Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сомаклональная вариабельность по признаку солеустойчивости в культуре клеток риса

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Сомаклональная вариабельность по признаку солеустойчивости в культуре клеток риса"

Р Г Б ОД

На правах рукопги

В / ПОП

БЕЛЯНСКАЯ Светлана Леонидовна

СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПО ПРИЗНАКУ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РИСА

Специальность 03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1995

1 " Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор З.БЛамина,

доктор биологических наук Л.А.Кучеренко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.В.Мазин,

кандидат биологических наук И.Л.Дридзе.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский Институт

картофельного хозяйства РАН.

Защита состоится " ае/са^/гЛ 1995г. в {£?_ часов на заседании

Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул.Ботаническая, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан "Ж" О/ШЛЬ^У- 1995г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

М.И.Азаркович

Актуалыгость проблемы.

В результате антропогенного воздействия на окружающую среду (осушение болот, орошение) на Земле усложняется почвенно-экологическая обстановка, в частности значительно возрастают площади засоленных земель, иссякают ресурсы пресной воды.

Как показала солевая съемка, на территории Краснодарского края около половины всех орошаемых площадей содержат повышенные уровни засоляющих ионов, что значительно снижает продуктивность этих земель. Хотя рис является мелиорирующей культурой, засоление почвы выше 0,35% приводит к гибели растений. Поэтому проблема выращивания риса на засоленных землях стоит очень остро. Решение ее возможно при использовании солеустойчивых сортов. Для успешного получения и использования этих сортов необходимо глубокое изучение генетических основ и физиологических процессов, определяющих свойство солеустойчивости. Сложность этой проблемы заключается в том, что солеустойчивость - полигенный признак, который проявляется в комплексе разнообразных физиологических реакций, затрагивающих практически весь метаболизм растения и реализующихся на разных уровнях организации растения. Поэтому и изучение этого явления требует комплексного подхода с использованием разнообразных методов.

Большую помощь в изучении проблемы солеустойчивости может оказать метод изолированных клеток, так как устойчивость целого организма связана о особенностями клеточного метаболизма. Культура клеток in vitro позволяет изучать ответные реакции изолированной клетки на солевой стресс. Кроме того, in vitro, с помощью селективных систем, можно моделировать условия формирования защитных механизмов. Гетерогенность клеточной популяции приводит к сомаклональной вариабельности, а использование селективных систем позволяет получать широкий набор клонов с определеными признаками.

Работы по сомаклональной вариабельности и клеточной селекции на солеустойчивость могут решать теоретические и практические задачи. С теоретической точки зрения мутантные клоны могут быть модельными системами для изучения многих вопросов физиологии, биохимии и генетики солеустойчивости. Регенерация растений из таких клеточных линий делает возможной реализацию полученной устойчивости на уровне целого организма и использование их как доноров генов в селекционном процессе.

Цель и задачи исследований

Целью работы было получение в различных селективных системах солеустойчивых клонов риса и их характеристика.

В связи с этим в задачи исследований входило:

1. Сравнительное изучение ответных реакций риса на солевой стресс на разных уровнях организации растения

2. Разработка селективных систем для отбора солеустойчивых клеточных линий. Выяснение связи между солеустойчивостью и устойчивостью к различным селективным факторам на примере нескольких сортов риса.

3. Получение резистентных к NaCl клонов и их характеристика.

4. Отработка условий регенерации из солеустойчивых клонов.

Научная новизна работы

Показана корреляция по устойчивости к засолению на уровне изолированных клеток in vitro и взрослых растений у трех различных сортов риса.

Установлено, что для получения солеустойчивых клеточных линий могут быть использованы различные селективные системы. В результате клеточной селекции на фоне NaCl, ПЭГ и этионина из популяции клеток риса чувствительного фенотипа получены клоны устойчивые одновременно к двум и трем селективным факторам. При этом солеустойчивые клоны могли быть выделены как на среде с NaCl, так и на средах с ПЭГ и этионином.

Показано, что устойчивость к NaCl у полученных клонов риса определяется различными механизмами.

Оптимизирована среда для морфогенеза из резистентных клонов риса.

Практическая ценность работы

; Резистентные клоны риса могут быть использованы для проведения физиологических исследований по изучению механизмов солеустойчивости на клеточном уровне.

Растения-регенеранты, полученные из резистентных клонов, - после изучения характера наследования признака, могут служить исходным материалом для создания солеустойчивых сортов риса. •■

Апробация работы

; Материалы диссертации доложены на: ... ...1. IV Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. (Минск, 15-20 апреля 1990г.).

2. Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации". (Чернигов, 22-24 апреля, 1991г.).

3. Расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН им. К.А. Тимирязева. (Москва, 29 ноября 1991 г.).

4 Совещании "Биология клетки в культуре". (Санкт-Петербург, 20-22 октября 1992г). ......' ■">■ •

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, экспериментальная часть, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на //Ш... страницах машинописного текста, содержит ,:[9... рисунков, таблиц, список литературы включает наименований.

Материалы и методы исследований

В работе были использованы три сорта риса (Oryza sativa L.), различные по степени солеустойчивости: Поккали-солеустойчивый, Союзный-244- чувствительный к засолению, Альтаир - среднесолеустойчивый. Устойчивость оценивали на уровне вегетирующих растений, прорастающих семян и каллусных тканей.

Вегетационные опыты проводили по стандартной методике, принятой во ВНИИ риса (Сметанин, 1972). Для оценки устойчивости семена проращивали in vitro на засоленной питательной среде. На десятые сутки определяли всхожесть, сырой и сухой вес наземной массы проростков.

Для получения культуры клеток зрелые выполненные семена риса помещали на среду Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением 4мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4Д). В дальнейшем каллусные ткани культивировали на среде МС+2мг/л 2,4Д (Кучеренко, 1980).

Для определения чувствительности к засолению и другим стрессовым факторам каллусы весом 20-25мг помещали на ту же среду, но с добавлением различных концентраций селективных факторов: хлорида натрия (NaCl, 0 - 2%), сорбита (О -2М), полиэтиленгликоляеооо (ПЭГ, 0 - 40%), L-гидрокси-пролина (НОР, 0 -15мМ) или DL-этионина (0 - ЗмМ), и культивировали в течение одного пассажа (30 дней). В конце пассажа каллусы взвешивали и высушивали до постоянного веса. Интенсивность роста определяли как разницу между весом каллусов в конце пассажа и их исходной массой.

Получение резистентных клонов проводили по стандартной методике, принятой в лаборатории генетики культивируемых клеток ИФР РАН (Шамина, 1984).

Определение содержания ионов в резистентных клонах выполняли по методу Назаренко, Захарьина (1986) на иономере ("Orion research microprocessor ionoliser/901" фирмы "Orion Research Inc"., США). Повторность опытов трехкратная.

Регенерацию растений проводили на среде МС+5мг/л 6-бензил-аминопурина (БАП). Для укоренения регенерантов использовали безгормональную среду МС с добавлением 20% сахарозы. Подращивание и адаптацию растений к условиям in vivo проводили в условиях гидропонной культуры на среде Иошида в камерах

искуственного климата (Кучеренко, 1994). Далее растения пересаживали в сосуды с почвой, где выращивали растения до полной зрелости.

Экспериментальная часть.

Сравнительное изучение ответных реакций риса на солевой стресс на стадии взрослого растения, прорастающих семян и изолированных клеток. ■

Культивирование трех генотипов риса, различающихся.по реакции на засоление на фоне различных концентраций NaCl, показало наличие положительной корреляции между реакцией взрослых растений, Прорастающих семян и каллусных тканей (Рис.1).

О 0.5 1 1.5

1. Всхожесть семян in vitro

160 140 120 100 80 60 40 20

—I—Поккялн —®—Альтаар -"О-Союзный

О 0.5 1 1.5 2%

3. Накопление сырой массы проростками

0 0.5 1 1.5

2. Процент растений с семенами

0 0.5 1 1.5 2%

4. Накопление сырой массы каллусами

о

Рисунок 1. Реакция сортов риса на различные концентрации NaCl.

Солеустойчивый сорт Поккали при разных уровнях засоления характеризовался высокой всхожестью семян, стимуляцией роста проростков при низких концентрациях засоляющих ионов. Зрелые семена были получены при всех уровнях засоления. Каллусные ткани этого сорта также выдерживали более высокие уровни засоления. Сорта Альтаир и Союзный оказались чувствительными к засолению на всех уровнях организации растения. Сравнение накопления сырой массы проростками и каллусными клетками показывает большую устойчивость всех генотипов в условиях дедифференцировки in vitro. То есть, культуру клеток можно использовать как модель для изучения признака солеустойчивости.

Влияние различных стрессовых факторов на культуру клеток риса Солеустойчивость растительной клетки определяется особенностями метаболизма в условиях засоления, что проявляется в комплексе различных физиологических реакций. Солеустойчивость на клеточном уровне может быть связана:

1) с непроницаемостью клеточных мембран для засоляющих ионов;

2) с аккумуляцией и компартментацией солей в определенных органеллах клетки;

3) с осмоустойчивостыо за счет регулирования ионного баланса;

4) с осмоустойчивостью, определяемой накоплением осморегуляторов и осмо-протекторов;

5) со способностью к накоплению предшественников серосодержащих аминокислот и компенсацией метаболического "дефицита" серы, возникающего в условиях хлоридного засоления.

Получение клеточных линий с любым из перечисленных механизмов устойчивости возможно при использовании определенных селективных систем. Мы предполагали, что культивирование на среде с сорбитом или ПЭГ будет способствовать выделению клеток с механизмами неионной осморегуляции. Выращивание клеток на среде с Ь-гидрокси-пролином (аналогом пролина) предполагало возможность получения клеток со сверхпродукцией осмопротектора пролина. Наконец, на среде с этионином (токсическим аналогом метионина) селективное преимущество могли получить клетки со способностью к сверхпродукции метионина или его предшественников. Неоходимо было выяснить связана ли устойчивость изолированных клеток к перечисленным стрессовым факторам с солеустойчивостью генотипа. Для решения этого вопроса каллусные ткани, полученные от трех генотипов риса (устойчивого, среднеустойчивого и чувствительного к засолению), выращивали на разных концентрациях перечисленных стрессовых факторов (Рис. 2).

Реакция каллусных клеток на сорбит у различных по солеустойчивости сортов риса была почти одинаковой. На низких концентрациях наблюдали значительную стимуляцию роста, сопровождавшуюся изменением морфологических характеристик каллусов в сторону регенеративного типа. На высоких концентрациях клетки погибали. Реакция каллусных тканей сортов Поккали и Альтаир на различные концентрации полиэтилен-гликоля была схожей. На концентрациях 5-15% наблюдали стимуляцию роста каллусных тканей у обоих сортов. Вероятно, это связано с их способностью к биохимической осморегуляции. При повышении концентрации рост каллусов ингибировался. Рост клеток чувствительного к засолению сорта Союзный ингибировался всеми концентрациями ПЭГ. Каллусы солеустойчивого сорта оказались нечувствительными к гидрокси-пролину, на всех концентрациях рост клеток оставался неизменным, на уровне контроля. Возможно, это связано с тем, что у клеток этого сорта хорошо развита способность к синтезу пролина.

ЫаС|

Сорбит

Концентрация селективных факторов ____________ 0.2 | ■■■И! ■1

ЫаС1, % 0 0.5 1.0 1.5 2.0

ПЭГ, % 0 5.0 10.0 15.0 20.0 30.0

Сорбит, М 0 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0

НОР, мМ - 0 ,1.0 3.0 5.0 10.0 15.0

Этионин, мМ 0 0.1 0,3 0.5 0.8 1.0

Рисунок 2. Влияние различных стрессовых факторов на рост калусных тканей риса.

Для сортов Альтаир и Союзный все концентрации гидрокси-пролина ингибировали рост каллусов. Присутствие этионина в среде резко ингибировало рост каллусных тканей солеустойчивого сЬрта' Поккали. Каллусы сорта Альтаир оказались наиболее устойчивыми к этионину. Возможно, их устойчивость связана либо с высоким содержанием эндогенного метионина, либо со способностью препятствовать его поступлению в клетку. Очевидно, что у солеустойчивого сорта Поккали этих защитных механизмов нет, поэтому он чрезвычайно чувствителен к токсическому действию этионина.

Таким образом, при анализе реакции трех генотипов риса на разные стррессовые факторы обнаружены специфические особенности. У сорта Поккали устойчивость к засолению коррелировала с устойчивостью клеток к ПЭГ и гидрокси-пролину и чувствительностью к этионину. Клетки Альтаир были устойчивы к ПЭГ, этионину, но чувствительны к ЫаС1 и гидрокси-пролину. Каллусные ткани сорта Союзный были чувствительны ко всем стрессовым факторам.

Для работ по клеточной селекции был выбран чувствительный ко всем стрессовым факторам генотип (с.Союзный-244). Селекцию устойчивых клеток проводили на фоне сублетальных концентраций ЫаС1 (1,5%), ПЭГ (20%) и этионина (0,7мМ), при которых рост каллусов ингибировался примерно на 60%.

Клеточная селекция па солеустойчивость.

Получение спонтанных резистентных клонов риса.

Для выделения спонтанных резистентных клонов микрокаллусы (весом 15-20 мг) высаживали в селективные условия.

На среде с ИаС1 можно было выделить 10-15% каллусов, имеющих светлые участки, из которых в последующих пассажах образовывались растущие колонии. При пассировании в селективных условиях отмечено постепенное снижение роста, а после пятого пассажа - гибель всех выделенных колоний. Аналогичный процесс наблюдался на среде с ПЭГ. Колонии имели буроватый цвет, слабый затухающий рост. На среде с этионином в первом селективном пассаже удавалось выделить лишь 2-3% колоний с участками живой ткани, а гибель их наступала уже во втором - третьем пассажах. Возможно, исходная клеточная популяция имела очень небольшое число устойчивых клеток, которые в селективных условиях не давали потомства. Рост выделенных колоний в нескольких пассажах, вероятнее всего, связан с созданием градиента стрессовых факторов. Все выделенные в первом пассаже колонии оказались нежизнеспособными при длительном пассировании в селективных условиях, то есть мы не могли выделить спонтанных резистентных клеточных линий. Можно было надеяться, что при использовании индуцированного мутагенеза и направленной селекции будут получены резистентные к стрессовым факторам клеточные линии.

Получение резистентных клонов риса, индуцированных мутагеном.

Для получения стабильно резистентных клонов риса, каллусные ткани первого пассажа обрабатывали Ы-нитрозо-И-метилмочевиной (НИМ) в дозе 4мМ/час, отмывали от мутагена и высаживали на сублетальные концентрации ЫаС1, ПЭГ и этионина. В конце пассажа выделяли только светлые, растущие колонии или светлые участки на фоне погибших каллусов и пересаживали на свежую среду с такой же концентрацией селективного фактора. Селекцию мутантных клонов проводили по схеме: три пассажа

в селективных условиях, два пассажа на среде без селективного фактора, далее два пассажа на среде с селективным фактором.

В результате применения этой схемы к седьмому пассажу количество первоначально выделенных колоний уменьшилось на порядок (Табл.1). Вероятно, в стабилизации гетерогенной клеточной популяции к стрессовым условиям существуют закономерности, которые не зависят от типа создаваемого стресса.

Таблица 1. Динамика элиминации микрокаллусов в разных селективных системах. ■

Селективная среда Микроколонии, обработанные НММ число % - Процент живых колоний по пассажам

1 2 3 4<St) 5 (St) 6 7

№С1 668 100 44,3±5,4 32,2±7,4 25,5±6,7 25,5±6,7 25,5±6,7 13,9±3,2 4,0±0,6

ПЭГ 695 100 51,6±4,5 29,6±1,4 14,811,9 14,8±1,9 14,8±1,9 10,1±0,6 4,6+0,5

Этионин 660 100 34,8±8,9 27,8±6,2 15,0±4,5 15,0±4,5 15,0±4,5 8,3±1,6 3,6±0,3

Всего в результате применения схемы клеточной селекции было выделено 26 клонов резистентных к ИаС1, 33 - устойчивых к ПЭГ и 24 этионин-устойчивых клона, что составляет около 4% от числа высаженных каллусов. Выделенные клоны стабильно сохраняли резистентность при дальнейших пересадках (8 и последующие пассажи) в селективных условиях, тогда как первично устойчивые колонии, выделенные из исходной популяции без обработки НММ, погибали через 3-4 пассажа.

Таким образом, предложенная схема клеточной селекции с использованием мутагенной обработки позволяет отбирать устойчивые к стрессу варианты, резистентность которых, вероятно, является следствием индуцированного мутационного процесса.

Характеристика резистентных клонов риса.

Полученные резистентные клоны различались по интенсивности роста и морфологическим особенностям. Индекс роста у большинства клонов, резистентных к ЫаС1 и ПЭГ, не превышал 3-4. Клоны, резистентные к этионину, имели большую интенсивность роста по сравнению с колониями, выделенными в осмотически активных системах. Их индекс роста колебался в пределах 6 - 7, то есть на уровне дикого штамма на стандартной среде. Клоны различались по цвету, консистенции, размеру составляющих их агрегатов. При всем разнообразии внешних характеристик все полученные клоны можно было отнести к регенеративному или промежуточному морфологическим типам, описанным Кучеренко Д.А. (1991). Так как в основе нашей работы лежало предположение о возможном сопряжении устойчивости к ИаС1 с устойчивостью к ПЭГ или этионину, полученные клоны были перекрестно проверены на устойчивость ко всем селективным факторам (Табл.2). Для этого оценивали

способность клонов к росту на других селективных средах. Как видно из таблицы, около 40% клонов, выделенных на среде с ИаС1 и ПЭГ, были резистентны одновременно к этим двум факторам (№*Рг). Можно предположить, что солеустойчивость у таких клонов определяется общими механизмами, связанными с осморегуляцией. Некоторые КаС1-резистентные клоны (15% от общего числа клонов) оказались устойчивыми к этионину и всего 11% из них обладали комплексной устойчивостью ко всем селективным факторам.

Таблица 2. Перекрестная проверка устойчивость клонов, (где И- ИаС1, Р- ПЭГ, Е-этионин, г-резистентность).

Фенотип % клонов, выделенных на среде с

№С1 ПЭГ Этионином

№ 38.5 - -

Рг - 45.5 -

& - - 58.5

ИгРг 34.5 39.4 -

№Ег 15.5 - 25.0

РгЕг - 9.1 12.5

№РгЬ 11.5 6.0 4.0

Среди ПЭГ-резистентных клонов процент устойчивых к этионину был ниже (9%). Комплексную устойчивость наблюдали лишь у 6% ПЭГ-резистентных клонов.

В популяции этионин-устойчивых клонов после перекрестной проверки можно было выделить около 60% клонов, устойчивых только к этионину, около 25% -резистентных к этионину и ИаС1 одновременно. Возможно, что у них солеустойчивость сопряжена со способностью компенсировать недостаток серы, возникающий в условиях засоления за счет синтеза метионина. Клонов, резистентных к этионину и ПЭГ, было меньше - около 12%, а комплексную устойчивость наблюдали лишь у 4% этионин-резистентных клонов. Перекрестная устойчивость этинин-резистентных и ПЭГ-устойчивых клонов может определяться синтезом ряда аминокислот и полиаминов, обладающих осмопротекторным действием. Возможно, именно это позволяет осмоустойчивым клонам расти на среде с этионином и, вероятно, по этой же причине этионин-устойчивые клоны были способны к росту в условиях повышенной осмотичности среды.

Таким образом, в результате проведенной работы из популяции клеток, чувствительной к ЫаС1, этионину и ПЭГ, были выделены клоны, резистентные к каждому селективному фактору или обладающие комплексной устойчивостью. Причиной возникновения клонов с разным типом резистентности может быть мутационный процесс и направленный отбор клеток с определенными механизмами защиты к создаваемым стрессам (засолению, повышенной осмотичности среды, токсическому аналогу аминокислоты).

.0-индекс роста на стандартной среде;ШВ- концентрация Ыа+ в клонах на стандартной среде, мМ/г; □ -индекс роста на среде с ИаС1; □- концентрация 1>1а+ в клонах на среде с ЫаС1, мМ/г.

Рисунок 3. Характеристика резистентных клонов риса.

Анализ содержания ионов Na+ и К* в резистентных клонах риса

Как известно, солеустойчивость может быть связана: с ограниченным поступлением солей в клетку; компартментацией солей в клетке; или с осмо-устойчивостыо клеток за счет регуляции ионного баланса. Поэтому, о механизмах проникновения солей в клетку можно судить по содержанию в них засоляющих ионов. Аккумуляция Na+ в клетке, при наличии роста в условиях засоления, может говорить об отсутствии изменений в проницаемости клеточных мембран, а также о возможности компартментации их в вакуолях или других клеточных вместилищах. С другой стороны, низкий уровень содержания засоляющих ионов в клетке на фоне интенсивного роста в условиях засоления может свидетельствовать об изменениях проницаемости мембран и способности к интенсивной осморегуляции.

Резистентные клоны характеризовались разной интенсивностью роста на пресном и засоленном фоне. Некоторые из них росли более интенсивно на засоленной среде (152, 158), другие снижали интенсивность роста в присутствии засоляющих ионов (240, 245, 165, 200), третьи одинаково хорошо росли как на стандартной среде, так и на среде с NaCl (175, 38, 233,185).

Содержание ионов калия в клонах, растущих на пресном фоне, колебалось в пределах 4-5 мМ/г сырого веса. При пересадке этих клонов в засоленные условия концентрация калия в клетках незначительно снижалась. Концентрация Na+ у части клонов увеличивалась в 2-3 раза, а у других возрастала очень значительно (более чем в 15 раз). В каждой ростовой группе можно было выделить клоны с высоким или низким содержанием Na+ (Рис. 3).

В соле- и осмоустойчивых клонах 152 и 158, растущих более интенсивно на засоленном фоне, концентрация Na+ возрастала почти в два раза по сравнению с незасоленным фоном, т.е. до 5-6 мМ/г. Эти клоны можно считать соле аккумулирующим и, при этом для нормального их роста необходимо присутствие в среде ионов Na+. Возможно, это связано с перестройкой метаболизма по галофитному типу.

Во второй группе были клоны, в которых, при росте в засоленных условиях, содержание ионов натрия значительно возрастало или оставалось неизменным. Так, в клонах 240, 245 и 165 наблюдали резкое увеличение содержания ионов Na+ в 15 - 20 раз. Возможно, устойчивость данных клонов к солям определяется механизмами компартментации ионов в метаболически инертных структурах клетки. В клоне 200, выделенном на среде с ПЭГ и. характеризующимся тройной устойчивостью, концентрация ионов Na+ на пресном и засоленном фоне

была примерно одинаковой. Возможно, устойчивость этого клона связана с нарушениями в системе поступления засоляющих ионов в клетку и его можно отнести к мембранным мутантам. С другой стороны, устойчивость этого клона к ПЭГ и этионину предполагает его способность к биохимической осморегуляции. Поэтому, способность к росту в засоленных условиях у клона 200 может быть следствием непроницаемости мембран для ионов Na+ и интенсивной биохимической осморегуляции. Вероятно, изменения мембран носят неспецифический характер, в результате чего, в условиях засоления нарушается поступление питательных веществ, что и приводит к некоторому ингибированию роста этого клона на среде с NaCl.

В третьей группе клонов, одинаково хорошо растущих на пресном и засоленном фоне, также наблюдали клоны, незначительно накапливающие Na+ и накапливающие его очень интенсивно. В клонах 175, 38 и 185 концентрация Na+ возрастала почти в два раза, то есть, мембраны клеток этих клонов проницаемы для ионов Na+. Но, учитывая, что концентрация Na+ ниже, чем в клетках дикого штамма, а также то, что клетки этого клона одинаково хорошо растут на соленом и пресном фоне, можно предположить, что устойчивость клонов связана с работой ионных насосов, активно выводящих ионы из клеток. Клоны 38 и 185, помимо устойчивости к NaCl, характеризовались устойчивостью к этионину, поэтому, вероятно, их солеустойчивоеть может быть также связана с накоплением предшественников серосодержащих аминокислот и синтезом полиаминов. В отличие от выше перечисленных, в клетках клона 233 концентрация Na+ была очень высокой. Возможно, устойчивость данного клона к соли определяется механизмами компартментации ионов в метаболически инертных структурах клетки. Высокая интенсивность роста и высокое содержание ионов натрия свидетельствуют о хорошо развитой системе компартментации ионов.

Таким образом, из клеточной популяции несолеустойчивого фенотипа в результате мутационного процесса и направленного отбора были выделены три группы резистентных клонов. Их устойчивость могла быть связана: 1) с ионной регуляцией; 2) солеаккумуляцией и компартментацией ионов Na+; или 3) с непроницаемостью мембран для засоляющих ионов.

Морфогенез в резистентных клонах риса.

В работах по клеточной селекции этап морфогенеза из резистентных клонов является очень важным. Регенеранты наследуют генетическую информацию клеток и могут реализовывать ее в фенотипе целого растения. Это позволяет не только доказать генетическую природу измененного признака, но и расширяет возможности

в получении исходного материала для селекционных работ. Большинство генотипов риса хорошо регенерируют на среде МС+5мг/л БАП. Этот состав регенерационной среды является базовым вариантом в технологии массовой регенерации риса in vitro (Кучеренко, 1994). Однако, регенерация из каллусов сорта Союзный на этой среде сопровождалась интенсивным некрозом, а доля каллусов, продуцирующих ре-генеранты, не превышала 30%. Колонии из первого селективного пассажа, то есть прошедшие обработку НММ и растущие 30 дней на среде с селективным фактором, имели еще более низкий процент регенерирующих каллусов. Поэтому необходимо было провести подбор оптимальной для морфогенеза среды, на которой впоследствии можно было бы получить достаточное количество регенерантов из резистентных клонов.

В литературе существует мнение, что повысить морфогенез in vitro можно используя вещества, повышающие осмотический потенциал среды (Kishor, Reddy,1986; Kishor,1987; Кучеренко,1991). Кроме того, обсуждается вопрос о значении сохранения селективной нагрузки на этапе морфогенеза. Ряд исследователей .считает, что это будет способствовать отбору истинно устойчивых форм (Li Su Nam et al., 1986). С другой стороны, существует мнение о снижении морфогенной способности в условиях стресса^ Поэтому, для регенерации были выбраны среды с повышенным, по сравнению с базовой средой, осмотическим потенциалом. Для этого в регенерационную среду МС+5 мг/л БАП (стандарт) добавляли сорбит (0,2М); NaCl (0,2%); ПЭГ (10%) или этионин (0,ЗмМ). Выбранные концентрации осмотически активных веществ (сорбит, NaCl, ПЭГ) создают в среде приблизительно одинаковый осмотический потенциал (около 200 м.осм/кг). Добавление этионина в среду для регенерации не влияет на осмотический потенциал и может служить негативным контролем. Для работы использовали каллусы риса первого пассажа, которые, согласно схеме клеточной селекции, были обработаны НММ и в течение 1 пассажа росли на среде с одним из селективных факторов. Контролем служили каллусы исходного сорта того же пассажа.

При добавлении в среду для регенерации NaCl образование почек происходило лишь в клонах, выделенных на засоленном фоне. При этом, число клонов, переходящих к морфогенезу, было значительно снижено по сравнению со стандартом. Клоны, устойчивые к другим стрессовым факторам, на среде с NaCl не регенерировали, но значительно возрастал процент некроза. Вероятнее всего, это связано с токсическим действием засоляющих ионов на неадаптированные к соли клетки. Добавление в среду для морфогенеза уменьшенных концентраций ПЭГ снижало интенсивность регенерационных процессов в клонах, резистентных к ПЭГ. В клонах, устойчивых к NaCl и этионину, морфогенез был полностью подавлен, но интенсивность некроза значительно снижалась по сравнению с регенерацией на стандартной среде (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние различных сред на морфогенез в культуре клеток риса

Характеристика клона Контрольные каллусы №С1-резистент-ные клоны ПЭГ-резистент-ные клоны Этионин-резистент-ные клоны

Стандартная среда*

Экспланты с почками, % 27.3 ± 2.7 13.3 ±2.7 22.2 ± 4.2 0.0

Число почек на эксплант 1.2 ±0.8 2.3 ± 0.7 5.8 ± 0.5 0.0

Некроз, % 29.0 ± 4.8 87.7 ± 3.5 18.1 ±3.2 37.6 ±5.1

Стандартная среда + 0,2% №С1

Экспланты с почками, % 13.3 ±2.7 12.8 ± 1.8 0.0 0.0

Число почек на эксплант 2.3 ± 0.7 9.3 ± 0.5 0.0 0.0

Некроз, % 87.7 ± 3.5 3.3 ± 0.9 48.3 ±2.4 80.9 ± 1.6

Стандартная среда + 10% ПЭГ

Экспланты с почками, % 2.3 ± 0.5 0.0 8.9 ± 1.0 0,0

Число почек на эксплант 0.7 ± 0.2 0.0 4.4 ± 1.4 0.0

Некроз, % 4.9 ± 0.3 23.3 ± 1.4 0.0 17.2 ±1.2

Стандартная среда + 0,2мМ этионин

Экспланты с почками, % 0.0 0.0 0.0 0.0

Число почек на эксплант 0.0 0.0 0.0 0.0

Некроз, % 83.0 ± 1.6 56.9 ± 0.9 78.0 ±1.3 36.6 ±2.1

Стандартная среда + 0,2 М сорбит

Экспланты с почками, % 60.1 ±4.8 37.3 ± 3.6 35.6 ± 2.8 7.7 ± 2.4

Число почек на эксплант 3.5 ± 0.6 8.3 ± 1.3 8.5 ± 0.7 2.1 ± 0.4

Некроз, % 7.4 ± 2.7 7.3 ± 2.5 0.0 1.0 ±1.1

* МС + 5 мг/л БАП + 30 г/л сахароза.

На среде с этионином во всех клонах регенерационные процессы были полностью подавлены. При этом наблюдался интенсивный некроз, особенно в каллусах, полученных на средах без этионина. То есть, этионин оказывает сильное токсическое действие и последействие на морфогенез, так как добавление его в среду для регенерации подавляло морфогенез во всех вариантах опыта. Добавление к среде 0,2М сорбита значительно увеличивало количество эксплантов с почками и число почек на эксплант во всех клонах. При этом, как видно из таблицы 3, этионин-резистентные клоны регенерировали только на этой среде. На среде с сорбитом отмечали низкий, по сравнению с другими вариантами, процент погибающих колоний. Добавление сорбита способствовало повышению интенсивности морфогенеза, во всех клонах увеличивалось число почек на эксплант. Стимулирующее действие сорбита на морфогенез в клонах риса, вероятно, связано не только с повышением осмотического потенциала среды, но и с трофическим действием этого вещества. Так как, при аналогичном повышении осмотического давления среды, при добавлении эквиосмолярных концентраций ПЭГ или ЫаС1, наблюдали понижение морфогенной способности клонов.

Селективная система, на которой получен клон Номер клона Фенотип Получено растений Характеристика регенерантов Получено зрелых растений Продолжительность вегетационного периода Высота растений, см Длина метелки, см Число метелок на растении Число колосков в метелке

1 2 3 4

ЫаС1 38 NrPrEr 13 7 4 2 8 93 36-58 5-8 2-4 13-20

51 Nr 50 28 1 16 5 26 100 38-87 9-23 2-15 14-82

127 Nr 30 23 1 3 3 20 100 51-85 6-12 2-8 12-21

153 Nr 3 3 - - 1 100 69 8 13 16

233 NrPrEr 10 5 1 4 - 4 95 35-51 7-10 1-2 15-20

240 NrEr 12 . 10 - 2 3 90 36-42 5-6 1-2 12-15

ПЭГ 66 Pr 1 1 - - 1 100 66 - - -

104 Pr 6 6 - - 4 100 52-65 10-11 2-3 11-16

115 Pr 8 3 1 3 1 1 100 40 8 4 16-20

165 PrNr 15 3 2 7 3 5 100 51-62 11 2 28-35

182 Pr 10 3 1 " 6 | - 6 100 66-93 10-13 2-3 12-25

186 Pr 21 3 3 10 5 11 100 58-68 8-12 3-5 13-27

200 PrEr 6 - 1 5 - - - - - -

Этионин 52 Er 3 - - 3 - 1 100 73 10-13 3 28-33

72 Er 4 4 - - - 1 100 77 12 2 30

127 Er 8 7 - 1 - 3 100 85-92 10-14 2-3 24-33

Исходный сорт - Союзный-244 100 95-100 16 - 80-98

где характеристика регенерантов: 1 - нормальные зеленые растения,

2 - кустистые зеленые растения,

3 - нитевидные слабозеленые растения,

4 - зеленые растения без корней.

Таким образом, добавление сорбита в регенерационную среду способствует повышению морфогенетического потенциала в клонах, устойчивых к различным стрессовым факторам. Поэтому, в последующих экспериментах для получения регенерации в устойчивых клонах использовали среду МС+5мг/л БАП+0.2М сорбит.

Как видно из таблицы 4 из стабильно резистентных клонов на оптимизированной регенерационной среде всего было получено 212 регенерантов. Наибольшее число растений регенерировали клоны, выделенные на среде с Иаа, наименьшее - из этионин-резистентных клонов. Продолжительность вегетации у всех полученных регенерантов была приблизительно на уровне контроля. Все растения были более низкорослыми, чем исходный сорт. Растения имели более короткую метелку, с меньшим числом колосков в ней. Метелки регенерантов зачастую были полностью стерильными, в некоторых случаях завязывались семена с невыполненным эндоспермом.

Из-за малого количества семян, полученных от регенерантов в первом поколении, мы имели возможность оценить всхожесть в засоленных условиях лишь у регенеранта, полученного от клона Иг 51. Проращивание его семян при засолении 1% показало, что регенерант имеет более высокую всхожесть в засоленных условиях, чем исходный сорт, но уступает солеустойчивому сорту (Табл. 5). Таблица 5. Всхожесть семян в условиях засоленния.

Условия / Сорт Поккали R1 (Nr 51) Союзный-244

1% NaCI 98% 62% 45%

диет, вода 100% 100% 100%

На основании этого нельзя сделать вывод о степени солеустойчивости регенеранта, так как для этого необходимо провести его оценку в полевых условиях в ряду семенных поколений. Поэтому все полученные регенеранта переданы в лабораторию культуры тканей ВНИИ риса (г. Краснодар) для размножения и изучения характера наследования признаков в семенных поколениях.

Заключение

Солеустойчивость - комплексный признак, который может проявляться на разных уровнях организации растения. Оценка трех генотипов риса in vivo и in vitro показала, что. устойчивый .генотип может проявлять повышенную солеустойчивость, как на уровне взрослых растений так и изолированных клеток.

Реакция этих генотипов риса на разные стрессовые факторы, моделирующие пути формирования различных механизмов устойчивости к солям, позволила предположить наличие у них различных защитных механизмов. У солеустойчивого сорта Поккали: 1) повышение "оводненности" клеток проростков для разбавления концентрации засоляющих ионов в цитоплазме - реакция, свойственная факультативным галофитам; 2) устойчивость изолированных клеток к осмотическому стрессу; 3) резистентность к гидрокси-пролину, вероятно, связанная с повышенным

синтезом пролина. Сорт Альтаир на клеточном уровне характеризовался повышенной осмоустойчивоетью и устойчивостью к токсическому действию этионина. Чувствительный сорт Союзный на клеточном уровне был неустойчив ко всем стрессовым факторам.

В работах по селекции на устойчивость к засолению могут быть использованы различные селективные системы, как прямые, так и косвенные, отражающие различные пути формирования солеустойчивого фенотипа. Проведенная работа показала, что солеустойчивые клеточные линии могут быть получены не только на среде с NaCl, но и в селективных системах с ПЭГ и этионином. Устойчивость к ПЭГ и этионину может говорить о метаболических механизмах создания солеустойчивости. Использование индуцированного мутагенеза и селекция на фоне NaCl, ПЭГ и этионина позволили из гетерогенной клеточной популяции риса неустойчивого ко всем стрессам фенотипа получить солеустойчивые клоны с двойной (NrPr и NrEr) и

тройной (NrPrEr) устойчивостью. Сравнительный анализ роста и накопления ионов + +

Na и К выявил многообразие ответных реакций резистентных клонов на засоление среды. Устойчивость клонов, независимо от системы в которой они были получены, могла определяться механизмами ионной регуляции, солеаккумуляции и компартментации или непроницаемостью мембран для засоляющих ионов.

Для передачи полученной устойчивости растениям регенерантам клеточные линии должны сохранять высокий морфогенетический потенциал. Однако, особенности генотипа и длительное культивирование в селективных условиях приводит к значительному снижению, а в случае этионин-резистентных клонов - к потере регенерационной способности. Использование селективных факторов на этапе морфогенеза значительно снижает регенерационный потенциал, а в некоторых случаях полностью его подавляет. Поэтому, для получения регенерации в резистентных клонах целесообразно использовать среды без селективной нагрузки, но с повышенным осмотическим потенциалом. Оптимизация регенерационной среды путем добавления сорбита позволяет получать растения из длительно культивируемых резистентных клонов.

Выводы

1. Изучена реакция на засоление у трех генотипов риса на разных уровнях организации растения: на уровне клеток, прорастающих семян и взрослых растений. Установлена кореляция признака на организменном и клеточном уровне in vitro.

2. Изучена реакция изолированных клеток различных генотипов риса на некоторые стрессовые факторы, отражающие пути формирования различных механизмов солеустойчивости: NaCl - ионная оеморегуляция; ПЭГ и сорбит -биохимическая оеморегуляция; гидрокси-пролин - синтез веществ осмопротектор-ного действия (пролин); этионин - синтез серосодержащих аминокислот (метионин).

В результате работы выбраны селективные системы, устойчивость к которым на клеточном уровне коррелировала с солеустойчивостью in vivo.

3. В результате использования индуцированного мутагенеза и клеточной селекции на фоне трех селективых факторов из популяции клеток неустойчивого фенотипа получены клоны, стабильно резистентные к NaCl, ПЭГ и этионину. Эти

системы (с ПЭГ, г ÇJL...... и этионином) могут быть использованы для

получения клеточных линий с определенными механизмами устойчивости. к засолению.

4. Проведена перекрестная проверка устойчивости резистентных клонов к другим селективным факторам. В результате, в каждой селективной системе были выделены варианты с различными фенотипами: 1) резистентные к одному селективному фактору (Nr, Рг или Ег); 2) резистентные к двум селективным факторам (NrPr, NrEr или PrEr); 3) резистентные к трем селективным факторам (NrPrEr).

5. Среди полученных клонов выделялись клоны "галофитного" типа, более интенсивно растущие в условиях засоления и "безразличные", интенсивность роста которых была приблизительно одинакова на средах в присутствии и отсутствии NaCl.

6. Проведен анализ содержания ионов натрия и калия в мутантных резистентных клонах. На основании полученных данных выделены группы клонов со следующими возможными причинами устойчивости к NaCl:

а)интенсивная солеаккумуляция ионов натрия с возможной компартментацией в метаболически инертных структурах - клоны 240, 245 и 233.

б) активная работа ионных насосов (возможно, слабая солеаккумуляция) -клоны 175, 38 и 185.

в) непроницаемость мембран для засоляющих ионов - клон 200.

Клоны в каждой группе были выделены в разных селективных системах и имели разные типы роста.

7. Изучено изменение морфогенной способности у клонов в процессе культивирования в стрессовых условиях. Оптимизированы условия регенерации из резистентных клонов. Наибольший выход регенерантов получен на среде МС+5мг/л БАП с добавлением 0,2М сорбита. Показано, что клоны риса, полученные в осмотически активных системах, поддерживали более высокий регенерационный потенциал, чем этионин-резистентные клоны и дикий штамм.

8. Получены и охарактеризованы растения из трех типов резистентных клонов. Показана сомаклональная вариабельность по количественным признакам. Линия 51 имела большую солеустойчивость по всхожести семян в засоленных условиях, чем исходный сорт Союзный-244.

Публикации

1. Белянская C.JI. Сравнительное изучение действия стрессовых факторов на клетки и проростки риса in vitro. Тез. докл. IV Всес. конф. молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, апрель 1990), М., 1990, с.142.

2. Белянская С.Л., Шамина З.Б., Ихсанов С.К. Использование культуры клеток риса для оценки солеустойчивости растений. Тез. докл. Всес. совещ. "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, апрель 1991), Цитология, 1991, т.ЗЗ, N5, с.90.

3. Белянская C.JL, Ихсанов С.К., Шамина З.Б. Влияние стрессовых факторов на клетки и проростки риса. Физ. раст., 1991, т.ЗО, N6, с. 1218-1226.

4. Белянская C.JI., Шамина З.Б. Характеристика клонов риса: резистентных к стрессовым факторам. Тез. докл. Совещания "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, октябрь 1992), Цитология, 1992, т.34, вып.9, с. 53.

5. Белянская C.JI., Шамина З.Б. Получение и характерстика клонов риса, резистентных к стрессовым факторам. Физ. раст., 1993, т.40, N4, с.681-685.

6. Белянская С.Л., Шамина З.Б., Кучеренко Л.А. Морфогенез в резистентных клонах риса. Физ. раст., 1994, т.41, N4, с.573-577.

Отдел оперативной полиграфии ТОО "ПЮИКО", Москва

Подписано к печати 20.06.95 Заказ N 375 Тираж 100 экз.