Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

РГ5 ОЛ

_ д На пРавах рукописи

ЛАРИНА Светлана Николаевна

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ И РАСТЕНИЯ-РЕГЕНЕРАНТЫ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

- Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор 3. Б. Шамина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н. И. Шевякова, кандидат биологических наук И. Д. Никифорова

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт кормов имени В. Р. Вильямса.

Защита состоится <¿3Р •» ¿¿¿ОЛ^ 1995 года

в часов на заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан «.¿У1995

Г

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук ✓-Л'У ' М. И, Азаркович

- 2 -

Актуальйость проблемы

В результате искусственного орошения в возделываемых почвах возрастает содержание солей. Это делает их малопригодными для культивирования сельскохозяйственных растений. Для решения этой проблемы существует два пути: комплекс мелиоративных мероприятий и получение новых солеустойчивых форм растений. Эффективное получение таких солеустойчивых форм невозможно без глубокого знания физиологических и генетических процессов, лежащих в основе солеустойчивости.

Применение разнообразных физиологических,биохимических, генетических подходов в современных исследованиях выявило значительную сложность явления солеустойчивости, которая может обеспечиваться в результате самых разнообразных физиологических реакций, затрагивающих практически все метаболические процессы, происходящие в растительной клетке (Бутенко, 1990).

Многосторонность проблемы солеустойчивости требует привлечения новых подходов, направленных на ее решение. Одним из них может быть применение метода культивируемых клеток in vitro. Использование данного метода раскрывает широкие перспективы в изучении солеустойчивости.

Клеточная культура позволяет анализировать физиологические реакции происходящие на клеточном уровне в условиях засоления при отсутствии координирующего и регулирующего влияния целого растительного организма. В культуре клеток in vitro более четко проявляются реакции собственно клетки (Сидоров, 1990). Выявление наиболее существенных, - связанных с солеустойчивостью, позволит использовать их в качестве маркерных для проведения тестирования и отбора солеустойчивых форм.

В результате разнообразных приемов селекции in vitro становится возможным получение клеточных линий с заранее "заданными" характеристиками, в том числе, с конкретным изменением определенных метаболических процессов, связанных с солеустойчивостью, которые возможны in vitro и проявляются на уровне целого растения.

Цель и задачи исследования Целью работы было изучение модельной системы " клеточная

- з -

культура in vitro и растения-регенеранты " применительно к проблеме солеустойчивости растений.

Для ее решения были поставлены следующие задачи:

- путем селекции in vitro получить .клеточные клоны резистентные к действию высоких концентраций NaCl;

- провести оценку солеустойчивости полученных клонов;

- изучить физиолого-биохимические реакции полученных клонов и контрольной линии в условиях засоления и на пресном фоне;

- получить растения-регенеранты из солеустойчивой клеточной культуры;

- оценить солеустойчивость растений-регенерантов и их потомства;

- оценить возможность применил метода изоферментного анализа для тестирования солеустойчивости клеточных клонов и растений;

Научная новизна работы

Показано, что полученные в одинаковых условиях резистентные к NaCl клеточные клоны весьма различны по своим физиолого-биохимическим характеристикам. Их устойчивость к солям не связана с уникальными специфическими механизмами, а определяется комплексом различных реакций, создающих способность к росту в условиях засоления. Впервые получена суспензия солеустойчивой клеточной линии кукурузы, обладающая длительно сохраняемым эмбриогенным потенциалом. Проведен генетический анализ солеустойчивых растений-регенерантов и показан доминантный характер наследования.

Практическая ценность работы

Полученные резистентные формы кукурузы могут служить основой для создания новых форм, обладающих устойчивостью: к засолению и могут быть включены в селекционный процесс.'

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

1. Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград, 1991).

2. Всероссийских планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1992, Москва, 1993, 1994).

3. Третьем съезде ВОФР ( Санкт-Петербург, 1993).

4. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Алматы, 1993).

5. Конференции по генетике соматических клеток в культуре ( Черноголовка, 1993).

6. Расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН им. К. А. Тимирязева (Москва, 1995).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы.

Работа изложена страницах машинописного текста,

содержит таблиц, рисунков, фотографии. Список

использованной литературы включает m наименований.

МАТЕРИАЛЫ II 13Т0ДЫ КССЛЕДОВАИШ

В работе была использована инбредная линия кукурузы А 188 американского происхождения. В связи с сильной поражаемостыо пузырчатой и пыльной голоЕней эта линия мало используется в селекции, но• является модельной в исследованиях проводимых на культуре тканей in vitro для получения эмбриогенной каллусной ткани. (Green, Rhodes, 1982; Kamo, et al., 1985).

Для получения культуры клеток использовали незрелые зародыши, культивирование эмбриогенной каллусной ткани, стимуляцию эмбриогенеза и регенерацию растений проводили по методике, принятой в лаборатории генетики культивируемых клеток ИФР РАН (Чернышева и др., 1988).

Для определения чувствительности к NaCl каллусную ткань культивировали на средах с различным содержанием соли. Ростовые характеристики получали после второго пассажа. Экспланты массой по 25-30 мг высаживали на чашки со средой Мурасиге и Скуга (MS) содержащей от 0% до ZZ NaCl и культивировали в течение 28 дней, а затем взвешивали. Интенсивность роста определяли как разницу между исходным и конечным весом.

Для определения. содержания ионов в каллусной ткани использовали метод Калинкиной с соавт. (Калинкина и др. , 1990). Измерение концентрации ионов проводили на иономере

("Orion research microprocessor ionalyzer/901", фирма "Orion Research Inc. США). Было проведено. 3 эксперимента в 3 пов-торностях.

Определение общих растворимых Сахаров проводили по колориметрическому методу (Dubois et al., 1956) на приборе "Specol" ( фирма "Karl Zeiss", ГДР). Провели 3 опыта в 3 повторностях.

Свободные аминокислоты экстрагировали согласно, методик (Тимошенко и др. , 1980). Определение свободных аминокислот в экстрактах проводили на аминокислотном анализаторе (ААА-Т339, фирма "Kovo", ЧССР). Было проведено два эксперимента в 3 повторностях.

Изоферментный анализ листьев проростков и каллусной ткани проводился в лаборатории д. б. н. Хавкина Э. Е. (BffifflCE РАСХ) согласно методике (Чаянова, Хавкин, 1990). Для электрофоретического разделения белков использовали две буферные системы: анодную систему Davis и катодную ситему Reisfild (Маурер,1971).

Тестирование потомства растений-регенерантов проводилось в почвенных опытах и в гидропонной установке. В почвенных опытах анализируемые растения высаживали в сосуды с почвой и вносили NaCl путем полива до содержания 0.3Z или 17, от сухого веса почвы. При использовании гидропонной установки питательный раствор содержал минеральные компоненты макро- и микросолей среды MS (1/2 концентрации) с добавлением соответствующего количества NaCl.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕШЖ

Характеристика исходной каллусной ткани и ее реакция на засоление среды

Каллусная ткань кукурузы, ' полученная из незрелых зародышей была гетерогенной и состояла из эмбриогенных и неэмбриогенных зон. На протяжении всей работы с культурой ткани ставилась задача поддержания именно эмбриогенной ткани.

Каллусная ткань штамма А 188 оказалась очень чувствительной к присутствию NaCl в среде (рис.1). При повышении содержания NaCl до 1Z прирост в среднем составлял менее 40Z от контроля. Культивирование ткани на среде с данной концентрацией приводило к проявлению наибольшей гетерогенности

каллусов по ростовым характеристикам эксплантов С с.v. 47%) и ткань была неэмбриогенного типа.

Повышение концентрации NaCl в среде до 1,5% и выше приводило практически к полному торможению роста и некрозу. На эксплантах полностью отсутствовали участки эмбриогенной ткани.

Рис.1. Рост клеточной линии А 188 в зависимости от

засоления среды.

% NaCl

В ответ на засоление в клетке могут появляться- различные вещества, выполняющие роль регуляторов осмотического потенциала. • Было определено содержание свободных аминокислот, общих растворимых Сахаров и ионов Иа+ и К+ в стандартных условиях и в присутствии ИаС1 в среде.

Среди свободных аминокислот были выделены те, изменение которых связано с нарушениями метаболизма при засолении. Пролин известен как осмопротектор. Алании, гамма - амино-масляная кислота (ГАМЮ могут присутствовать в клетке в 'значительных количествах и повышать осмотический потенциал. Глу-тамин, аспарагин и аргинин могут косвенно свидетельствовать о степени детоксикации аммиака, накапливающегося при стрессе. Суммарное содержание аминокислот отражает интенсивность процессов биосинтеза белка в клетке (рис.2).

При сопоставлении динамики содержания аминокислот и роста исходного клеточного штамма на средах с различным со-

- 7 -

держанием NaCl выявлено следующее:

1) При повышении концентрации NaCl в среде до 1,07. рост ингибировался до 40% по сравнению со стандартными условиями, содержание большинства аминокислот возрастало, что может быть связано с постепенно усиливающимся ингибированием синтеза белка и, как следствие, ростовых процессов.

2) Концентрация 1% NaCl в среде является критической для растущего каллуса, т. к. резко измененяется содержание аспарагина, глутамина и глутаминовой кислоты, выполняющих роль " нейтрализаторов" свободного аммиака, отмечается максимальная концентрация аммиака и повышается содержание пролина

3) На средах с высокими концентрациями соли (1,5% и 2,07. ) роста практически не было, наблюдался некроз и гибель эксплантов. Содержание большинства аминокислот резко снижалось по сравнению с 17. - ным засолением среды. Концентрация некоторых аминокислот (аланин, аспарагин, серин и др.) была ниже.чем в отсутствии засоления. Т.е. содержание 1,5% и 2,0% NaCl в среде, по-видимому, приводит к весьма сильному нарушению метаболизма, торможению синтеза аминокислот, их распаду и гибели ткани.

Рис.Z. Изменение содержания свободных аминокислот в клетках линии А 188 при засолении среды.

26 20 16 10 6 О

О 0.6 0.7 1.0 1.6 2.0

% NaCl

ESI asp Melu ЛШеШ Шр'О ЕШЗа!» Оо-аЬа ваагд

Культивирование в присутствии солей приводит к накоплению Na+ и изменению ионного баланса, что подтверждается анали-

тКМ/ г сыр. в.

Fh

'п л 1Й и

а* -uê п j Лт G ■ \

зом клеточной массы при выращивании на среде с 1Z NaCl (табл. 1). Засоление приводило к повышению внутриклеточного содержания ионов Na+ в 6-7 раз, а содержание К+ незначительно возрастало, в результате соотношение K+/Na+ снизилось более чем в 4 раза.

Таблица 1. Содержание общих растворимых Сахаров и ионов Na+ и К+ в каллусной ткани линии А 188 (возр. 14 дн.).

Стандартная Среда с

среда (MS) 1Z NaCl

Ионы Na+ мМ 1,08t0,03 7,2±0,0б

Ионы К+ мМ 1,43±0,2 2,3±0,05

K+/Na+ 1,3±0,07 0,3±0,01

Сахара

мг/г сыр. массы 1,7±0,5 2,1±0,1

Изменение содержания Сахаров при добавлении в среду культивирования 1% NaCl было недостоверным, по-видимому, для данного штамма сахара не участвуют в регуляции осмотического потенциала в клетке (табл.1).

На основании полученных результатов по содержанию аминокислот, ионов и Сахаров можно сделать заключение о том, что все из названных агентов могут выполнять защитную функцию в клетках данной линии. Каждое из рассмотренных веществ, по-видимому, вносит определенный вклад в регуляцию солевого обмена, и, соответвенно, в условиях солевого стресса в клетках линии А 188 одновременно могут действовать различные механизмы защиты.

Селекция NaCl устойчивой клеточной линии.

Первый этап проведения селекции состоял в отборе каллусной ткани, выживающей на среде с IX NaCl, т.к. эта концентрация была критической по ингибированию роста и резкому изменению метаболизма. Экспланты весом по 10 - 15 мг высаживали на среду МЗ с добавлением 1Z NaCl и культивировали в течение 25 - 30 дней. В конце пассажа определяли долю экс-плантов, давших прирост биомассы, их делили по 10-15 мг и снова помещали в селективные условия. -

Элиминация чувствительных каллусов продолжалась на протяжении 6 пассажей (Табл. 2). Исходно было высажено 700

эксплантов. Полученные после 7 пассажей клоны проверяли на стабильность признака солеустойчивости: высаживали на среду без селективного фактора и затем снова в условия засоления. Устойчивость всех оставшихся после 6 пассажей клонов к действию МаС1 сохранялась.

Таблица 2. Элиминация эксплантов в ходе селекции солеустойчивых вариантов на среде с IX NaCl.

Пассажи 1 2 3 4 5 6 7

Высажено эксплантов Отобрано эксплантов % выживания 700 281 132 49 20 19 16 90 64 44 14 3 3 16 12,8 2,95 0,97 0,28 0,04 0,006 0,006

Для повышения солеустойчивости культуры клеток был проведен второй этап селекции. Была поставлена задача получить индивидуальные высокосолеустойчивые клоны, сохраняющие эмбриогенную способность.

Этот этап состоял в отборе из устойчивой к 1% NaCl кал-лусной ткани кукурузы клонов, выживающих при более высоком засолении среды (1,5% NaCl). Более 300 эксплантов устойчивого штамма- размером 5-10 мг помешали в чашки Петри на поверхность среды с 1,5% NaCl и через 25-30 дней отбирали выжившие микрокаллусы. После первого пассажа осталось 56% каллусов, после второго пассажа выживаемость составила 25% от исходного-числа эксплантов. Всего после двух пассажей было отобрано около 80 клонов без некрозов и с приростом массы больше 200% от исходного веса. Двадцать клонов среди отобранных имели участки ткани эмбриогенного типа. Для дальнейшей работы и проведения физиолого - биохимического анализа были выбраны пять стабильно растущих клонов, которые имели эмбриогенные зоны и зеленые апексы, т. е. обладали регенерационной способностью. Эти клоны существенно отличались от контрольного штамма линии А 188 и различались между собой по морфологии и эмбриогенной способности.

Каллусная ткань контрольного штамма А 188 в ходе длительного пассирования (18 месяцев) несколько снизила интенсивность роста и эмбриогенный потенциал. Цвет эксплантов изменился от светлого до более темного, желтовато-серого. На

- 10 -

среде с засолением змбриогенный 1саллус не образовывался.

Каллусная ткань клона N 88 имела ярко выраженную морфологию эмбриогенного типа. Экспланты были белого цвета, плотной, крупинчагой структуры. На поверхности эксплантов образовывалось в среднем по 5 - 10 зеленых апексов. В ходе культивирования в условиях засоления морфология данного клона практически не изменялась. Особенностью данного клона было получение хорошо растущей суспензии, которая была способна к формированию эмбриоидов и сохраняла ее в течение-1,5 лет культивирования.

Значительно меньшей эмбриогенной способностью обладали клоны NN 201, 203 и 232. Каллусная ткань этих клонов была более рыхлой, желтовато-белого цвета, имела меньшее количество зеленых апексов ( в среднем 2-4). При засолении образование змбриогенных зон и зеленых апексов не снижалось.

Каллусная ткань клона N 75 практически не обладала эмбриогенной способностью. Зкспланты были оводненными, серовато-желтого цвета, отмечено образование единичных зеленых апексов.

Эмбриогенная способность всех анализируемых клонов могла быть реализована: из клона N 88 были получены более 30 растений, из N 203 - 4 растения, из N 75 - 1 растение-.

Все клоны были выделены из одной популяции и в одинаковых условиях, однако, по морфологии каллуса, интенсивности роста и эмбриогенной способности они различались между собой. Интересно было выяснить их реакцию на засоление среды (рис.3).

Контрольный штамм линии А 188 имел невысокую интенсивность роста по сравнению с анализируемыми клонами. В условиях 0,5% засоления интенсивность роста практически не изменялась. Повышение концентрации NaCl в среде приводило к- снижению интенсивности роста. На среде с 1,5% NaCl рост эксплантов отсутствовал, каллусы имели серо-коричневый цвет и выглядели полностью некротизированными.

Рост клона N 75 в стандартных условиях был близок к росту контрольного штамма. В присутствии NaCl до 1% рост каллусов практически не снижался и только на концентрации 1,5% отмечено 50% ингибирование роста.

Клон N 203 по ростовым характеристикам в наименьшей степени проявлял признак солеустойчиЕости по сравнению с дру-

гими клонами. При повышении концентрации NaCl отмечено пропорциональное снижение роста. Однако, по внешним признакам Рис. 3. Зависимость роста клонов и штамма А 188

от засоления среды.

эоо

260,

200

0.6 1.0 NaCI,%

(отсутствию некрозов, светлой окраске) и по сохранению эмбри-огенного потенциала в условиях засоления его можно отнести к средне устойчивым.

Клон N 232 в отсутствии засоления имел высокую интенсивность роста, при 0,5% NaCl в среде рост каллусной ткани резко падал. Но при повышении содержания соли дальнейшее снижение роста не наблюдалось.' При 1,5% засолении вес эксплантов достоверно превышал показатели контрольного штамма в аналогичных условиях.

Для клона N 201, так же как для N 203 было характерно постепенное снижение роста при повышении засоления среды. Од--нако, на каждой из рассматриваемых доз NaCl прирост биомассы был ' выше, чем в клоне N 203 и контрольном штамме на соответствующих концентрациях.

У клона N 88 отмечена высокая интенсивность роста в отсутствии засоления и стимуляция роста в присутствии 0,5% NaCl. На среде с 1% и 1,5% NaCl рост биомассы был одинаковым.

Таким образом, анализируя рост контрольного штамма линии А 188 а также полученных клонов следует отметить:

1) Длительное культивирование (более 18 месяцев ) в

отсутствии селекции приводило к изменению морфологии кал-лусной ткани контрольного штамма по типу незмбриогенной.

2) Все клоны различались по ростовым характеристикам на стандартной среде и в условиях засоления. Эмбриогенный потенциал у клонов и был выше, чем у контрольного штамма и сохранялся на среде с NaCl.

Физиолого-биохимический анализ клонов и контрольного штамма Для выявления реакций возникающих в клетках солеустой-чивых клонов в ответ на действие засоления и для выяснения возможных механизмов солеустойчивости определили содержание ионов Na+ и К+ , общих растворимых Сахаров и свободных аминокислот и провели анализ изоферментного спектра эстераз и пе-роксидаз. Сравнивали характеристики каждого клона на среде без засоления и с 1% NaCl,

Ни в одном из рассматриваемых клонов содержание ионов На*"в каллусной ткани не превышало концентрации ионов в среде культивирования (табл.3). По-видимому, полученные клоны не проявляют свойство соленакопления и создания высокого осмотического давления за счет повышенной концентрации ионов внутри клеток. Наблюдаемое увеличение содержания ионов в 5-10 раз, возможно, является предельно допустимой внутриклеточной концентрацией для каждого клона. Можно отметить тенденцию к большему относительному накоплению ионов Na+ в каллусной ткани более резистентных клонов (N88, N201). 'Однако, у чувствительного клона N203 содержание Na+ еще выше.

Таблица 3. Содержание ионов Na+ и К+ в каллусной ткани контрольного штамма и устойчивых клонов (мМ/г сыр. веса).

Содержание Na+ Содержание K+

MS flZ NaCl MS +1% NaCl

А 188 2,4 19,7 5,2 5,7

N 75 3,4 15,4 6,2 5,9

N 88 2,1 20,5 5,4 6,4

N 201 2,7 24,4 4,6 4,4

N 203 4,3 26,9 4,4 5.4

N 232 4,4 22,3 5,5 5,8

Содержание К+ е рассматриваемых клоках и контрольном

штамме в стандартных условиях варьировало от 4,4 мМ до 6,2 мЫ на грамм сырого веса. При засолении концентрация К+ в большинстве клонов несколько возрастала, но в клонах N 75 и N 201 наблюдалось некоторое снижение концентрации К+ .

Т. о. , из приведенного анализа изменения содержания ионов Иа+и К+в каллусной ткани в условиях засоления нельзя сделать вывод о существовании корреляции между содержанием ионов и степенью солеустойчивости.

По содержанию общих растворимых Сахаров все клоны различались между собой (табл.4). При действии засоления в ряде анализируемых клонов содержание Сахаров увеличивалось (клоны NN 232, 88 ), в каллусной ткани клонов NN 75 и 201 оставалось практически неизменным и несколько снижалось в ткани 203 клона.

Таблица 4. Содержание общих растворимых Сахаров в каллусной ткани контрольного штамма и полученных клонов (м*г/г сыр. в. ).

MS MS+1% NaCl

А 188 0,22 0,31

N 75 0,36 0,35

N 88 0,14 0,32

N 201 0,24 0,25

N 203 0,28 0,25

N 232 0,25 0,30

Среди клонов с накоплением Сахаров при засолении следует отметить N 88. Данный клон характеризовался наибольшим относительным увеличением концентрации Сахаров на среде с 1% NaCl ( 228% относительно содержания в стандартных условиях). По-видимому, только для данного клона возможно • повышение • осмотического давления внутри клетки за счет увеличения концентрации Сахаров.

Одним из возможных механизмов солеустойчивости может быть изменение аминокислотного метаболизма. Изменения суммарного пула или содержания отдельных аминокислот для многих видов растений имеет определенные корреляции со степенью устойчивости к стрессам, в том числе и к засолению (Flowers et al. , 1977). Изучаемые клоны значительно различались по суммарному содержанию и по соотношению отдельных аминокислот

как на стандартной среде так и на средах с различным содержанием NaCl.

Контрольный штамм характеризовался высоким суммарным содержанием аминокислот. В наибольшей концентрации в клетках штамма присутствовал аланин. При засолении его содержание несколько снижалось. Действие засоления вызывало возрастание концентрации глутамина, гамма-аминомасляной кислоты и проли-на (рис. 4). При сравнении изменения аминокислотного состава штамма А 188 после 1,5 лет культивирования обращает на себя внимание резкое увеличение содержания суммы аминокислот и изменение их соотношения (рис. 2,4).' Возможно, это связано с потерей эмбриогенной способности штамма и соответствующим изменением метаболизма.

Рис. 4. Содержание свободных аминокислот у штамма А 188 пои засолении среды.

ткм/ г cud, в.

70 j----:-1

irtm

60--i-

60 -|-If —-jSjj-1 --

40-1-1|-|-r-р |-

30 -I —-|-|- - | --

20 !i?' S 85 10 о

О 0.6 1.0 1.6

% NaCl '

ESS asp ЕШд1и ЕШоШ из pro EHDela CZ)o-aba ЕЯ erg

Для клона N 88 было показано достаточно высокое содержание аминокислот на стандартной среде. Действие ' 0,5% NaCl приводило к резкому снижению содержания всех аминокислот. Одновременно, на данной концентрации соли отмечалась стимуляция роста ткани. Возможно, снижение концентрации аминокислот связано с активизацией биосинтетических и ростовых процессов, с активным вовлечением аминокислот в процессы биосинтеза белка. При повышении засоления среды в клетках клона возрастало содержание аспарагика, глутамина, пролина, аргинина и ГАМК (рис.5&).

88

О 0.5 10

«N80

■ ме Е2Эд1и О «и ЕИяо Е2«« О о-«» Шаг«

ткМ/д !г.%».

201

-гггЛПП

О 0.5 10 18

» ыаО

1и БЭдк< ЕЗд* ЕЯ ига СПиа СЭд-ш Ш п

203

ткМ/д

-

\

•

п I

«--П-! "'ШШ

о 05 го

8 ЫвО

■Зт БЭдь Шди ЕЭрга ЕШаа ШЗр-аь»

ткМ/д |г.и.

232

Л

Об 10 и

«N80

ВЕЗ«» Б2д<и ЕЗдт ЕЯ»<о ЕЭяа Од-мх Шп

Рис. 5. Содержание свободных аминокислот в каллусных клонах.

- 16 -

Клоны N 201 и N 232 со средней резистентностью к засолению характеризовались значительно меньшим суммарным содержанием аминокислот и сходной реакцией на засоление (рис.5 Б, В). В этих клонах на стандартной среде в наибольшей концентрации присутствовала гамма-аминомасляная кислота. При засолении до 1% NaCl у клона N 232 тормозился рост и снижалось содержание аминокислот. Возможно, в данном случае это связано с поддержанием эмбриогенности в условиях засоления. Содержание пролина возрастало в клетках этих клонов только при 1,5% засолении. Основной реакцией этих клонов в стрессовых условиях была детоксикация аммиака.

Клон N 203 характеризовался значительным содержанием аминокислот. На стандартной среде в наибольшей концентрации присутствовали аланин, ГАМК (рис.5 Г). Действие засоления вызывало значительное возрастание содержания пролина, и ГАМК, т.е. устойчивость этого клона, по-видимому, связана с осморегуляцией.

На основании проведенного анализа содержания свободных аминокислот в клетках каллусной ткани полученных клонов и контрольного штамма нельзя говорить о выявлении единых и однозначных маркеров устойчивости к засолению. Селективное давление и условия in vitro приводят к появлению солеустойчивых вариантов с существенно различающимися морфологическими, ростовыми и физиолого-биохимическими характеристиками. Каждый из рассмотренных клонов имел индивидуальные характеристики значительно отличающиеся друг от друга. Возможно, эт'о связано с преобладанием и активизацией конкретных регуляторных механизмов, направленных на создание солеустойчивости, индивидуальных для каждого клона. Из наиболее общих признаков, сопутствующих реакции на засоление, следует' отметить снижение содержания аланина, значительное возрастание концентрации пролина, увеличение количества глутамина, аспарагина и ГАМК, но выделить маркерные аминокислоты или группу аминокислот "солеустойчивости" для всех клонов или для каждого оказалось невозможно.

Для уточнения возможности специфических реакций на засоление был проведен изоферментный анализ пероксидаз и эсте-раз. Данный метод широко используется для изучения внутривидовой и популяционной изменчивости (Глазко, ..Созинов, 1993) и

в последнее время для оценки изменений, возникающих в результате сомаклональной вариабельности (Атаева и др., 1991).

При анализе спектров эстераз на стандартной среде и при 1% засолении выделяются основные зоны Е4, ЕЮ, Е9, Е8. Во всех клонах по сравнению с контролем уменьшается подвижность в зоне Е4. В зонах ЕЮ, Е9 и Е8 отмечены количественные изменения активности, но различия между клонами незначительные, На среде с NaCl в клонах N 232 и N 203 изменений нет. В клоне N 201 снижается, а в клоне N 88 увеличивается активность в зоне Е8.

Т. о. , анализ эстеразного спектра позволяет выявить различия клонов и контрольного штамма возникающие в результате сомаклональной вариабельности. Незначительные количественные изменения, обнаруживаемые в солеустойчивых клонах при действии засоления, не позволяют использовать данную систему для выявления изменений связанных с солеустойчивостью.

При анализе изозимов пероксидаэы штамма А 188 были обнаружены зоны Рхб и Рх12 и в контроле,и при засолении. Все клоны отличались от исходного штамма. У них отмечена активность в зоне РхЮ и наблюдались количественные различия между собой по РхЮ и Рх12. При засолении в клонах N 88 и N 203 усиливалась активность Рх12, а в клоне N 201 - РхЮ. Одновременное рассмотрение характеристик клонов в стандартных условиях и при засолении позволяет их идентифицировать.

На основании рассмотренных результатов можно сделать следующие заключения:

1) Выявленные различия между контрольным штаммом и клонами позволяют использовать систему анализа эстераз и пероксидаз для детекции сомаклональной вариабельности.

2) Различные клоны имеют несколько отличающиеся изменения изоферментного спектра в ответ на засоление. Однако, выявить общие тенденции в изменении изоферментных спектров, связанные именно "с засолением, а не сомаклональной вариабельностью, не удалось.

Характеристика растений-регенерантов и их потомства.

В ходе, первого этапа селекции часть эмбриогенного, устойчивого к NaCl каллуса из каждого пассажа использовали для получения растений - регенерантов (табл.5). После четвертого пассажа» хотя каллусная ткань сохраняла эмбриогенный

тип, ее способность к регенерации практически отсутствовала.

Таблица 5. Индукция регенерации на среде с ЫаС1.

Пассажи

1 2 3 4

Отсажено растений

для укоренения 18 23 9 4

Получено регенерантов 4 8 3 4

(из них кустистых) (4) (3) (1) (3)

Растения с початками 4 О 1 0

Растения - регенеранты, полученные в селективных условиях и без селективного давления оценивали по количественным признакам (табл.6). Они весьма отличались друг от друга и, по-видимому, действие селективного давления не приводило к единому смещению количественных признаков и не снижало гетерогенности полученной популяции растений-регенеран-тов.

Таблица 6. Характеристика растений-регенерантов Ш.

Признаки Число пассажей на МаС1

О 1 2 3 4

число растений 30 4 8 . 3 4

число побегов 1-2 1-3 1-5 1-2 1

высота побегов

(см) 68,3+8,7 10б±8,7 106,1±15,5 71,7122,4 70,7121,1

длина листа

(см) 52,4±3,8 62,4±4,б 61,, 2±5,3 51,6±3,8 54,719,8

ширина листа

(см) 4,5±0,7 8,410,5 4,3±0,3 2,5±1,0 5,210,9

размер метелки

(см) 22,8±3,1 27,513,1 30,3±2,8 10±2,5 18,315,8

число веточек к <е телки

(шт.) 4.1+1.6 9,2+1,1 5±1,б ' 2+1,7 1,2+0,2

Семена одного из регенерантов ЯО (Ыг1), полученного после одного пассажа на МаС1, с лучшими морфометрическими показателями и с наибольшим количеством зерен были использованы для получения и анализа потомства Все растения И имели нормальную морфологию и не отличались от контрольной линии, хотя среди

них было обнаружено до 10% альбиносов.

У растений R1 были получены семена после принудительного самоопыления при строгой изоляции - R2 и при возвратном скрещивании с исходной линией - Bel. Растения R2 и Bel имели нормальную морфологию и по ростовым показателям несколько превышали показатели контрольной линии. Альбиносов среди растений R2 и Bel не было.

Сохранение солеустойчивости у потомства регенерантов было проверено двумя способами. Сначала были тестированы семена, полученные от всех имевшихся регенерантов R0 на гидропонной установке, позволяющей создавать одинаковые условия, для большого, числа растений.

Наиболее высокие показатели энергии прорастания и выживаемости имели растения, полученные из каллусной ткани, отобранной после одного пассажа на NaCl ( рис. 6). Увеличение числа пассажей на NaCl не приводило к получению растений-регенеран-тов с большей устойчивостью к действию засоления.

120

Рис. 6. Энергия прорастания и. выживаемость растений Rl в условиях засоления (0,5% МаС1).

А 188 Nr1(1) Nr2(1) Nr3(1) Nr4(1) Nr6(3) Nr6(3) Nr7(4) Nr8(4)

BB Прорастание • H Выживаемость (10 д.) О Выживаемость (20 д.) ВИ Выживаемость (30 д.)

При тестировании потомства регенерантов R1 в почвенном опыте показано сохранение устойчивости (табл.7).

Для определения наследования признака солеустойчивости в растениях, полученных от солеустойчивого регенеранта Nr-1,

Таблица 7, Характеристика потомства растений-регенерантов (R1).

Растения Высота Число листьев Длина листа Ширина листа

(варианты) см шт. см см

1. А 188

(пресн. фон) 88±6,0 7,8±0,3 69,0±3,1 3,9±0,3

2. А 188 - - -

(засоление) растения погибли

3. NR-1

(пресн. фон) 103,3±12,7 8,0±0 71,7±9 4,5±0,2

4. NR-1

(засоление) 78,7±4,3 7,4±0,5 52±5,8 4,1±0,3

семена R2 и Bel также проверяли на гидропонной установке. Были получены сл&дующие результаты (рис.7) :

1) Все семена имели энергию прорастания выше контроль-, ной линии в 2 -2,5 раза.

2) Гибель растений была значительно ниже, чем у контрольной линии.

3) Гибриды имели особенно высокую энергию прорастания, выживаемость и дольше всех сохраняли жизнеспособность.

Это позволяет сделать вывод о доминантном характере наследования признака солеустойчивости .

Рис. 7. Энергия прорастания и выживаемость растений R2 и Bel е условиях засоления (0,5% NaCl).

ъ

веч Прорастание Ш Выживаемость (10 д.)

О Выживаемость (20 д.) Ш Выживаемость (30. д.)

- 21 -

При анализе изозимных спектров пероксидаз и эстераз у проростков Rl, R2 и Bel в условиях гидропоники было показано, что солеустойчивые растения-регенеранты R1 отличаются по проявлению эстеразной активности от контрольных растений исходной линии А 188: 1) изменением подвижности Е4, которое не связано с действием NaCl, 2) появлением дополнительной полосы в зоне между Е8 и Е9 в условиях засоления. Данный признак проявляется в контрольных растениях только при действии NaCl, а в растениях-регенерантах присутствует постоянно, это может свидетельствовать о конститутивной активности данной изоформы фермента в солеустойчивых растениях.

При анализе изозимов пероксидаз у линии А 188 при засолении появлялась зона активности Рхб, которая отсутствовала на пресном фоне. Кроме того, при засолении проявлялась слабая активность в зоне ЕЮ. В растениях Rl, R2, Bel активность локусов рхб и рхЮ обнаруживалась как при засолении, так и в его отсутствии.

Т. о. , полученные результаты позволяют рассматривать ферментную систему эстеразы и пероксидазы в качестве потенциального маркера солеустойчивости и сомаклональной вариабельности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивируемые клетки и растения-регенеранты являются перспективной моделью для изучения солеустойчивости растений. Путем селекции _ in vitro получены резистентные к NaCl клеточные клоны с различными свойствами и растения-регенеранты, наследующие признак солеустойчивости.

Применение физиолого-биохимических методов анализа выявило разнообразие реакций изучаемых клонов в ответ на одинаковые стрессовые условия. Каждый клон проявлял индивидуальную реакцию по изменению интенсивности роста, эмб-риогенной способности, аминокислотного метаболизма, содержанию ионов, Сахаров, изоферментному спектру эстеразы и пероксидазы, что позволяет сделать предположение о сочетании различных механизмов и метаболических путей в реализации солеустойчивости каждого клона.

Использование клеточной культуры в практических целях как донора устойчивости к стрессовым факторам предполагает сохранение змбриогенного потенциала для получения растений,

экепрессирующих устойчивость. Значительным препятствием в получении растений-регенерантов в длительно ' культивируемых культурах, и, особенно при воздействии стрессовых селективных факторов является потеря эмбриогенной способности клеточных линий. Проведение клеточной селекции в два этапа и использование в качестве теста эмбриогенной способности каллусной ткани позволило получить солеустойчивые клеточные клоны и растения-регенеранты. Растения-регенеранты и их потомство, а так же гибриды, полученные в результате возвратного скрещивания с исходной несолеустойчивой линией, сохраняли признак солеустойчивости при тестировании в различных условиях, что позволяет рекомендовать эту систему отбора для создания исходного для селекции материала - доноров устойчивости.

Изоферментный анализ эстераз и пероксидаз выявил наличие изменений спектров, связанных с сомаклональной вариабельностью в анализируемых клонах и растениях-регенерантах. Проявление экспрессии Рхб и РхЮ в растениях контрольной линии являлось ответом на стресс при действии засоления. Наличие конститутивной, т.е. не зависящей от действия NaCl экспрессии этих ке локусов в солеустойчивых растениях может рассматриваться как потенциальный маркер солеустойчивости.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема двухступенчатой селекции in vitro на солеустойчивость. '

2. Отбор устойчивых клеточных клонов проходил по двум показателям - рост и сохранение эмбриогенной способности в условиях засоления. Среди анализируемых клонов выделена уникальная клеточка? линия, дающая эмбриогенную суспензию.

3. Дана физиологе-биохимическая характеристика контрольного штампа и резистентных клеточных линий. Показано, что устойчивость к NaC] определяется разными факторами - повышенным внутриклеточным содержанием Na+, растворимых Сахаров, накоплением ряда аминокислот.

4. Установлено, что клеточные клоны обладают комплексным механизмом устойчивости, индивидуальным для каждого клона. Т. е. при использовании одного исходного клеточного материала и одинаковых условий клонирования изменения происхо-

дят случайно и независимо.

5. Из устойчивой к 1% NaCl клеточной линии получены со-леустойчивые растения-регенеранты. Показано сохранение признака солеустойчивости в первом и втором поколениях. Использование беккроссов позволило оценить доминантный характе] наследования.

6. Сравнение изоферментных спектров эстераз и перокси-даз исходного штамма, клеточных клонов, растений-регенеранто! в трех поколениях позволяет предложить этот метод для тестирования сомаклональной вариабельности у кукурузы.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Ларина С. Е .Долгих Ю. И. .Шамина 3. Б. Применение культуры тканей кукурузы для тестирования

устойчивости к абиотическим стрессам. Матер, науч. конф. по с/х биотехнологии,Целиноград,1991г. ,стр. 40-41.

Z. Долгих Ю. И., Ларина С. Е , Болонкина Ю. R Анализ изменчивости регенерантов инбредной линии AI88. Генетика,1992,т. 28,N 6,с. 74-81.

3. Y. 1. Dolgykh, Y. V. Bolonkina, S.N. Larina, Z. В. Shamina. Somaclonal variability in inbred line A188. Maize Genet. Coop News letter, 65, 1991, p. 89,

4. Y. I. Dolgykh,S. N. Larina,Z. B. Shamina Use of tissue culture to test plant resistance to abiotic stress. Maize Genet. Coop. News Letter, 66, 1992, p..82.

5. Ларина С.E .Долгих Ю.И.,Шамина 3.Б. Получение и физиологическая характеристика солеустойчивых линий кукурузы. 3 Съезд Всероссийского общества физиологов растений,24 - 29 июня 1993 г. ,С-Петербург,тез. докладов,т. б,с. 648.

6. Долгих Ю. И. , Ларина С. Е , Пустовойтова Т. Е , Панова Е Е. ,Шамина 3. Б. Получение засухоустойчивых растений кукурузы методом клеточной селекции. 2 междунар. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алматы, 1993, тез. докл. , с. 98.

7. Долгих Ю. И. .Ларина С. Е .Шамина 3. Б. Селекция in vitro на устойчивдсть к абиотическим стрессам. Тез. конф. по генетике соматических клеток в культуре,п. Черноголовка,Моск. обл. ,22 -24 ноября 1993 г. ,с. 9.

8. S. N. Larina, YU. I. Dolgykh,Z. В. Shamina Development of

NaCl-résistant callus .culture and régénérant. Maize Genet. Coop. News Lett. , v. 67,1993, p. 84.

9. Ларина С..H. .Забродина M. В. .Долгих Ю. И. Возможность применения изоферментных спектров пероксидазы и эстеразы для тестирования солеустойчивости кукурузы. Тез. конф. " Молекуляр-но-генетические маркеры растений". Киев, "Аграрна наука", 1994, с. 40-41.

10. Долгих КХ И. , Ларина С. Е , Шамина 3. Б. , Жданова Е Е. , Пустовойтова Т. Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгли-коля меточных линий. Физиол. Раст. ,• 1994, т. 41,. N6, с. 853-858.

11. Долгих Ю. И. , Забродина M. R , Ларина С. Е , Хавкин Э. Е. , Шамина 3. Б. Наследуемая сомаклональная изменчивость у кукурузы. Меддунар. симп. "Биотехнология растений и генная инженерия", тез. докл. С. 15.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ларина, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы солеустойчивости.

2. Использование клеточной культуры для изучения солеустойчивости.

3. Получение солеустойчивых клеточных линий и растений регенерантов

4. Получение солеустойчивых растений-регенерантов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика исходной каллусной ткани и реакция на присутствие NaCl в среде

2. Получение солеустойчивых клеточных клонов.

3. Физиолого-биохимический анализ клонов.

4. Характеристика растений-регенерантов и их потомства

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточные линии и растения-регенеранты как модель для изучения солеустойчивости"

В результате исфкусйвенного орошения в возделываемых почвах возрастает содержание солей. Это делает их малопригодными для культивирования сельскохозяйственных растений,ограничивает естественные ареалы дикорастущих видов растений. В связи с этим актуальной задачей становится получение новых солеустойчивых форм растений. Эффективное получение таких солеустойчивых форм невозможно без глубокого знания физиологических и генетических процессов, лежащих в основе солеустойчивости.

Применение разнообразных физиологических,биохимических, генетических подходов в современных исследованиях выявило значительную сложность проблемы солеустойчивости.

Солеустойчивоеть растительного организма может обеспечиваться в результате самых разнообразных физиологических реакций, затрагивающих практически все метаболические процессы, происходящие в растительной клетке. По мнению современных исследователей солеустойчивоеть растений является полигенным признаком со сложной системой регуляции активности генов. Однако, "выделить" и локализовать эти отдельные гены в растениях пока не удалось.

Многосторонность проблемы солеустойчивости требует привлечения новых, перспективных подходов, направленных на ее решение. Одним из таких подходов может быть применение метода культивируемых клеток in vitro. Использование данного метода раскрывает широкие перспективы в изучении солеустойчивости.

Клеточная культура позволяет анализироватьфизиологические реакции происходящие на клеточном уровне вусловиях засоления. В условиях отсутствия координирующего и регулирующего влияния целого растительного организма более четко выявляются реакции собственно клетки. В культуре клеток in vitro эффективно анализируются цепи биохимических реакций и трансформации веществ. Выявление наиболее существенных физиологических реакций, связанных с солеустойчивостью, позволит использовать их в качестве маркерных для проведения тестирования и отбора солеустойчивых форм.

В результате разнообразных приемов селекции in vitro становится возможным получение различных культивируемых клеточных линий с заранее "заданными" характеристиками, в том числе, с конкретным изменением определенных метаболических процессов. Сомаклональная вариабельность in vitro позволяет выявить специфические варианты сочетания физиолого - биохимических реакций, связанных с солеустойчивостью, которые возможны только in vitro и не проявляются на уровне целого растения.

Свойство тотипотентности клеток растений позволяет получать растения-регенеранты из различных клеточных культур. Становится возможным получение растений-регенерантов сохраняющих признак солеустойчивости как на клеточном так и на организменном уровне. Изучение реализации и наследования данного признака межет ответить на вопросы, связанные с генетической основой солеустойчивости и влиянием эпигенетических факторов на проявление данного признака. Кроме того, получение солеустойчивых форм растений может иметь важное значение для создания новых сортов.

Т. о. методы культивирования in vitro занимают особое место в изучении проблемы солеустойчивости. Клеточнаякультура и получаемые из нее растения-регенеранты представляют собой модель для изучения физиологических основ солеустойчивости и ее реализации на клеточном уровне и на уровне целого растения.

Целью настоящего исследования было изучение модельной системы "клеточная культура in vitro и растения-регенеранты" применительно к проблеме солеустойчивости растений. Для ее решения были поставлены следующие задачи:- путем селекции in vitro получить клеточные клоны резистентные к действию высоких концентраций NaCl- провести оценку солеустойчивости полученных клонов- изучить физиолого-биохимические реакции полученных клонов и контрольной линии в условиях засоления и на пресном фоне- получить растения-регенеранты из солеустойчивой клеточной культуры- оценить солеустойчивость растений-регенерантов и их потомства- оценить возможность применил метода изоферментного анализа для тестирования солеустойчивости клеточных клонов и растений

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ларина, Светлана Николаевна

- 98 -ВЫВОДЫ

1. Разработана схема двухступенчатой селекции in vitro на солеустойчивость.

2. Отбор устойчивых клеточных клонов проходил по двум показателям - рост и сохранение эмбриогенной способности в условиях засоления. Среди анализируемых клонов выделена уникальная клеточная линия, которая может длительно культивироваться в форме эмбриогенной суспензии.

3. Дана физиолого-биохимическая характеристика контрольного штамма и резистентных клеточных линий. Показано, что устойчивость к NaCl определяется разными факторами - повышенным внутриклеточным содержанием Na+, растворимых Сахаров, ряда аминокислот.

4. Установлено, что клеточные клоны обладают комплексным механизмом устойчивости, индивидуальным для каждого клона. Т. е. при использовании одного исходного клеточного материала и одиниковых условий клонирования изменения происходят случайно и независимо.

5. Из устойчивой к 1% NaCl клеточной линии получены со-леустойчивые растения-регенеранты. Показано сохранение признака солеустойчивости в первом и втором поколениях. Использование беккроссов позволило оценить доминантный характер наследования.

6. Сравнение изоферментных спектров эстераз и перокси-даз исходного штамма, клеточных клонов, растений-регенерантов в трех поколениях позволяет предложить этот метод для тестирования сомаклональной вариабельности.

- 96 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивируемые клетки и растения-регенеранты являются перспективной моделью для изучения солеустойчивости растений. Путем клеточной селекции получены солеустойчивые клеточные клоны с различными свойствами.

Применение физиолого-биохимических методов анализа выявило разнообразие реакций изучаемых клонов в ответ на воздействие одинаковых стрессовых условий. Каждый клон проявлял "индивидуальную" реакцию по изменению интенсивности роста, эмбриогенной способности, аминокислотного метаболизма, содержанию ионов, Сахаров, изоферментному спектру. Что позволяет сделать предположение о сочетании различных механизмов и метаболических путей в реализации солеустойчивости каждого клона. В то же время, большинство выявляемых реакций, в той или иной мере присущих каждому клону, характерны и для других объектов. К таким реакциям относится повышение содержания пролина, возрастание концентрации ионов Na в клетках каллусной ткани.

Проведение клеточной селекции в два этапа позволило получить солеустойчивые клеточные клоны, сохраняющие свойство эмбриогенности. В ходе отбора весьма существенное значение в оценке солеустойчивости наряду с ростовой характеристикой имеет показатель эмбриогенной способности каллусной ткани. Выявленное соответствие между высокой эмбриогенной способностью клона А 188 и его наибольшей солеустойчивостью, позволяет предположить, что эффективный отбор резистентных форм в исходно эмбриогененой клеточной линии затруднен без учета сохранения признака эмбриогенности ткани.

- 97

Получение растений-регенерантов кукурузы из солеустойчивых клеточных линий позволили оценить возможность реализации признака солеустойчивости клеток на уровне целого организма. Растения-регенеранты и их потомство, а так же гибриды, полученные в результате возвратного скрещивания с исходной несолеустойчивой линией проявляли признак солеустойчивости при тестировании в различных условиях. Солеустойчивость наследовалась как доминантный ядерный признак.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ларина, Светлана Николаевна, Москва

1. Бабурина О. К Возможная защитная роль бетаинов у растений люцерны (Месиса^о) в условиях засоления ИаС1: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: ИФР РАН, 1990. С. 25.

2. Балнокин Ю. В. , Мазель Ю. Я Проницаемость плазматической мембраны галофильных водорослей БипаПеПа для ионов Иа+. Физиол. Раст. , 1985, т. 32, вып. 1. С. 33. 3. Балнокин

3. Ю. В. , Строгонов Б. П. Значение солевого обменав солеустойчивости растений. Ташкент, изд-во "ФАН" УзССР, 1989, С. 3.

4. Белянская С. Л., Шамина 3. Б. Получение и характеристика клонов риса, резистентных к стрессовым факторам. Физиол. Раст. , 1993, т. 40, N4. С. 681.

5. Белянская С. Л , Шамина 3. Б. Морфогенез в клонах риса, резистентных к стрессовым факторам. Физиол. Раст. , 1994, т. 41, N4. С. 681.

6. Бородина Р. А. Свободный пролин и солеустойчивость озимого рапса. Физиол. и биохим. основы солеуст. растений. Тез. докл. , 1986, С. 60.

7. Ву Дык Куанг, Шамина 3. Б. Цитгенетический анализ клонов, полученных от индивидуальных клеток и протопластов кукурузы. Цитология и генетика, 1985, т. 19, N1. С. 26.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Т. 1. Под ред. Кретовича В. Л , М. , "Мир", 1986. С. 364.

9. Глазко В. И. , Созинов И. А. Генетика изоферментов животных и растений. Киев, "Урожай", 1993. 525 с.

10. Долгих Ю. И. , Ларина С. Е , Шамина 3. Б. Селекция на осмо- 100 устойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-ре-генерантов. Физиол. Раст. , 1994, т. 41, N1. С. 114.

11. Дридзе И. JL Использование аналога пролина для отбора стрессоустойчивых вариантов в культуре тканей сои и табака. Автореферат . канд. биол. наук. М. , ВНИИСБ, 1990. 24 с.

12. Завадская Е Г. , Шухтина Г. Г. Влияние комбинированного действия обезвоживания и супероптимальных температур на теплоустойчивость клеток листьев засухоустойчивого ячменя. Цитология, 1971, т. 13, N10. С. 1304.

13. Захарин А. А. О некоторых особенностях солевого обмена гликофитов при засолении среды. Агрохимия, 1980, N8. С. 139.

14. Калинкина JL Г. Накопление пролина и растворимых Сахаров у микроводорослей при длительном солевом стрессе. Физиол. и биохим. основы солеуст. растений. Тез. докл. , 1986, С. 57.

15. Калинкина JL Г. , Наумова Т. Г. Роль фотодыхания в накоплении пролина в клетках Chlorella stigmtophora при засолении. Физиол. Раст. , 1993, т. 40, N4. С. 577.

16. Кирьян И. Г. , Шевякова Е И. Пути накопления пролина у NaCl-резистентной клеточной линии Nicotiana sylvestris. Физиол. Раст., 1984, т. 31, N4. С. 712.

17. Клячко Е JL , Кулаева 0. Е Теплоустойчивость белковогфинтеза у листьев разного возраста. ДАН СССР, 1969, т. 188, N1. С.230.

18. Колупаев Ю. Е. , Трунова Т. И. Активность инвертазы и содержание углеводов в колеоптилях пшеницы при гипотермическом и солевом стрессах. Физиол. Раст. , 1994, т. 41, N4. С. 552.

19. Кузнецов Вл. В., Рошупкин Б. В. Стрессорный ответ клеток Nicotiana sylvestris на засоление и высокую температуру. 2. Синтез белков теплового шока и фосфорилирование полипептидов.

20. Физиол. Раст. , 1994, т. 41, N4, С. 566.

21. Кузнецов Вл. В. , Хыдыров Б. В. , Рошупкин Б. В. , Борисова Е Е Общие системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: факты и гипотезы. Физиол. Раст. , 1990, т. 37, вып. 5. С. 987.

22. Куркова Е. Б. , Балнокин Ю. В. Пиноцитоз и его возможная роль в транспорте ионов в клетках соленакапливающих органов галофитов. Физиол. Раст., 19946 т. 41, N4. С. 578.

23. Кучеренко JL А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под ред. Бутенко. М. , "Наука", 1991. С. 232.

24. Кучеренко JL А. , Харченко П. Е , Ковалева Е. Е Использование методов биотехнологии в селекции риса. Состояние и развитие с. х. биотехнологии. Матер. Всесоюз. конф. , М. , июнь 1986. С. 92.

25. Лапина JL Е , Строгонов Б. П. Локализация солей в клетках в связи с приспособлением растений к условиям засоления. Успехи совр. биол. , 1979, т. 88, вып. 1. С. 93.

26. Люттге У., Хигинботам Е Передвижение веществ в растениях. М.: Колос, 1984. С. 408.

27. Маурер Т. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. М., "Мир", 1971.

28. Ошмарина В. И. , Шамина 3. Б. , Бутенко Р. Г. Получение резистентных к NaCl и этионину клеточных линий Nicotiana sylvestris и их характеристика. Генетика, 1983, т. 19, N5. С. 822.

29. Полевой В. В., Саламатова Т. С. Протонные насосы и их функциональная роль. Итоги науки и техн., Физиология расте- 102 ний. M. ВИНИТИ, 1980. 230 с.

30. Самыгин Г. А. Причины вымерзания растений. М. , Наука, 1971. С. 192.

31. Семихатова 0. А. , Иванова Т. И. , Щцина 0. С. Дыхательная цена произрастания в условиях засоления. Физиол. Раст. , 1994, т. 40, N4. 0. 558.

32. Сидоров В. А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, "Наукова думка", 1990. 280 с.

33. Собко В. Г. , Шамина 3. Б. , Строгонов Б. П. Получение адаптированной к NaCl клеточной линии Crépis capillaris. Физиол. Раст. , 1981, т. 28, вып. 6. С. 1198-1203.

34. Строгонов Б. П. Физиологические основы солеустойчивости растений. М. Изд-во АН СССР, 1962. 366 с.

35. Строгонов Б. П. Солеустойчивость растений. Физиология сельскохозяйственных растений. М. Изд-во Моск. ун-та, 1967, т. 3. С. 270.

36. Строгонов Б. П. Метаболизм растений в условиях засоления. XXXIII Тимирязевские чтения. М. Наука, 1973. 52 с.

37. Удовенко Г. В. Солеустойчивость культурных растений. Л "Колос", 1977. 215 с.

38. Удовенко Г. В. Состояние и пути решения проблемы солеустойчивости растений. М., изд-во ВНИИТЭИСХ, 1978. 41 с.

39. Удовенко Г. В. Механозмы адаптации растений к засолению почвы: физиологические и генетические аспекты солеустойчивости. Проблемы солеустойчивости растений. Ташкент, "ФАН"1. УзССР, 1989. С. 113.

40. Хочачка П. , Сомеро Дж. Стратегия ббиохимической адаптации. Е: Мир, 1977. С. 124.

41. Чернышева В. Г. , Долгих Ю. И., Шамина 3. Б. , Бутенко Р. Г.- 103

42. Влияние генетических характеристик исходных растений на мор-фогенный потенциал каллусных клеток кукурузы. Докл. АН СССР, 1988, т. 300, N1. С. 227.

43. Шевякова Е И. Метаболизм серы в растениях. М. , "Наука", 1979. 186 с.

44. Шевякова Е И. Метаболическая роль ди- и полиаминов в растениях. Физиол. Раст. , 1981, т. 28, N6. С. 1052.

45. Шевякова Е И. Состояние и новые подходы к решению проблемы солеустойчивости растений. Физиол. и биохим. основы со-леуст. растений. , тез. докл. , 1986. С. 54.

46. Шевякова Е И. Хроника. Международная: конференция по полиаминам в естественных науках. Физиол. Раст. , 1987, т. 34, N3. С.

47. Шевякова Е И. Состояние и новые подходы к решению проблемы солеустойчивости растений. Проблемы солеустойчивости растений. Ташкент, изд-во "ФАН" УзССР, 1989. С. 95.

48. Шевякова Е И. , Кирьян И. Г. , Строгонов Б. П. Повышенная скорость образования спермидина у NaCl-резиетентной клеточной линии Nicotiana sylvestris. Физиол. Раст. , 1984, т. 31, вып. 5. С. 810.

49. Шевякова Е И. , Рощупкин Б. В. , Парамонова Е В. , Кузнецов Вл. В. Стресеорный ответ клеток Nicotiana sylvestris на засоление и высокую температуру. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров. Физиол. Раст., 1994, т. 41, N4. С. 558.

50. Abel G. Н. Inheritance of the capacity for chloride inclusion and chloride exclusion by soybeans. Crop Sei. , 1969, v. 9, N6. P. 697.

51. Anil D. , Noel E. Т. H. Deleted forms of plastid DNA inalbino plants from cereal anther culture. Curr. Genet. 1985, v. 9, N8. P. 671.

52. Ashraf M. The effect of NaCl on water relation, chlorophyl and proline contents of two cultivars of blackgram (Vigna mungo L.). Plant Soil, 1989, v. 119. P. 205.

53. Ashraf M. Organic substances responsible for salt tolerance in Eruca sativa. Biol. Plant., 1994, v. 91, N1. P. 255.

54. Austenfeld F. A. The effect of various alkaline salts on glycolate oxidase of Salicornia europaea and Pisum sativum in vitro. Physiol. Plant. ,1976, v. 36, N1. P. 82.

55. Bayliss M. H. Chromosomal variation in plant tissues in culture. Int. Rev. Cytol. , 1980, v. 11a, suppl. P. 113.

56. Ben-Hayyim G. , Kochba J. Aspects of salt tolerance in NaCl-selected stable cell line of Citrus sinensis. Plant Physiol. , 1983, v. 72. P. 685

57. Benzioni A. , Itai Ch. Preconditioning of tobacco and bean leaves to heat shock by high temperature or NaCl. Plant Physiol., 1975, v. 35, N2. P. 80.

58. Bernstein L. Osmotic adjastment of plants to saline media 2. Dinamic phase. Amer. J. Bot. , 1963, v. 50. P. 360.

59. Bernstein L. , Ayers A. D. Salt tolerance of five varietes of carrot. Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. , 1953, v. 61. P. 360.

60. Billard J. B. , Boucard J. Effect of NaCl on te activities of glutamate syntase from a halophyte Suaeda maritima and from glycophyte Phaseolus vulgaris. Phytochemistry, 1980, v.19, N9. P. 1939.

61. Binzel M. L. , Hasegawa P.M., Rhodes D. Solute

62. Physiol. , 1987, v. 84. P. 1408.

63. Binzel M. L. , Hess F. D. , Bressan R. A. , Hasegawa P. № Intracellular compartmentation of ions in salt adapted tobacco cells. Plant Physiol., 1988, v. 86. P. 607.

64. Blumwald E. , Tel-Or E. Osmoregulation and cell composition in salt adaptation of Nostoc muscorum. Arc. Microbiol. , 1982, v. 132, N2. P. 168.

65. Borkird C. , Sung R. Z. Isolation and characterization of ABA-insensitive cell lines of carrot. Plant Physiol. , 1987, v. 84. P. 1001.

66. Boucard J. , Billard J. B. Characterization de la glutamate chez un halophyte obligatore: le Suaeda maritima var. microcarpa. Physiol. Plant. , 1978, v. 44, N1. P. 31.

67. Bressan R. A. , Singh N. K. , Handa A., K. Resistance of cultured higher plant cell to polyethyleneglycol-induced water stress. Plant Sci. Lett., 1981, v. 21. P. 23.

68. Bressan R. A., Singh N. K. , Handa A., K. et al. Stability of altered genetic expression in cultured plant cells adapted to salt. Drought Resistance in Plants. Physiological and Genetic Aspects. 1987. Eds.: L. Monti, Porceddu E. , Brussels: EEC. P. 41.

69. Brettel R. I. S. , Pallotta M. A. , Gustafson J. P. , Appels R. Variation at the Nor loci in Triticale derived from tissue culture. Theor. and Appl. Genet., 1984, v. 71, N4. P. 637.- 106

70. Briens M. , Larher F. Osmoregulation in halophytic higher plants: a comparative study of soluble carbohydrates, polyols, betaines and free proline. Plant Cell Environ., 1982, v. 5. P. 287.

71. Bright S. V. J. , Shwery P. R. Improvement of protein quality in cereals. Critical Reviewes in Plant Sciences. Boca Raton (Fl.): CRC Press, 1983, V. 1. P. 49.

72. Brugge man V. , Janiesh P. Comparison of plasma membrane ATP-ase from salt-treated and salt-free grown Plantago maritima L. J. Plant Physiol. , 1988, v. 134, N1. P. 26.

73. Chandler S. F. , Thorpe T. A. Characterization of growth, water relation and proline accumulation in sodium sulfate tolerant callus of Brassica napus L. cv. Westar. Plant Physiol. , 1987, v. 84. P. 106.

74. Cheesemann J. M. Mechanisms of salinity tolerance in plants. Plant Physiol. , 1988, v. 87, N3. P. 547.

75. Conti G. J. , Bocci A.M., Sprocati № T. Peroxidase and polyphenoloxydase isoenzymes, hypersensitive reaction and systemic induced reaction in Nicotiana glutinosa L. infected with tobacco mosaic virus. Rev. Patol. Veg. , 1982, v. 13, N1. P. 1.

76. Cooper D. B. , Sears R. G. , Lookhart G. L. , Jones B. L. Heritable somaclonal variation in gliadin proteins of wheat plants derived from immature embryo callus culture. Theor. and Appl. Genet., 1986, v. 71, N6. P. 784.

77. Crougham T. P. , Stavarek S. J. , Rains D. W. Selection of NaCl-tolerant line of cultured alfalfa cells. Crop Sci., 1978, v. 18. P. 959.

78. Curtiss C. D. , Widholm J. M. , Gonzales R. A. Selection and characterization of methionine and tryptophane analog resistant asparagus cells. J. Plant Physiol. , 1987, v. 130, N213. P. 125.

79. Daines R. J. , Gould A. R. The cellular basis of salt tolerance studied with tissue cultures of the halophytic grass Distichlis spicata. Plant Physiol. , 1985, v. 119, N3. P. 269.

80. Das N. , Misra M. , Misra A. N. Sodium chloride salt stress indused metabolic changes in callus culture of pearl millet (Pennisetum americanum L. Leche): free solute accumulation. J. Plant Physiol. , 1990, v. 137, N2. P. 244.

81. DixP. J. Chilling resistance is not transmitted sexually in plant regenerated from Nicotiana sylvestris cell lines. Z. Pflanzenphysiol. , 1977, v. 84. P. 223.

82. DixP. J. Cell line selection. Plant Cell Culture Technology. Oxford, London; Blackwell Sci.Publ. , 1986. P. 143.

83. Dix P.J. , Joo F. , Maliga P. A cell line of Nicotiana sylvestris with resistance to kanamicin and streptomycin. Molec. and Gen. Genet. , 1977, v. 157. P. 285.

84. DixP. J., Pearce R. S. Proline accumulation in NaCl-resistant and sensitive cell lines of Nicotiana sylvestris. Z. Pflanzenphysiol., 1981, v. 102. P. 243.- 108

85. Dix P. J., Street H. E. Sodium chloride resistant cultured cell lines from Nicotiana sylvestris and Capsicum annuum. Plant Sci. Lett., 1975, v. 5. P. 231-237.

86. Dubois M. , Gilles K. A., Hamilton I.K. , Rebers P. A. , Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analyt. Chen , 1956, v. 28, N2. P. 350.

87. Duran M. , Lakan D. Sodium prtitioning within the shoot of soybean. Biol. Plant., 1994, v. 91, N1. P. 65.

88. Eberhardt H.-J. , Wegmann K. Effect of abscisic acid and proline on adaptation of tobacco callus cultures to salinity and osmotic shock. Physiol. Plant., 1989, v. 76. P. 283.

89. Edwards D. , Reel R. , Foster R. , Stewart W. Organic solute accumulation in osmotucally stressed Enteromorpha intestinal is. Mar. Biol., 1987, v. 95, N4., P. 583.

90. Ehrey D. , Ho L. The effect of salinity on dry matter partitioning and fruit growth in tomatoes grown in nutrient film culture. J. Hort. Sci., 1986, v. 61. P. 361.

91. Epstein E. Responses of plants to saline environments. In: Genetic engineering of osmoregulation. Eds: Rains D. W. , Valentine R. C. , Polyakoff-Mayber A. Plenum Press. New York, 1980. P. 7.

92. Erdei L. , Kuiper P. G. C. Substrate dependent modulation of ATP-ase activity by Na+ and K+ in roots of piantago species. Physiol. Plant., 1980, v. 49, N1. P. 71

93. Erdei L. ,Trivedi S. , Takeda K. , Matsumoto H. Effect of osmotic and salt stress on the accumulation of polyamines in leaf segments from wheat variétés differing in salt and drought tolerance. J. Plant Physiol. , 1990, v. 137, N2. P.

94. Evans D. A., Sharp W. R. , Medina-Filho H. R. Somaclonal and gametoclonal variation. Am. J. Bot. , 1984, v. 71. P. 759.

95. Flowers T.J. Physiology of halophytes. Plant Soil, 1985, v. 89. P. 41.

96. Flowers T. J., Troke P. F. , Yeo A. R. The mechanisms of salt tolerance in halophytes. Ann. Rev. Plant Physiol. ,1977, v. 28. P. 89.

97. Flowers T. J. , Yeo A. R. Ion relation of plants under drought and salinity. Australian J. Plant Physiol. , 1986, v.13. P. 75.

98. Friedman R. , Altman A. , Levin N. The effect of salt stress on polyamine biosynthesis and content in mung bean plants and in halophytes. Physiol. Plant. , 1989, v. 76. P. 295.

99. Galiba G. , Erdei L. , Sarcadi L. , Salgo A. , Kocsy G. Genotype dependent responses of wheat varietes to water and salt stresses in vitro. Abst. VII th Intern. Congress Plant Tissue and Cell Cult. , Amsterdam. 1990. P. 561.

100. Gettys K. L. , Hancock Y. F. , Cavalieri A.J. Salt tolerance of in vitro activity of leucine aminopeptidase, peroxidase and malate dehydrogenase in halophytes Spartina alterniflora and S. patents. Bot. Gas., 1980,v. 141, N4. P. 453.

101. Gibbs J. , Draucup M. , Greenway H. , McComb J. A. Effect of high NaCl on growth, turgor and internal solutes of tobacco callus. J. Plant Physiol., 1989, v. 134, N1. P. 61.

102. Gonzales R. A. , Das P. K. , Widholm J. M. Characterization of cultured tobacco cell lines resistant to ethionine, a methionine analog. Plant Physiol., 1984, v. 74. P. 640.- 110

103. Godoy J. A. , Padro J. M. , Pintor-Toro J. A. A tomato c-DNA inducible de salt stress and abscisic acid: nucleotide sequence and expression pattern. Plant Mol. Biol. ,1990, v. 15, N5, pp. 695-700.

104. Gorham J. , Bristol A. , Young E. M. , Jones R. G. W. The presence of the enhanced K/Na discrimination trait in diploid Triticum species. Theor. Appl. Genet. ,1991, v. 82, N6, pp. 729-736.

105. Green C. E. , Phillips R. Plant regeneration from tissue culture of maize. Crop Sci. , 1975, v. 15. P. 417.

106. Green C. E. , Rhodes C. A. Plant regeneration in tussue culture of maize. Eds: V. Sheridan, Maize for biological research. Un. Press, Grand Forks, ND, 1982. P. 367.

107. Greenway H. , Gunn A. , Pitman N. , Thomas D. A. Plant responce to saline substrates. VI. Chloride, sodium, and potassium uptake and distribution within the plant during ontogenesis of Hordeum vulgare. Aust. J. Biol. Sci. , 1965, v. 18. P. 525.

108. Greenway H. , Munns R. Mechanisms of salt tolerance in nonhalopytes. Annu. Rev. Plant Physiol. ,1980, v. 31. P. 417.

109. Hale H. B. Cross adaptation. Environ. Res., 1969, v. 2, v. 2, N2. P. 324.

110. Hansen C. E. , Meins F.J. Evidence for a cellular gene with potential oncogenic activity in plants. PNAS USA. , 1986, v. 83. P. 2492.

111. Harms C.T. , Oertly J.J. The use of osmotically adapted cell cultures to study salt tolerance in vitro. Plant Physiol. , 1985, v. 120. P. 29.

112. Hasegawa P. M. , Bressan R. A. , Handa A. K. Growth- Ill characteristics of NaCl-selecte4d and nonselected cells of Nicotiana tabacum L. Plant and Cell Physiol., 1980, v. 21, N8. P. 1347-1355.

113. Hasegawa P. M. , Bressan R. A. , Handa A. K. Cellular machanisms of salinity tolerance. Hort. Sci. , 1986, v. 21, N6. P. 1317.

114. Heisher J. W. , Nabors M. W. Osmotic ajustment of cultured tobacco cells grown on sodium chloride. Plant Physiol., 1981, v. 67. P. 720.

115. Hibberd K. A. , Green C. E. Inheritance and expression of lysine plus threonine resistance selected in maize tissue culture. PNAS USA, 1982, v. 79. P. 559.

116. Hibberd K. A., Walter T. , Green C. E. , Gengenback B. G. Selection and characterization of a feedback-insensitive tissue culture of maize. Planta, 1980, v. 148. P. 183.

117. Hughes K. Selection for herbicide resistance. Handbook of Plant Cell Culture. Techniques for propagation and Breeding. New York, London: Macmillan, 1983, v. 1. P. 442.

118. Hurkman W. J. , Tanaka C. K. The effect of salt on the pattern of protein synthesis in barley roots. Plant Physiol. , 1986, v. 83. P. 517.

119. Jones W. , Storey R. Salt stress and comparative physiology in the Gramineae. II. Glycinebetaine and proline accumulation in two salt- and waterstressed barley cultivars. Aust. J. Plant Physiol., 1978, v. 5. P. 817.

120. Kalir A. , Poliakoff-Mayber A. Effect of salinity on respiratory pathways in root tips of Tamarix Tetragyna. Plant Physiol. , 1976, v. 57, N2. P. 167.

121. Kamo K. K. , Becwar M.R. , Hodges T. K. Regeneration of Zeamays L. from embryogenic callus. Bot. Gas., 1985, v. 146, N3. P. 327.

122. Kirti P. B. , Hadi S. , Kumar P. A. , Choprav Z. Production of sodium chloride-tolerant Brassica Juncea plants by in vitro selection at the somatic embryo level. Theor. Appl. Genet. ,1991, v. 83, N2. P. 233.

123. Kochba J. , Ben-Hayyim G. , Spiegel-Roy P. et al. Selection of stable salt tolerant callus cell lines and embryos in Citrus sinensis and C. aurantium. Z. Pflanzenphysiol. , 1982, v. 106. P. 111.

124. Koyro H. -W. , Stelzer R. Ion concentration in the cytoplasm and vacuoles of rhisodermis cells from NaCl treated Sorghum, Spartina and Puccinellia plants. J. Plant Physiol. , 1988, v. 133, N4. P. 441.

125. Koster K. L. , Lynch D. V. Solute accumulation and compartmentation during eld acclimation of Puma Rye. Plant Physiol. , 1992, v. 98, N1. P. 108.

126. Lark in P. J. , Ryan S. A. , Brettel R. I.S. , Scowcroft W. R. Heritable somaclonal variation in wheat. Theor. and Appl. Genet. , 1984, V. 67, N5. P. 443.

127. Lark in P. J. , Scowcroft W. R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. and Appl. Genet., 1981, v. 60, N4. P. 197.127. La Rosa P. C. et al.

128. Abscisic acid stumulated osmotic ajustment and its involvement in adaptation of tobacco cells to NaCl. Plant Physiol., 1987, v. 85. P. 174.

129. La Rosa P. C. , Singh N. K. , Hasegawa P. M. , Bressan R. A. Stable NaCl tolerance of tobacco cells is associated with- 113 enhanced accumulation of osmotin. Plant Physiol., 1989, v. 91, N3. P. 855.

130. Laughli A. Salt exclusion: on adaptation of legumes for crops and pastures under saline conditions. Salinity tolerance in plants. Eds: Staples R. S. , Toennienssen G. H. , 1984. P. 171.

131. Le Rudulier D. , Strom A. R. , Dandekar A.M. et al. Molecular biology of osmoregulation. Science, 1984, v. 224, N 4553. P. 1064.

132. Levitt J. Responses of plants to envirinmental stress. Chilling, freezing and temperature stresses. N. Y.: Acad. Press, 1980, v. 1. P. 497.

133. Lupotto E. , Locatelly F. , Lusardi M. C. In vitro selection for salt tolerance in maize. Biotechn. in Agricult. and Forestry. Maize. Ed.: Bajaj, Springer-Verlag, 1994. P.

134. Matsumoto T. , Ikeda T. , Kanno L. et al. Selection of high ubiquinone-10 producing of tobacco cultured cells by cell cloning technique. Agr. and Biol. Chem. , 1980, v. 44. P. 967.

135. Maliga P. , Breznovits S. A. , Marton L. Streptomycin-resistant plants from callus culture of haploid tobacco. Nature, 1973, v. 244. P. 29.

136. McCoy T. J. , Phillips R. L. , Rines H. V. Cytogenetic analysis of plant regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures; High frequency of partial chromosome loss. Can. J. Genet, and Cytol. ,1982 v. 24. P. 37.

137. McCoy T.J. Characterization of alfalfa (Medicago sativa L.) plants regenerated from selected NaCl tolerant cell lines. Plant Cell Reports, 1987, v. 6. P. 417.

138. McHughen A. A salt tolerance through increased vigor in flax line (STS-II) selected for salt tolerance in vitro. Theor and Appl. Genet. , 1987, v. 74, N6. P. 727.

139. McHughen A. , Swartz M. A tissue culture derived salt tolerant line of flax (Linum ussitatissimum). J. Plant Physiol. , 1984, v. 117. P. 109.

140. Mittal R. , Dubey R. S. Behavior of peroxidases of rice: changes in enzyme activity and isoforms in relation to salt tolerance. Plant Physiol, and Biochem. , 1991, v. 29, N1. P.31.

141. Munns R. Physyological processes limiting plan growth in saline soils some dogmas and hypothesis. Plant Cell Environ. , 1993, v. 16, pp. 15-24.

142. Murasige T., Nakano R. Tissue culture as potential tool in obtaining poliploid plants. J. Hered. ,1966, v. 57. P. 114.

143. Nabors M. W. , Gibbs S. E. , Bernstein S. , Meis EE. NaCl-tolerant tobacco plants from cultured cells. Z. Pflanzenphysiol. , 1980, v. 97, P. 13.

144. Novak F. J. Phenotype and cytological status of plants regenerated from callus cultures of Allium sativum L. Z. Pflanzenzucht. , 1980, v. 84. P. 250.

145. Pesci P. Ion fluxes and abscisic acid-indused proline accumulation in barley ladf segments. Plant Physiol. , 1988, v. 86. P. 927.

146. Polyakoff-Maiber A. Biochemical and physiological responses of higher plant to salinity stress. Biosaline research. Eds.: A. Hollander. 1982. P. 145.

147. Ramagopal S. Differential mRNA transcription during salinity stress in barley. PNAS USA, 1987, v. 84. P. 94.- 115

148. Ramagopal S. Salinity stress induced tissue-specific proteins in barley seedlings. Plant Physiol. , 1987, v. 84. P. 324.

149. Ramagopal S. Protein synthesis in maize callus exposed to NaCl and mannitol. Plant Cell Rep., 1986, v. 5. P. 430.

150. Reddy P. J. , Vaidyanath K. In vitro characterization of salt stress effects and the selection of salt tolerant plants in rice (Oryza sativa L.). Theor. and Appl. Genet. , 1986, v. 71, N5. P. 757-760.

151. Reisch B. , Bingham E. T. Plants from ethionine resistant alfalfa tissue cultures: variation in growth and morphological characteristics. Crop Sci. , 1981, v. 21. P. 783.

152. Riccardi G. , Cella R. , Camerino G. , Ciferri 0. Resistance to azetidine-2-carbixylic acid and sodifcim chloride tolerance in carrot cell cultures and Spirullina platensis. Plant and Cell Physiol., 1983, v. 24. P. 784.

153. Robinson S. R. , Downtown W. J. S, Millhouse J. A. Photosynthesis and ion content of leaves and isolated chloroplasts of salt-stressed spinach. Plant Physiol. , 1983, v. 73. P. 238.

154. Rosema J. , Gude H. , Bijl F. , Wesselmann H. Sodium concentration in xylem sap in relation to ion exclusion, accumulation and secretion in halophytes. Acta Bot. Neerl. , 1981, v. 30. P. 309.

155. Rus-Alvarez, Guerrier G. Proline metabolic pathways in calli from Lycopersicon esculentum and Lycopersicon pennellii under salt stress. Biologia plantarum, 1994, v. 36, N2. P. 277.

156. Sabbah S. , Tal M. Development of callus and suspension cultures of potato resistant to NaCl and mannitol and theirresponce to stress. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1990, v. 21, N2. P. 119.

157. Salgado-Garsiglia R. , Lopez-Gutierres F. , Ochoa-Alejo N. Nacl-resistant variant cells isolated from sweet potato cells. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1985, v. 5. P. 3-12.

158. Secor G. A. , Shepard J. F. Variability of protoplast derived potato clones. Crop. Sci. , 1981, v. 21. P. 102.

159. Shannon M. C. Breeding, selection and the genetics of salt tolerance in plants. Eds: Staples R. S. , Toennienssen G. H. , 1984. P. 231.

160. Shevyakova N. I. , Strogonov B. P. , Kiryan I. G. Metabolism of poliamines in NaCl-resistant cell lines from Nicotiana sylvestris. Plant Growth Regulation, 1985, v. 3. P. 365.

161. SingerS. R. , McDaniel C.N. Selection of glyphosate tolerant tobacco calli and the expression of this tolerance in regenerated plants. Plant Physiol., 1985, v. 78, N2. P. 411.

162. Singh N. K. , Handa A. K. , Hasegawa P. M. , Bressan R. A. Proteins associated with adaptation of cultured tobacco cells to NaCl. Plant Physiol. , 1985, v. 79, N1. P. 126.

163. Singh N. K. , Nelson D. E. , Kuhn D. et al. Molecular cloning of osmotin and regulation of its expression by ABA and adaptation to low water potentials. Plant Physiol. , 1989, v. 90. P. 1096.

164. Singh M. , Singh B. B. , Ram P. C. Effect of iso-osmotic- 117 levels of salts and PEG-6000 on Saccharides, free proline and nitrogen content during early seedling growth of pea (Pisum sativum L.). Biologia plant. , 1990, v. 32, N3. P. 232.

165. Singh N. K. , Nelson D. E. , La Rosa P. C. et al. Osmotin: A protein associated with osmotic stress adaptation in plant cells. Environ. Stress Plants: Biochem. and Physiol. Mech. Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Berlin, 1987. P. 67.

166. Smith R. H. , Bhaskaran S. , Miller F. R. Screening for drought tolerance in sorgum using cell culture. In vitro Cell and Dev. Biol., 1985, v. 21, N10. P. 541.

167. SreeR. K. , Dijakhuis P. , Cate Ch. , Hanisch Ten, Groot B. D. Pattern of DNA and chromosome variation during in vitro growth in various genotypes of potato. Plant Sci. , 1985, v. 41, N1. P. 69.

168. Sree Ramulu K. , Dijakhuis P., Roest S. Genetic instability in protoclones of potato (Solanum tuberosum L. cv. "Bintje"): new types of variation after vegetative propagation. Theor. and Appl. Genet. ,1984, v. 68, N6. P. 515.

169. Stewart C. R. , Lee J. A. The role of proline accumulation in halophytes. Planta, 1974, v. 120. P. 279.

170. Storey R. , Jones R. G. V. Betaine and choline levels in plants and their relationship to sodium chloride stress. Plant. Sci. Lett. , 1975, v. 4. P. 161.

171. Sung Z. R. , Smith R. , Horowitz J. Quantitative studies of embriogenesis in normal and 5-methyltriptophan resistant cell lines of wild carrot. Planta, 1979, v. 147. P. 236.

172. Swaaij A. C. , Jacobsen E. , Keil J. A. , Feenstra W.J. Selection, characterization and regeneration of hvdroxyproline-resistant cell ines of Solanum tuberosum:- 118 tolerance to NaCl and freezing stress. Physiol. Plant. , 1986, v. 68. P. 359.

173. Sze H. H+ translocating ATP-ases of the plasma membrane and tonoplast of plant cells. Physiol. Plant. , 1984, v. 61, N14. P. 4376.

174. Tam V. H. J. , Constabel F. , Kurz V. G. V. Codeine from cell suspension culture of Papaver somniferurn. Phytochemistry, 1980, v. 19. P. 486.

175. Tal M. Physiological genetics of salt resistance in higher plants studied in the level of the whole plant and isolated organs, tissues and cells. Salinity tilerance in plants. Eds: Staples R. S. , Toennienssen G. H. , 1984. P. 321.

176. Thomas B. P. , Pratt D. Isolation of paraquat tolerant mutants from tomato cell cultures. Theor. and Appl. Genet. , 1982, v. 63. P. 169.

177. Treichel S. , Hettfleisch H. , Eilhardt S. et al. A possible induction of CAM by NaCl-stress in heterotrophic cell suspension cultures of Mesembryanthemum crystallinum. J. Plant Physiol. , 1988, v. 133, N4. P. 419.

178. Tyagi A. K. , Rashid A., Maheshwari S. C. Sodium chloride resistant cell line from haploid Datura innoxia Mill. A resistance trait carried from cells to plantlet and vise versa in vitro.

179. Vanlerberghe G. C. , Brown L. M. Inhibition of celldivision by proline analogues: reversal by proline and high salinity. Plant Physiol., 1986, v. 123. P. 229.

180. Voetberg G. , Stewart C. R. Stedy-state proline levels in salt-shocked barley leaves. Plant Physiol. , 1984, v. 76. P. 567.

181. Vunsh R. , Aviv D. , Galun E. Valine resistant plants derived from mutated haploid and diploid protoplasts of Nicotiana sylvestris and N. tabacum. Theor. and Appl. Genet. , 1982, v. 64. P. 51.

182. Wakasa K. , Widholm J. M. 5-methyltryptophane resistant rice mutant selected in tissue culture. Abst. 6th Int. Congr. of Plant Tissue and Cell Culture. Minneapolis, 1986. P. 440.

183. Vatad A. N. , Reinholi H. R. , Lerner H. R. Comparison between a stsble NaCl-selected Nicotiana cell line and the wild type. Plant Physiol., 1983, v. 73, N3. P. 624.

184. Widholm J. M. Tryptophan biosynthesis in Nicotiana tabacum and Daucus carota cell cultures: site of action of inhibitory tryptophan analogs. Biochim. et Biophys. Acta, 1972, v. 261. P. 44.

185. Widholm J. M. Selection and characterization of aminoacid analog resistant plant cell cultures. Crop Sci., 1977, v. 17. P. 597.

186. Winicov I. Characterization of salt tolerant alfalfa (Medicago sativa L.) plant regenerated from salt tolerant cell lines. Plant Cell Rep., 1991, v. 10, N 11. P. 561.

187. Winicow I., Seeman J. R. Expression of genes for photisynthesis and the relationships to salt tolerance of alfalfa (Medicago sativa) cells. Plant Cell Physiol. , 1990, v. 31, N8. P. 1155.- 120

188. Yeo A. R. , Kramer D. , Laughli A., Gullash J. Ion distribution in salt stressed Zea mays roots in relation to ultrastructure and retention of sodium. J. Exp. Bot. , 1977, v. 27. P. 17.

189. Yeo A. R. , Flowers T.J. Accumulation and localization of sodium ions within the shoots of rice (Oryza sativa) varietes differing in salinity resistance. Physiol. Plant. , 1982, v. 56. P. 343.

190. Yeo A. R. Salinity resistance: physiology and prices. Physiol. Plant. , 1983, v. 58. P. 214.

191. Yeschke W. D. K+ Na+ exchange at cellular membranes, intracellular compartmentation of cations and salt tolerance. Salinity tolerance in plants. Eds. R. S. Staples, G. H. Toenniensen. , 1984. P. 37.

192. Zenk M. H. , El-shagi H. , Arens H. et al. Formation of the indole alkaloids serpentine and ajmalicine in cell suspension culture of Catharanthus roseus. Plant Tissue Culture and its Biotechnological Application. Berlin: Springer, 1977. P. 27.