Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Сомаклональная изменчивость пшеницы и её использование в селекционно-генетических исследованиях

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Сомаклональная изменчивость пшеницы и её использование в селекционно-генетических исследованиях"

Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В.Р.Вильямса

РГ6 од

7;, На правах рукописи

ЖУМАБАЕВА БЕЙБИТГУЛ АКИМАЛИЕВНА

СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПШЕНИЦЫ И ЕЕ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

Специальность 06.01.05- Селекция и семеноводство 03.00.23- Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п.Алмалыбак-1996 г.

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии Казахского НИИ земледелия им. В.Р.Вильямса и в лаборатории клеточной инженерии Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А.Айтхожина.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент КАСХН О.Ш.Шегебаев

доктор биологических наук М.К.Карабаев

Ведущая организация Казахский сельскохозяйственный институт.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент НАНРК Р. И. Берсимбаев

кандидат сельскохозяйственных наук М.С.Кудайб^ргенов.

. Затта диссертации состоится " 1996 г. в

"/ 7 часов на заседании специализированного совета Д 55.05.01 при Казахском научно-исследовательском институте земледелия им. В.Р.Вильямса по адресу: 483133, Алматинская область, Каскеленский район, п.Алмалыбак, КазНИИЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан

«¿г,. ^¿¿и . 1996 Г.

Ученый секретарь специализированного совета, д /Т^у .

доктор биологических наук £ с.Б. Рамазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Успех селекционной работы и ее эффективность во многом определяется разнообразием форм исходного материала и его пригодностью для ведения селекционных работ в конкретной зоне. В последние годы традиционная селекция обогатилась новыми вспомогательными методами создания исходного материала. Один из них основан на использовании культивируемых клеток растений. Генетические изменения культивируемых клеток и регенерированных из них растений делают возможным улучшение существующих сортов. Культивирование соматических клеток in vitro расширяет возможность увеличения частоты и спектра мутации. Высокая степень изменчивости растений-регенерантов, имеющей важное сельскохозяйственное значение, установлены у пшеницы (Larkin et al., 1984; Cooper et al., 1986), кукурузы (Edallo et al..1981), сорго (Ma Hontu, Hang, 1985), риса (Oono, 1981; Давоян,1983) и др. Сомаклональная вариабельность позволяет существенно повысить генетическую изменчивость растений и, тем самым, возможность отбора.

Вместе с тем, успешное применение сомаклональной вариации в селекции ограничивается, с одной стороны, отсутствием эффективных методов регенерации растений в культуре in vitro, с другой - недостаточной изученностью этого явления. Для решения данной проблемы важное значение имеет изучение факторов, влияющих на интенсивность каллусообразования и регенерации растений, наследуемости изменений, обусловленных стадией неорганизованного роста культуры клеток.

Для направленного улучшения некоторых признаков (устойчивость к болезням, вредителям и неблагоприятным факторам среды) пшеницы еще слабо разработаны методы культуры клеток. Одной из перспективных клеточных систем являются суспензионные клеточные культуры, которые уже хорошо зарекомендовали себя в биотехнологиях для многих растений. Однако потенциальные возможности суспензионной культуры клеток для злаковых растений остаются все еще нереализованными. Прежде всего необходимо определить условия получения активно пролиферирующих эмбриогенных клеточных суспензий.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ. Цель настоящего исследования - изучение сомаклональной изменчивости селекционных признаков и условий

суспензионного культивирования клеток пшеницы для использования их в биотехнологиях.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние генотипа донорных растений и эпигенетических особенностей эксплантов на регенерационную способность пшеницы в культуре in vitro.

2.Изучить особенности сомаклональной изменчивости селекционных признаков растений, регенерированных в культуре in vitro, исследуя: а) количественные признаки (структурные элементы продуктивности и устойчивости растений к полеганию); б) устойчивость к видам ржавчины:

3. Изучить компонентный состав запасных белков (глиадина и глютенина) линий-регенерантов, а также поведение хромосом при мейозе в материнских клетках пыльцы.

4. Получить суспензионную культуру клеток пшеницы и определить факторы, влияющие на интенсивность ее роста.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. На обширном материале изучены влияние генотипа и экспланта на кал-лусогенез и морфогенетический потенциал культивируемых клеток пшеницы. Изучена зависимость этих процессов от плоидности пшеницы. Впервые для селекционного использования получены расте-ния-регенеранты из константных линий яровой мягкой пшеницы.Показана генотипическая зависимость сомаклональной изменчивости по элементам продуктивности (высота растений, длина колоса, масса зерен с одного растения). Выделены 7 сомаклональных линий пшеницы, характеризующиеся изменением хозяйственно-ценных признаков (устойчивые к видам ржавчины и продуктивные) для селекционного использования. Изучены условия получения активно пролиферирующих клеточных суспензий для сорта Казахстанская-Ю (Тг. aestivum).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены и представлены на отчетных сессиях аспирантов КазНИИЗ (1988 -1990 г.г.), на сессии Научного совета Казахстанского отделения ВОГиС им. Н.И.Вавилова "Физиолого-генетические основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений" ( Алматы,1988 ), на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы,1988), на Международном симпозиуме "Клеточные и генные биотехнологии для зерновых злаков" (Ал-

маты, 1989), на Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград,1991), на Республиканской научно-практической конференции Актюбинской сельскохозяйственной опытной станции "Пути увеличения производства и улучшения качества сельскохозяйственной продукции в Казахстане" (Актюбинск, 1992).

ПУБЛИКАЦИИ.По теме диссертационной работы опубликовано 10 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и предложений для практической селекции, списка литературы из 201 наименования, в т. ч. 126 на иностранных языках. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц и 14 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исходным материалом по изучению влияния генотипа на каллу-согенез и регенерацию служили мягкие сорта ("Казахстанская-3", "Казахстанская-9", "Казахстанская-10", "Карлыгаш", "Алма-Атинская полукарликовая"), константные линии F5: "Мутант 1x13671" и F5 "14364хГрекум 476",твердый сорт "Казахстанская янтарная" и виды пшеницы (Тг. timopheevil и Тг. monococcum). Для изучения сома-клональной изменчивости использовали линии F5 "Мутант1х13671" и "14364хГрекум 476". В экспериментах по суспензионному культивированию клеток использовали сорт "Казахстанская-10".

Донорные растения и растения-регенеранты выращивали на орошаемом селекционном участке и в теплицах Казахского НИИ земледелия.

В экспериментах по культивированию In vitro эксплантов из различных органов и тканей пшеницы нами были использованы общие методические приемы, описанные в монографиях Р.Г. Бутенко (1964) и Ф. Л. Калинина с сотр. (1980), с некоторыми модификациями, принятыми в лаборатории клеточной инженерии Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина.

В качестве эксплантов использовали зародыши, изолированные из зрелых семян и из семян через 10 - 24 дней после опыления, а также корни, вычлененные из проростков недельного возраста.

Растительный материал стерилизовали по 1 мин в 75 %-ном растворе этанола и в 0,1 %-ном растворе сулемы, трижды промыва-

ли стерильной дистиллированной водой и в асептических условиях помещали'на питательную среду щитком вверх. Культивирование проводили при температуре 23±2°С, в темноте. Первый пассаж с вычленением инициалий проводился через 16-20 дней после помещения эксплантов на среду для культивирования. В качестве базовой питательной среды использовали среду Мурасиге-Скуга (1962) с добавлением 2,4 Д (дихлорфеноксиуксусной кислоты).

Для регенерации растений зоны морфогенеза с прилегающими участками каллуса переносили на среду, содержащую 1 мг/л индо-лил-3-уксусной кислоты и 1 мг/л кинетина, культивировали на свету. Побеги, достигшие 4 -¡- 5 см на среде для регенерации, пересаживали на среду для укоренения. По мере роста проростки высаживали в вегетационные сосуды с почвенной смесью ( 3 части почвы + 1 часть песка ) и выращивали до полного созревания в теплице.

Суспензионная культура. Для получения клеточной суспензии и изучения поведения отдельных клеток использовали каллусы, полученные из незрелых зародышей. Техника получения клеточных суспензий заключалась в переносе кусочков каллуса с агаризован-ной питательной среды в жидкую и выращивании еб на качалке (120 об/мин). Каллусы помещали в колбы ёмкостью 250 мл с питательной средой 25 мл. При первом переносе на свежую среду удаляли крупные агрегаты клеток. Через каждые 5-7 дней суспензионную культуру пассировали на свежую среду с расчетом, чтобы соотношение объёмов "старой" и свежей среды поддерживалось в пределах 3:1.

Состояние суспензии оценивали по количеству клеток в единице объема и морфологическим особенностям клеток. Подсчет клеток производили в камере Горяева. Для оценки жизнеспособности клеточной популяции использовали метод окрашивания препаратов О,5 %-ньш раствором синей Эванса (Wldholrn, 1972). Подсчет клеток и изучение суспензионных и каллусных культур проводили при помощи инвертированного микроскопа (Biostar, Reichert Young, Austria).

Число клеток подсчитывали по формуле: х=(Мх1000):3,2храз-ведение, где х-число клеток в 1 мл, М - среднее число из 6-ти повторностей количества клеток в камере. При появлении крупных агрегатов подсчёт клеток в суспензии весьма затрудняется.В этом случае суспензию разводили и проводили мацерацию клеточных аг-

регатов. Все эксперименты проводили минимум в 3-х повторностях.

Изучение сомаклонов пшеницы. Для выявления сомаклональной изменчивости оценивали селекционно-важные признаки регенеран-тов, полученных в культуре клеток из незрелых зародышей двух гомозиготных генотипов F5 ("Мутант 1x13671" и "143б4хГрекум 476"): высота растения, продуктивная кустистость,длина главного колоса, число колосков и зерен с главного колоса, масса зерен с одного растения.

Все данные проведенных исследований обработаны математи-ко-статистическими методами по Доспехову (1985). Данные структурного анализа урожая Р2 - Р5 обрабатывали на ЭВМ Mera Coman 125/Sm-4 (Польша) при помощи пакета "Диана", разработанного на языке Фортран-4.

Устойчивость к видам ржавчины растений-регенерантов определяли совместно с лабораторией иммунитета растений КазНИИЗ.

Исследование электрофоретического спектра глиадина у реге-нерантов пшеницы было проведено в лаборатории физиологии и биохимии растений КазНИИЗ.

Для изучения мейоза в материнских клетках пыльцы регене-рантов отбирали один или два боковых колоса с каждого растения, фиксировали в охлажденном фиксаторе Ньюкомера, окрашивали аце~ токармином. Проводили изучение нескольких стадий мейоза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Геноштческие и эпигенетические особенности каллусоге-неза и регенерации растений в культуре in vitro пшеницы.

При изучении культуры in vitro пшеницы основное внимание было уделено генотипическим и эпигенетическим особенностям образования каллуса и регенерации из них растений. Показано, что генотип в пределах изученных нами видов не оказывает заметного влияния на частоту каллусогенеза. Основная часть изученных генотипов, относящихся к четырём видам пшеницы, продуцировали каллус с высокой частотой.. При этом различия по каллусообразованию в зависимости от экспланта варьировали от 100 % до 80 %. При оценке интенсивности роста каллуса отмечено, что различия, проявляемые на уровне принадлежности к различным уровням плоиднос-ти, менее выражены, чем различия, проявляемые на уровне сорто-

образцов одного вида. Причем по интенсивности роста каллусы-из первичных корней уступали каллусам из незрелых зародышей, т.е. существует выраженная зависимость роста каллуса - от типа экс-планта.

При анализе образования морфогенных каллусов установлено, что на их частоту существенное влияние оказывает генотип донор-ных растений, тип экспланта и условия культивирования (рис.1а). Например, размах выхода морфогенных каллусов из незрелых зародышей в зависимости от генотипа колеблется от 25 % до 60 %, у зрелых зародышей от 8 % до 25 % и у корней от 4 % до 12 %. Самый высокий процент образования морфогенных каллусов наблюдали у линий F5 ("Мутант 1x13671") и F5 ("14367хГрекум 476") и у озимых сортов "Карлыгаш" и "Алма-Атинская .полукарликовая". Из наших исследований следует,- что сорта мягкой (гексаплоидной) пшеницы с большей частотой формируют морфогенные культуры, чем пшеницы другой плоидности,. :что свидетельствует о влиянии уровня плоидности.растений на степень проявления,ими.морфогенетическо-го потенциала в культуре in vitro.

Было выяснено, что добавление 20 мг/л триптофана в культу-ральную среду увеличивает/выход морфогенных каллусов. Эти данные являются одной из иллюстраций существенного влияния1 компонентов среды на формирование морфогенных каллусов.

Более значительное .влияние уровня плоидности генотипа установлено при изучении стеблевого органогенеза и регенерации растений (рис. 16). Если по частоте регенерации, растений из каллусов незрелых зародышей самый большой процент показали представители мягкой пшеницы (F5 "Мутант 1x13671" - 43,3 %; Е5"14364хГрекум 476"-40,0%;. "Карлыгаш" - 39,2 % и др.), то низкий выход регенерации был у "Тг. monococcum" (10 %). Процент стеблевого органогенеза из зрелых зародышей значительно ниже, чем из незрелых зародышей. Распределение'-генотипов по признаку интенсивности стеблевого органогенеза из каллусов зрелых зародышей аналогично с данными, полученными для незрелых зародышей. Способность культуры клеток регенерировать растения сильно зависит от эпигенетических особенностей зксплантов". Так, , -например, очень трудным оказалось индуцировать этот процесс на/ морфогенных каллусах первичных корней.

По количеству полученных растений-регенерантов среди гено-

4 у л-л. с а £ л. г г «. г й. г ^

Рис!.А. Частота образования морфогенных каллусов ( % от общего числа проанализированных) из различных эксплантов пшбницы. а-ерелые зародыши, б-незрелые зародыши, в-корни. 1. Казачстан-скзя-3; 2. Казахстанская-10; 4. Карлыгаш; 5. Алма-Атинская полукарликовая: б. Р5(14364хГрекум 476); 7. Р5(Мутант 1x13871); 8. Казахстанская янтарная: Э. Тг. 'ЫггорЬееуП; 10. Тг. топососсигп.

Б. Частота стеблевого органогенеза в каллусач из зрелых я незрелых зародышей. Обозначения как на рис.А.

типов лучшие результаты были выявлены у константных линий яровой мягкой и у озимых сортов пшеницы.

Таким образом, изучение факторов, влияющих на интенсивность каллусообразования и регенерации растений свидетельствует о генетической природе морфогенетических реакций в культуре in vitro. В то же время факты указывают, что генотип реализуется в конкретных условиях внешней среды и, подбирая условия культивирования, можно выявить его потенциальные способности к каллусо-генезу и регенерации растений.

2. Изменчивость селекционно-генетических признаков расше-ний-регенерантов пшеницы. В данной части работы представлены результаты исследований, в которых основное внимание уделено изучению соотношения наследуемых и ненаследуемых изменений, выделению наиболее вариабельных признаков.

Было проведено изучение растений, регенерированных в культуре клеток из незрелых зародышей двух линий Г5"Мутант 1x13671" и "14364хГрекум 476". В первом поколении (Р1) было отмечено появление различных морфологических изменений у некоторых расте-ний-регенерантов: ветвистые, булавовидные колосья. Регенеранты первого поколения также отличались от растений' исходной формы высокой гетерогенностью по высоте,размеру и плотности колосьев, длине междоузлий. Кроме того, в первом поколении (Р1) у линии "Мутант 1x13671" около 15 % регенерантов оказались частично стерильными.

Для определения наследуемости изменений у растений-регене-рантов проводили анализ поколения Р2, полученного от самоопыления растений Р1. К ненаследуемым изменениям у регенерантов можно отнести аномалии развития (альбиносы, ветвистость). В то же время в потомстве морфологически нормальных растений линии F5 Мутант 1x13671 отмечены частично стерильные колосья (5 %).

С целью выявления изменений по количественным признакам проводили структурный анализ урожая регенерантов Р2. Отмечено, что сомаклональные линии имеют больший размах изменчивости по всем изученным признакам, чем растения исходной формы. Причем, изменчивость направлена как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения значения признаков. Соотношение этих двух типов изменений зависило от генотипа и изучаемого признака. Например,

все регенеранты линии "Мутант 1x13671" можно было разделить на 4 группы:

1) морфологически нормальные растения - 60 %;

2) растения с понижением значения большинства определяемых показателей - 16 %;

3) растения с изменением одного или двух взаимосвязанных показателей - 17 %;

4)' растения с большим значением показателей, чем контроль- 7 %.

Среди ^менений в третьей группе отмечены укорочение меж-доузли^, сопровождающееся уменьшением высоты растений до 5 %. Также наблюдали увеличение числа колосков в одном колосе, что приводило к увеличению числа зёрен с одного колоса, до 2 %. Отмечены растения, уменьшение высоты которых сопровождалось увеличением длины колоса; при этом колос становился более рыхлым.

По проанализированным признакам статистически достоверные различия между регенерантами и исходными растениями получены для таких признаков, как высота растений, длина верхнего междоузлия, число зёрен с главного колоса. Так, например, средняя высота некоторых растений Р2 оказалась меньше, чем у исходной формы. Эти различия оказались выраженными в потомстве линии-ре-генерантов N 126 и N 152. По этому признаку потомства линии-ре-генерантов N 38.N 39 и N 138 также превышали исходные растения.

Судя по полученным результатам, значительная часть возникающих изменений у линии-регенерантов ("Мутант 1x13671") носит, скорее всего, эпигенетический характер. Для более четкой классификации сомаклональной вариации необходим анализ следующего поколения. В связи с этим по данным структурного анализа и фенологических наблюдений нами были отобраны для дальнейшего изучения 150 линий-регенерантов, различающихся по ряду количественных признаков. Результаты изучения количественных признаков линий-регенерантов РЗ "Мутант 1x13671" (рис. 2) показали, что амплитуда варьирования у сомаклональных линий больше, чем у контроля. По спектру изменчивости количественных признаков можно заметить сходство этих гистограмм, т.к. большинство регене-рантов по изученным параметрам сходны с контролем. Число растений Р4 поколения, идентичных с контролем по количественным поколения составило у линий "Мутант 1x13671" - 92 %, у линий

%

(.о №

30 20

Ю •

(О

гс> Ьо

30 ее

I, - ;

I- ''Л

1со т но йр т к? по

В

л> // <г /р // /¿> л?

п.

/ о

лг 6? яг / Г г з г ^г ^ • > -

Рис.2. Распределение растений-регенерантов (РЗ) линии -Р5 Мутант 1x13571 по. количественным признакам.

А - высота растений. Б - длина колоса, В - число верен с одного колоса;;-Т - масса . ^

аеоен с колоса. Л масса верен с одного растения. I 1 -контроль, □ -линии регенерантов.

"14364хГрекум 476" - 96%. Такой высокий процент сходства может обусловлен тем, что некоторые регенеранты, достоверно отличавшиеся от контроля по ряду признаков в первом и втором поколениях, в третьем и четвертом поколениях возвращались к исходному типу (форме). Так, например, потомства регенеранта N 152-15 во втором семенном поколении отличались от контроля меньшей высотой растений; в третьем поколении произошел возврат к исходному состоянию.

Однако следует подчеркнуть,что при изучении сомаклональных линий РЗ поколения "Мутант 1x13671" выделен ряд форм, отличающихся от исходных растений.Так,линия Н 39-31 отличалась от контроля по высоте растений,по длине колоса и по массе зёрен с одного растения в сторону увеличения, а линия N 176-42 -в сторону уменьшения.Если у исходной формы высота растений составила в РЗ -(109,3+1,05) см, то у линий N 39-31 она составила в РЗ-(127,5± 1,07) см, Р4 - (128,6+1,60) см. Масса зерен с одного растения у этой линии в РЗ поколении составила (8,86+1,51) г и в Р4-(9,42+ 0,41) г,у контроля(8,22±0,24) г и (7,59±0,39) г соответственно.

В отличие от большой вариабельности по количественным показателям в потомстве регенерантов были обнаружены только два изменения по качественным признакам.Отмечены булавовидность колосьев и антоциановая окраска на ушках листьев, • причем эти изменения наследовались в последующих семенных поколениях.

При изучении коэффициента вариации у линий Мутант 1x13671 установлены достоверные различия от контроля по нескольким признакам. Это - высота растений, длина колоса, масса зёрен с одного растения.

Растения-регенеранты линий "14364хГрекум 476" в РЗ и Р4 поколениях вели себя аналогичным образом.

Таким образом, анализ Р1. Р2 и Р3~поколений растений-ре-генерантов показывает, что степень изменчивости по количественным признакам регенерантов в большей мере зависит от изучаемого признака. При этом установлено, что изученные признаки по разному варьируют внутри каждого генотипа. Например, у линий "Мутант 1X13671" наибольшая частота наследуемых изменений обнаружена при анализе массы зерен с одного растения.

3. Сомаклональная изменчивость селекционных признаков рас-

тений в различных экологических условиях произростания Р5 - поколения. Сомаклональные линии "Мутант 1x13671", отличающиеся по элементам продуктивности от контроля в положительную сторону по селекционным признакам, были изучены в условиях КазНИИ земледелия и Семипалатинской ГОСХОС. Анализ количественных признаков был сделан нами отдельно для растений, выращенных в КазНИИ земледелия и Семипалатинской ГОСХОС.Значения признаков были неодинаковы при разных условиях выращивания, но по отношению к выращенным в тех же условиях контрольным растениям потомства одного регенеранта вели себя примерно одинаково. Показано, что по высоте растений регенеранты, выращенные в КазНИИЗ и Семипалатинской ГОСХОС, резко различались.Так, размах изменчивости по высоте растений для регенерантов, выращенных в КазНИИЗ, составил 106 - 116 см, тогда как для растений,выращенных в Семипалатинске, - 44-62 см. Отличие, вероятней всего, связано с различиями в почвенно-климатических условиях данных регионов. По массе зёрен с одного растения - наилучшие результаты в обоих случаях по сравнению с контрольными растениями показали линии О 44-47 и 39-20.

4. Продуктивность выделенных сомаклональных линий пшеницы. Сомаклональные линии пшеницы, выделенные по хозяйственно-ценным признакам, были испытаны на урожайность в питомнике конкурсного сортоиспытания отдела биотехнологии КазНИИЗ в 1992 - 1994 г.г. Всего было оценено 16 сомаклональных линий от "Мутант1х13671" и "143б4хГрекум 476" (Р5 - Р7). Наиболее высокую урожайность по сравнению с контролем и другими линиями регенерантов показали линии N 152 (38,58 Ц/га);N 15-9 (38,01 Ц/га); N 87(37,51 ц/га); (таблица 1).

5. Иммунологическая оценка созданных сомаклональных линий пшеницы.Линии. представляющие интерес для селекции, были изучены по устойчивости к видам ржавчины. Испытание сомаклональных линий "Мутант1х13671" и "14364хГрекум 476" на устойчивость к жёлтой ржавчине в течение 1989-1990 годах показало довольно высокую их резистентность к патогену. При этом у линии N 112 (1/10; 1/10) и N 114 (1/10; 1/20) от "14364хГрекум 476" устойчивость к жёлтой ржавчине оказалась выше, чем у исходного гено-

Таблица 1.

Урожайность созданных сомаклональных линий-регенерантов яровой мягкой пшеницы.

1 ...........1 1 Сортообразец и | Урожайность 1 1 1 Отклонение!

I сомаклональные линии | ц/га Îот контроля! 1 ц/га 1

1 Казахстанская 3(st) | 36,20

| Контроль"Мутант1х13671" | 33, 05

I Линии: H 38 | 35,60 1 +2,55 |

1 N 152 ! 38,58 1 +5.53 |

I N 39 | 36,46 1 +3,41 |

I N 188 | 32,53 1 -0,52 !

1 N 50 | 33,54 1 +0,04 I

1 N 188 | 33,51 1 +0,46 I

1 N 53 | 30,31 1 -2,74 !

1 N 87 | 37,51 1 +4,46 1

I Ы 57 | 33,06 1 -0,01 |

1 N 158 | 37,07 1 +4,02 i

! N 159 | 38,01 1 +4,96 |

1 Контроль"14364хГрекум476"I 34, 20

1 Линии: N 112 | 35,72 I +3,52 I

1 N 114 | 34,94 1 +0,23 |

1 N 116 | 35,43 1 +1.23 |

1 N 119 | | . . . 1 34,60 1 +0,40 | i i

НСР 0,95 - 3,3 0,99 - 4,5 Р=3, 91 %

типа.

При оценке на устойчивость к бурой ржавчине была выявлена самая низкая заражаемость у линии "Мутант 1x13671" N 152 (1/25; 2/10). Степень поражаемости стеблевой ржавчиной большинства испытанных сомаклональных линий оказалась ниже, чем у исходных форм. Таким образом," можно констатировать, что спектр обнаруженных отклонений от контроля включает в себя как положительные, так и отрицательные изменения изученных признаков. Нам удалось выявить более устойчивые по сравнению с исходными генотипами формы к изученным патогенам. Эти линии: N 152 от "Мутант 1X13671" и О 112, 114 ОТ "14364хГрекум 476".

6. Сомаклональная изменчивость растений-регенерантов по спектру запасных белков.

Изменчивость легче изучить при использовании маркерных признаков, контролируемых определенными генами. Кроме того, такие признаки могут служить контролем за -/чистотой исследуемого материала. В качестве маркерных признаков.в наших .экспериментах, были использованы- глиадины итлютенины.

Проведенный электрофоретический анализ запасных-белков "-38. растений от различных сомаклональных линий "Мутант 1x13671" показал константность и гомогенность донорной линий и выявил - изменения в спектре глиадина'и глютенина у отдельных сомаклональных растений. Среди регенерантов было ^выявлено пять групп растений, отличающихся друг от-друга по электрофореграммам глиади-нов и глютенинов. Часть линий-регенерантов (N,N127-6; 51-38; 126-41; 50-5) оказалась идентичной по составу глиадино-глютени-нового компонента. Белковые формулы глиадинов линии И, N 38-5; 39-7; 40-8 отличались от контроля подвижностью ОЭП белковых компонентов в зонах^ЗЛ;р 2; £Составы компонентов зоны идентичны. Однако эти линии по распределению глютениновых компонент в .электрофоретическом спектре относятся к разным группам. У линий N. N 87-47; 39-20; 102 в электрофоретических спектрах глиадина произошли изменения в^-зоне и в составе высокомолекулярной субъединицы глютенина. Электрофореграммы глиадинов 7 линий N.11 102-2; 36-8; 44-3; 152-15; 57-9; 176-42 отличаются .от контрольных растений по подвижности ОЭП белковых компонентов только в одной зоне <7(7. У этих сомаклональных линий в электро-

форетическом спектре глютенина отсутствует высокомолекулярная субьединица Вгг.

Как и в случае N 53-4, некоторые линии по -распределению глиадиновых компонентов в электрофоретическом спектре идентичны с контролем, а спектру глютенинов отличаются от него присутствием высокомолекулярной субъединицы В23.

Таким образом, анализ электрофоретических спектров запасных белков исходной формы и регенерантов "Мутант„1x13671" выявил изменчивость по этим признакам.

7. Цитозенетический анализ растений-регенератов.

Результаты исследования мейоза в материнских клетках пыльцы (МКП) регенерантов линий Мутант 1x13671 показали, что у основной части растений все. исследованные нами стадии протекают ■нормально (рис.За). Однако у 10,5 % растений-регенерантов были обнаружены нарушения в мейозе. У 7,9 % растений в большинстве исследуемых клеток обнаружены униваленты в метафазе I (рис.36). Из линий,N 188-15 вывлены;растения анеуплоидные с конфигурацией хромосом 18 бивалентов'и'4".унивалента (рис.3 в). Наличие транс-локации в гетерозиготном состоянии приводило к появлению в анафазе I мейоза определённого процента клеток с унивалентамн, мостами и: фрагментами, возникающими в результате перекреста в гетерозиготной инверсии (рис.Зг). Остающие униваленты в дальнейшем образовывали микроядра в тетрадах..■ Показано, что изменения морфологических признаков и спектра запасных белков пшеницы не сопровождались крупными хромосомными перестройками, которые можно было бы выявить при анализе хромосом в мейозе.

Таким образом, проведенные исследования выявили сомакло-нальную изменчивость: 1) морфологических признаков; 2) количественных признаков; 3) по устойчивости к различным видам ржавчины; 4) по электрофоретическому спектру запасных белков пшеницы. По данным цитологического анализа имеются также нарушения в протекании различных стадий-мейоза, обусловленные сомаклональ-ной вариабельностью.

Полученный в настоящей работе экспериментальный материал свидетельствует о том, что сомаклональная вариабельность,- в основе которой лежат генетические изменения культивируемых: клеток

' г .....**.........^«^спив и материнских клетках пыльцы регенерантов-

А - метафааа 1, в норме 21 б-метафаза 1 мейоза с отброшенным унивалентом: в - Мйтяляяя\

и регенерированных из них растений, может быть использована в биотехнологиях для селекции. Причины и механизмы сомаклональной вариабельности широко обсуждаются и до сих пор привлекают пристальное внимание исследователей. Но ясно одно, что эти изменения могут затрагивать самые различные стороны жизнедеятельности клетки и растения, в том числе и хозяйственно ценные признаки. И именно с данным обстоятельством связано практическое использование этого явления. Вообще надо отметить, что Казахстан с его разнообразными природно-климатическими условиями представляет собой уникальный "полигон" для испытания различных биотехнологий для селекции, в том числе и на основе сомаклональной изменчивости. Полученные сомаклональные линии могут быть использованы и уже используются:

- в качестве родительских форм как источники отдельных хозяйственно-ценных признаков:

- для непосредственного включения в практический селекционный процесс и доработки до новых сортов различных агроэкоти-пов;

- для создания изогенных линий по лимитирующим хозяйственно-ценным признакам.

Сомаклональная вариабельность на сегодняшний день представляет большой интерес для исследования механизмов генетической изменчивости клеток и растений, генетической обусловленности отдельных процессов, их регуляции и т. п., поскольку сомакло-ны являются вариациями одного и того же генотипа (отдельно взятого растения) и в этом отношении могут быть сравнимы с моногенными линиями. Не переоценивая, но и не умаляя возможностей сомаклонального варьирования, следует относиться к нему как к одному из методов в арсенале селекционера.

8. Суспензионное культивирование клеток пшеницы.

Большинство исследований культивируемых клеток зерновых злаков и технологических приемов на их основе до настоящего времени было ориентировано на использование каллусов и твердых питательных сред. Прежде всего это связано со сравнительной легкостью и доступностью получения и выращивания каллусной ткани. Однако на современном этапе развития биология культивируемых клеток и биотехнология зерновых злаков нуждаются в более

Число

клетокх1С? /ш.

эффективных моделях и экспериментальных системах, которые- позволили бы осуществлять селекцию на клеточном уровне, генетические модификацию и реконструирование растений.

Такой эффективной системой являются суспензионные клеточные культуры. Разработка технологий суспензионного выращивания клеток сельскохозяйственных растений, прежде всего, преследует цель получения быстрорастущих клеточных культур с высокой реге-нерационяой активностью. Однако для зерновых злаков глубинное культивирование клеток оказалось сложной задачей, таковой она остается и до сих пор: успешных работ по получению морфогенных клеточных суспензий пшеницы на сегодняшний день не так уж и много. Следует подчеркнуть, что выделение интенсивно растущей, высокоактивной в регенерационном отношении суспензионной клеточной линии воспринимается как несомненный успех, поскольку с ее получением открывается возможность различных манипуляций с данным генотипом.. Прежде всего решается'проблема клонирования -- получения колоний и далее-целого растения: из .индивидуальных клеток и протопластов, а вместе с ней и создания эффективных технологий.клеточной селекции, генетической трансформации и соматической гибридизации.

Мы начали проводить исследования суспензионной культуры; клеток пшеницы с. 1986 года. Эта работа включала несколько этапов, отражающих наши попытки получения клеточной культуры, отвечающей всем требованиям "истинной" суспензии. Настоящая дис- -сертационная работа является начальным этапом этих* исследований. Здесь мы впервые попытались выращивать клетки пшеницы в жидкой среде и получить активнорастущую суспензионную культуру.

Для получения клеточной суспензии использовали каллусы из незрелых зародышей пшеницы Тг. аеэШит (сорт "Казахстанская-10").Каллусы получали на среде Мурасиге-Скуга-1 с 2 мг/л 2,4 Д. Через две недели эти каллусы пересаживали на среду для поддержания в пересадочной культуре эмбриогенных каллусных тканей Му-расиге-Скуга-2 с добавлением 20 г сорбита. После двухмесячного культивирования каллусы, в основном,состояли из плотных участков желтоватого цвета. В некоторых из этих каллусов появлялись эмбриогенные рыхлые участки. Эти рыхлые участки каллусов помещали в жидкую среду Мурасиге-Скуга-3 1-2 мг/л 2.4 Д с различными аминокислотами. Культивирование проводили при 25+1°С на ка-

чалке (120 об/мин).

Одним из способов отбора быстрорастущих линий является подбор оптимального количества инокулята и продолжительность субкультивирования. В наших опытах исходные плотности клеточных суспензий пшеницы были следующими:1) 2х106 клеток/мл,2) 1,5х106 клеток/мл и 3) 0,7х106 клеток/мл (рис.4).Показано, что увеличение начальной плотности сокращает длительность фазы ростового цикла на несколько дней и, соответственно, время субкультивирования. Так, при культивировании суспензии клеток с исходной плотностью 2х106 клеток/мл наблюдали экспоненциальный рост в течение первых пяти суток. Затем наступала фаза замедленного роста, продолжавшаяся до конца пассажа.Число клеток за этот период субкультивирования возросло в 3,2 раза. Культура с исход-* ной плотностью 0,7x10е клеток/мл характеризовалась фазой логарифмического роста числа клеток, продолжавшейся до 7 суток. Далее наблюдалось замедление роста. За 8 суток число клеток увеличилось в 8,57 раз.

Помимо основного состава питательных сред большое влияние на состояние суспензионной культуры оказывают гормоны. При изучении влияния различных концентраций 2,4 Д на рост клеточной суспензии пшеницы было установлено, что оптимальным является вариант опыта, где концентрация 2,4 Д уменьшается с 2 мг/л до 1 мг/л. При минимальных концентрациях 2,4 Д и на безгормональных средах в суспензии наблюдали появление плотных эмбриоподобных структур, которые в условиях наших опытов давали корни. Ряд авторов установили положительную корреляцию между увеличением концентрации L-пролина в среде и эмбриогенным потенциалом каллусов (Vasil et al., 1986; Wright et al., 1987). В связи с этим представляло интерес выяснить влияние этой аминокислоты на мор-фогенетическую активность клеток в условиях глубинного культивирования в жидкой среде. Как показали исследования, наличие пролина в питательной среде при всех испытанных концентрациях приводило к усилению деления клеток и образованию эмбриоподобных структур.

Основные результаты данного этапа исследований позволяют сформировать следующее.

Рост суспензионной культуры клеток, ее популяционный состав и структурно-морфологические характеристики определяются

условиями культивирования, генетическими и эпигенетическими особенностями экспланта. Суспензионная культура клеток требует иных условий гормонального обеспечения и концентраций элементов питательной среды, чем каллусная культура на твердых средах. Так, интенсивный рост суспензионной культуры наблюдался в разведенной вдвое среде Мурасиге-Скуга с низким содержанием 2,4 Д. Цитокинины оказывают ингибирущее действие.

Возможен рост и на безгормональной среде. Показано, что длительное культивирование в таких условиях приводит к повышению однородности клеточной популяции: как правило, начинает преобладать популяции мелких меристемоподобных клеток. Этот факт, а также полученные нами данные, о влиянии различных компонентов, таких, как гормоны, осмотики, источники азота, углерода и другие, указывают на возможность регулировать рост и морфологические реакции суспензионной культуры клеток условиями 'выращивания. Это имеет принципиальное значение для последующей разработки систем клеточной селекции и генетической реконструкции клеток злаковых растений.

Последнее обусловило наш интерес к получению суспензии из отдельных клеток (по существу, разработке метода клонирования в жидкой среде, т. е. получения колонии из одной клетки). В условиях наших опытов индуцировать деление одиночных клеток и получить рост такой культуры оказалось возможным только на обогащенных, в частности, кокосовым молоком средах. Такой же эффект достигался при замене кокосового молока культурой "няньки" из змбриоподобных клеточных структур. Для поддержания культуры в активно растущем состоянии было необходимо частое субкультивирование (5-10 дней).

Таким образом, нам удалось найти подход к получений'- суспензионной культуры клеток пшеницы. Этот подход был разработан нами для гексаплоидной пшеницы сорта "Казахстанская-10". Однако, как показали дальнейшие исследования сотрудников Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А.Айтхожина, этот метод оказался приемлемым для широкого ряда генотипов пшеницы, и он в принципе применим и к другим зерновым злакам (в частности, для кукурузы). Указанная возможность следует из того, что разработанный нами прием основан, прежде всего, на общих свойствах культивируемых клеток злаковых растений, на изучении их жизне-

деятельности. Дальнейшие работы сотрудников Института молекулярной биологии и биохимии в данном направлении привели в настоящее время к получению эмбриогенной клеточной суспензии пшеницы, из клеток которых удается регенерировать целые растения.

Выводы:

1. Изучены каллусообразующая и регенерационная активности различных генотипов пшеницы. Показаны генетическая обусловленность процессов роста и развития в культуре клеток и решающая роль условий среды в реализации потенции клетки (генотипа, экс-планта) к морфогенезу in vitro. Выявлены генотипы F5 "Мутант 1x13671" и "14364хГрекум 476" с высокой регенерационной активностью, которые могут быть использованы в качестве доноров этого признака в селекционно-биотехнологических исследованиях.

2. Определены особенности глубинного культивирования клеток пшеницы и подходы к получению активно растущей суспензионной клеточной культуры.

3. В материнских клетках пыльцы растений, полученных из культивируемых клеток, выявлены изменения в протекании различных стадий мейоза. Получены растения с анеуплоидным числом хромосом.

4. По электрофоретическим спектрам глиадинов и глютенинов показаны стабильно наследуемые изменения в составе запасных белков у сомаклональных вариантов пшеницы.

5. Наибольшая сомаклональная изменчивость характерна для регенерантов первого поколения (Р-1). Они отличаются от растений исходной формы высокой вариабельностью таких селекционных признаков, как высота растений, размер и плотность колоса, длина междоузлий, продолжительность вегетационного периода, уровень стерильности. По количеству полученных сомаклональных линий (16-49 %) лучшими генотипами были Fs "Мутант 1x13671". "14364хГрекум 476", "Карлыгаш" и "Алма-Атинская полукарликовая".

6. Изменчивость регенерированных в культуре in vitro растений имеет как наследственную, так и модификационную природу. У сомаклональных вариантов выявлена значительная изменчивость по количественным признакам, степень такой изменчивости определяется каждым конкретным признаком. На реализацию генетичес-

ки измененных количественных признаков у сомаклонов существенно влияют климатические условия произрастания растений.

7. Селекционные признаки регенерантов второго поколения (Р-2), определяющие продуктивность и устойчивость к полеганию показали более высокий коэффициент вариации, чем у исходных линий. Значительная часть возникающих изменений селекционных признаков носит эпигенетический характер.

8. Сомаклональная изменчивость селекционно-ценных-.признаков в поколениях Р-3 и Р-4 у большинства линий регенерантов снижалась. Для селекционного использования выделены хозяйственно-ценные линии-регенеранты: N 176-2 повышенная устойчивость к полеганию, N 39-31. увеличение числа зерен в колосе, N. 152-15 -повышение массы зерен с одного растения. По уровню изменчивости признаков выделены более 150 селекционно-ценных линий регенерантов Р4.

9. В различных., агроэкологических. условиях (КаэНИИЗ, -Семипалатинская ГОСХОС) выращивания регенерантов Р-5 выявлены достоверные различия от■исходных форм по селекционным признакам -число колосков с главного колоса, число-зерен с главного колоса, а по высоте растений, продуктивной кустистости и длине колоса только в условиях -семиалатинской ГОСХОС.Это свидетельствует о различии реакции сомаклональных линий на изменение условий среды, т.е. наличии взаимодействия "генотип и среда".

10. Созданы и выделены для селекционного использования хозяйственно-ценные сомаклональные линии достоверно превышающие исходные формы по продуктивности: сомаклоны N 87 (на 4.,02 ц/га), N 159 ( на 4,96 ц/га) и N 112 (на 3,52 ц/га); по устойчивости к видам ржавчины N 152, N 112 и'И 114.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

В целях повышения эффективности практической селекции пшеницы рекомендуются:

1. Эффективные приемы массового получения сомаклональных линий пшеницы применительно к.сортам казахстанских агроэкотипов.

2. Привлечение константных линий с селекционно-ценными признаками для получения сомаклональных и андроклинных линий.

3. Использование в практической селекции сомаклональных линий от "Мутант 1x13671" и "14364хГрекум 476", отличающихся хозяйственно-ценными признаками:

-устойчивость к видам ржавчины 209; 152; 112; 114.

-с высокой массой зерен с одного растения N. N 152-5; 39-31.

-с высокой продуктивной кустистостью N 159-6.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Карабаев М.К.. Джардемалиев Ж.К., Сопабаева Б.А., Кур-баков О.И., Шевченко Е.Л., Бегалиев М.К., Шегебаев О.Ш. Культура in vitro пшеницы. - Всесоюзная конференция по биотехнологии злаковых культур. Тезисы докладов. Алма-Ата, 1988, с. 63.

2. Джардемалиев Ж.К., Шевченко Е.Л., Сопабаева Б.А., Карабаев М.К., Шегебаев О.Ш. Суспензионная культура клеток пшеницы-Всесоюзная конференция по биотехнологии злаковых культур. Тезисы докладов. Алма-Ата, 1988, с. 62-63.

3. Сопабаева Б.А., Джардемалиев Ж.К., Карабаев М.К. Исследование роста клеточных популяций различных видов пшеницы и эгилопса в суспензионной культуре - Физиолого-генетические основы повышения устойчивости с.-х. растений. Алма-Ата: Наука, 1988, с. 133.

4. Сопабаева Б.А., Джардемалиев Ж.К., Карабаев М.К. Выделение протопластов из каллусных тканей пшеницы и эгилопса - Физиолого-генетические основы повышения устойчивости и продуктивности с. -х. растений. Алма-Ата: Наука, 1988, с. 132.

5. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К., Бегалиев М.К., Курба-ков О.И., Сопабаева Б.А., Шевченко Е.Л. Культура пшеницы in vitro. - Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Москва, Наука, 1991, с. 252-256.

6. Кабаева З.Н., Сопабаева Б.А. Электрофоретический анализ глиадина сомаклональных линий озимой пшеницы.-Пути увеличения производства и улучшения качества сельскохозяйственной продукции в Казахстане. Тезисы докл. Республиканской научно-практической конф.. посвящённой 35-летию Актюбинской Гос. с.-х. опытной станции.-Актюбинск. 1992, с.62-63.

7. Жумабаева Б.А. Анализ изменчивости растений регенеран-тов пшеницы MR1.- Деп. в КазгосИНТИ. Реферат в сборнике: "Депонированные научные работы". Алматы, 1994, Выпуск III, стр.60.

8. Жумабаева Б. А. Суспензионная культура клеток пшеницы.-Деп. в КазгосИНТИ. Реферат в сборнике: "Депонированные научные работы". Алматы, 1994, Выпуск III, стр.60.

9. Жумабаева Б.А., Шулембаева К. К., Шамбакин К. Ж. Цитоге-нетическое изучение растений-регенерантов мягкой пшеницы. -Деп. в КазгосИНТИ. Реферат в сборнике: "Депонированные научные работы". Алматы, 1995, Выпуск 1, стр. 63.

10.Жумабаева Б. А., Булатова K.M., Шамбакин К.Ж. Сомакло-нальная изменчивость по электрофоретическим спектрам запасных белков у пшеницы. Деп. в КазгосИНТИ. Реферат в сборнике: "Депонированные научные работы". Алматы, 1995, Выпуск 1, стр. 63.

Jumabaeva B.A.

Somaclonal variation in wheat and its using in selection and genetics research. Present submit a thesis for a candilat"s of blolodgy degree 06.01.05. Breeding end seed production 03.00.23 Biotechnology. Alraaty, 1996, p. 25.

Callus formative and regeneration activity of different types of wheat were studied. The genetical dependence of the processes of growth and development in the culture of cells and substantial role of environment in realization of the cell potential (genotype, explants) to raorphohenesis in vitro were shown. Variation of regenerated in culture in vitro plants has both heritable and raodificatlonal nature. Somaclonal lines have shown the significant variation in quantitative characters the degree of such variation can be determined by every concrete character. In maternal cells of pollen of some plants the variations in the process of different phases of meiosis were revealed. Using the electrophoretic spectra of gliadins and glute-nins the regular heritable changes in the composition storage proteins in somaclonal vaiations in wheat were shown. On the basis of the developed methods of cells culture in plants regeneration and their selection and genetics tests in different ecological regions and infection backgrounds the production valuable lines in wheat including rust-resistant were isolated. The peculiarities of suspension cultivation of wheat cells were studied and the approaches to obtaining of the actively growing suspension cell culture.

Жумабаева Б.А.

"Бидайдын сомаклонды earepiaiTiri жена оны селекция-генвти-калык. звр ттеу лер дв кол дану" . Биология гылын дардын. кандидаты гмлыми дэрежеЫн алу yuiiH дайындалган диесертациянын аоторвфераты. В6.01.05 Секция жэне т*кым марувмылыгы Oo.00.23 биотехнология. Алматы. 1996. 23 бет.

Эр TVPrti видам генотиптвР!Hiн каллус жанв регенерация тузу aKTUBTifliri зерттелд!. Клетка культурасындагы генвтикалык. всу жэне жетглу процеотер1 клетнаныч tri vitro жагдайында норфо-генезгв btvî не оырткм орта эс<=р1тч маныэди ролх керсетглген. In vitra культ/расында сайта курылган noiнд1кте>рдз.H esreoiumri tïKum куалаушьмык «вне модификациилы< табигатымвн сипаттялады. Самьклон аркылы ю.рылган ееХмдЪстер варианттарында саыдык бел— rirtepi бойыныа «i^repibiTiK пайдя болды, мундай вэгерiи»тiктiц, дэ-режес! пайда болган бвлг1лвр*мен аиыкталды. Культура клетиа aAiciMOH алынган кейбз р есЫдЫтердгч аналык. тозанкап клвтиа-ларында ететгн чртурЛ! мейоз стадияоында ауыткулар таоылды. Каятд цхршган сомаклонды биддй ео1НД1ктер!н1н глютеним тшнв глиаднн спектiрлерiндег i белок коры кУрамында электрофорез методы врк.алы туран.ты туцым куалайгын earepiuiTiK кврсетг лген. KopsKTin ортада к.айта ь^рыпган eoit-iA'i ктёрд! алу здютерг нег"131нде жэне оларды эртурлх экология лык. ыэнв инФекциялык. ортада срлекциялык-генетикалык скнак.тан етнлзу аркылы ыаруаиймлык,-ка к*ды бидай, соымн хшгнде тат ауруына тезгмдг сомаклон линия-лйры алынды. К'оректхк ортада ас1ид1ктх вару ©рекшелхктерi жан-какты зерттб>л1п жэне суоик. корвктiк ортада ягни оуопензиялыц куль тураоын бидай клеткал арынын aktmbti осу эд1стврг табылды.

Подписано в печать 2. 05.96 ФОРМАТ 60x84 Бум.тяп № 1 Печать ризографическая.Усл. н.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 371.

Издано в Компьютерном Центре Института Теоретической и Прикладной Математики HAH PK 480021, Алматы, ул. Пушкина, 125 Тел.: 61 38 10