардемалиев "Бурдой луяайра ва протопластлар зкмасида 9симликлар р^ген^т-цияешшнг биотехнологии аспектлари" Биология фанлари номзодлигкгд тавспя зтилган диссертацнясишшг диспача ыаэмуни.

Хн.чоя 1994 йил__Узбекистон Фанлар Акгдемняси !>ш;.

робкоЛогия йнстичутинннг мздсуе кенгашда булади. 700128, •';■■!;:-кент-128, А. ^одирий кучаси 75. микробиология Института.

Диссертация кии кирш, адабиЗтлар анализи. амалий иш, олиигон маълуштлар ва уларнинг иэоз^н. хулоса, фойдаланилган 8дабиёт.пр руйхати 457 иборат. Диссертация 223 бетдан иборат булиб, 39 «адгал. 22 аслидан олинган расмларни уэ ичига олган.

Бурдой экмасининг in vitro шароитида ?схш ва морфогенетик яарз-енлари ^ужайралар эффектов биотехнологиям яратилшзи Оилан борлик; крлда ?рганилган. Бу жараенларшшг генетик борланганлигй ва кухит-нинг з^уяайра регеиеранион потенциясини (генотип,эксплант) оширюш-ги дал килувчи роли курсатилган.

Бутяой регенерацион хусусиятинннг иаслдан-иаслга утиши урга-нилган ва бу хуоусиятшгаг цитоплазмааий ва оналик эффектларга боглик б?летг мумгашлигн курсатилган. Зкманшг in vitro шроитида устирпливи еабабли келиб чкиздигав «шклонал ?згарувчагшм 'бурдой регенерант ?сишигшшнг генетик хилма-хиллигини кучайтирадигаи энг муцпы усуллардая бяри булиб, ;<;зр хил белгиларга, лумладан муднм ху-ж&вик белгилэрига х,ам таьсвр этази.

йвлаб чяфиган' з^уяайра зкшеи ттодларя, усимлик регенерацпяси ва уларшшг Дрзорксгоштяг хдр хил зкологик воналарида утказнлган селекшюн-геиетшс сшговлари (Г^озогнстон тупро^ауноолик' илмий-текшн-рнш шстити бялаи хдвдсордикда) асоенда 200 дан ортщ бугдоннинг сомаклоиал линиялари олииди ва улар ярэирги ва^тда амалий селекцион илмий-излашпп иЕшряда идшштщда. Бурдой! з{ужайралари экмаеинняг* суспензиясида омбриогеилик ва актив пролиферация |$обилиятини ошрив усули шлаб чигоиган, Бу суспензион раайралардан олинган протоп-лаелар ofmnmm ва регенерация Й3?лк бклщг ?сиилик беряш цобяиягига зга.

Ь'(ундай нилиб, хукайра 'снстемаси вулудга келтярилган ва бу система бугдойни биотехнологии люсатдан урганищда, яумладаи, зогаайра селекцияси, соматик дурагайлаш ва генетик трансформация' »ушт изла-

нииларида фойдаланиш мумкин.

- 27 -

Academy of Sciences of Republic Uzbekistan Institute of Microbiology

J. K. Djardemaliev Biotechnological aspects of plant regeneration in cell and protoplasts cultures of wheat

Thesis of dissertation presented for receiving a degree of Candidate of Biological Sciences

Summary

The thesis will be defended ■ 1994 at__o'clock at

the Special Council of the Institute of Microbiology of AS of Rife. at address: 700128. Tashkent, Kadiry str., 7B, Institute of Microbiology.

The thesis was typewritten in 223 pages and cotains 39 tableland 82 pictures. It consists of Introduction, б chapters, conclusion, proposals and list of 457 references.

It угаз studied growth and morphogenetic processes of wheat culture life in.vitro in respect of the creation of effective cell biotechnology. Genetiо cause of these processes and decisive role of medium conditions in realization of cell (genotype, explant) potention to the plant regeneration тего shorn. Inherit peculiarity of regenerative ability of wheat »as studied and its possible dependence on the cytcplasoatic and rraternal effects were shorn. Somaolonal alteration caused by in vitro culture is one of a powerful1 methods of the intensification of genetic variety of the regenerated wheat plant affecting different, sign ' including a valuable ones. On the basis of elaborated methods of cell culture, plant regeneration and their selectional-geneUcal tests in different ecolo«rical zones of Kazakhstan in col 1 aboration with Kazakh Scientific Si-search Institute cf Agriculture were isolated about 200 somaclonal lines of wheat using at present in practical selection. The method of. obtaining the embryogenio, actively prolyphering suspension cell culture of wheat was worked out. The protoplast from cells of such suspension vere able to division and plant regeneration. Thus were created the cell systems xhich might be used in wheat biotechnology, in particular in cell selection, somatic hybridization and genetic transformation.

Тип. ДОГ. Зак. 265-100.