Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Цитологические, анатомо-морфологические и физиолого-биохимические признаки регенерантов, каллусов и протопластов риса в связи с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Цитологические, анатомо-морфологические и физиолого-биохимические признаки регенерантов, каллусов и протопластов риса в связи с хозяйственно-ценными свойствами растений в целях создания новых и совершенствования существующих методов и приемов селекционно-семеноводческой работы"

краснодарский сельскохозяйственный биотехнологический центр

На правах рукописи

Харченко Петр Николаевич

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ РЕГЕНЕРАНТОВ, КАЛЛУСОВ И ПРОТОПЛАСТОВ РИСА В СВЯЗИ С ХОЗЯЙСТВЕННО-ЦЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ РАСТЕНИЙ В ЦЕЛЯХ СОЗДАНИЯ НОВЫХ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДОВ И ПРИЕМОВ СЕЛЕКЦИОННО-СЕМЕНОВОДЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

Диссертация

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Краснодар -1997

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор, член-корр.РАСХН Драгавцев в. А. ;

доктор биологических нале, профессор воробьев н. в.;

доктор сельскохозяйственных наук Колесников ф.а.

ведущая организация - Кубанский государственный университет.

в ю.оо на заседании диссертационного совета Д ого. 66.01 ВНИИ риса по адресу:350063,г. Краснодар, п/оБелозерное.

С диссертацией в виде научного доклада нохно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института риса.

Зашита состоится

Диссертация в виде научного доклада

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н.

Сорочинская Е. и.

- 3 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

1.1. Актуальность темы. Рис-древнейшая и важнейшая зерновая культура. Он является основный продуктон питания для большей части человечества, рисовая крупа составляет половину рациона 1,6 млрд. человек и от 25 до 50радиона еше 400 млн. человек (Сваминатхан е., 1965). Кроме рисовой крупы в мировом хозяйстве большое значение имеют крахмал, масло, лузга, солона и другие его продукты, использованные в пишевых, кормовых и технических целях (Алешин Е. П.. Алешин н. Е., 1993).

С 1960 по 1990гг. средняя урожайность риса в Азии возросла на Ч0У-, а его производство - более чем на бох, за тот же период население этого региона увеличилось на 55*. Рост производства риса был достигнут за счет повышения урожайности, а не путем расширения посевных площадей. этот успех был достигнут в основном благодаря национальным селекционным программам и использованию мировых генетических ресурсов риса.

Успешное решение современных селекционных программ во многом зависит от методов выведения и возделывания сельскохозяйственных растений.

Роль научно-технического прогресса в селекции новых высокопродуктивных сортов, прежде всего, состоит в ускорении темпов селекционной работы. Использование традиционных, классических методов выведения новых сортов риса в настоящее время исчисляется ю-ю годами. Из них на селекционную работу, связанную с получением гомозиготных линий, приходится 5-7 лет.

Одним из наиболее перспективных путей ускорения селекционного процесса на сегодняшний день является создание нетрадиционной технологии селекции посредством быстрого и нассового получения гомозиготных линий яз гаплоидов гибридных растений (3, 16, 23).

Практическое воплощение возможностей технологии протопластов в селекционную практику позволит создать урожайные сорта риса, устойчивые к болезням и вредителям, сопротивляе-

«Научный консультант диссертации - доктор сельскохозяйственных наук,профессор,почетный доктор Университета Феррары, заслуженный деятель науки Кубани, академик Н. Е.Алешин.

иостью к стрессовым факторам среды.

1. г. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является получение гаплоидов и гомозиготных линий от сортов и гибридов риса первых поколений методом культуры пыльников. в связи с этим решались следующие задачи:

- разработать оптиналыше варианты питательных сред и условий культивирования пыльников, клеток, тканей риса и дичании для получения каллуса с последующей регенерацией из него растений;

- разработать технологию массового получения гаплоидов из пыльников риса;

- определить эффективность диплоидизадии гаплоидов риса при обработке их колхшшнон и при культивировании In vitro гаплоидной ткани;

- внедрить ускоренную технологию получения гомозиготных линий от межсортовых гибридов в селекционную практику;

- подобрать оптимальные варианты питательных сред и условий культивирования протопластов риса;

- получить регенеранты из протопластов риса;

- получить неосыпаюшиеся формы цицании;

- создать новые линии, мутанты, сорта с использованием вышеуказанных методов.

1. з. научная новизна исследований. Исследования по разработке и применению методов in vitro для задач селекции риса являются новым направлением как в нашей стране, так и за рубежом.

В результате проведенной работы впервые в нашей стране были получены этим методом гаплоидные растения злака - риса и регенеранты из его протопластов, дана морфологическая характеристика гаплоидов.

Установлена возможность получения гомозиготных линий из пыльяевого каллуса гибридов риса минуя этап получения гаплоидов с последующим переводом их на диплоидный уровень.

Разработаны модификации питательных сред и условия культивирования пыльников, тканей, клеток, протопластов риса и цицании для получения каллусов и регенерантов.

Разработана методика перевода гаплоидов на диплоидный уровень посредством колхицина и спонтанной диплоидизапии в

культуре ткани.

Проведены гистологические и цитометрические исследования гаплоидных клеток и каллуса.

Установлена частота образования близнецовых проростков у риса и впервые зафиксировано возникновение проростков-тройни.

1.4. практическая ценность работы, автором разработана технология кассового получения гаплоидов из пыльников риса in vitro, полученные методом культуры пыльников гомозиготные линии переданы в лабораторию селекции и рабочую коллекцию для использования их в селекционных целях, конкурсное испытание прошли шесть линий, одна из них выделена в качестве сорта (см. Приложение).

Были переведены через культуру тканей на тетраплоидный уровень несколько сортов и межвидовых гибридов, которые не удавалось полиплоидизировать при помоши колхицина.

Практическая ценность разработанных методов in vitro в тон, что они сокращают селекционный процесс в два-три раза и создали основу для исследований по генной инженерии риса и пи-цании. Некоторые результаты исследований официально внедрены в научно-исследовательскую практику (см. приложение).

1, 5. основные положения, вынесенные на защиту:

- Ускорение селекционного процесса при использовании методов культуры in vitro пыльников, тканей, семян, зародышей, клеток и протопластов риса.

- Технология массового получения гаплоидов из пыльников

риса.

- Способы увеличения выхода зеленых регенерантов при культивировании пыльников риса.

- Эффективность метода спонтанной диплоидизации гаплоидных клеток риса на питательных средах In vitro перед методой колхицикирования.

- Иетод культуры тканей и клеток - способ полиплоидизадии растения.

- Культура протопластов риса - основа для исследований по генной инженерии и создания устойчивых, к болезням, вредителям и стрессовым условиям окружающей среды Форм риса.

- культура тканей и клеток цицании - способ создания нео-сыпаюшихся Форм для сельскохозяйственного производства.

мостью к стрессовым Факторам среды.

1. г. Апробация работы, материалы диссертации доложены на совещании по применению методов культуры In vitro зародышей, органов и тканей в селекции растений, г. Мичуринск ,1977 г.; на региональной научной конференции "теоретические вопросы регенерации растений", г. Махачкала, 1976г.; на научной конференции молодых ученых Куб. СХИ. г. Краснодар, 1979 г.; на президиуме ВАСХНИЛ, г. Москва, i960 г.; на научно-теоретической конференции молодых ученых, посвяшенной 110-й годовшине со дня рождения В.И.Ленина, г.Краснодар, 1960г.; на I Всесоюзной конференции "регуляторы роста и развития растений", г. Москва. 19S1 г.; на IV Всесоюзной конференции "Культура тканей растений и биотехнология", г.кишинев, 19S3 г.; на научно-теоретической конференции "Проблемы селекции и генетики пшеницы и ячменя", г. Краснодар. 198*г.; на координационном совещании "Итоги выполнения научно-исследовательских работ по рису за XI пятилетку и задачи на XII пятилетку", г.Кзыл-орда, 1985 г.; на рабочем совещании "Перспективы использования клеточных технологий и практической селекции злаков", г.саратов, 1985 г.; на координационном совещании "Создание гибридного риса на основе оде". г.Краснодар, 1965 г.; на конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", г.Носква, 1996 г.; на региональной научно-теоретической конференции "Научно-технический прогресс в сельском хозяйстве Северного Кавказа". г.Майкоп, 1996г.

г. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И НЕГОДИКА ИССЛЕДОВАНИИ

г. 1. Условия исследований. Эксперименты проводились в Краснодарском Сельскохозяйственном Виотехнологическом Центре в 1972-1997ГГ., Ханойском институте сельскохозяйственной генетики (1991-1992гг.). цзилинской Академии сельскохозяйственных наук Китая (1993г.), Узбекском республиканском сельскохозяйственном биологическом центре "Хосил"(1993г. ), Узбекском НИИ риса (1991-1995гг.), гаванском НИИ риса (19в9г.), Корпорации северного риса (Лондон, 1991-1995гг.) в рамках международной программы "Интеррис-2000".

Полевые опыты закладывались в Элитно-семеноводческом хо-

зяйстве "Красное" и на экспериментальном участке Краснодарского сельскохозяйственного биотехкологического центра.

В ходе работы автор пользовался консультациями академика РАСХН е. П. Алешина, член-корр. РАК Бутенко Р. г.. проф. И. м. Сурикова, которым выражает глубокую благодарность.

2. 2. натериал исследований. В своей работе автор использовал линии и сорта из мировой коллекции ВИР, рабочей коллекции ВНИИ риса, гибриды из селекционных подразделений ВНИИ риса. Экспериментальным материалом в исследованиях служили пыльники, зрелые и незрелые зерновки, ткани культурных и диких Форм риса и пицании.

Рис (Orrza sativa L, , О. perennls, О. stapfll, О. rufipogon, 2n=24) - однолетник, самоопылитель, цветки которого собраны в нетелку и состоят из двух цветковых четуй, завязи с двумя перистыми рыльцами и шести тычинок.

Цицания (Zizanla latlfolia L, ) - многолетник, пветки собраны в метелку (в верхней части -с нужскими цветками, в нижней - с женскими).

2. з. нетодика исследований.

2. 3.1. Использование полиэмбрионии для получения гаплоидов. Натериалом для получения полиэмбрионных проростков служили се-нена сортов и линий из коллекций ВИР и ВНИИриса.

Зерновки риса после 20 часового замачивания в водопроводной воде проращивали на влажной Фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 28-30°с. Натериал просматривали на 1-7 день, У близнецовых проростков фиксировали в уксусном алкоголе (3:1) кончики корней для цитологического анализа. Подсчет хромосом проводили в метафазных пластинках на давленых ацетокар-ниновых препаратах. Просмотр препарата производили на микроскопе МБИ-з.

2. 3.2. Культура пыльников и тканей in vitro. Использовали общепринятые методы работы с растительными тканями (Бутенко Р.г., 1964). в том числе собственные охраноспособные методы исследований (17). Донорские растения риса выращивали в полевых условиях или в теплице.

Нетелки риса, находящиеся еше в листовой обертке, срезали на определенной стадии развития пыльника. Стадия развития оп-

- в -

ределялась цитологически на временных ацетокарминовых препаратах. Пыльники для анализа брали с нижней, средней и верхней части метелки. В зависимости от опыта, метелки риса помешали перед инкубированием в холодильник на 1-3 суток при бвс. Перед посадкой метелку предварительно обрабатывали О, Г/ растворон сулемы в течение 10-12 минут и три раза ополаскивали стерильной водой, пыльники культивировали в пробирках на агаровой среде в термостате при 2б-гв°С в темноте. Для культивирования пыльников использовали питательную среду Блейдса ( BiaYdes D,. 1966). органические добавки и витамины по Ничу (Hltsch J. , Kitsch е., 19бб).Фитогормон 2,4-Д -гнг/л. среда имела рН = 5,8-б,о. пыльники просматривали еженедельно под бинокулярной лупой и Фиксировали появившийся каллус и эмбриоиды.

Для регенерации растений из каллуса и эмбриоидов, полученных в культуре пыльников, использовали среду мурасиге и Скуга (Murashlge and SKooe, 1964). Фитогорнон - кинетин-гмг/л, ИУК - 1,5мг/л, рН=5, 6-6, 0. Каллусы, а затеи растеньица культивировали в климатической камере при 12-часовом фотопериоде, температуре £8-зовс и освещенности 15-20 тыс. люкс, образующиеся зеленые растеньица в Фазе 2-3 листьев с хорошей корневой системой пересаживали в стаканы с почвой и в течение недели выращивали в климатической камере при повышенной влажности, затем укрепившиеся растеньица высаживали в сосуды с почвой или в микрочеки.

Для получения каллуса с последующей регенерацией из него растений кроме пыльников использовали зрелые и незрелые сене-на, стеблевые узлы и зачаточные метелки риса. Методика их куль-тиворования была подобна культивированию пыльников.

2.3.3. Дипдоидизация гаплоидов. Гаплоидные растения, полученные методом культуры пыльников, диплоидизировали 0,01-0, г/, раствором колхицина, используя методику полиплоидизации дипло-идов риса (Щербак C.B., 1979). Колхицированию подвергали боковые побеги взрослых гаплоидных растений в Фазе 1-е листочков. В раствор колхицина погружали только побеги, чтобы исключить отрицательное воздействие алкалоида на корневую систему.

Для диплоидизашга гаплоидов применяли спонтанную подипло-идизацию соматической ткани гаплоидов на дедиФФеренцируюшей

среде.

Анализ хлорофилла в листьях гаплоидных и диплоидных растений проводился в лаборатории Физиологии на спектрофотометре QV-50 по стандартной методике (Нилаев Я. И. и др,, 1969).

Статистический анализ данных выполнен на ЭВМ. Определялась средняя, ошибка средней, коэффициент вариации ( Рокицкий П. Ф.. 1967).

2.3.4. культура протопластов In vitro. Каллус для суспен-зиальных культур получали на агаризованных питательных средах MS (Hurashiee and SKoog. 1962) с В5-витаминами (Gamborfi et ai. 1968) или R2 (Cfhlra et al, 1973). дедиФФереяциатором использовали горнон 2,4-Д (2,4 -дихлорфеноксиуксусная кислота). Суспензионные культуры получали из каллуса (1-3 г) помешенного в конические колбы с жидкими средами (HS + В5-витамины или R2) и культивируемого на роторной качалке (120-140 об/мин).

Для получения мелкодисперсионной суспензии клеток исходную суспензию циклически пассировали через 7-10 суток на свежую питательную среду предварительно подвергнув ее Фильтрации через металлические сита (разнер ячейки 100-150 мкм). с целью получения протопластов ферментативную обработку клеток каллус-ных и суспензионных культур проводили энзимным препаратом Cel-lulase RS, Hacerozyme Rio, пектиназой 5S.

Для осмостабилизации протопластов использовали в качестве осмолитиков следующие рецепутры: CPV- соли + 21/ сахарозы, насоли + 0,4И глюкозы, V/5-соли Шокот В. П., 1989), CPV-соли (Power J. et al, 1985) + 13x маннитола.

Протопласты очищали фильтрацией через систему медных Фильтров последовательно (размер ячеек 100, 70, 50 мкм)и трехкратным центрифугированием (60 х g,5 нин) в растворе оснолити-ка.

Из-за опасности лизиса первые 10-15 дней протопласты культивировали в условиях высокого осмотического давления на жидких питательных средах с высокой концентрацией Сахаров:

1. HS + В5-витамины + о, 4Н сахарозы или мальтозы;

2. R2 + о, 4М сахарозы или мальтозы;

3. General (Ll Lh. et al, 1990) +0,4M сахарозы или мальтозы;

1. Н6+ О, 4Н сахарозы, 146 мИ глюкозы Шаиа Б, ег а1, 1990). После образования клеточной стенки протопластами осмотическое давление постепенно снижали, разбавляя культуральную среду 1-2 каплями аналогичной среды, но с уменьшенным содержанием Сахаров. Процедуру периодически повторяли до образования микроколоний видимых визуально.

для индукции морфогенеза применяли агаризованные питательные среды МБ + В5-витамины и Нб с питокинином.

регенеранты выращивали в камерах при температуре 2в°с, Фотопериоде 12 час., освещенности 40 люкс, относительной влажности воздуха ток.

2. 3. 5. гистологическое и цитологическое исследование тканей и клеток. Для цитологических и гистохимических исследований использовали ткани каллуса и пыльников гаплоидов риса, на-териал отбирался с поверхности питательной среды и Фиксировался в Фиксаторе Чемберлена. затем обезвоживался и заключался в парафин. Парафиновые срезы толщиной 7-12 мкн окрашивали гематоксилин-эозином для обшенорфологических целей и для гистохимических на нуклеиновые кислоты галлоцианином, тионином и азу-ром.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. 1. Использование полиэмбрионии для получения гаплоидов риса. Известно, что зародыши семян могут образовываться как в результате оплодотворения, так и апомиктичным путем, причем зародыши разной природы могут возникать в пределах одной семяпочки или одного зародышевого мешка (тырнов в. с., 1970). Вслед-ствии того, что близнецовые проростки образуются разными путями, они могут различаться по генетической конституции, а часть - и по числам хромосом (Цветова Н., 1971).

Из 197000 зерновок трех сортов риса,пророшенных на влажной Фильтровальной бумаге в чашках Петри, выявлено и полиэмбрионов. Все они, кроме одной тройни, были двойнями (рис.1, 2). Две двойни представляли тип гп-п и восемь - гп-гп. число хромосом в корешках определялось в метаФазных пластинках на давленых ацето-карминовых препаратах. Анализ частоты встречаемое-

ти близнецовых гаплоидов показал, что для получения одного гаплоида необходимо прорастить около 10 тысяч зерновок. Низкая частота близнецов среди проросших семян риса и еше более низкая частота встречаемости среди них гаплоидов указывает на безперспективность использования данного метода для получения гаплоидов риса в нассовом количестве (1).

Рис. 1 Близнецовые проростки риса-двойни

Рис. г Близнецовые проростки риса-тройня

- 12 -

3.2, изучение процесса индукции каллуса из пыльников сортов и гибридов риса. Многочисленные литературные данные указывают на важное значение стадии развития пыльцы для каллусооб-разования. При культивировании пыльников на питательной среде нами установлено, что оптимальной для образования каллуса является одноядерная стадия (4.6,15). установление корреляции между стадией развития пыльцы и положением метелки риса в период трубкования позволило в дальнейшем визуально Фиксировать оптимальную стадию, не прибегая каждый раз к цитологическому контролю, что очень важно при массовом культивировании пыльников. Пыльники для цитологического анализа брались в период начала выхода Флага из трубки до появления верхних колосков метелки из влагалища. Анализ показал, что цветки по всей длине метелки находились на разных стадиях развития. Наиболее благоприятная для эксплантации пыльников стадия развития Фиксировалась за 2-3 дня до выметывания или когда метелка достигала г/з длины влагалища. В это время пыльцевые зерна в средней части метелки в большем случае были одноядерными и некоторые - дву-ядерными (рис. 3).

Рис. 3 Пыльца риса в одноядерной и двуядерной стадиях

При культивировании пыльников вами испытывались питательные среды Блейдса, Нурасиге и скуга и n6. Наиболее пригодной оказалась среда Кб, но ее преимущество было незначительным перед двуня другини и в дальнейших исследованиях нами использо-

валась среда Блейдса, как наиболее простая по своему составу.

с целью поиска оптимального варианта эта среда модифицировалась. варьирование в среде концентрацией ауксинов г, 4-д и с1-НУК выявило преимущество оС-НУК -5мг/л (табл.1), однако, каллус, полученный на среде с с£-НУК при пассировании его на дифференцирующую среду.образовывал растения лить в редких случаях.

Исходя из этого, предпочтение было отдано среде с 2,4-Д -г мг/л, как оказывающей влияние на последующую регенерацию растений из каллуса (2,4,5,6,7,8,11,12,14).

таблица 1

Влияние ауксинов 2,4-Д и <£-НУК на каллусогенез из пыльников,-/.

Образец г, 4-д ©¿-НУК

2 мг/л 5 мг/л 2 мг/л 5 мг/л

Дезарио П Италика 70 х X БНИИР 212 4, б 1 0.64 0. 7 ± 0, 51 2. 6 + 0. 90 1.3 ± 0,67 4, 3 + 0.67 1.5 + 0. 71 8. 7 + 1. 55 5. 6 + 0, 58

Наиболее эффективным оказался вариант, когда в среду добавляли 10* отвара из неочищенного картофеля (табл.2), причины увеличения образования каллуса в пыльниках при культивировании на среде с картофельным отваром неизвестны. Возможно, что в нем присутствуют активные вещества, способствующие делению

микроспор (15).

Таблица г

Влияние 10'/. картофельного отвара в среде Блейдса на каллусогенез из пыльников риса

Образец Пыльники давшие каллус.х

варианты

без картофельного отвара с картофельным отваром

Р1 Бару X ВНИИР1171 7. 8 + 1. 38 18,2 + 1,77

П ВИР 660 х солнечный 1,8 ± 0,60 7, 5 + 1, 35

К1 Л/ВНИИР 660 X

ПР.прекоче/ х Цезарио 5. 5 + 1, 21 12, 5 1 1, 73

Италика 70 4, 3 +. 0, 76 6,7 + 0,91

р-гв б, 0 ± 0,72 8, 3 + 0,54

- 14 ~

Увеличению частоты образования каллуса способствовала и предобработка свежесрезанных нетелок риса пониженными температурами. Наиболее оптимальной в наших опытах явилась их обработка в течение 2-3 суток при бсС. Наряду с увеличением образования каллуса, холодовая обработка метелок позволяет сохранять их в течение нескольких суток, что важно при массовом культивировании пыльников (6,15).

Выращивание одного и того же исходного материала риса в различных условиях влияло на каялусогенез и регенерацию растений гораздо больше, чей состав питательной среды. Изучение влияния условий выращивания донорских растений позволило установить. что процент каллусогенеза из пыльников растений, выращенных в теплицах, был ниже, чем у растений того же сорта, выращенного в полевых условиях (б,15).

В некоторых работах (Fouletler В. .1974) отмечалось, что число каллусов увеличивалось в зависимости от количества пыльников, высеянных на единицу плошади питательной среды. Наши наблюдения не установили подобной связи, однако, увеличение числа пыльников, высаженных на среду в пробирку с 5 штук до 15 позволило увеличить объемы и уменьшить затраты (7,6),

Существенное влияние генотипа на андрогенез в культуре пыльников риса отмечалось многими исследователями. В некоторых работах (Chen с., 1976) показано, что частота образования каллуса и эмбриоидов в зависимости от генотипа риса колебалась от 1 до юх. наши данные позволили подтвердить роль генотипа в индукции каллуса из пыльников (7,вь Пыльники гибридов риса имели более высокий процент выхода каллуса (15). чем те, которые были взяты от родительских растений (табл. 3).

Поиск и применение лучших вариантов культивирования пыльников риса позволило увеличить средний процент каллусогенеза с 2,&у. в 197бг, почти до 10Z в 1981-1993гг. При этом на питательную среду было зксплантировано свыше 1 млн. пыльников сортов, линий и гибридов риса.

предложенная для культивирования пыльников риса новая модифицированная питательная среда отличающаяся от предшествующих содержанием крезацина позволили увеличить каллусогенез на 67.5'/ (ia, 19). Крезацин -синтетический регулятор роста, биоло-

таблица з

Частота индукции каллуса из пыльников сортов и гибридов риса

Образец число пыльников

эксплаятировано дали каллус, у-

Гибриды

Италика 70 х Пионер 1020 13. 1 * 1.ТЗ

Цезарио х ВНИИР 2024 1350 8.4 + 1, 20

Пезарио х Р-28 750 16, 5 + 1, 55

Сатурн X ВНИИР 2024 300 10,0 + 1, 08

ВНИИР 7873 X ВНИИР 8857 325 16,0 + 1,04

сорта

Италика 70 2100 4, 5 + 0, 91

Пионер 300 Т,0 1,07

Цезарио 300 4,7 + 0, 66

Сатурн 900 4, 1 4- 1,02

ПРИКУбанскнй (ВНИИР 2024) 1050 9,4 £ 1,71

Р-28 1800 6,4 + 0,96

ВНИИР 7873 300 6, 3 £ 1,63

ВНИИР 8857 300 8. 3 + 0, 61

гически активное вещество три-(г оксиэтил)аммоний-(г-метилФе-ноксиацетат) по механизму действия подобен природным ауксинам, но обладает более высокой активностью. Использование его в питательной среде позволило интенсифицировать процесс каллусоге-неза, уменьшить объемы приготавливаемых сред.

3. 3.регенерация растений из пыльцевого каллуса, регенерация растений из пыльцевого каллуса проводилась на среде Нура-сиге и скуга и кинетином 2 нг/л и ИУК 1-2мг/л при освещенности 15-20 тыс. люкс, температурном режиме 28е с днем и ночью, при 12 -часовом Фотопериояе (4,5,7,8,9,12). Замена кинетина на БАП (бензиланинопурин) 0,5-2 мг/л не была эффективной (14,15). пряная регенерация, минуя каллус, нами не наблюдалась. Анализ опытов по регенерации растений показал широкий спектр колебаний потенциальных возможностей у сортов и гибридов риса, средняя частота регенерации (от количества пассированного на диф-

Ферендирующую среду каллуса) варьировала от 0 до 50,4х. Отмечена различная частота регенерации зеленых и альбиносных растений у исходных сортов и гибридов, что показывает на генетическую детерминацию этого признака (б, 17). Большинство регене-рантов было альбиносами. В одной пробирке из одного каллуса величиной з мм образовывалось от 1 до 25 растеньиц.

Поскольку каллус одного пыльника регенерировал альбинос-ные и зеленые растеньица, продуцировал только корни или унего отсутствовал органогенез, можно было предположить, что каллус в пыльнике образовывался из нескольких пыльцевых зерен, это подтвердилось при анализе регенерантов. подученных из каллуса одного пыльника гибридного растения (14). Вывод о правильности гипотезы одна микроспора-один каллус подтвержден другими (К1-пояшла, 1902).

Практическая эффективность метода культуры пыльников во многом зависит от увеличения выхода зеленых регенерантов. Заслуживает внимание использование Форм риса с генетически детер-нинированными изменениями метаболизма. Используемый в опытах мутант Алексеенко характеризуется пониженным биосинтезом эндогенных гиббереллинов и повышенным содержанием хлорофилла. Последнее подтвердило предположение об увеличении выхода зеленых регенерантов по сравнению с высокорослыми исходными Формани риса (17).

Изучалась способность пыльцевого каллуса регенерировать растения в зависимости от длительности его культивирования на дедиФФеренцируюшей среде (табл.4).

^ Таблица 4

Зависимость плоидности растений-регенерантов от длительности культивирования каллуса на дедиФФеренцируюшей среде

Образен Возраст каллуса, дней Зеленых регенерантов с плоидностью

п 2П 4П

ВИР 660 х

Радуга 30 21 4 -

60 б 12 2

90 1 3 1

италика 70 30 16 3 -

60 5 7 1

90 - - -

С увеличением вренени культивирования уменьшалась способность индуцировать побеги, особенно зеленые (15, 32, 34). Наиболее длительно сохранялась его способность к ризогенезу (табл.5).

Таблица 5

Зависимость органогенеза от возраста каллуса

Образец Возраст каллуса, дней Пробирок Регенерантов

всего С РИ30- генезом каллуса с зелеными рас тениями с альби-норасте-ниями альби-носных зеленых

Fl ВИР 660

к Радуга 30 30 3 18 3 9 61

60 87 19 31 8 46 49

90 90 36 9 21 87 9

120 90 22 - 24 23 -

150 89 19 - 1 1 -

Италика 70 30 28 2 21 1 3 103

60 90 4 29 17 59 127

90 88 27 1 б 45 3

120 90 16 - - - -

150 87 - - - - -

Некоторые авторы (Не comb, 1977,1978) отмечали, что включение кинетина в дифференцирующую среде влияло на частоту по-липлоидизации, особенно там, где регенерация шла через каллус-ную стадию. Еще большее влияние на полиплоидизацию клеток каллуса в дедиФФеренцируюшей среде оказывали ауксины (4,5,7,8). Спонтанная диплоидизааия посредством зндонитоза гаплоидных каллусных клеток в период культивирования успешно использовалась для получения диплоидных гомозиготных Форм от гибридов Fl (9, 15. 25, 32),

Спонтанное получение диплоидных растений из гаплоидных микроспор гибридов первых поколений в культуре пыльников предпочтительнее метода удвоения гаплоидов с помощью колхицина, который обладает токсическим действием.

Полиплоидные Формы, особенно тетраплоиды, представляют интерес в практической селекции. Были получены тетраплоидные формы из каллуса пыльников двух гибридов риса, которые не удавалось полиплоидизировать раствором колхицина. Таким образом.

было показано, что метод культуры in vitro может с успехом применяться для получения полиплоидов, где метод колхидиниро-вания не дает положительного эффекта (15).

3. 4. Диплоидизапия гаплоидов риса. Для диплоидизапии гаплоидов использовали метод колхицинирования и спонтанную поли-идизадию ткани при культивировании на питательной среде (7,8, £6).

Обработке о,oi-o,iz раствором колхицина подвергали боковые побеги взрослых гаплоидных растений в Фазе 1-Е листьев. Чтобы исключить отрицательное воздействие алкалоида на корневую систему, в раствор погружали только побеги, предварительно сделав накол иглой над точкой роста, в период колхидинирования растения находились в течение суток в термостате при температуре 26-30°с. Наиболее оптимальным явился о, 05У. раствор колхицина.

Обработка гаплоидных растеньиц колхицином влекла за собой гибель большинства из них - 62-80'/:. Образовывались химерные растения, на которых диплоидные метелки находили обычно на побегах второго порядка. Гаплоидными оставались 14-22'/. колхичи-нированных растений. Эффективность диплоидизапии данным методом оказалась низкой и составила в лучшем варианте 16'/..

Трудности диплоидизапии гаплоидов риса раствором колхицина вызвали необходимость использования в решении этого вопроса спонтанной полиплоидизации соматической ткани гаплоидов. При этом из ткани гаплоидного растения можно получать множество диплоидных растений, что имеет несомненное преимущество перед методом колхидинирования.

При получении каллуса от гаплоидов предпочтение было отдано его стеблевым узлам и зачаточным метелкам, как имеющим меристекаткческие клетки (28). Инокуляцию зачаточных метелок гаплоидов на дедиФФеренцирующую среду Блейдса с г-5 иг/л 2,4-д проводили в период колосков, когда иетелочка имела длину ю-30 мм. Стеблевые узлы гаплоидов брались у растения, выбросивших метелку, с целью провокации роста пазушных почек, метелки растений срезались на 5-7 дней до культивирования узлов.

Преимущество зачаточных метелок над стеблевыми узлами вы-

разилось не только в выходе каллуса, но и в том, что метелка менее подвержена воздействию никроФлоры (табл. 6).

Таблица &

Каллусообразование из стеблевых узлов и зачаточных метелок гаплоидных растений

Среда Вид ткани пробирок

с инфекцией, '/• с каллусом, 7.

Блейдса + 2 мг/л Зачаточные

2,4-Д нетелки 7,6 + 3,05 85,3 + 6,02

стеблевые

узлы 37,0 + 3,61 35,3 ± 4,04

Блейдса + 5 мг/л зачаточные

2,4-Д метелки 5,0 ± 2,07 88, 9 ±2,64

стеблевые

узлы 38,2 + 3,73 47, 7 + 4, 16

Регенерация растений осуществлялась на среде нурасиге и скуга с кинетином - г мг/л и йУК - 1,5 мг/л из 50-60 дневного каллуса, полученного из зачаточных иетелок гаплоидов.

3.5. характеристика гаплоидов риса, гаплоидные растения риса, как правило, представляют собой уменьшенную копию исходной формы (табл.7). Они стерильны, низкорослы, с меньшими размерами вегетативных и генеративных органов. Цитологический анализ клеток показал наличие в них 12 хромосом (5,8, 35)(рис.4)

таблица 7

Характеристика гаплоидных и диплоидных растений риса

Образец Плоид-ность Высота, см Длина метелки, см Число колосков на 1 метелку

италика 70 п 56,4 + 3, 32 11,2 + 0,68 166,7 + 8,97

2п 87,4 £ 4,31 17, 2 ± 1, 23 92, 6 ± 5, 32

Белозерный п 52,4 + 3, 16 10. 9 ± 0, 87 104, 3 ± 4, 51

2п 83, 8 + 3, 94 14.7 ¿. 1,06 88,5 ± 6,97

Рис. Ч Метафаза гаплоидной клетки

для гаплоидов оказалось характерным, что продуктивная кустистость (имелись в виду стебли с отцветшими нетелками у гаплоидов и созревшими метелками у диплоидов) у гаплоидов в два раза выше, чем у диплоидов. окраска листьев и Флага у гаплоидов риса была интенсивнее, чем у диплоидов при одних и тех хе условиях выращивания. Биохимический анализ листьев показал, что количество хлорофилла у гаплоидов превышает его уровень у диплоидов в 1.7 раза. Изучение устьичного аппарата у гаплоидов и диплоидов риса в Фазе пятого листа позволило установить довольно значительные различия, что дает возможность определять плоидность по количеству устьиц на единицу площади и по длине замыкающих клеток (9.33).

Среднее число устьиц на 1 ин2 листа у различных сортов и гибридов колебалось в пределах 31.2 а 2.65 до 34.7 + о. 69. тогда как у гаплоидов,полученных от этих сортов и гибридов,они колебались от 4в. 2 + 0,63 до 66,1 .+ 0,71. При этом коэффициент вариации признака находился на низком (от 2,95 до 5,55) уровне независимо от сорта и его уровня плоидности.

Размеры устьиц у изучаемых сортов различались в зависимости от уровня плоидности (табл. 6). диплоидный уровень сортов характеризовался большими размерами устьиц по сравнению с гаплоидным Формами.

Таблица 8

размеры замыкавших клеток устьиц диплоидов и гаплоидов риса

Образец Плоидность Размеры устьиц, мкм

Белозерный 2П 152, 1 £ 1, 57

п 123.7 Д 1. 53

Спальчик 211 149, 7 + 1. 17

П 132,3 ± 1, 17

3.6. НорФологическая характеристика некоторых дигаплоидных линий. Семена диплоидных линий» полученных из каллуса пыльников сортов и гибридов риса, высевали семьями в кикрочеки с междурядьем в 15 см. Рядом, для контроля, высевались семена исходных родительских Форм (табл.9). При выращивании соблюдались все требования агротехники, велись Фенологические наблюдения. Во время созревания селекционерами устанавливалась гомозиготность линий и делалась их предварительная оценка по хозяйственно-пенным признакам.

Таблица 9

Сравнительная характеристика диплоидных линий, полученных из каллуса пыльников гибрида Р1 Краснодарский 424 х Мутант Шиловского

Образец в линии Высота растения, см Длина метелки,см наличие остей

Краснодарский 424 81,4 + 4, 13 17, 3 А 1. 87 -

Нутант Шиловского 33,9 4,41 7,3+. 2, 93 +

Р1 Краснодарский 424 1 50,9 ♦ 3, 86 12, 9 + 2. 65 +

х Нутаят Ииловского 2 2в, 7 * 3,75 7.2 ± 1, 30 +

3 29. 3 ± 3, 04 7, 7 + 2, 06 -

После уборки проводился биометрический анализ дигаплоидных линий. Лучшие линии передавались в селекционный питомник, а остальные в рабочую коллекцию. Уже на третий год, после получения гомозиготных линий из пыльников, лучшие из них проходили испытания в контрольном и конкурсном питомниках (13), а одна

- гг -

(ВНИИ 2103) передана в госкомиссию по сортоиспытанию,

Анализ гомозиготных линий,полученных из пыльников более 150 районированных и перспективных сортов риса, показал, что 9ЗУ. из них были по высоте меньше исходного сорта (25,26). Наши выводы сводятся к тому, что исходные выведенные традиционным методом сорта, являются гетерозиготными, в частности, и по высоте. поэтому для физиолого-биохимических и методических опытов желательно использовать чистолинейный натериал.

При культивировании пыльников сортов наблюдался формообразовательный процесс, который мог быть результатом мутаций, вызванных воздействием компонентов питательной среды на гаплоидные клетки каллуса. Полученные таким образом линии различались по многим признакам, которые сохранялись в последующем потомстве (табл. Ю).

Таблица ю

У

Характеристика гомозиготных линий в сравнении с исходной

Форма Вегетационный период, дни Высота растения, см Длина метелки, сн Количество колосков в метелке, шт. Касса зерна с метелки, г Пасса 1000 зерен,г

солнечный 117 86, 1 12.9 99,4 1. 96 30. 7

линии 1 108 63,9 13,0 77,6 2,07 29,6

4 115 79,0 13.7 92,6 2, 57 32. 1

5 111 87,9 13,4 94, 1 2,24 29. 1

3. 7. Культура изолированных зародышей и семян риса. В селекционной. практике нередки случаи получения семян риса кол-лекционых и селекционных форм (особенно гибридных зерновок) в ограниченных количествах и зачастую недозрелых шуплых. пораженных грибками, что ведет к потере образцов. Выла поставлена задача найти пути получения всходов из таких секян (3,7,8,15).

Изучали партии семян массой 25-зок от нормальных, при лабораторном проращивании они давали 4-28!« всходов, полностью пораженных грибной инфекцией.

Опыт показал, что проращивание in vitro является надежным способом получения всходов от таких семян, однако потребовалась тщательная обработка режимов стериализации и состава питательных сред, найдено, что лучшей является среда Нурасиге и

Скуга; отмечалось положительное действие добавки кинетина (О.2 -0,5 нг/л). Обработка семян тох-ным спиртом (1-г мин) с последующей стериализавдей в течение 4 мин в iz-ном растворе дио-цида позволила почти полностью уничтожить грибную инфекцию без снижения всхожести сенян.

В партиях с исходной лабораторной всхожестью 28,12,47. in vitro всхожесть семян достигла соответственно 100,78 и 58'¿.

Прием проращивания in vitro включен в селекционный процесс для щуплых семян F0 и FU при этом получаются нормальные растения.

Разработан способ восстановления образцов сенян внешне нормальных, но полностью утративших способность давать хотя бы единичные проростки в результате процессов естественного старения семян. Найдено, что в процессе старения семян существует стадия, когда их зародыши уже потеряли способность к прорастанию, однако отдельные их части еще сохраняют способность к недифференцированному росту, йз семян в такой "переходной" стадии удавалось на среде нурасиге и скуга с добавками 2,4-Д получать каллус, а из него на среде с добавкой вдггокининов и ауксинов (кинетин 2 нг/л,иук ю-14 мг/л) регенерировать проростки, из которых затем вырадавали нормальные растения. Таким образом восстановлены сотни коллекционных образцов, которые иначе были бы полностью утрачены.

Проводились опыты по культивированию недозрелых семян и изолированных молодых зародышей. Показано, что зародыши ухе в возрасте 5-б дней способны прорастать m vitro, при этом всхожесть достигала бОХ. использовалась среда Уайта. Обязательное условие культивирования таких зародышей - изолирование их от эндосперма и добавление к среде гидролизата казеина (500 мг/л). значительно более простым является культивирование более взрослых зародышей начиная с Ю-диевного возраста, при этом всхожесть достигает 95*.

Учитывая» что у риса от цветения до созревания составляет 30-35 дней, путем использования проростков из молодых зародышей можно сократить период одной генерации на 20-30 дней, что немаловажно при круглогодичном выращивании растений в условиях искусственного климата, изучается возможность получать с помо-

- *

шью этого метода три генерации риса в год (обычным же методом при.использовании теплиц получают два поколения в год).

Метод культуры молодых зародышей ножет быть применен также для репродуцирования позднеспелых Форм, у которых не удается собрать зрелого зерна.

С целью получения полиплоидных форм риса широко используется прием обработки семян колхицином, однако выход химерных по плоидности проростков низок, а попытки увеличить концентрацию колхицина ведут к гибели семян, разработка и применение нетода in vitro для этой процедуры позволили увеличить концентрацию колхицина в ю раз и при этом снизить гибель проростков в 3-4 раза, в результате были получены полиплоиды от таких образцов, для которых обычным методом этого сделать не удавалось, например для вида Oryza glaberrlma,

з. 8. Получение мутантов и сомаклональных вариантов, клетки сонатических тканей риса способны к каллусогенезу in vitro с последующей регенерацией растений. Получаемые при этом регене-ранты представляют собой важный источник расширения генетического разнообразия. В основе его лежит изменчивость, возникающая в процессе культивирования тканей (7,15).

С целью изучения возможности применения этого метода для селекции риса проводились по получению каллуса из соматических тканей риса, регенерации из него проростков и изучению получаемых тканей.

Поскольку селекционная работа требует больших объемов изучаемого материала, важное значение придавалось разработке иетодов, обеспечивающих массовую регенерацию растений, опыты показали, что регенерадионная способность каллуса риса обусловлена генотипом, однако может быть значительно повышена путем оптимизации условий культивирования in vitro (состав питательных сред, температура, обьен культивационных сосудов). Важное значение имеет выбор эксплантата, возраст и величина трансплантата. Особое внимание было уделено изучению разнока-чественности каллусной ткани и связи ее морфологических характеристик с регенерационной способностью. В результате разработаны способы, позволяющие получать более гоо проростков в расчете на 100 пробирок, при этом подавляющее большинство регене-

рантов - зеленые. Определены условия применения химических мутагенов (НИМ,- ДЭС) для обработки каллуса риса. Начата работа по использованию Физических мутагенов (гамма-лучей и Х-лучей).

Изучены большие партии регенерантов. получаемых при различных уровнях Фитогормонов в питательных средах. Показано,что среди регенерантов Р1 встречается много аномальных проростков (например, со скрученными или гофрированными листьями, с измененным геотропизмом и др. ), Опыты показали, что эти аномалии являются морфозами и не наследуются, чтобы судить о наличии среди регенерантов генетических изменений, следует изучить их в ряду семенных поколений,

В настоящее время изучены в течение десяти семенных поколений потонства регенерантов, полученных от 12 сортов риса. Установлено, что часть регенерантов внешне ничем не отличается от исходных сортов, в то время как другие несут наследуемые изменения. Чаще всего встречались мутации стерильности, высоты растений, остистости, окраски цветковых чешуй. Наряду с этим были выделены Формы, отличавшиеся от исходных по таким важнейшим хозяйственно ценным признакам, как длина вегетационного периода, строение метелки, продуктивность и качество зерна. Интересно отметить, что среди регенерантов найдены Формы с очень редкини для риса признаками (антоциановая окраска листьев, "сорговидная" Форма метелки, очень толстая соломина и др. ), а также с признаками, которые вообще ранее не встречались среди селекционного материала и форм мировой коллекции (необычная окраска цветковых чешуй и веточек нетелки).

среди Форн, внешне ничем не отличающихся от исходных, найдены изменения, которые можно определить лишь специальными анализами, и некоторые из этих изненений могут быть полезными для селекции. Эксперименты подтвердили это предположение, так, среди регенерантов были найдены и последующим отбором закреплены, например. Формы с повышенным содержанием белка в зерне. У отдельных вариантных линий оно достигало ну. при в-9У. у исходного сорта.

Выход и спектр вариантных Форм не зависел от условий культивирования, в том числе от применяемых Фитогормонов, но

резко различался в зависимости от сортов риса. Нутанты получали как при применении обработки каллуса химическими мутагенами (ННН), так и без нее. Обработка каллуса мутагенами резко снижала его регенерационную способность.

Ежегодно проходили полевое изучение 600 линий регенеран-тов, полученных из каллуса риса. Наиболее интересные из них переданы в мировую коллекцию риса ВИР и коллекцию отдела селекции ВНИИ риса. Линии, представляющие непосредственный селекционный интерес, изучались в селекционных питомниках по типу контрольного и конкурсного сортоиспытания.

з. 9. культивирование соматических тканей риса. Проводились опыты по получению каллуса из различных органов растения риса. Каллус легко образовывался из прорастающих семян, кончиков корней, из молодых зародышей, стеблевых узлов и зачаточных метелок риса (7,6,15,28).

Регенерация из каллуса, образованного от сонатических тканей, шла значительно успешнее, чем из каллуса, возникшего при культивировании пыльников и достигала бох и выше; при этом лишь единичные растения были альбиносами, отмечены большие различия в способности к регенерации из соматических тканей в зависимости от сорта.

3. ю. Культивирование протопластов риса. Протопласты, лишенные стенки клетки, можно успешно использовать в генной и клеточной инженерии для соматической гибридизации, переноса выделенных генов, селекции сомаклональных и индуцированных мутагенами изменений, переноса органелл с целью модификации вне-ядерных генетических элементов, однако, регенерация интактных растений из протопластов, в особенности однодольных, долгое время была связана с пробленой - митотическим блоком на ранних стадиях культивирования протопластов. Усилиями биотехнологов нногих стран создан ряд методических схем получения жизнеспособных регенерантов из протопластов риса, кукурузы, ячменя и других злаков.

Целью нашей работы было получение жизнеспособных растений из протопластов отечественных сортообразиов, диких Форм риса, а также оптимизация условий эксперимента для повышения плотности протопластов при выделении и их митотической активности

на всех стадиях культивирования (20,21.22.24.27,31.37).

экспериментальный материалом служили зрелые зерновки диких Форм О. perennis. О. stapf11. О. rufipogon. зрелые и незрелые зерновки одной из краснозерных Форн риса, зрелые зерновки районированных сортов отечественной селекции Кулон и спальчик, пыльники коллекционных сортообразцов 14306 х КП-1352-67, ВЗ(Г8 х кулон).

3.10.1.Стериализадия эксплантатов, зрелые и незрелые зерновки поверхностно стериализовали о, Г/-нын раствором сулемы (незрелые зерновки механически извлекали из цветковой чешуи на стадии молочной спелости). Все асептические процедуры выполняли в условиях стерильного бокса.

3.10.2. Питательные среды для каллусных и суспензионных культур. Каллус из зерновок получали на агаризованной питательной среде Hurashlge and SKooe (HS)+В5-витамины, каллус из пыльников - на агаризованной среде Blayd.es,

з. Ю. з. инициация суспензионной культуры. 1-2 г каллуса помещали в конические колбы с 40 мл жидкой культуральной среды R2 или HS+В5-витамины и культивировали при 26е с (в темноте на роторной качалке 120 об/мин). В качестве Фитогормона использовали 2,4-Д. По данным опыта, мелкодисперсная суспензионная культура клеток имеет ряд преимуществ как источник протопластов: клетки суспензии не связаны тесно между собой, что облегчает доступ к ним энзимов при Ферментной обработке. Кроме того, непрерывной Фильтрацией (удалением крупных конгломератов клеток), субкультивированием (заменой части культуральной среды свежей порцией) удается резко повысить в клеточной популяции процент эмбриогенных клеток: мелких, быстрорастущих, с крупным ядром и плотной цитоплазмой, мелкими вакуоляни и с крахмальныни зернами, суспензия, состоящая из таких клеток, может продолжительно сохранять морфогенетический потенциал (способность к органо- или энбриогенезу) на высоком уровне, что необходимо для получения регенерантов.

Рост и жизнедеятельность клеточных суспензий многих генотипов риса инеют общую закономерность, сначала клетки быстро делятся и растут, удваивая сырую массу, что служит важным показателем скорости роста суспензионной культуры (время, необ-

холимое для этого, индивидуально для каждого генотипа), затеи культура замедляет рост, таким образом, кривая роста имеет экспоненциальный вид. По мнению многих авторов, начало Фазы замедленного роста - оптимальный период для получения протопластов.

3. 10. 4. Проверка норфогенетического потенциала суспензионной культуры. Перед выделением протопластов 2-3 мл клеточной суспензии помешали на поверхность агаризованных индукционных питательных сред с цитокининами (или смешивали клетки суспензии с подогретой до 50°С питательной средой, в связи с чем после застывания агара они оказывались в толше питательного слоя), в качестве индукционных сред использовали HS+BS-витами-ны и Кб с кинетином (5 нг/л) + КУК (1,5 мг/л). Культуры выращивали в условиях освещения, до начала образования корешков и побегов. Варианты без видимых проявлений морфогенеза выбраковывали.

3. 10. 5. Энзимная обработка "материнской" клеточной суспензии. Использовали коммерческие энзимы celluíase RS. Hacerozyme Rio. пектиназу 55, варьируя их количественное и качественное соотношение! РН Ферментной смеси 5,6-5,8 во всех вариантах. Приненяли также способ осмостабилизации протопластов для зашиты их от лизиса после разрушения ферментами клеточной стенки. В качестве осмолитиков, входивших наряду с Ферментными компонентами в состав Ферментной среды, служили следующие комбинации неорганических солей с сахарами или сахарными спиртами:CPW -соли + 13Х маннитола; CFW-соли + El* сахарозы; на-соли + о, ад глюко зы; W5 - с о ли.

з. ю. 6. Питательные среды для начального культивирования протопластов. Из-за осмотической нестабильности и опасности лизис первые 10-15 дней протопласты необходимо культивировать в условиях высокого осмотического давления. Поэтому использовали питательные среды с высоким содержанием источника углеводного питания: HS + В5-витамины + о, 4 Н сахарозы (мальтозы)í R2 + о,ад сахарозы (мальтозы); N6 + о, 4Н сахарозы. 146 пй глюкозы.

Изучали сравнительную эффективность сахарозы и мальтозы в качестве осмолитиков и источников углеводного питания клеток, Некоторые авторы отнечали преимущество мальтозы по срав-

нению с другими сахарами в стимуляции нитотической активности, а также процессов морфогенеза в культурах протопластов риса. В качестве Фитогорнона использовали 2.4-д (2 мг/л); рН 5,8-6,о во всех вариантах.

После ресинтеза протопластами клеточной стенки <5-7 дней) осмотическое давление культуральной среды постепенно снижали, чтобы избежать возможного неблагоприятного влияния плазмолиза на жизнедеятельность протопластов. Частоту деления протопластов, то есть отношение числа делящихся протопластов к общему числу высеянных в питательную среду, умноженное на 100, определяли на седьной день культивирования с помощью камеры Фукса-Розенталя, используя среднее значение из 5 проб,

3.10.7. Питательные среды для индукции морфогенеза в культуре протопластов, после достижения колониями протопластов 3-4 мм в диаметре их пересаживали на агаризованные питательные среды с цитокининами для индукции нороФогенетических процессов:

us + В5-витамины + 5 мг/л кинетина + 1,5 нг/л иук; ыб+5 мг/л кинетина + 1,5 мг/л иук. пробирки с морфогенным каллусом помещали в ростовую камеру (температура 28°с, влажность 70И, Фотопериод 12 часов), спустя 10-15 дней наблюдали начало Формирования органов интактного растения. Полученные регенеранты доращивали на аналогичных безгормональных питательных средах.

3.10.8. Результаты и выводы. Время, необходимое для приобретения суспензией мелкодисперсной структуры, состояния стабильного роста, индивидуально для каждого генотипа, под контролем которого, очевидно, находятся скорость деления и "организованность" роста клеток (табл. И). Клеточные суспензии, полученные от эксплантов с высоким содержанием керистемных клеток (быстроделяшихся, малодифференцированных) - пыльников, незрелых зародышей - стабилизировались быстрее, питательная среда не влияла на митотические процессы клеток суспензионных

культур.

При выборе генотипа - источника протопластов - мы руководствовались способностью клеточной суспензии сохранять мор-♦огенетический потенциал на высоком уровне, неснотря на длительное культивирование m vitro. (К сожалению, многие исследователи отнетили отрицательную корреляцию); временем, необхо-

Таблица 11

наступление стадии стабильного роста и морфогенетический потенциал суспензионных культур риса

генотип и тип экспланта Время до достижения стадии стабильного роста в питательной среде, не д. Возраст культуры, мес. Способность к норФогенезу

HS + В5- витамины R2

Краснозерный рис:

зрелые зерновки 4-5 4-5 6 ++

12 +

незрелые зерновки 3-4 3-4 6 4 +

12 + +

пыльники 2-3 2-3 3 + +

6 + +

12 + +

спальчик:

зрелые зерновки 4-6 5-6 6 + +

12 «

Кулон, то же 6 6 6 + +

12 +

0. perennls, то же 4-6 4-6 3 + +

6 *

12 . к

0. stapf 11, то же - - 3 +

6 «

12 *

0. ruflpogon, то же - - 3 с +

0 12 к к

14306 ХКП-1352-67 3-4 3 3 + +

6 + +

12 + +

вз (г8 x кулон), 2-3 2-3 3 + +

то же 6 + +

12 + +

Примечание: ++ - рост побегов;

+ - ризогенез;

* - разрастание каллуса без видиных проявлений морфогенеза.

димыи для достижения клеточной суспензии стадии стабильного роста; способностью суспензионной культуры сохранять мелкодисперсную структуру длительное время.

Исходя из этого, для получения протопластов отбирали суспензионные культуры генотипов зкспяантами для инициации которых служили пыльники и незрелые зерновки. Эти культуры до 12 месяцев сохраняли значительный норфогенетический потенциал и сравнительно быстро - за 2-4 недели -стабилизировались. V суспензионной культуры о. perennls стадия "стабильного" роста наступала спустя 4-6 недели после начала культивирования, а способность к норфогенезу пропадала уже через 6 месяцев непрерывного культивирования. Клеточная суспензия этой форны отличалась чрезвычайной мелкодисперсностью. конгломераты клеток не увеличивались более 1 мм в дианетре в течение всего периода жизнедеятельности культуры. у о. stapf11 и о. ruflpogon суспензия оставалась крупнодисперсной (конглонераты клеток более 1 мм), неснотря на периодическую Фильтрацию.

Из табл. 12 видно, что из сени питательных сред HS+ В5-ви-тамины + 0,4M сахарозы (мальтозы) оказала наибольшее стимулирующее влияние на митотическое деление протопластов, хотя и на других они делились с частотой, достаточной для Формирования колоний и получения каллуса, как осмолитик и источник углеводного питания мальтоза не инела преимуществ по сравнению с сахарозой и глюкозой. Протопласты трех Фори, клеточные суспензии которых получены из пыльников, делились более интенсивно независимо от вида культуральной среды. Очевидно, что при выборе экспланта предпочтение следует отдавать растительным тканян с высоким содержанием меристемных клеток.

Таким образом, суспензионные культуры риса позволяют получать протопласты с высокой плотностью, способные к Формированию каллусных масс и интактных растений.

3.11. Гистологическое исследование развития каллуса, в пыльниках делящиеся микроспоры и Фигуры митоза отмечены на в-й день. На ю-й день микрокаллус в стадии 16-32 клеток, масса его нарастает, на 12-й день микрокаллус достигает размеров о. 1-0, 2 мм (36).

В стадии микрокаллуса его клетки с интенсивно окрашенным протопластом и крупным ядром относятся к меристеноидному типу.

таблица 12

Частота деления протопластов некоторых Форм риса, '/• (х + Бх)

сор та Культуральная среда

НБ + В5-витамины+ о, 4Н сахарозы ИЙ + В5-витамины+ 0, 4Н мальтозы Е2 + 0, 4Н сахарозы Кг + 0.4Н мальтозы General + 0,4Н сахарозы General+ 0, 4М мальтозы N6 + 0, 4Н сахарозы+ 146Н глюкозы Среднее

1 21, 75+0, 89 22, 30 + 0, 87 20. 10+0, 85 18, 28+0, 59 20, 50+0, 55 19,78+0, 96 17,88+1,47 20, 08

2 27,72+0, 56 26,45+1,00 25,05+0, 50 23, 70+0, 72 24, 28+0,45 25,08+0, 6? 25, 10+0, 50 25, 34

3 22,65+0, 17 23, 70+0, 21 21.49+0,08 21,05+0,48 20, 95+0, 36 20,00+0, 16 19, 69+0, 60 21, 39

4 17, 22+0, 86 17, 95 + 0, 85 16. 53+0, 82 15, 39+0, 67 15, 30+0, 79 15, 85+0, 81 15,04+0, 50 16, 18

Примечание: 1,2,3,4 - генотип и тип эксплантата;

1 - краснозерный рис,пыльники; 2 - 14306 х КП-1352-67, пыльники; 3 - ВЗ (Г8 х Кулон),пыльники; 4 - О. регепп1э, зрелые зерновки.

- 33 -

На 16 день в ткани каллуса начинается диФФерендировка на меристему, внутреннюю и наружную паренхиму.

Образовавшийся комочек меристемных клеток каллуса быстро и неудержимо распространяется во все стороны. Клетки активно делящейся зоны располагаются непрерывным пластом, оттесняя слои наружных клеток, которые видоизменяются в наружную рыхлую, пронизанную межклетниками, паренхиму. Клетки ее крупные, часто вытянутые, червеобразной Формы, с вздутиями в середине, тонкими стенками и небольшим ядром. Наружная паренхима предохраняет каллус от высыхания, не препятствуя газообмену.

Гистохимически клетки наружной паренхимы активны, они выделяют на поверхности каллуса слизь, в состав которой входят низкомолекулярные белки и углеводы.

При достижении комочком каядусной ткани некоторых размеров. непосредственное всасывание питательных веществ затрудняется, группы клеток, находящихся в центре, перестают активно делиться, увеличиваются в размерах. С этой стадии начинается их диФФерендировка в опорную ткань, а затем Формирование из опорных элементов проводящей ткани. В идеале каллус должен развиваться в виде полусферы, основание которой лежит на питательной среде. Однако, развитие проводящих элементов случайно, в отдельных, более снабжаемых участках происходит более интенсивный рост меристемы, образуются выступы - протуберанцы. Формирование проводящих элементов происходит радиальными пучками, идущими от места контакта с питательной средой к периферии протуберанцев с активными меристенатическими зонами, клетки основной паренхимы удлиняются, происходит их диФФерендировка в ксилемные и Флоэнные элементы. Первичная флоэма дифференцируется в ситовидные трубки, а ксилена в элементы с лестничной поровостью стенок, там. где более развита проводящая ткань, отмечены активные зоны быстро растущей меристемы протуберанцев и вторичные зоны промежуточной меристемы, первоначальный сплошной пласт меристемы дробится на участки с различной ростовой активностью. Протуберанцы могут иметь Форму простых удлиненных выступов, либо грибовидную Форму с множественными очажками активности. Гистохимически в активных зонах выявляется высокое содержание нуклеиновых кислот и белков.

Энбриогенный каллус закладывает на краю протуберанцев очажки-инициали, которые превращаются в эмбриоиды стебля либо корня. ДиФФеренцировка тканей эмбриоидов происходит быстро, часто наблюдаются множественные эмбриоиды, особенно при преимущественном ризогенезе. Ткани каллуса дифференцируются в структуры, напоминающие корнеродную зону стебля, среди клеток, похожих на совокупность клеток образовательной ткани - пери-цикл, закладываются единичные и множественные зачатки, аналогичные корневым кармашкам. Активные зоны таких зачатков, как и растущие корни, образуют настоящие корневые структуры с корневым чехликом и тканями корня.

Из подобных зачатков-инициалей каллуса дифференцируются образовательные ткани стебля. ДиФФеренцировка эмбриогенных структур в стебель происходит как у обычного растения - закладывается вегетативный конус нарастания (почечка) в виде бугорка меристемных клеток, на поверхности которых образуются валики, зачатки 1 и г листа. Почечка лежит в чехлике из рыхлых клеток - в колеоптилеподобной структуре. Поперечные и продольные срезы эмбриоидов стебля сходны по строению с таковыми у обычного растения риса.

Развитие каллусной ткани из диплоидного и гаплоидного материала морфологически одинаково.

3. 12. Цитонетрия гаплоидных клеток риса. Для подсчета чисел хромосом у растений-регенерантов риса применялась нетоди-Накино (Иакто, 1975). при этом обрезанные кончики нолодых корней длиной 5 мм погружали в дистиллированную воду и выдерживали в течение 15-24 часов при температуре 6-6"С, что очень важно для накопления метаФазных пластинок. Затем корешки Фиксировались ацетоалкоголен (1:3) с добавлением О.5х хлорного железа. Окрашивание производилось в ацетокармине в течение 24 часов. Хромосоны подсчитывались на давленных препаратах под покровным стеклом, нами впервые были получены фотографии хромосом риса.

Для определения Фертильности пыльцы пыльники Фиксировались в 70*-нон спирте. Затем пыльник раздавливался на преднет-ном стекле, пыльца окрашивалась слабым раствором йода в йодистом калии. При просмотре под микроскопом фертильная пыльца имела черный цвет, а стерильная оставалась прозрачной.

стадия развития пыльцы определялась по методике, разработанной нами, для этого в нижней, верхней и средней частях метелки тонким пинцетом, минимально нарушая листовую обертку, брались пробные колоски. Пыльник дробился стеклянной палочкой в капле дистиллированной воды на предметном стекле. Стенки пыльника удалялись препаровальной иглой. Затем препарат просматривался под микроскопом (объектив 60/0,17) в зеленом свете. При этом видна картины пыльцы с вакуолью, ядром и плазмой, а при окраске и накрывании пыльцы покровным стеклом эта картина нарушалась (35).

з. 13. культура тканей цицании. После риса цицания (г1гап1а 1а-и:£о11а) в трибе Рисоподобных имеет наибольшее значение. Индейцы северной Америки использовали зерновки дикорастушей цицании в пишу, в настоящее время промышленные посевы этого злака имеются в США. Его зерно смешивают с рисовым для придания аромата.

Зерновки дипании служат хорошим кормом для животных и водоплавающей птицы, вследствии чего это растение рекомендуется разводить в охотничьих хозяйствах.

В Японии и Китае кроме зерна в пишу употребляются молодые побеги и основания стебля этого многолетника.

в Краснодарском сельскохозяйственном биоцентре цицания изучается в течении последних двух лет (30). в сосудах и лизиметрах наблюдается ее очень быстрый рост даже без подкормки азотным удобрением, мощная корневая система почти полностью занимает обьен сосудов, вытесняя из них почву.

Высота растений достигает 165-190 см. Быстрый рост вегетативной массы связан с активностью эндогенных гиббереллинов, Они обуславливают так же длинную метелку (от 26 до 48 см).

Колоски с мужскими и женскими цветками располагаются в пределах одного соцветия, в процессе созревания зерновки легко осыпаются, что затрудняет их сбор.

С целью создания неосыпашихся Форм цицании и введения ее в культуру в биоцентре проводятся исследования по культуре тканей и клеток последней (29).

Эксплантани служили молодые листочки из узлов кущения, сами узлы и зачаточные метелки, которые предварительно стерилизовались в О, и растворе сулемы. Для каляусогенеза использо-

-зевалась среда Блейдса с 2 нг/л 2,4-Д. почти в каждой из 410 пробирок образовался халлус. Пассирование каллуса на регенера-пионную среду Иурасиге и скуга с 5 нг/л кинетина и 1 мг/л оС-НУК не дало положительного результата. На 3-4 день каллус зеленел, но через 10-15 дней темнел и некротизировался. Не было получено ни одного регенеранта.

4. ВЫВОДЫ

1.Нетод культуры изолированных пыльников является эффективным способон стабильного получения андрогаплоидных растений риса, удобным для использования в практической селекции. Процесс Формирования гаплоидов и гомозиготных линий из пыльников в культуре проходит через каллусогенез.

2.Оптимальной для развития пыльника в культуре m vitro является стадия одно-двуядерной пыльцы.

3.Установлено наличие широких колебаний потенциальных возможностей генотипов при каллусогенезе и морфогенезе, средняя частота каллусообразования у различных генотипов варьировала от 2,6 до зох. на реализацию потенции генотипов к каллу-согенезу и морфогенезу влияли: стадия микроспор, состав питательных сред, предобработка пониженными положительными температурами.

4. Показано, что плоидность регенерантов зависит от возраста каллуса, полученного из пыльников, каллус го-зо-дневного возраста на регенерирующей среде образует в основном гаплоидные растения, 50-60-дневный - диплоидные. Регенерационная способность каллуса снижается в процессе его культивирования на дедифференоируюшей среде.

5. отрицательным номентом метода является регенерация из пыльцевого каллуса альбиносных растений. Впервые установлено, что карликовые линии риса с заблокированным синтезом эндогенных гиббереллинов являются источником повышенного выхода зеленых регенерантов.

6. При диплоидизации гаплоидов предпочтительнее использовать культивирование гаплоидной ткани в пробирочной культуре на соответствующей питательной среде для каллусо- и органогенеза, чем метод колхшшнирования,приводящей к большой гибели

гаплоидных растений.

7. Растения реституционных линий гибридов проявляли высокую константность по комплексу хозяйственно ценных признаков.

8.На основе культуры тканей, экспериментальной гаплоидии разработана технология использования андрогаплоидного метода в селекции риса, программа позволяет в 2-3 раза ускорить темпы получения константного материала из гибридов по сравнению с обычными методами селекции.

9. Нетод культуры тканей и клеток может успешно применяться для полиплоидизацш риса.

10. Эксплантом для получения каллусных и суспензионных культур, предназначенных для выделения протопластов, могут служить ткани с меристемными клетками (кончики корней проростков, пыльники, незрелые зерновки).

11. Показано, что лучшим источником получения протопластов риса являются мелкодисперсные суспензионные культуры.

12. На выход протопластов риса влияют состав питательных сред, структура "материнской" клеточной культуры, условия ее ферментной обработки, способ осмостабилизации протопластов.

13. При обработке клеточных суспензий деллюлитическями ферментными препаратами, оптимальная суммарная концентрация их равна 5'/.. а оптимальная экспозиция в фернентном растворе - 3 часа.

14. При ресинтезе клеточной стенки и первых митотических делениях культивирование протопластов из-за возможного лизиса необходимо проводить в условиях высокого осмотического давления.

15. Лучшие питательные среды для индукции морфогенетичес-ких процессов в культуре протопластов риса - НЭ + В5-витамины или Нб с цитокининами.

16. Получены регенеранты из протопластов риса.

17. разработана и внедрена в практическую биотехнологию риса питательная среда для культивирования пыльников интенсифицирующая образование каллуса.

18. Подана заявка в Госкомиссию по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур России на сорт риса хенчуг (селекционный нонер ВНИИР гюз).

- зв -

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Рекомендуется, наряду с традиционными методами селекции, использовать для ускоренного получения гомозиготных линий метод культуры пыльников.

г. предлагается получение дигаплоидных линий, минуя гаплоидную фазу, используя спонтанную диплоидизадию в культуре ткани.

3. При получении тетраплоидов риса рекомендуется использовать метод полиплоидизации в культуре m vitro как более эффективный, чей метод колхицинирования.

4. эксплантон для закладки суспензионных и каллусных культур рекомендуется использовать растительные ткани с высоким содержанием меристенных клеток.

5. лучшим источником получения протопластов являются мелкодисперсные клеточные суспензии с высоким норфогенетическим потенциалом.

6. Предлагается нетодика получения интактных растений из протопластов риса.

6'. НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО НАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харченко п. Н. Полиэмбриония у сортов риса Краснодарский 424 и Кубань 3//БЮЛ. НТИ ВНИИ РИСа. 1974. ВЫП. XII. С. 6-7.

2. Кучеренко л. А., Харченко п. Н. Использование метода культуры тканей в селекции риса//Сельское хозяйство за рубежом.

1975. КН. С. 20-21.

3. Кучеренко Л. А., харченко П. Н., давоян э. И. О получении всходов из шуплых семян риса на питательных средах// Бюл. НТИ ВНИИ риса. 1975. ВЫП. XVI. С. 3-5.

4. харченко П. Н.,Кучеренко л. А. Получение растений риса из пыльник0в//Д0КЛ. ВАСХНИЛ. 1977. Н4. С. 15-16.

5. харченко п. Н. Получение растений риса из пыльников гиб-ридов//Теоретические вопросы регенерации растений. - Махачкала,

1976. С. 49-50.

6.Харченко П. Н., Кучеренко Л. А. Культивирование пыльников риса//Апониксис и цитоэмбриология растений. -Саратов:Изд-во Са-

- 39 -

рат. универ., 1976. Вып. 4. С. 119-120.

7. Кучеренко Л. А., Харченко П. Н. .Давоян Э. И. Использование культуры изолированных органов и тканей в селекции риса// Вест, сельскохоз. науки. 1979. НЮ. С. 116-119.

6. Кучеренко Л. А.. Харченко П. Н., Давоян Э. И. О возможности применения методов культуры изолированных органов и тканей в селекции риса//Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. -Н. '.ВАСХНИЛ, 1979. С. 31-38.

9. харченко П. Н. использование метода культуры пыльников в селекционном процессе//Тез. докл. конф. молодых ученых. Краснодар, 1979. С. 4.

Ю.Алешин Е. п. ,Харченко П, Н.,Парашенко В. Н. Советы молодых ученых//Зерновое хозяйство, 1980. Н11. с. 34-36.

11. Харченко П. Н., Парашенко в, Н., Громов В. С., Сергеев А. И. / Рабочий дневник молодого рисовода. Краснодар, 1980.

12.Харченко П. Н. Влияние ростовых веществ на каллусогенез из пыльников риса и органогенех из пыльцевого каллуса// тезисы докл. I всесоюзн. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Носква. Наука, 1981.

13.Харченко п. н. .Шиловский в. н. Использование метода культуры пыльников в ускорении селекционного продесса//Докл. ВАСХНИЛ. 1962. n9. С. 24-25.

14. Харченко П. н. Индуцирование растении из пыльцевого каллуса гибридного происхождения с целью получения гомозиготных Форм для селекции//Тезисы докл. IV Всесоюзн. конф. по биотехнологии "Культура клеток растений и биотехнология", Кишинев:штиин-ца, 1983. С. 155-156.

15. Кучеренко Л. А., Харченко П, Н., Ковалева Е. Н. Использование методов биотехнологии в селекции риса//Состояние и развитие с. -х. биотехнологии. Натер. Всесоюзн. конФ. -носква, июнь 1986. -Л. , 1986. С. 92-96.

16. Алешин Е. П. , Харченко П. Н., Кучеренко л. А. , Авакян Э. Р. , Алешин Н. Е. Исследования по биотехнологии и молекулярной биологии риса// Тез. докл. Неждун. совещания по сельскохоз. биологии. Краснодар. Краснодарский с. -х. биотехнологический центр. 1988,С. 3 -4.

17. Красникова о. В. .Авакян э. Р., Алешин Н. Е., харченко П. н., Алешин Е. П. Генетические аспекты решения проблемы повышения

выхода хлорофильных пыльцевых регенерантов РИса//Докл. ВАСХНИЛ. 1991. Н4. С. 13-14.

18. Харченко П. Н., Алешин Н. Е. . Авакян Э. Р. , Алешин Е. п., Воронков И. Г. питательная среда для культивирования пыльников риса. Авторское свидетельство Н1678256. открытия, изобретения. 1991. Н35. С. 8(2).

19. Харченко П. Н, Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П., Воронков И. Г.Питательная среда для культивирования пыльников. Патент Н 1678256 от 15.04.1993.

20. Мухина X. м., харченко П. Н.. Алешин н. Е. сравнительная оценка суспензионных и каллусных культур в качестве источников получения протопластов риса//Рис России. 1996. т. 4. Н2(7). с. 1-2.

21. Нухина х. M., Харченко п. Н. .Алешин н. Е. изучение интенсивности морфогенетических процессов в культурах протопластов риса//рис России. 1996. т. 4. Н2(7). с. 3-5.

гг. Мухина X. м.,Харченко п. Н. Нетодика получения регенерантов из протопластов риса//Рис России. 1996. НЗ (8). т. 4. с. 59.

23. просветова н. ю., Харченко п. н. БИотехэкономика//Рис России. 1996. Т. 4. НЗ (8). С. 44.

24. Нухина X. Н., Харченко П. Н., Алешин Н. Е. О перспективах генной инженерии на рисе// Научно-технический прогресс в сельской хозяйстве Северного Кавказа.-Майкоп, 1996. С. 11.

25. Колесников г. П., Шундрина Л. А., харченко п. н. Физиологические особенности гонозиготных линий риса, полученных методой культуры пыльников/Научно-технический прогресс в сельском хозяйстве Северного Кавказа. -Майкоп, 1996, с. 10.

26. Барсуков д. А., харченко п. н., Алешин н. Е. Гетерозигот-ность сортов риса по высоте/Научно-технический прогресс в сельском хозяйстве Северного Кавказа.-Майкоп. 1996. с. 22.

27. Мухина х. м.. харченко п. н.. Алешин Е, п., Алешин н. Е. Регенерация растений из суспензионных культур риса(Огуха sativa L.) /ДОКЛ. РАСХН. 1996. Н4. С. 18-20.

28. Харченко п. Н., Савенко Е. г., Датта п., Кумар д. диплоиди-зация гаплоидов риса//Рис России. 1997. Т. 5. Н5( 13). С. 3.

29.харченко п.н., Прокопенко в.В., Глазырина В.А., Алешин н. Е. культура тканей ципании m vitro//pnc России. 1997. т. 5. Н4(12). С. 18

- 41 -

30. Харченко П. Н., Глазырина В. А., Алешин Н. Е.. Прокопенко В. В. Перспективы возделывания цицании на КУбани//Рис России. 1997. Т. 5. Н4. С. 17

31. Нухина *. И., Харченко П. Н. О перспективах клеточной инженерии риса//Рис России. 1997.Т. 5.Н5(13).С.12.

32.кумар д., Харченко П. н..Барсуков д. А. Полиплоидизация пыльцевого каллуса риса в зависимости от длительности его культивиРования//Рис России. 1997. Т. 5. К5(13). С. 4,

33. Харченко п. Н., Скаженник И. А., кунар Д., Датта П.. Барсуков А. Д. Анатомо-морфологическая и Физиологическая характеристика гаплоидов риса//Рис России. 1997. Т. 5. Н5 (13). С. 5.

34. Харченко П. Н..Барсуков Д. А.. Прокопенко В. В. некоторые особенности регенерации растений риса из пыльцевого каллуса// Рис России. 1997. Т. 5. Н5( 13). С. 2.

35. Харченко П. Н. Власов в. Г. , Алешин Н. Е. Питометрия гаплоидных клеток риса//рис России. 1997.т. 5. Н5(13). с. 7,

36.Харченко П. н.. Власов в. Г. , Алешин Н. Е. гистология развития каллуса из пыльников и зерновок риса//Рис России. 1997. т. 5. К5 (13). С. в.

37. Харченко П. н. .Нухина X. И.. Получение регенерантов из протопластов риса//Рис России. 1997.т. 5. Н5(13). с. 11.

7. ПРИЛОХЕНИЕ

Официальные сообщения об использовании охраноспособных результатов диссертации:

1. Приказ от ВННИриса Н232-0К от 30. 12.1993 (итоги внедрения в 1993г. "Питательной среды для культивирования пыльников риса"-п. К1678256);

2. Приказ по ВНИИРиса N18 от 20.02. 1995г»(Итоги внедрения в 1994г. патента Н 1678256);

3. Приказ по ВНИИриса НЮ-Л от 26.01. 199бг. (Итоги внедрения в 1995г. патента Н1678256).

4. Уведомление госкониссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений о приеме заявок на допуск к использованию и выдачу патента на сорт риса хенчуг. Заявка Н29868 от 05. 12. 1996. код сорта 9607943.