Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ ГАЗОННЫХ ТРАВ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ И ИОНАМ МЕДИ, МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ ГАЗОННЫХ ТРАВ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ И ИОНАМ МЕДИ, МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ"

Я-Ъ 3 изо

На правах рукописи

ГЛАДКОВ Евгений Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ ГАЗОННЫХ ТРАВ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ И ИОНАМ МЕДИ, МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

03.00.23 — биотехнология 03.00.16 — экология

АВТОРЕФЕВЇГ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток отдела биотехнологии и биологии клетки Института физиологам растений РАН и на кафедре экологической и промышленной биотехнологии Московского государственного университета инженерной экологии

Научные руководители, кандидат биологических наук, доцент Юлия Ивановна Долгих; доктор технических наук, профессор Валентин Васильевич Бирюков.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Александр Андреевич Минин, кандидат биологических наук, доцент Елена Анатольевна Калашникова.

Ведущая организация — Биологический факультет Московского государственного университета им М.В Ломоносова

Защита диссертации состоится « у*^^/ * 2003 г в /^часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Адрес- 127550, г. Москва, ул Тимирязевская, 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА

Автореферат разе \ <, 7 Ґ/ і / 2003 г.

Ученый диссерта^ кандидат с.

ета — зіх наук

Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . .. , , •

Актуальность темы. Один из важнейших элементов озеленения. городов — газоны. Газоны имеют не только декоративное значение, но и выполняют огромную экологическую, санитарно-гигиеническую роль, защищают почву от водной и ветровой эрозии, а город от пылевых образований.

Газоны, расположенные в городе, постоянно испытывают действие техногенных и антропогенных факторов. Содержание меди, цинка и, свинца в городских почвах превышает ПДК более чем в 5 раз (Обухов, 1990). Наибольшей фитотоксичностью среди тяжелых металлов обладает медь. Крайне высокое содержание меди фиксируется даже в почвах скверов и парков. , • ., -

В последние годы из-за использования противогололедных смесей в почвы весной наряду с тяжелыми металлами в значительном количестве поступают соли. Это приводит к неблагоприятному для роста и развития растений изменению химических и физико-химических свойств почвы. , Характерное действие загрязняющих веществ на городские газоны «краевой эффект» состоящий в образовании не покрытых растительностью участков придорожных газонов вдоль проезжей части. , ' ' V 1 ■

Один . из способов решения проблемы озеленения г города даже в неблагоприятных экологических условиях является получение растений, устойчивых к загрязнениям почвы. Наряду с традиционными методами селекции перспективно использовать современные биотехнологические подходы, которые. уже хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам: засухе, засолению, низким и высоким температурам и др. (ЫаЬогз,1980; Долгих, 1994; Белянская, 1995). Применительно к газонным травам подобные работы отсутствуют, хотя нет принципиальных показаний против их использования.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было получение с помощью методов биотехнологии газонных трав, толерантных к засолению и солям меди.... ... .. .... .'......,. . ,, . . . ... - , . ,

. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

провести оценку фитотоксичности ряда противогололедных реагентов, предложенных для использования в городе Москве,

на примере 2 практически важных видов газонных трав оптимизировать условия кучьтивирования каллусных культур овсяницы и полевицы и регенерации растений,

разработать условия клеточной селекции для отбора устойчивых к хлориду натрия и сотям меди калтусных -іншій газонных трав

из отобраных калтусных тиний, толерантных к. хлориду натрия и солям меди, по іучить растения регенера!ггы, устойчивые к этим токсикантам,

проверить сохранение признаков солєустойчивости и толерантности к меди в следующих поколениях выделеных регенераіггов

Научная новизиа работы Проведено испытание фитотоксичности 7 образцов противоготоледных материалов в диапазоне концентраций 0,1 -1,5° о на прорастание семян газонных трав овсяницы красной и полевииы гшантскои Показано, что большинство изученных противого штедных материалов ингибир\ет прорастание семян уже в концентрациях 0 5-1°о Разработана схема клеточной селекшш, включающая культивирование кал іуснои ткани на средах с хлоридом натрия и іи ионами меди в с> б летальных кониеігграциях в течение 2 пассажей и последующая регенерация и укоренение на среде с токелкантами а затем и в почве Впервые с помощью биотехнологических методов получены растения нотевицы и овсяницы, толерантные к соли У полевицы показано нас ісдование признака солєустойчивости в двух поколениях Впервые потучены растения ноіевицьі тоаерантные к высоким концентрациям меди, показано наследование признака \.стойчивости к меди в следующем поколении

Практическая ценность работы Полученные толерантные формы газонных трав могут служить основой для создания новых сортов обладающих устойчивостью к засолению и ионам меди Разработанная схема клеточной селекции может быть использована для получения устойчивых форм других видов растсний

Апробация работы Основные положения диссертации доложены на Пущинской школе-конференции 'Биология - наука 21 века , 2003, Международной выставке Доркомэкспо 2003, Москва, Международных конференциях Инженерная

, защита окружающей среды", Москва, .2002, 2003; Международной конференции «Экологическая безопасность как фактор устойчивого развития», 2001,2002 г.(работа дважды признанна лучшей); Международных симпозиумах Юнеско «Техника и технология экологически чистых производств», 2001, 2002, 2003; Международной конференции «Сельское хозяйство и природные, ресурсы»,. 2002. г., Москва, Международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективы», Москва, 2002г. .. ... . - . . . . .

Основные результаты докладывались на 5 выставках: "НТТМ 2001" (Москва, ВВЦ, получена медаль ВВЦ); выставке молодежных инициатив (Москва, ВВЦ, 2001); "НТТМ 2002" (Москва ВВЦ, получен диплом ВВЦ); международной выставке "Биотехнология- состояние и перспективы развития" (Москва, мэрия, 2002); ., международной выставке "Взгляд в будущее- экспо 2010" (Москва, ВВЦ, 2002).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на , 433 страницах ..машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы. включает ¿^источников. Текст иллюстрирован/¿таблицами и ^/рисунками. г, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . Объектами исследования было 2 вида газонных трав: овсяница красная красная . (Festuca rubra) и полевица побегоносная (Agrostis stolonifera). Фитотоксичность противогололедных реагентов проверяли, на другом виде полевицы - полевице гигантской (Agrostis gigantea L.) .

Условия гсультивирование каллусных культур и регенерации растений. Первичный каллус получали из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей ЗОг/л сахарозы, 500мг/л гидролизата казеина и 7 г/л агар агара. Концентрации 2,4-Д варьировали в пределах оті до 10мг/л. Для роста каллуса использовали среду МС с добавлением от 1 до 3 мг/л 2,4-Д. Раз в месяц клетки , пересаживали на свежую питательную среду. Регенерацию растений проводили на , среде МС без гормонов, укоренение на среде МС с 2мг/л НУК. Укоренившиеся регенеранты высаживали в почву.

... Оценку степени токсичности противогололедных материалов( ПГМ) проводили путем проращивания семян овсяницы и полевицы в чашках Петри на

фильтровальной бумаге, смоченной растворами тестируемых реагентов в концентрациях 0,05-1,5% В качестве реагентов ислотьзовали хшрид натрия технический карьерный , хлорид магния шестиводный (Бишофит) хлорид кальция твердый и жидкий (ХКМ) нитраты кальция и магния, карбамид (НКММ) ацетат аммония (Антиснег-1, Марка А), ацетат калия (Нордикс П)

Оценку устойчивости кахпсных кучъгтр и растений к засолению и ионам меди проводили для каллусных тканей по увеличению сырой массы hhhokvijomob посте месяца культивирования на средах с разным содержание сстекгивных факторов а для растений - по всхожести семян в почве, содержащей ЧаС1 in и CuSO«, и увеличению сухой массы за два месяца В каждом варианте опыта анализировали по 200 семян, 200 растений или 150 каллусов, опыты повторены трижды

Для каждого качественно сличающегося вида эксперимента рассчитаны значения дисперсии воспроизводимости относительных величин vcpeaileilllble д 1я всего массива данных, а также доверительные интервалы различии между группами измерений при надежности оценки 9Ч%

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. I. Экологическая экспертиза ПГМ

Учитывая негативные для растений последствия грименсния хлористого натрия для борьбы с гололедом, го заданию правительства Москвы рядом организаций предложены новые ПГМ Нами быю проведено изучение влияния раз шчных ПГМ на прорастание семян газонных трав по 1евицы и овсяницы

Летальной концентрацией дтя всех реагентов включая техническую соль, оказалось их содержание в воде 1 0-1,S% (Табл 1) Степень токсичности ПГМ на стадии прорастания семян и в период роста растении быта примерно одинаковой

По степени опасности все испытанные реагенты можно отнести к двум группам к 1-ой группе могут быть отнесены Бишофит, ХКМ твердый и жидкий Нордикс П как итоопедьно безопасные при условии соблюдения пршотых норм их расхода в течение жмнего периода. Во 2-ю группу реагентов с возможными отрицательными последствиями их действия на растения воппиЛггтиснег-1 и НКММ Высокая фитотом-и'шость обоих реагентов проявилась при разведении нативных препаратов (0 5-1 п 1000 мл воды), что во много раз превышает степень токсичности NaCl для этой тест-системы

' Таблица 1." Влияние ! противогололедных реагентов на прорастание семян полевицы и овсяницы в % к контролю на воде. »>••' * ' •«'*'.•»■.•..•,

ПГМ Всхожесть при концентрации ПГМ, % '

.. , 0,1 , 1.5

Л -1 ,■2: •• 1. 2 . 1 2 ; .1 ; ■А:

Хлорид натрия (технич) - 81 30 ' 76 12 ' 12 0

,.... Хлорид магния < •. (Бишофит) ' 105 114 79 : ' 82 79 30 : 60 0і

Хлорид кальция, • \ твердый ■ 90 68 74 52 '48' 0 14 0 '

Хлорид кальция жидкий 81 55 71 46 38 9 19 0

Нитраты кальция и магния 71 15 10 0 0 ■••о.. 0 0

Ацетат аммония . 56 , 32 4' 0 . 0 . 0 . 0 .

Ацетат калия (Норд икс-П) 100 78 61 ' 10 62 10 52 0

Примечание к таблице 1: «1» - полевица; «2» - овсяница.

Поскольку все испытанные ПГМ обладают определенной фитотоксичностью, актуальной является задача получения растений, толерантных к засолению. Все реагенты первой группы (бишофит, ХКМ) содержат токсичный для растений ион хлора. Кроме того, техническая соль до сих пор широко применяется в борьбе с гололедом, хотя и обладает большей фитотоксичностью, чем выбранные ПГМ. Поэтому при разработке биотехнологии получения устойчивых к ПГМ газонных трав в качестве селективного агента был выбран хлорид натрия. Предполагалось, что , толерантные к №01 растения могут проявить перекрестную устойчивость к бишофиту и ХКМ.

2. Разработка условий получения и культивирования каллуса и регенерации растений.

Эффективная система каллусогенеза и регенерации растений является обязательным условием успешного применения биогехнологических подходов Были оптимизированы усзовия каллусогенеза кутьтивирования каллуса и индукции морфогенеза Быпаиспочьзована универсальная срела МСс разным содержанием 2,4-Д При концентрации 2,4-Д I мгп у полевицы и овсяницы наблюдали интенсивное прорастание семян, процент образования каллуса был невысок. При концентрации 2,4-Д 10 чэт частота кал чусообразования была значительной, однако ботыпая часть калт>са была неэмбриогенной Эчбриогенный калт\ с формировался с высокой частотой на семенах обеих трав при концентрации 2,4-Д 3 и5мт (Тд1т2\

Табтица 2 Влияние концентрации 2,4-Д на калл>сообразование у овсяницы и полевицы

Концентрация 2,4-Д, мг/т

Индукция калтуса

Кутьтевиро-ваниекаддаса

ч

"о каллусогенеза

"о регенерирующих каллусов

I

полавивд

33

овсяница

полевица

3 3 <; 5 10 10

I Г

50

80

80

95

50 80 70 78

50 78 < 70 "І-77- | 82

43

~43~

56

40

45

Довсртельный и ігервал различий 1 | ("'о ог інмериемой величины)

56

40

43

5,6

6 1

4,0

Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д вето к быстрой потере способности к морфогенезу При снижении концентрации 2,4-Д до 1 мт удалось повысить частоту регенерирующих растения каллусов до 80% у овсяницы и до 95% у полевицы (Табл 2)

Для дальнейшей работы была выбрана среда МС, содержащая Змг/л 2,4-Д для образования каллуса, 1мг/л -для пассирования..

В результате проведенной оптимизации условий культивирования тканей полевицы и овсяницы разработана эффективная система in vitro, характеризующаяся высокой частотой образования каллуса и регенерации растений. -3. Получение газонных трав, толерантных к засолению 3.1. Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к NaCI ■■."''■

Для проведения селекции и оценки получаемых регенерантов нужно было определить чувствительность к соли растений и каллусных культур.

Масса каллуса на среде без соли увеличивалась за месяц в 6 раз. Добавление 1% NaCI вызывало снижение роста тканей в 2 раза для полевицы и в 1,6 раза для овсяницы. При 2%-ном засолении средняя масса каллуса была в 2,5 раза ниже контрольной у обоих видов трав. На средах с 1 и, особенно, 2% NaCI сильно проявлялась гетерогенность культивируемых тканей.

Интенсивность роста отдельных инокулюмов различалась в полтора-два раза. Часть каллусов погибала на среде с солью, а некоторые сохраняли рост на уровне контроля. . . ..•'..

Засоление значительно снижало эмбриогенную способность каллусной ткани. При 1% засоления у выживших каллусов полевицы эмбриогенная способность составляла 49% от контроля, у овсяницы-56%, при 2% засолении у полевицы-.45%, у овсяницы -43%. Таким образом, только половина каллусов выживших на средах с NaCI сохраняла способность к регенерации растений. "'*"

Концентрации 1% и 2% были выбраны для дальнейшей селекции в культуре клеток. ....

> . Действие соли на растения определяли пределах концентраций 0,3-1%, так как • именно такой уровень засоления регистрируется в почвах Москвы. ,

Таблица 3 Влияние №С1 на всхожесть семян и рост растений овсяницы и полевицы

Концентрация КаС1, % Всхожесть семян, 0/ 1 %от контроля Средняя масса растении, °оог контроля

Овсяница | Полевица | Овсяница Полевица

0,3 65 1 52 71 62

! 0,6 56 1 37 58 50

! .,0 20 46 50

Доверительный интервал различий (% от гомеряемой величины) 3.7 I 50 43 3,5

Ингибируюгаее влияние на прорастание семян и рост растений проявлялось уже при низкой концентрации МаСД (03%) При невысоких концентрациях хлорида натрия более чувствительной оказалась полевица, однако однопроцентное засоление было одинаково токсично для обеих трав (Табд.3) Растения на засоленной почве росли медленно, листья, особенно нижние, желтели и засыхали Концентрация 1% №С1 являлась с\блеталыгой для овсяницы и полевицы, при очень низкой всхожести v большинства выживших растений половина листьев желтела и отмирала

3.2. Получение солеустойчивых клеточных клонов и растений.

Для отбора соле\'стойчивы\ клонов первичный калтус культивировали на средах с I и 2 "о ЫаС1 В ходе отбора происходило изменение выживающих эксплантов уменьшалась эмбриогенная способность ткани нерастущие -жспланты приобретали темный цвет некротизировались Светлые экспланты, у ве точившиеся в размере, отбирали для дальнейшей пересадки Отобранные экспланты помешали вновь на селективную среду с 1% и 2% ЫаС1 После двух пассажей в на среде с \% №С1 и у овсяницы, и у полевицы выжило около 30% каллусов Процесс морфогенеза является наиболее чувствительным к стрессам [Белянская и др ,1994 ) Поэтому для повышения вероятности отбора только устойчивых мутантных вариантов регенерацию растений из отобранных клонов также проводили на среде с 1% КаСЛ Только 60 каллусов овсяницы и 200 каллусов полевицы сформировали растения, более половины которых погибла при пересадке в почву (1абл 4)

Таблица 4. Отбор толерантных к №С1 растений овсяницы и полевицы

Концентрация №С1, % - Общее число ■ каллусов• ■ Число устойчивых - * клонов Число регенерантов ш у!1го - Число ,. . регенерантовв почве ^

Полев. Овеян. Полев. Овеян. Полев. Овеян. Полев. Овеян.

1 1500 450 590 180 200 60., .132 . 26 ,

2 600 300 150 86 50 25 . 18 , - 9

При проведении селекции в более жестких условиях (среда, с 2% ИаСО, значительная часть каллусной ткани теряла . жизнеспособность в, течение 2 недель. Лишь некоторые клоны сохраняли эмбриогенную способность и имели прирост биомассы. Из них были получены растения-регенеранты, однако с меньшей частотой, чем при проведении селекции на среде с 1% соли. Полученные растения хуже приживались в почве и не дали семян. По-видимому, культивирование клеток на среде с 2% соли вызывает неспецифические повреждения, которые впоследствие снижают выживаемость регенерантов. В целом выживаемость овсяницы была ниже, чем у полевицы. " . .

3.3. Характеристика растеннй-регенерантов

Выжившие растения-регенеранты полевицы и овсяницы первоначально выращивали в почве без соли. Около 5% регенерантов имели морфологические отличия от исходных растений: отсутствие кущения, более жесткие и темные листья. Остальные растения были морфологически нормальны и росли так же, как контрольные образцы. После месяца выращивания растения были срезаны на расстоянии 10 см от поверхности почвы для имитации стрижки газона. Затем .для проверки солеустойчивости: в сосуды с частью.. растений вносили КаС1 в концентрациях 0,5 — 2,0%. Остальные регенераты были использованы для оценки характера отрастания травы после стрижки и для получения семян.

Прирост растений в почве без соли за месяц был одинаковым у исходных растений и регенерантов и составил 5 см для овсяницы и 4 см для полевицы. В варианте с засолением выживаемость регенерантов была выше - выживаемости исходных растений при всех концентрациях №С1. С увеличением концентрации соли

разница увеличивалась (Табл 5) Средний прирост за месяц у растений, полученных из солеустойчивых клонов был в 2 раза больше при уровне сота 1% и в гри раза при полуторапроцентном засолении (Габл 5) В отличие от пожелтевших исходных растений, большая часть регенераптов сохраняла высокие декоративные качества при концентрации КаС1 1% При более высокой средней устойчивости растений, полученных после клеточной селекции, индивидуальные растения демонстрировали различную реакцию на КаС1 Например у полевицы при концентрации соли 1% из 10 растений 3 имели чувствительность иа уровне исходных растений, 2 оказались немного устойчивее, а на 5 регенерантов засоление не оказывало никакого влияния По-видимому, не у всех растений, регенерированных из отселектированных клеточных клонов, признак устойчивости проявляется на уровне целого организма, и степень его проявления может быть различной

Таблица 5 Выживаемость и рост растений-регенерашов полевицы (овсяницы) полученных посте селекции на солєустойчивость (в "о к росту без засоления)

Концяпрашя МаС1%

Выживаемость исходных растений, %

і

Выживаемость регенератов,0 о

Прирост регенератов в

Прирост исходных

расгенийв _ ,

засоленной почве ишпенои почве. „ 1

о ->

Л

полев овеян Полев . Овеян Полев , овечн потев I овеян

05

і л

I

¡оа

1 0 15

90

100 100

100

100

100 100

5Я

33

69 33

90

юоН

70

80

20

10

20

80

80

18

20

56

50

30

Доверительный

интервал различий (% от шмеряемой величины)

26

5,6

65

43

20

2 6

I

Анализ солеустоичивости растений, полученных из отселектированных клонов показал, «по методом клеточной селекции можно потупить газонные гравы, толерантные к засолению

3 4 Проверка наследования признака солеустойчивости

Поскольку селекционную ценность представляет только наследуемая солеустойчивость необходимо было проверить реакцию на засоление растений, вырашенных из семян регекерантов Несмотря на отсутствие морфологических отличий от контроля регенеранты существенно различались по семенной продуктивности У овсяницы зацвело только одно растение, образовавшихся семян было слишком мало для анализа У полевицы семена завязались у десяти регенератов, полученных из клонов, отобранных на среде с 1% ЫаС1 Потомство трех наиболее продуктивных клонов было использовано для определения

солоустоичивости

Всхожесть семян регенерантов .4° I и № 2 проращиваемых в чашках Петри на фичьгровальной бумаге, смоченной 1% раствором N¿0, и дчина проростков через три недети посте начала опыта быта в два раза бо гьше соответствующих показателей исходных растений У контрольных прсростков в варианте с сочью корни появились только у единичных семян а у семян регенерантов ингибирования корнеобразования по сравнению с семенами проращиваемыми на воде, не отмечено (Рис 1)

Рис 1. Влияние 1% моления па чсхожесть и рост потомков растения-регенеранта почевицы

растения

_□ Всхожесть_Я Рост_

По 30 семян регенерантов .4° 1 и № 3 высаживали в почву с содержанием МаС1 0,7% Семена контрольных растений в этих условиях не проросли, хотя в почве без

И

соли они имели всхожесть 95%.У регенерата Ж 1 всходы дали 60 % семян, а у регенеранта № 3 - 33 %. По степени кустистости и высоте потомки регенератов на , соли не уступали растениям, выращенным в* нормальной почве (Таб.6). У отселектированных растений отмечено обильное цветение и завязывание семян в стрессовых условиях. '

Табл 6. Влияние хлорида натрия на всхожесть, рост и декоративные свойства растений первого поколения (Р|). .. / ' '

Найме нование групп расте ний Коли чесгворасге ний " Всхожесть ■ % ; Кустис тость (число, побегов) Количе ство продук тивных -побегов. , Высота, см

Контроль (без со л;и )

Исходные ' 26 ' 86,7 ' ' 3,7 " 1,5 ' 14,5

Р)(№1) 23 , 76,7 . 5,0 . 3,5 14,9

Р1(№3), 19 63,3 4Д ' 3,4 14,2

Втом числе растение* 1 - 17 10 18

Концентрация ИаС1 - 0,7% . ... -

Исходные , 0 0 0 0 " 0

Р,(№1) . 18 ' '60 4,9 3,1 15

Втомчжле растение** : ;1 •■ ; - ■ " 18 ' / - 5 23

Р[(№3) 33 5,9 / 3'2 13,5

В том числе растение*** * ...... ^ , 12 У .17

.7 ,,

Проверка слелующего семенного поколения также показала сохранение

признака солеустойчивости

Проявление солеустойчивости в потомстве регенерантов, полученных после

клеточной сетекции, свидетельствует о мутационной природе данного признака

Различная степень устойчивости к Ь'аО является, вероятно, отражением сегрегации

генов контролирующих реакцию на засоление

4 Проверка устойчивости к бишофиту растений, толерантных к №С1

Наличие обших механизмов устойчивости позволяет предполагать что формы,

толерантные к одному фактору, могут быть менее чувствительны и к другим Так как

бишофот может быть рекомендован в качестве новой противогололедной смеси

вместо хлористого натрия, целесообразно было проверить устойчивость к нему

растении, толерантных к МаС1 Хлористыи магний мало повлиял на прорастание

семян всхожесть как отселектированных, так и исходных растений была высокой Но

исходные растения значительно отставали в росте от контрольных, а рост растений,

выращенных из семян регенерата, почти не уступал росту в почве без соли (Табл 7)

В след\ющем поколении 90° о проверенных МаС1 устойчивых растений также роста

на бишофите лучше, чем контрольные

Таблица 7. Влияние бишофита (1°о) на рост растений полевицы,

\стоичивых к Ь'аС I

„ Всхожесть, Рост,

Растения

__% от контроля % от контроля_

Исходные _78_|_50_1

Устойчивые к МаС1 _83 _86

Доверительный интервал 1 ¿у 54 _различий (°"о) !_ _|_____1

Таким образом, данный метод можно рекомендовать для получения газонных трав обладающих повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям мегаполисов

4. Получение растений, толерантных к нонам меди

4.1: Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к меди ' ' " ,'•".':,.>..-,; Г., >

Другим важным составляющим техногенным фактором являются соли тяжелых металлов, среди которых медь имеет наибольшее значение. Для селекции устойчивых к ионам, меди газонных трав была исследована чувствительность растений и каллусных , культур овсяницы и . полевицы , к CuSO«. В . почвах г. Москвы зарегистрировано содержание ионов меди <{• до • ( i 300 мг/л (Добровольский,Строгонова,1997). Между тем нами было показано, что добавление в сосуды с экспериментальными растениями 150 мг/л Си вызывает значительное уменьшение всхожести семян и двукратное замедление роста у обеих трав . При повышении дозы меди до 300 мг/л у растений начинался хлороз, а при длительном выращивании в загрязненной почве они погибали.... ... , ..

Добавление соли меди в питательную среду ингибировало рост каллуса (Табл. 8). Как и целые растения, культивируемые ткани овсяницы были более чувствительны к меди, чем полевицы. Одна и та же степень подавления роста отмечена у овсяницы при дозе Си 100 мг/л, а у полевицы при дозе 150мг/л. -

При концентрации 300 мг/л и выше каллус газонных трав приобретал голубую окраску, вероятно, вследствие интенсивного накопления меди в клетках. Большая часть каллусных инокулюмов теряла способность к регенерации растений после культивирования на среде с медью.

На основании исследования действия меди на каллусные ткани и растения овсяницы и полевицы доза 150 мг/л была выбрана в качестве селективной для отбора устойчивых клеток и растений.

Таш.8 Влияние меди на рост и способность к морфогенезу каліуса газонных трав

Вид

Концентрация меди і

M Г/1

Полевица

Г

I Доверительный і

интервал ^ различий (%)

Овсяница ,

Доверительный І шперпаї 1_различии ("о4)

100

150 200 300 450

100

150

200 300

450

"о прироста по отношению к контролю

61,5

36 9

20

38

40

34,2

28,5

10,7 2,1 0

4,5

% образования | эмбриогенного

калтуса по отношению к контролю

33,3

20,5

64

25

4,4

!8

S

2,5

65

4.2. Отбор и характеристика толерантных к меди растений

Дія отбора толерантных к меди растений была использована такая же схема сеіекции, как и в стучае с КаС1 Селективный фактор присутствовал в среде на всех этапах отбора включая укоренение регенерантов

Таблица 9 Отбор толерантных к ионам меди растений овсяницы и полевицы

і«» Чиста І

Общее чисто Число \стойчивых1 1 I

1

каллусов ' клонов 1

Чисто регенерантов m vitro

регенерантов в . почве

т

Овеян Полев Овеян 1 Потев Овеян Полев і Овеян

250 256 62 , 80 10 35 і 0

Всего в селективных условиях было получено 80 регенерантов полевицы и 10 регенерантов овсяницы (Табл. 9). Жизнеспособность последних была крайне низкой, все они погибли в..течение 7 недель после посадки в почву. Поэтому проверить устойчивость к меди у регенерантов овсяницы не удалось.

Большинство регенерантов" полевицы имели нормальную морфологию и хороший рост. Пять регенерантов зацвели и дали семена. Для проверки устойчивости к высоким концентрациям меди регенераты полевицы были высажены в почву со 150 мг/л Си. Около 80% растений, полученных из устойчивых к меди клеток, росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.

Для определения наследуемости признака устойчивости к меди, около 300 семян одного из регенерантов проращивали со 150мг/л меди. Всхожесть семян регенеранта была в 3 раза выше, чем у исходных растений (рис.2). Медь не угнетала рост исследуемых растений и не вызывала хлороза.

Рис.2. Влияние меди (150 иг/г) на всхожесть и рост растений полевицы

—:..........2

I □ Исходные растения .

I ■ Потомки [ , ,.,

i регенерата

Примечания к рис.2: «1» - всхожесть, «2»-рост. ' ,, >

Таким образом, большинство. растений-регенерантов, полученных из устойчивых к меди клеточных линий, обладало повышенной толерантностью к меди. У растений полевицы показано наследование отсеяектированного признака в следующем поколении

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании подбора vmobhh культивирования m vitro и исследования реакции культивируемых тканей овсяницы и полевицы на хлористый натрий и ионы меди разработана биотехнология получения растений, толерантных к этим стрессовым факторам Выбранная схема отбора предусматривающая и культивирование, и регенерацию растений в селективных условиях, обеспечила отбор форм с преимущественно генетической природой устойчивости Доказательством )Того утверждения является тот факт, что отбираемые m vitro признаки проявились на уровне целых растений и большая часть регенератов имела повышенную устойчивость к засолению и ионам меди (Табл 10) Габл 10 Эффективность клеточной селекции

Селективный фактор J К0НЦЄ1ГГ-рашія і Кол- 1 во семян Кол-во растений °0 Кол-во _ растении давших семена 0а Кол-во растений у | кот уст-ть I наслед-ся в след поко тении 0 о

| \аС1 Го 18~5 , "04 1,06 0 74

1 \iaCl :% 1-І) j 2,4 0 0 1

Си 1 ^Омг КІ 87< | 4 1 14 | 0 8 j

У полевицы показано наследование тотераігтности к обоим стрессовым факторам Благодаря небогьшой продолжительности культивирования тканей в селекливных условиях V далось сохранить достаточную способность к регенерации растении и избежать нежслате іьной сомаклональной изменчивости Более эффективным оказалось проведение отбора в относительно мягких селективных условиях (Ш<0) с последующим его завершением уже на уровне растений При испо іьзование для селекции среды с 2°« ИаС1 существенно уменьшалась способность ку тьгивируемых клеток к морфогенезу, а полученные растения имели низкую жизнеспособность

По частоте выделения форм с наследуемой толерантностью разработанный способ клеточной селекции не уступает индуцированному мутагенезу, но количество нежелательных іенетических изменений в нашем случае было ниже Процесс получения растений со стабильной и наследуемой устойчивостью при использованной в данной работе биотехнологии занимает два года Это намного меньше, чем

проведение селекции традиционным методом с применением отдаленной гибридизации/ ' • ; г

Все перечисленное выше позволяют рекомендовать - данный метод: для получения' газонных трав, обладающих повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям мегаполисов. ' • ' • «'•* ' ' ' " * •

ВЫВОДЫ: ■ .-...,., , ; .

' 1. ' Подобраны условия индукции и культивирования каллусных тканей и регенерации растений газонных трав овсяницы красной красной и полевицы побегоносной. Активный рост тканей и наибольшая частота регенерации получены при использовании среды МС с 3 мг/л 2,4-Д для индукции, с 1 мг/л - для пролиферации каллуса и среды МС без гормонов для регенерации растений. 4

2. - Определена реакция растений и культивируемых тканей полевицы и овсяницы на хлористый натрий и ионы меди. Концентрации 1 и 2% NaCl и доза меди 150 мг/л определены как селективные как для клеток in vitro, так и для растений. ;

.3. Разработаны условия клеточной селекция каллусных культур и растений, толерантных к хлориду натрия и ионам меди. Предложенная схема предусматривает проведение всех этапов отбора (культивирование тканей в течение двух, циклов выращивания и регенерацию растений) в селективных условиях.

, 4. Из устойчивых к 1 и 2% хлорида натрия каллусов получены растения полевицы и овсяницы, толерантные к соли. У полевицы показано наследование признака солеустойчивости в двух поколениях.

5. Проведена экологическая оценка новых противогололедных материалов. Показано, что наименьшей фитотоксичностью обладают бишофит и хлорид кальция. Применение' ацетата аммония и НКММ нежелательно из-за их выраженного отрицательного действия на растения.

6. Выявлена перекрестная устойчивость к 1% бишофита у растений, толерантных к соли.

7. В результате клеточной селекции 'получены растения полевицы с наследуемой толерантностью к 150 мг/л меди.

8. Устойчивые к стрессовым факторам растения не уступали исходным по таким газонным качествам как габитус, кустистость и скорость роста.

Публикации:

1 I вдков Е А , Долгих Ю И , Бирюков В В Отбор солеустойчивых газонных трав с помошью методов биотехнологии I Биотехнология -М ,2003 №5 С 32 37

2 Гладков Е А , Долгих Ю И Оптимизация процесса получения каллуса // В сборнике статей трудов МГУИЭ М, 1999 Т4 -С 158-162

3 Гладков ЕА Долгих ЮИ Аксенова ЛА Анализ стресс-индуцируемых белков в чувствительных и устойчивых к ЧаС1 клетках h В сборнике статей трудов ЧТУ ИЭ М ,2001 - Т 5 -С 16-18

4 Gladkov Е А , Dolgikh Yu I, Shevvakova NI, Birvukov V V The effect of antucing reagents and heavy metals on the grovvth of lown's grasses ' In Symp Plant under Environmental Stress - VIoscovv, 2001 pp 80

5 Гладков ЕА, До и их ЮИ, Бирюков В В Перспективы применения методов биотехнологии, для совершенствования газонных трав в неблагоприятных жо готических условиях города В сборнике докладов 5 межд конференции Экологическая безопасность и устойчивое развитие Москва 2001 -С 335 -336

6 Гладков F А Долгих К) И , Бирюков В В , Щевякова Н И, Шайкина ЕЮ Экологические подхолы в решении проблем городского озеленения И В сборнике научных трудов МГУИЭ Математика механика экология" -М,2002 -вып 1 С 189 193

7 Г идхов ЕА, До них ЮИ Бирюков В В Получение газонных трав. Устойчивых к неблагоприятны« жо'готическим условиям горол.1 В сборнике докладов VI Между нар конф « Рло 10+ Экологическая безопасность как ключевой фактор устойчивого развития» - М 2002 С 1*0-151

8 Гладков F А Долгих Ю И , Бирюков В В , Шевякова Н И , Шайкина ЕЮ Экологическая оценка противогололедных материалов и отбор толерантных, к неблагоприятным условиям окружающей среды, газонных трав ' В сборнике III Между нар российско-иранской конф «Сельское хозяйство и природные ресурсы» Москва2002 -С 183

9 Гладков ЕА Долгих ЮИ, Бирюков В В Биотехно югическая модификация газонных трав устойчивых к экологическим стрессам города /' В

сборнике I Международного Конгресса «Биотехнология, г. ^состояние и перспективы».-Москва, 2002.-С.129-130. > ,

■ 10., Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В. Получение растений устойчивых к хлористому натрию и, засухе. // Материалы II Международной конференции «Актуальные проблемы современной генетики». -Москва , 2003. - С 57-58. • г- . .-,. . < • . ^. . ■

11., Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В., и др. Клеточная селекция газонных трав, устойчивых к высоким концентрациям меди и цинка. // .Сборник докл. Международной конференции "Инженерная защита окружающей среды".-М.,2003.-С.51-52. , • „.

12. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В., и др. Отбор газонных трав, устойчивых к неблагоприятным условиям мегаполисов, с< помощью методов биотехнологии. // Тез, докл. V Международной выставки Доркомэкспо. -М., 2003. — С. 56 -57.

13. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Колодезных З.К., Шевякова Н.И., Шайкина Е.Ю.,. Бирюков В. В.,и др. Экологическая оценка противогололедных материалов и- отбор газонных трав, толерантных к бишофиту.. И В сборнике докл. Междунар9даой конференции "Инженерная защита окружающей среды". - Москва .2003.-С.53.

,14. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В. Отбор солеустойчивых растений с помощью методов биотехнологии. // В сборнике тез. докл. VII Пущинской школы-конференции "Биология-наука21 века"-2003.-С 95. , ■ •

Объем 1,25 пл.

Зак. 437

■ А1Ю «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Тираж 100 экз.