Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение регенерантов из протопластов риса (Oryza sativa L. )

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Получение регенерантов из протопластов риса (Oryza sativa L. )"

1 7 ОПТ 13.%

НУХИНА ХАННА НИХАЙЛОВНА

на правах рукописи

ПОЛУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ ПРОТОПЛАСТОВ РИСА (Oryza sativa L. ) Специальность: Об.01.05. - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар. 1996

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте риса

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Харченко П. Н.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук.с. н. с.

Воробьев н. в.;

Ведшее предприятие - Краснодарский научно-исследовательский

институт сельского хозяйства

в 10 час. на заседании Диссертационного совета д ого. бб. 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте риса.

Адрес:353Е04,г. Краснодар, пос. Белозерный, Всероссийский НИИ риса

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса

Автореферат разослан " ______ 1996 г.

кандидат биологических наук. с. н. с.

Образцов И.с.

зашита диссертации состоится

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических

Е. Н. Сорочинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тены

Эффективность селекционного процесса во многой зависит от темпов селекционной работы. Традиционные, классические методы выведения новых сортов большинства культур и. в частности, риса-пропесс. требующий,как правило, т-ю лет.

Стремительное развитие альтернативных, сравнительно молодых направлений селекции сельскохозяйственных злаков:клеточных технологий культивирования in vitro органов, тканей,изолированных протопластов, методов генной инженерии может облегчить и ускорить селекционный процесс, повысив тем самым его эффективность.

Наиболее подходящи объектом для генной и клеточной инженерии являются протопласты (лишенные стенки клетки)-отправная точка многочисленных методик генных манипуляций.

Основное направление применения технологии протопластов для выполнения практических селекционных задач - создание новых, генетически модифицированных растений посредством:

- сонатической гибридизации протопластов, позволяшей получать Форны с уникальным сочетанием ядерного и цитоплазмати-ческого геномов;

- пряного переноса чужеродных генов (часто в Форне плаз-мид) в протопласт - реципиент.

Генные манипуляции позволяют преодолеть нескрешиваеность сильно дивергированных видов, генетически модифицировать Формы с длинным жизненным циклон, вносить в реиипиентную Форму ряд полезных признаков-цитопяазматическую мужскую стерильность,устойчивость к болезням, сельхозвредителян, гербицидам, они позволяют ускорить селекционный процесс в 2-3 раза, так как не тре-

буют долговременной процедуры насыщающих скрещиваний, обычной для традиционной селекции при создании форм с указанными признаками.

Реальность практического воплощения возможностей технологии протопластов в селекционную практику зависит прежде всего от наличия методик регенерации интактных растений.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в получении растений из протопластов разных Форм риса. Для этого выполнялись следующие задачи:

- селекция морфогенных (способных к эмбрио- или органогенезу) , мелкодисперсных суспензионных культур клеток;

- оптимизация условий энзимной обработки клеточных культур, предназначенных для выделения протопластов;

- подбор оптимальных питательных сред и условий культивирования протопластов;

- получение регенерантов из морфогенного каллуса, сформированного протопластами.

Научная новизна работы

Исследования по разработке методик регенерации растений из протопластов злаков и применение их для выполнения селекционных задач является новым направлением экспериментальной биологии в нашей стране.

В результате проведенной работы впервые в России получены регенеранты из протопластов риса.

Разработана методическая схема получения морфогенных суспензионных культур и выработаны критерии оценки пригодности

клеточных суспензий в качестве источников протопластов.

Эмпирическим путей подобраны условия эксперимента, позволяющие получать максимальный "урохай" протопластов.

Практическая ценность работы

Полученные в данной работе результаты - базис для проведения дальнейших исследований по генной инженерии риса, и внедрения технологии протопластов в практическую селекцию этой

культуры.

Разработанная методика получения морфогенных суспензионных клеточных культур может быть, кроме того, использована для экспериментального мутагенеза in vitro, а также изучения сома-клональной изменчивости.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались на региональной научно-теоретической конференции "Научно-технический прогресс в сельской хозяйстве Северного Кавказа"(199бг). на заседаниях ученого совета ВНИИ риса.

Публикации

По материалам представленной работа опубликовано 2 печатных работы. 2 статьи находятся в печати.

Структура и обьем диссертации

Диссертация состоит из введения,¿_глав,выводов, предложений к внедрению и списка литературы, который включаетлЙ^наине-

нований, из них __зарубежных авторов. Работа изложена

страницах машинописного текста и содержит _^_таблиц и .//^рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал

экспериментальным материалом для проведения исследований послужили:

- пыльники коллекционных сортообразиов риса (Oryza sativa

L. )¡

- зрелые,незрелые зерновки,пыльники краснозерного образца ботанической разновидности var. sundensls Korn (далее в тексте именуемого "краснозерный рис");

- зрелые зерновки районированных сортов отечественной селекции;

- зрелые зерновки диких форм риса о. stapfil. о, ruflpodon, О. perennls.

методы исследования

Все асептические процедуры выполняли в условиях стерильного бокса,Растительные ткани, используемые в качестве эксплантатов, стериализовали 0,1*-м раствором сулемы (НВС12).

Для индукции каллусных культур применяли агаризованные культуральные среды MS(Murashlge F. and SKoog F. ,1962)с В5-ви-таминами(Gamborg о. et al, 19б8)или R2(Ohlra К. et al,1973). в качестве гормона роста использовали 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиук-сусная кислота). Для инициации суспензионных культур полученный каллус (1-Зг)помешали в конические колбы с жидкими культураль-ныни средами (MS + В5-витамины или R2). которые устанавливали на роторную качалку (120-140 об/мин).

Для получения высокого "урожая" жизнеспособных протопластов необходимы мелкодисперсионные суспензии клеток, состоящие в основном из способных к активному митозу и быстрому ор-

ганизованному росту эмбриогенных клеток. При их получении исходную клеточную суспензию подвергали циклическому пассирова-нию(один раз в 7-10 суток), заменяя 2/3 культуральной среды новой порцией, а также периодическин Фильтрациям через металлические сита(разнер ячеек 100-150 мкм), добиваясь в итоге требу-еного состава клеточной популяции.

Перед использованием суспензионных и каллусных культур в качестве источников протопластов оценивали их норфогенетичес-кий потенциал - способность к морфогенезу на соответствующих питательных средах. В качестве индукционных сред применяли HS + В5-витамины и Нб (Chu С, et al, 1975) с цитокининами [кинетин или бензиламиноаурин рибозид (БАП) - 5иг/л, -индолилуксусная кислота - 1. 5мг/л). Варианты без видимых проявлений морфогенеза выбраковывали.

Ферментную обработку клеток суспензионных и каллусных культур с целью получения протопластов проводили коммерческими энэимныни препаратами Celluíase RS, Hacerozyrae RIO, пектиназой 5S,количественное и качественное соотношение которых варьировали в вариантах опыта.

Программой исследования также была предусмотрена сравнительная оценка разных способов осмостабилизашш протопластов для зашиты их от лизиса после разрушения целлюлитическими Ферментами клеточной стенки, в качестве осмолитиков использовали следующие рецептуры:CPW - соли (Power J. et al, 1985) + 13'/ ман-нитола, CPW - соли + 21'/- сахарозы, R2 - соли + o, 4Н глюкозы, W5 -соли (Номот В.П.,1936).

Выделенные протопласты очищали от Ферментного раствора и "осколков"клеток, разрушенных ферментами, Фильтрацией через систему медных Фильтров (размер ячеек 100,70,50 мкм, соответствен-

но)с последующим трехкратным центрифугированием (60 х g, 5 мин) • в растворе оснолитика, каждый раз заменяя надосадочную жидкость свежей порцией раствора.

Начальные этапы культивирования протопластов

Первые 10-15 дней протопласты, ввиду их осмотической нестабильности и опасности лизиса, необходимо культивировать в условиях высокого осмотического давления. Для этого использовали жидкие питательные среды с высокой концентрацией Сахаров:

1.HS + В5-витамины + о, 4 н сахарозы или мальтозы;

г.R2 + о,4 и сахарозы или мальтозы;

3. General (Ll Lh. et al.l990)+ 0,4H сахарозы или мальтозы;

• 4. N6 + 0,4 н сахарозы, 146 мМ глюкозы (Datta S. et ai,i990).

После ресинтеза протопластами клеточной стенки осмотическое давление культуральной среды постепенно снижали, разбавляя ее 1-г каплями аналогичной среды,но со сниженным (до 30 г/л) содержанием Сахаров. Процедуру повторяли периодически вплоть до .Формирования протопластами никроколоний, видимых -невооруженным глазом,

Для.индукции морфогенеза в колониях, сформированных протопластами. использовали агаризованные културальные среды HS + В5-витамины и на с градиентом сахарозы или мальтозы, в качестве Фитогормонов добавляли цитокинины, регенеранты выращивали в камере искусственного климата(тенпература 28*с, освещенность 40 клкс, относительная влажность воздуха 10'/., фотопериод 12 часов).

- 9 -РЕЗУЛЬТАТЫ

Суспензионные клеточные культуры как источник получения протопластов

наш экспериментальный опыт показал,что суспензионные культуры, пригодные для получения протопластов, должны отвечать следующим требованиям:

1. иметь высокую плотность клеток, которую клеточные суспензии достигают, как правило, в начале стационарной Фазы роста;

2. оставаться мелкодисперсными независимо от длительности культивирования (конгламераты клеток не увеличиваются в размере более 1 им);очевидно,это определяется не только условиями культивирования, но и генотипон;

3. содержать высокий процент эмбриогенных клеток,способных быстро делиться и расти (рис. 1);

1. продолжительно (до 1 года) сохранять на высоком уровне морфогенетический потенциал.

В этой связи основной стратегией эксперимента был с одной стороны удачный выбор генотипа.сочетающего в себе все упомянутые положительные качества, и оптимизация условий культивирования клеточных суспензий с другой. На рисунке 3 в графической Форне изображена динамика роста клеточных суспензий семи протестированных Форм риса. Из рисунка видно, что:

1. несмотря на наличие индивидуальных особенностей, рост суспензионных культур большинства изученных генотипов можно описать одной схемой:за какой-то начальный период времени(индивидуальный для каждого генотипа) сырая клеточная масса довольно интенсивно нарастает (лаг-Фаза роста). достигнув определенного пика,после чего ее рост замедляется и вскоре прекра-

25НИМ

Рис. 1 эмбриогешше клетки суспензионной культуры

краснозерного риса (возраст культуры-1.5 месяца)

Рис. £

Протопласты краснозерного риса через 15 минут после выделения, находящиеся в растворе осмостабилизатора

Рис. 3 Динамика роста сырой клеточной массы суспензионных культур риса

_ —V— 1- краснозерный —-—рис (зрелые —■зерновки)

^ / "" ---2- краснозерный

./ _«—v—рис (незрелые

у"/1 зерновки)

_3 г

•¿У^-^Г КП-1352-87

' ...»••7 л (пыльники)

/...••............ВЗ(ГвХКУЛОН)

** -.....Г1

.* (пыльники) '

/д / —о—5- о. stapfll -

#* (зрелые |

• / зерновки)

f — 6- о. ruf 1Р080П

• ° " (зрелые

зерновки) о. perennis (зрелые зерновки)

О 1 2 3 4 5 б 7 9 9 10 11 12 13 14 15 16 17 продолжительность культивирования (в сутках)

шается, кривые роста "выходят на плато"(начало стационарной Фа-Фазы роста). По всей видимости, клеточные популяции достигают какой-то оптимальной для своей жизнедеятельности плотности клеток;

2, наглядно преимущество использования в качестве эксплантатов для суспензионных культур тканей, богатых меристемны-ми клетками. Сырая масса клеток таких суспензий была больше,чем у суспензий, полученных от зрелых зерновок.

Оптимизация условий выделения протопластов из клеточных суспензий риса

конечный выход протопластов зависит не только от качества "материнской" клеточной культуры,но и от способа и продолжительности ее ферментной обработки (рис. табл. 1).

Как видно из рисунка 4, оптимальная суммарная концентрация целлюлитических Ферментов для обработки суспензионных культур риса - незначительное повышение "урожая" протопластов, вызванное увеличением Ферментной концентрации до Ь'/-, на наш взгляд, не оправдано,вследствие возможного усиления повреждающего действия последних на "голую" клетку.

Анализ таблицы 1 позволяет констатировать, что оптимальная длительность экспозиции клеток суспензионных культур в Фер-нентном растворе 1,5-3 часа. Более длительное воздействие Ферментами хотя и вызвало достоверную прибавку плотности протопластов трех из четырех протестированных генотипов,нежелательно. Как показали дальнейшие наблюдения, оно снижало мито-тическую активность полученных протопластов.

программа эксперимента включала оценку эффективности раз-

Ц

X

ч

ч 1 а>

X &

® ^

и <0 ч а о

¡г" О

л 4'

о о

Б

И

с

рис. 4 зависимость плотности протопластов при выделении

от суммарной концентрации Ферментов и состава смеси:

(A) - целлюлазы и мацерозима;

(B) - целлюлазы и пектиназы 5Б

(В)

б-5 4

<м

I

- краснозерный рис

- 1^30ГХ КП-1352-87

Суммарная концентрация Ферментов ('/•)

ВЗ (Г8 X КУЛОН) о. регепШз

3

Влияние длительности ферментной обработки клеточных

в

суспензий на конечный выход протопластов(кл/мл х 10 )

Генотип и тип эксплантата Длительность Ферментной обработки (ч)

1.5 3 6

Краснозерный рис

(пыльники) 5" 1430 X КП-1352-87 7, 31 б, 83 7, 03

(пыльники) б, 00 8, 89 9,40

ВЗ (Г8 x кулон)

(пыльники) 8, 01 8, 20 8, 36

0. регешиэ

(зрелые зерновки) 7, 19 8, 20 7, 18

НСРв 0,1 НСР^О, 17

Примечание:1. сумарная концентрация Ферментных компонентов - 5'/. во всех вариантах опыта;

2. при обработке двухфакторного опыта за фактор А принята продолжительность Ферментной обработки, за Фактор в - генотип.

ных способов осмостабилизации полученных протопластов для зашиты их от лизиса. В качестве осмолитиков применяли сахарозу. глюкозу, маннитол в различных комбинациях с неорганическими солями (табл. 2).

Установлено,что опробованные рецептуры существенно не различались по эффективности для всех вариантов опыта. Другими словами,не выявлено наглядных преимуществ какого-либо сахара

Влияние вида осмостабилизатора на плотность протопластов при выделении

Генотип и тип эксплантата Плотность кл/мл протопластов при <xl0tf), х + Sx выделении

I II III IV

Краснозерный рис

(пыльники) б. 8 + 0, 23 7. 2 + 0, 20 б, 8 ± 0 24 б б + 0, 24

1430УХ КП-1352-07

(пыльники) 7, 8 + 0, 21 8, 0 + 0,23 8, 1 + 0 21 7, 9 i 0. 30

ВЗ (Г8 X КУЛОН)

(пыльники) 6, 2 0, 25 5, 9 + 0, 21 5, 9 + 0 32 б. 0 + 0. 20

О.регепп1з

(зрелые зерновки) 6, 8 + 0, 17 б, 3+0,23 6,9 + 0 07 б, 0, 12

Примечание: суммарная концентрация Ферментов - 5/.;длительность Ферментной обработки -зч. во всех вариантах опыта; I. СРУ-солиЧЗИманнитола; II. сру-соли+гисахарозы; III. У5-соли; IV. 1?2-соли+0,4M глюкозы.

(или сахарного спирта) из использованных в качестве осмостаби-лизаторов.

Нами проведено цитологическое обследование протопластов через несколько минут после выделения, которое показало, что, находясь в растворе оснолитика,они имеют сферическую Форму (рис. 2).

Культивирование протопластов, получение микрокаллуса

Наши наблюдения показали, что на стадии ресинтеза клеточной стенки и первых митотических делений протопласты особенно

чувствительны к условиям культивирования, очевидно, из-за своей осмотической нестабильности. В этой связи задачей эксперимента было создание оптимальных осмотических условий и выбор наиболее благоприятной питательной среды для стимуляции интенсивного митоза.

Для начальных этапов культивирования протопластов опробовано 7 вариантов питательных сред с высоким содержанием углеводов в качестве осмолитиков (О,4Н/л) (табл.3).

Из таблицы 3 следует,что для всех генотипов предпочтительнее оказалась среда HS + В5-витамины. Замена сахарозы мальтозой не способствовала усилению интенсивности частоты деления* протопластов. Это, однако, противоречит данным Ella Е. and zapata F. (1992),которые констатировали лучшую выживаемость протопластов в среде Нб в случае использования мальтозы. Кроме того, очевидно, что частота деления протопластов,полученных из суспензионных культур, для закладки которых использовали пыльники, достоверно выше таковой у протопластов, выделенных из клеточных суспензий от зрелых зерновок. Таким образом, наглядно видно преимущество использования в качестве эксплантатов тканей, богатых меристен-ными клетками (пыльники, незрелые зародыши, кончики корней проростков и т. д. ).

Нами исследовано также влияние гелеобразуюшего агента в составе культуральной среды на митотическую активность протопластов (табл.4).

Как следует из таблицы 4, агароза оказывала угнетающее воздействие на способность протопластов к митозу на начальных этапах культивирования. Частота деления протопластов всех проверенных генотипов была максимальна в жидких культуральных средах.

Частота деления» протопластов при использовании разных питательных сред,

Генотип и тип эксплантата

Культуральная среда

II

III

IV

VI

VII

краснозерный рис (пыльники) 1430ГХ КП-1352-87 (пыльники) ВЗ (Г8 X КУЛОН) (пыльники) о. регепп1з (зрелые зерновки)

НСРд О, 41

21, 75

27,72

22, 65

17, 22

22, 30

26. 45

23, 70

17, 95

20, 08

25, 05

21.49

16, 53

18,28

23, 70

21,05

15, 39

20, 50

24, 28

20, 95

15. 30

19. 78

25. 08

20,00

15, 85

17, 88

25, 10

19. 88

15. 04

НСРв0. 31 НСРА60. 82

Примечание:1. При обработке двухФакторного опыта за Фактор А принята питательная среда,за Фактор В-генотип;

2. I - MS + В5-витамины + о, 4Н сахарозы; II - MS + В5-витамины + 0,4Н мальтозы; III- R2 + 0,4Н сахарозы;

IV - R2 + 0,4Н мальтозы;

V - General + 0,4М сахарозы;

VI - General + 0,4М мальтозы;

VII- Нб +0,4Н сахарозы + 14бмН глюкозы.

3. Частота деления* - отношение числа делящихся к общему числу "высеянных'в культуральную среду протопластов х 100.

I

V

сравнительная частота деления протопластов на начальных этапах культивирования в жидкой и агаризованной питательной среде, и).

Генотип и тип эксплантата

Градиент агарозы в питательной среде НБ +В5-витамины (¡с)

О. б

о, в

1,2

краснозерный рис

(пыльники) 21,75 20,50 18,67 15,38

1430^х КП-1352-87

(пыльники) 27,72 25,22 23,40 20,32

ВЗ (Г8 х Кулон)

(пыльники) 22,65 19,65 17,70 16,15

о. регептИэ

(зрелые зерновки) 17,22 15,05 13,43 ю,15

НСРд О, 39 НСРв0, 39 НСР^О, 78

Примечание: При обработке двухФакторного опыта

за Фактор А принят градиент агарозы в питательной среде, за Фактор В-генотип.

О

На рисунках 5-6 показаны этапы Формирования микроколоний протопластов до размеров, видимых невооруженным глазом

Получение морфогенного каллуса из протопластов

после достижения колониями протопластов 1,5-2 мм в диаметре их пересаживали на питательные среды для индукции морфо-

Л;-5 - '

г/Гмкм

Рис. 5 Начало формирования микроколонии протопластов краснозерного риса, 5-е сутки культивирования

- г.

г$ тм

Рис.6 Никроколония,сформированная протопластами краснозерного риса за 10 суток

генетических процессов. На индукционных средах колонии разрастались и Формировали первичный каллус, на поверхности которого через некоторое вреня (обычно 7-10 суток) можно было различить маленькие светлые образования - вторичный, морФогенный, каллус. Норфогенный каллус Формировал удлиненно-сферические образования. Поскольку тип морфогенеза нани не определялся, нохно предположить, что это были соматические эмбриоиды или зачатки побегов.

В таблице 5 показана интенсивность морФогенетических процессов в культурах протопластов на двух видах индукционных сред с использованием разных комбинаций фитогормонов.

Из таблицы видно, что

1. культуральные среды мб и Кб одинаково хорошо пригодны для использования в качестве индукционных для морфогенеза в культурах протопластов риса; способность Формировать органы ин-тактного растения зависит скорее от генотипа и типа эксплантата:

2. увеличение содержания углеводов как в МБ, так и в Нб средах не способствовало усилению интенсивности морФогенетических процессов. Поэтому оптимальное количество Сахаров для индукционных сред при культивировании колоний протопластов риса, вероятно,30-60 г/л;

3. не выявлено преимуществ мальтозы в стимуляции органо-или эмбриогенеза;

4. замена основного цитокинина кинетина на ВАЛ существенно не отразилась на качество и интенсивность морФогенетических процессов.

Регенерацию растений из каллуса проводили, поместив мррФо-генные каллусные нассы с Формирующимися корешками и побегами

Таблица 5

Морфогенез в каллусных культурах протопластов

Генотип и тип эксплантата Фито-гормоны Питательная среда

МБ Нб

сахароза (г/л) мальтоза (Г/Л) сахароза (г/л) мальтоза (Г/Л)

30 60 80 30 60 80 30 60 80 30 60 80

Краснозерный рис I + + 4-4- + + ++ + + 4- + + + 4-4- 4- 4-4- 4-

(пыльники) II ++ 4-4- + + + + + + + 4- + 4-4- 4-

1430ГХ КП-1352-87 I + + + + + + + + 4- + + + + 4-4- 4-4- + 4- 4-4-

(пыльники) II + + 4-4- + ++ + + + + + + + 4- + + 4- 4- +

ВЗ (Г8 X КУЛОН) I + 1 4- + + + + 4- + 4-4- 4-4- К + 4-

(пыльники) II + + + + + + + 4- + + + + 4-4- 4- 4-4- 4-

о. регепшз I + + + + « + 4- X + + 4- X + К

(зрелые зерновки) II к 4- + + к + + * + + » X ■

Примечание: I - (кинетин,5 мг/л + -индолилуксусная кислота,1»5 мг/л);

II - (бензиламинопурин рибозид, 5 мг/л + у?-индолилуксусная кислота, 1,5 мг/л); ++ - Формирование побегов и корней; + - ризогенез;

» - разрастание каллуса без видимых проявлений морфогенеза.

на безгормональные агаризованные питательные среды НЭ и Н6 (содержание сахарозы ЗО-бОг/л). Наши наблюдения показали, что при удачном выборе генотипа и типа эксплантата для закладки клеточных суспензий-источников протопластов-регенеранты Формировались из морфогенного каллуса уже на средах с цитокининами.

Ны не выращивали полученные растения до репродуктивной Фазы ввиду сниженной фотосинтетической способности последних. Необходима дальнейшая экспериментальная работа по созданию методической схены массового получения зеленых растений из протопластов риса.

рис.т Три регенеранта, полученные из протопластов краснозерного риса

Сравнительный анализ эффективности использования каллусных и суспензионных клеточных культур в качестве источников протопластов

Нами была поставлена серия опытов по изучению возможности использования каллусных культур наряду с суспензионными для получения протопластов.

Сравнивая эффективность этих двух источников протопластов, мы считаем, что клеточные суспензии имеют ряд преимуществ, так как:

1. отселектированные мелкодисперсные суспензионные культуры состоят в основном из энбриогенных клеток, способных к быст-рону организованному росту,которые в конечном счете определяют способность культуры к морфогенезу;

2. клетки суспензионных культур не так тесно связаны между собой, как в каллусной массе,что облегчает доступ к ним деллю-литических ферментов, вследствие чего улучшается качество Фер-нентной обработки и плотность выделенных протопластов;

3. протопласты, полученные из клеточных суспензий, нет необходимости подвергать многоступенчатой очистке от "некондиционных" клеток, ввиду высокой клеточной однородности суспензионных культур;каллусные протопласты,напротив, необходимо очищать повторными Фильтрациями и центрифугированием, что неизбежно снижает их плотность, а отчасти, и жизнеспособность.

К недостатку клеточных суспензий следует отнести, однако, довольно продолжительный период селекции, необходимый для достижения ими мелкодисперсности и однородности. Это увеличивает продолжительность эксперимента и, кроме того, снижает морфогене-тический потенциал культуры.

Компромиссной стратегией,на наш взгляд, может быть тшатель-

ный отбор генотипов и типов эксплантатов для закладки суспензионных культур, которые способны быстро достигать мелкодиспер-сности и однородности и в то же время длительно сохранять мор-♦огенетическую потенцию на высокой уровне.

выводы

1.На "урожай" протопластов риса оказывают влияние:структура "материнской" клеточной культуры, условия ее Ферментной обработки, способ осмостабилизации полученных протопластов,состав культуральных сред.

2. Установлено, что мелкодисперсные суспензионные культуры, обладающие высоким морФогенетическин потенциалом, - наилучший источник получения протопластов риса.

3. При выборе эксплантата для закладки суспензионных и каллусных культур, предназначенных для выделения протопластов, предпочтительнее использовать растительные ткани, богатые ме-ристемными клеткани (пыльники, кончики корней проростков,незрелые зерновки и т. д.), т. к. они имеют хорошую способность к морфогенезу.

. Оптимальная суммарная концентрация целлюлитических ферментных препаратов для обработки клеточных суспензий -5оптимальная продолжительность экспозиции в Ферментном растворе -з часа.

5. На этапе ресинтеза клеточной стенки и первых митотичес-ких делений культивирование протопластов необходимо проводить в условиях высокого осмотического давления из-за опасности лизиса, для этого лучше применять питательную среду НБ+Вб-вита-нины, содержащую сахарозу или мальтозу в количестве 0,4М/л.

6.Для индукции морФогенетических процессов в культурах

протопластов рекомендуется использовать агаризованные питательные среды MS+B5-витамины или Ыб с цитокининами. (Содержание углеводов - 30-60 г/л).

7. На основе разработанной методической схемы регенерации интактных растений из протопластов получены регенеранты красно-зерного риса, сортообразцов вз (Гв х Кулон) и нзо^х кп-1352-87. Фотосинтетическая способность растений оказалась, однако.сниженной. Необходима дальнейшая экспериментальная работа для создания методики массового получения зеленых регенерантов.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ К ВНЕДРЕНИЮ

1. Предлагаемая в данной работе легковоспроизводимая методическая схема - способ получения интактных растений из протопластов риса.

2. Рекомендуются мелкодисперсные быстрорастущие клеточные суспензии с высоким норфогенетическим потенциалом как основной источник получения протопластов с высокой плотностью.

3. при выборе эксплантатов для закладки суспензионных и каллусных культур - источников протопластов - предпочтительнее использовать растительные ткани с высоким содержанием мерис-темных клеток.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Нухина X. н.. Харченко п. Н.. Алешин Н. Е. Сравнительная оценка суспензионных и каллусных культур в качестве источников получения протопластов риса//Рис России. -1996. -т. 4.Н2(7). -с. 1-2.

2. Мухина X. н.. харченко п. Н. .Алешин Н. Е. изучение интенсивности морФогенетических процессов в культурах протопластов ри-са//Рис России. -1996. -т. 4. Н2(7). -с. 3-5.

3. Мухина X. М..Харченко П. Н., Алешин Н. Е. регенерация растений из каллусных культур риса (Oryza sativa L. > - в печати.

4. Мухина X. Н., Харченко П. Н., Алешин Е. П.. Алешин н. Е. Регенерация растений из суспензионных культур риса(Oryza sativa L. ) - в печати.