Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA НА ГАЗОННЫЕ ТРАВЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ ПОЧВЫ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA НА ГАЗОННЫЕ ТРАВЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ ПОЧВЫ"



На правах рукописи

СОКОЛОВА Анна Ярославна

Изучение протекторного действия бактерий рода Klebsiella на газонные травы в условиях засоления почвы

Специальность 03.00.07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научный руководитель, доктор биологических наук, профессор В Т Емцев Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, профессор А Л Степанов

кандидат биологических наук, доцент И Г Тараканов

Ведущее учреждение - ГНУ ВНИИ кормов им В Р Вильямса

Защита диссертации состоится « 2006 г в « /Л часов на

заседании диссертационного совета Д 220 043 03 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, ул Тимирязевская, д 49, Ученый совет

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной библиотеке РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан « 006:

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время проблема засоления почв, лимитирующая рост и продуктивность растений, приобретает все большее значение, как в условиях городов, так и в сельской местности. Во всем мире 950 млн. гектаров используемых почв являются засоленными и 77 млн. гектаров орошаются соленой водой (Epstein Е. et al., 1980). Одной из крупных проблем озеленения больших. , городов России является техногенное засоление почвы, вследствие использования ! противогололедных реагентов на дорогах в зимний период (Гладков Е.А., 2003; ' Калашникова О.В., 2003). Это приводит к нарушению экологической обстановки, | гибели зеленых насаждений, изреженности и недолговечности газонов. По данным лаборатории солеустойчивости Института физиологии растений РАН только за

I 1999 год в Москве погибло 40000 деревьев и кустарников.

I

| В настоящее время для ремедиации земель используют агротехнические

I

'. мероприятия, вывоз грунта или его полную замену, что требует больших

! экономических затрат и полностью не решает проблему восстановления почв.

I Техногенное загрязнение окружающей среды в городах носит комплексный

характер. Происходит не только засоление почв, но и их загрязнение тяжелыми

металлами, нефтепродуктами. Это оказывает стрессорное действие на растения.

В последние годы для защиты растений от воздействия стрессорных факторов

окружающей среды стали активно использовать микробиологические методы. С

этой целью начали применять биопрепараты, основу которых составляют

различные микроорганизмы, относящиеся к родам: Aeromonas, Alcaligenes,

Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Xanthobacter (Емцев

,B.T., 1994; Голодяев Г.П., 1997, 1998, 1999, 2000, 2002; Станкевич Д.С., 2002;

Егоров С.Ю., 2003; Белимов А.А., 2004; Архипова Т.Н. с соавтр.2004; Hirano Shin-

ichi et al., 2004). Главным преимуществом метода биоремедиации является

длительность действия и гармонизация биосферы. Данный метод признан дешевой

и безвредной технологией очистки почв от различных гтплпптянт™1, иадпг.дшай

РГАУ-МСЧА

дополнительного ущерба окружающей сред

ЦНБ имени Н.И. Ж '.л з»о«а ^ Фонд научный лшьратури }

Участие микроорганизмов в снятии «рессорного воздействия засоления на растения до настоящего времени исследовалось недостаточно Это и определило цель и задачи настоящего исследования

Целью исследования было изучение протекторного действия бактерий рода Klebsiella на газонные травы в условиях засоления почвы

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1 Изучить влияние бактерий рода Klebsiella (Klebsiella planticola и Klebsiella pneumoniae) на рост и развитие газонных трав в условиях засоления

2 Исследовать совместное воздействие К planticola и биологически активных веществ (регуляторов роста) на газонные травы в условиях засоления

3 Изучить приживаемость К planticola при инокуляции семян газонных трав в условиях засоления почвы

4 Определить влияние К planticola на морфофизиологические показатели газонных трав в условиях засоления

5 Изучить влияние К planticola на некоторые показатели качества газонных трав, культивируемых в условиях засоления почвы

6 Изучить роль К planticola на содержание кадмия в различных растениях под влиянием засоления и загрязнения почвы кадмием

Научная новизна Впервые установлен протекторный эффект инокуляции

бактериями рода Klebsiella (К planticola и К pneumoniae) газонных трав,

культивируемых в условиях засоления Выявлено неизвестное ранее для К

pneumoniae свойство обеспечивать нормальный рост растений в условиях высокой

концентрации хлорида натрия Инокуляция семян газонных трав бактериями

совместно с обработкой регуляторами роста растений (6-БАП, крезацин)

способствует взаимному усилению роста растений по фону засоления Инокуляция

растений бактериями, оптимизирует морфофизиологические показатели растений

газонных трав, увеличивает количество митозов в апикальной части корня, что

приводит к менее интенсивному падению митотического индекса в условиях

засоления Протекторный эффект бактеризации газонных трав в условиях

засоления хлоридом натрия обусловливает также повышение содержания в

2

растениях пролина. Кроме того, установленная способность Klebsiella planticola проникать в растения, что по-видимому, способствует активизации защитных механизмов, повышающих иммунный статус растений, что позволяет им проявить устойчивость к засолению.

Впервые выявлено, что в условиях засоления почвы инокуляция бактериями газонных трав способствует снижению содержания кадмия в растениях.

Практическая значимость. Результаты проведенной работы позволяют сделать заключение, что бактерии рода Klebsiella, оказывают многогранное воздействие на растения газонных трав, способствуют их солеустойчивости и могут быть рекомендованы для защиты от солевого стресса как при использовании противогололедных реагентов в городской среде, так и в сельскохозяйственной практике. Кроме того, полученные данные позволяют использовать бактерии К. planticola для стимуляции роста растений в условиях загрязнения почвы кадмием.

При подборе штаммов бактерий, устойчивых к стрессорам-противогололедным реагентам, тяжелым металлам и ксенобиотикам следует учитывать наличие повышенного коэффициента насыщенности жирных кислот и снижение показателя текучести клеточных мембран бактерий, позволяющие считать, что данный штамм бактерий способен адаптироваться к экстремальным факторам среды.

По итогам исследований получен патент РФ № 2189155 от 20 сентября 2002 года, подана заявка на изобретение № 2004119090 от 24 июня 2004 года

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на

Международной научной конференции молодых ученых «Молодые ученые -

аграрной науке», посвященной 140-летию Российского государственного аграрного

университета - МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2005), VIII Международном

симпозиуме молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника экологически

чистых производств в XXI веке: Проблемы и перспективы» (Москва, 2004),

Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология -

XXI век" (Саратов, 2004), 11 -th International Congress on molecular plant-microbe

interactions (С-Петербург, 2003), V Международном Симпозиуме "Новые и

нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2003).

з

Работа удостоена звания лауреата конкурса Правительства Москвы "Гранты Москвы" в области наук и технологий в сфере образования, в номинации -"Аспирант-2004"

Объем работы Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает в себя следующие раздеты введение, обзор штературы, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 21 f наименования, в том числе 96 зарубежных авторов, приложения Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 9 рис>нками ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования К. planticola (штаммы ТСХА-91 и Rif*00 из коллекции кафедры микробиологии РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева), К pneumoniae (штамм 204 из коллекции ГИСК имени JIА Тарасевича)

Питательные среды Для культивирования К planticola использовали среду Luna Bertani (LB) (Миллер Дж X, 1976) и LB с добавлением римфампицина Среда Федорова - Калининской (ФК) использована в качестве накопительной среды (Емцев ВТ, 1999) Для культивирования К pneumoniae использовали среду Ворфетя-Ферпоссона (ВФ) (Мирошниченко И В , 1980)

Культуры газонных трав Для исследования протекторного действия К planticola на газонные травы по фону засоления отобраны следующие растения райграс пастбищный сортов ВИК, Дуэт, овсяница красная сортов Татьяна и Юлишка Тест-культурой для изучения протекторного воздействия бактерий на поступление кадмия в растения с тужила капуста китайская сорт Ласточка

Определение коэффициента насыщенности жирных кисют бактерий и показатетя текучести клеточных мембран К planticola ТСХА-91 и Rif '(Loffhagen N et al, 1995) проводили по спектру жирных кислот, используя метод газовой хроматографии, на приборе Microbial Identification System Sherlock, MIDI Inc, Newark, Del, США (Stead D E et al, 1992)

Для количественной оценки протекторной активности К planticola ТСХА-91 и К pneumoniae 204 на растения в условиях засоления оценивали следующие параметры всхожесть семян (ГОСТ 12038-84), длину наибольшего листа и среднею длину корней газонных трав В качестве стрессора использовали NaCl,

■4

КС1 или СаСЬ- Концентрация NaCl составляла 1,0-2,0-3,0%, СаС12 и КС1 применяли в эквимолярных количествах по отношению к NaCl, что соответствует 0,2-0,3-0,5 М (в опытах с К planticola ТСХА-91). В опытах с К. pneumoniae 204 использовали NaCl в концентрации 0,1-0,2-0,3 М. Семена газонных трав

инокулировали в течение 30 минут суточной суспензией живой культуры К. *

planticola ТСХА-91 или К. pneumoniae 204, разведенной дистиллированной водой до концентрации 109 микробных клеток/мл. После этого семена переносили в чашки Петри и проращивали в темноте по 25 штук в четырех повторениях при температуре +20°С при указанных стрессорных факторах. Для контроля использовали дистиллированную воду. Учет результатов для райграса пастбищного проводили через 7 дней, для овсяницы красной через 14 дней.

Сравнительное изучение совместного действия К. planticola и регуляторов роста на газонные травы в условиях засоления проводили по вышеуказанной методике. В качестве синтетических регуляторов роста использовали б-бензияаминопурин (6-БАП) - 25 мг/я, трис-(2-оксиэтил)-аммоний-орто-крезокси (крезацин) -125 мг/л. Стрессором служил 0,3 М NaCl.

Цитофотометрический анализ газонных трав, используемых в опыте, проводили для определения длительности фаз клеточного цикла на цитоспектрофотометре SMP-20 «Opton». Семена райграса пастбищного сорт Дуэт проращивали и инокулировали К. planticola ТСХА-91 по вышеописанной методике по фону 0,1 - 0,2 - 0,3 М NaCl. Контролем была дистиллированная вода. Через 7 дней проводили приготовление препаратов из клеток меристемы корня. •Препараты окрашивали по методу Фельгена (реактив Шиффа, Merck). Выборка для каждой экспериментальной точки составляла не менее 70 ядер из 10 корешков. Ядра по содержанию ДНК в телофазе митоза соответствовали G1, в метофазе - G2, а находящиеся между 2С и 4С рассматривали, как пребывающие в S-фазе. Длительность фаз клеточного цикла среди интерфазных клеток рассчитывали по частоте их появления.

Митотическую активность корневых меристем изучали у райграса дастбищного сорта Дуэт. Семена проращивали также как для цитофотометрического анализа. На 7оЯ день проводили фиксацию, приготовление ! 5

давленых препаратов и подсчет митотических индексов с помощью световой микроскопии по общепринятому методу (Паушева 3 П , 1970)

Вегетационный опыт проводили в почвенной культуре (Журбицкий 3 И, 1968) в период 2003-2004 гг, с целью определения приживаемости К planticola ТСХА-91 Rai200 в фитоплане по методу ЕЗ Теппер (1987) и некоторых показателей качества растений при засолении почвы В чернозем обыкновенный вносили расчетное количество NaCl (0,05-0,1-0,2% к массе почвы) Создавался общий фон минерального питания путем внесения солей (NH4PO3, КН1РО4) Все соли вносили в почву перед набивкой сосудов и перемешивали В опыте были использованы пластиковые сосуды, содержащие по 6 кг почвы каждый Посев семян проводили спустя 14 дней посте набивки сосудов Семена райграса пастбищного сорта Дуэт и овсяницы красной сорта Татьяна перед посевом иноку тировали суточной культурой К planticola Rilî0° 30 минут (титр исходной культуры 109 микробных клеток/мл) Во время зимнего периода сосуды с газонными травами закапывали в траншеи на уровне почвы Опыт проводился в 3-кратной повторности Колонизирующую способность К planticola ТСХА-91 Rif200 в ризосфере, ризоплане и филлосфере определяли путем подсчета количества колоний после высева исследуемого материала на твердую питательную среду LB с 200 мкг/мл рифампицина Численность жизнеспособных бактерий в ризосфере и ризоплане определяли по методике Е 3 Теппер ( 1987)

Показатели качества растений В фазу колошения газонных трав в листьях растениий определяли содержание сухого вещества (Ганжара H Ф с соавт , 2002), нитратного азота (нитрат-тестер «Морион-ОК2»), хлорофилла (Ягодин Б А с соавт, 1987), p-каротина (Ягодин Б А с соавт, 1987), пролина (Bâter L S et al 1973), селена (МУК 4 1 033-95), аскорбиновой кислоты (ГОСТ 24556-89) Содержание ионов калия, натрия, бария, хлора, кадмия в тканях определяли с помощью ион-селективных электродов в водном экстракте ("Эксперт-001")

Опыт по изучению влияния К planticola на содержание кадмия в корнях и листьях капусты китайской сорта Ласточка по фону засоления и повышенной концентрации кадмия в почве проводили в вегетационном опыте Субстрат -чернозем обыкновенный Применяли Cd(CH3COO)2x2HjO 10 мг/кг и NaCl 500

6

мг/кг почвы. Семена инокулировали К. planticola ТСХА-91 перед посевом. Растения собирали в период вегетации. Определяли количество кадмия в корнях и в листьях. Содержание ионов кадмия определяли с помощью ион-селективных электродов в водном экстракте ("Эксперт-001"). Повторность опыта 4-кратная.

Для атомно-силовой микроскопии культуру микроорганизмов штаммов К. planticola ТСХА-91, К. pneumoniae 204 в концентрации 109 микробных клеток/мл наносили на подложку из свежесколотой слюды. Изображения получали на микроскопе Femtoscan в контактном режиме. Обработку изображений производили по программе Femtoscan Online.

Статистическую обработку полученных данных проводили по критериям Фишера-Стьюдента на ПК с использованием программы Statistica 6,0 (Боровиков В.П.,2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение действия бактерий К. planticola и К. pneumoniae, а также регуляторов роста на всхожесть, рост и развитие газонных трав в условиях засоления

Известно, что рост растений является интегральным показателем, отражающим все изменения физиологических и биохимических процессов, происходящих в растениях, в том числе под действием стрессорных факторов окружающей среды.

Влияние К. planticola на всхожесть семян и развитие проростков различных сортов газонных трав оценивали в модельной системе in vitro в присутствии различных концентраций солей натрия, калия и кальция (табл.1). Выявлено, что для всех исследованных сортов газонных трав критической концентрацией солей, при которой семена не прорастали, составляла 0,3-0,5 М. (Заметим^что у райграса пастбищного при концентрации 0,3 М СаС12 отмечали ростовые процессы). Инокуляция растений К, planticola снижала фитотоксичность исследуемых солей. При этом всхожесть исследованных газонных трав во всех вариантах опытов при 0,3 М концентрации солей составила 60-90%. При 0,5 М концентрации в реакциях различных генотипов наблюдались отличия. Семена всех газонных трав с

7

инокуляцией К р1апПсо1а по фону 0,5 М КС1 не прорастали, кроме того, всхожесть отсутствовала у овсяницы красной по фону 0,5 М ЫаС1 и СаСЬ Исключение составил вариант с 0,5 М МаС1 где всхожесть у сорта Юлишка была 24% У райграса пастбищного всхожесть семян в этих вариантах опыта была 5359% Аналогичные данные были получены для райграса пастбищного сорта Вик

Таблица 1

Влияние К. р1апНсо1а ТСХА-91 на всхожесть, длину наибольшего листа и корней газонных трав по фону различных концентраций КаС1, КС1 и СаС12

> п,п Вариант опьгга Райграс пастбищный | Овсяница красная Сорт Дуэт Сорт Татьяна

Всхожесть Средняя | Длина Всхожесть, 1 Средняя 1 Длина длина наибольше % ' длина наибопыпе корней, го чиста, 1 корней го тиста мм мм | мм мм

1 Контрочь (Н20) 94 0±1 0 66 9-3 7 1 56 3±2 7 1 97 0*1 7 39 4*2 2 58 3±2 1 |

-> нг К. р1апПсо1а | 94 0±1 0 48 7*2 5 69 6±2 5 1 96 0*1 2 28 2±2 1 1 68 2±3 2

0 2М МаС1 1 83 0±3 7 21 1±2 0 6 3±19 1 80 0±1 8 7 6*1 0 2 2*0 8

4 0 ЗМ МаС1 0 0 0 1 0 0 0

5 0 5М №С1 0 0 0 0 0 0

6 0 2МКаС1+ЛГр 87 0±3 4 44 8±2 2 1 50 7±2 5 91 0±1.7 42 1±2 3 35 7±1 7

7 0 3М№С1+Кр 60 0±4 9 1 9 8±1 1 ' 2 3*0 6 74 0+3 1 2 79±0 4 0 1*0 01

8 0 5МНаС1+АГр 59,0±3,2** 3,9±0,5** 0 3*0,3 0 1 0 0

9 0.2М КС1 1 73 0±4 2 10 9±0 7 1 7±0 3 85 0±1 0 9 9±0 6 10 6*1 2

10 0 ЗМ КС1 0 0 0 0 0 0

11 0 КС1 0 0 0 0 0 0

12 \ 0 2МкС1+£р 81 0±1 7 24 9±1 4 10 7*0 2 92 0*1 4 21 3±10 32 7±1 6

13 0 ЗМ КС1+Кр 80,0±4,0** 10,7±0,8** 1,8±0 3 79,0±4,4** 7,6±0,5** 0 6,8±0,8**

14 , 0 5М КО+АГр 0 0 0 0 0

15 0,2М СаС12 91 0±1 7 13 3*0 7 9 6*0 8 85 0±0 9 9 8±0 9 1 13 5

16 0 ЗМ СаС12 40 0±2 1 | 1 4*0 2 0 0 0 0

17 0 5М СаСи 0 0 0 0 0 1 0

18 0,2МСаС12+Л:р 94 0±1 0 36 2±1 7 28 3*1 3 95 0±1 5 20 6*0 9 5*2 3

19 0 3МСаС1г~Кр 75 0*4 7 15 2±1 0 И 2*1 0 91 0±1 7 10 3±0 7 20 1*1 7

20 0 5МСаС12--/Г р 53,0±2Д** 2.0±0,4* 0 0 0 0

Примечание 1) Кр — К р1аписо1а штамм ТСХА-91, 2) достоверность разности между 5 и 8; 10 и 13, 17 и 20, *- р<0,01,**- р<0,001

Повышение всхожести семян газонных трав свидетельствует о защитном (протекторном) действии К р1аппсо1а оказываемое на растения в устовиях абиотического стресса, вызванного засолением

Здесь следует отметить, что возможность выживать и осуществлять

протекторное действие в условиях засоления газонных трав, по-видимому,

%

связана с коэффициентом насыщенности жирных кислот и показателем текучести клеточных мембран бактерий (Loffhagen N. et al., 1995), придающих им способность адаптироваться к экстремальным факторам среды. В связи с этим нами были проведены соответствующие исследования, которые показали, что, например, для штамма Rif200^. planticola характерно повышенное значения коэффициента насыщенности жирных кислот и снижение показателя текучести клеточных мембран.

Атомно-силовая микроскопия К. planticola и К. pneumoniae показала наличие капсул и фимбрий у К. planticola, что важно для успешного взаимодействия бактерий с растениями. У К. pneumoniae 204 обнаружена зернистая морфология клеточной стенки, капсула и фимбрии отсутствовали.

Было установлено сходство К. planticola ТСХА-91 и К. pneumoniae 204 в защитном действии на растения газонных трав при засолении (0,1-0,2-0,3 М NaCl). При летальной концентрации 0,3 М NaCl для газонных трав, инокуляция их семян К. planticola ТСХА-91 и К. pneumoniae 204 обеспечивала достаточно высокую всхожесть семян, до 57-93% соответственно (табл.2).

Во всех случаях при внесении микроорганизмов выявляли увеличение длины наибольшего листа и корней по сравнению с соответствующими вариантами в контроле. Под воздействием изучаемых штаммов Klebsiella длина наибольшего листа и корней была больше, чем в контроле даже при максимальной концентрации NaCl, составляющей 0,3 М. Аналогичные данные были получены для райграса пастбищного сорта Вик и овсяницы красной сорта Юлишка.

Как следует из вышеизложенных результатов исследований, К. planticola и К. pneumoniae оказывают протекторное действие на растения газонных трав в условиях солевого стресса.

Представлялось также интересным провести исследования и по оценке действия К. planticola на газонные травы с использованием регуляторов роста в условиях засоления в аналогичной модельной системе (табл.3).

В этих опытах использовали 0,3 М концентрацию NaCl, при которой, как было показано выше, ингибировались все ростовые процессы у исследуемых

газонных трав Установлено, что внесение б-БАП или крезаиина по фону засоления повышало всхожесть семян райграса пастбишного

Таблица 2

Влияние К. р1аписо1а ТСХА 91 и К.рпеитотае 204 на длину наибольшего листа и корней газонных трав при действии на них различных концентраций

' № П/П Вариант опыта Райграс пастбищный | Овсяница красная Сорт Дуэт 1 Сорт Татьяна 1

1 1 Всхожесть, % Средняя длина корней мм Длина наибольш его тиста мм Всчо- 1 Средняя жесть 1 длина "'о корней мм Длина наибольш его листа мм

1 Контрспь (НгО-) 99 0±0 9 42 7±3 э 25 8=1 5 100 131 3±10 49 9*2 4

2 0 lMNaCl 93 0±2б 30 2±2 б 18 3=2 1 100 20 5±1 0 29 7=2 5

3 0 2М NaCl 83 0±3 7 21 4±2 2 8 2±1 4 60 0±4 9 4 0±0 9 2 0±0 7

4 0 ЗМ NaCl 0 0 0 0 0 0

5 К plcmticola 93 0±2 б 34 1=2 5 57 б±2 1 100 33 8=1 9 <4 2*2 1

6 1 К. pIaniicola+ 93 0±2 6 lOIMNaCI i 29 3±2 3 23 8±1 8 100 28 1±1 4 44,5±3,2*

7 К. planticolcri-0 2М NaCl 90 0±3 0 28 0±2 2 23 2=2 1 100 25 6±1 2 31,0±1,9*

8 К. planncola+ 0 ЗМ NaCl 57,0±4,9* 9,6±1,7* 2J±0,5* 70,0±4,6* 2 9±0 5 0 03=0 0

9 К рпеитотае 87 0±3 4 34 6*3 7 26 2±2 6 100 31 1=1 0 58,4±2,4*

10 К рпеитотае + 0 1М NaCl 90 0±3 0 29 4=2 9 23 5±2 3 93 0±2 6 29 0=1 9 42,4±2,9*

11 К рпеитотае ■+■ 93 0=2 6 0 2М NaCl 26 6»2 7 17,2±1 6 | 93 0±2 6 22 4±1,7 27,б±2,6*

12 ! Крпеитотае - 77,0±4,2* 16,6±2,0* 1 0 ЗМ NaCl 4,8±1,0* | 93,0±2,6* 1 7,8±0,9* 43±1,И*

Примечание 1) достоверность разности между вариантами 4 и 8, 4 и 12 *- р<0,01.

0,001

Выявлены различия в действии регуляторов роста на овсяницу красную в условиях засоления Это проявлялось в том, что прибавление 6-БАП по фону засоления не влияло на всхожесть семян овсяницы красной, тогда как крезацин стимулировал их рост

Неравноценный эффект на растения в условиях засоления оказывала инокуляция семян газонных трав К р1аписо1а по фону внесения регуляторов роста Например, для овсяницы красной, бактеризация семян газонных трав К р1апчсо1а оказывала более благоприятное действие на всхожесть семян (74%), чем крезацин (20%)

Таблица 3

Влияние К. р1апйсо1а ТСХА-91 и регуляторов роста на всхожесть, длину наибольшего листа и корней газонных трав по фону 0,3 М N8О_

№ п/п Вариант опыта Райграс пастбищный Сорт Дуэт Овсяница красная 1 Сорт Татьяна

Всхожесть % Средняя длина корней, мм Длина наиболь шего листа, мм Всхожесть, % Средняя Длина длина I наиболь корней 1 шего мм листа ' мм

1 i Контроль 1 94 0±1 0 66 9±3 7 56 Vt2 3 97 0±1 7 39 4±2 2 58 3*2 1

2 К. planticoia 94 0*1 0 48 7*2 5 69 6*2 5 96 Oil 2 28 2*2 1 68 2*3 2 54 4±1 1 1 92 5*3 0

3 6 БАП 97 0*1 7 88 2*2 8 94 ^±2 0 99 0*0 9

4 Крезацин 99 0*0 9 63 6±11 j 111 0±3 2 96 0±1 2 Э9 6*1 2 | 111 5*3 6

5 0 ЗМ NaCl ООО 0 0 0

6 0,3MNaCl+ K.planticola 60,0*4,9* 9,8*0,8* 2,3*0,1* 74,0*3,1* 2.8*0,1* 0 1*0 01

7 1 0 ЗМ NaCl +6 БАП 62,0*2,6* 15,1*1.0* 17,0±0,7* 0 0 | 0

8 0 ЗМ VaCl +Крезацин 66,0*2,9* 9,6*0,2* 16,9*1,0* 20,0*1,9* 3,2*0,1* | 7,6*0,4*

9 0 ЗМ MdCl + 6-БАП+К planticoia 94,0*1,0* 37,8±1,7* 44,7*1,9* 91 0*1,9 30,5*0,8* 45,8*1,6*

10 0,3M NaCl - ' 94,0*1,0* Крезацин+ К planticoia | 23,1*1,3* 34,9*0,9* 60 0±1,9 10,6*0,6* 19,2*0,2*

Примечание 1) достоверность разности между вариантами 5 и 6, 7, 8, 9 и 5, 6, 8, 10 и 5, 7, 8 *-р<0,001

Для райграса пастбищного подобного эффекта не выявили Аналогичные данные были получены для райграса пастбищного сорта Вик и овсяницы красной сорта Юлишка

Однако, при комбинированном использовании регуляторов роста и К planticoia выявлен их синергизм в защитных реакциях при стрессорном действии засоления, проявляющийся в усилении всех ростовых процессов у растений

Следовательно, в результате проведенных модельных опытов установлено, что инокуляция газонных трав бактериями рода Klebsiella, выращиваемых в условиях засоления, способствует прорастанию семян по сравнению с солевым контролем

Представлялось важным провести исследования приживаемости в ризосфере растений вносимых в почву бактерий в условиях засоления Был проведен 2-х годичный вегетационный опыт (почвенная культура, по 3 И Журбцкому, 1968) В

2003 г. исследована способность К. р1апНсо!а приживаться в ризоплане газонных трав в условиях засоления в течение зимнего периода. После искусственного засоления почвы (май) в нее высевали семена газонных трав, инокулированных К. р1апНсо1а ТСХА-91 Учет результатов проводили в динамике, после посева

исследуемого материла (по фазам развития растений) на плотную питательную среду (ЬВ). Выявлено, что численность К. р1апйсо1а ТСХА - 91 Ш^00 в ризоплане овсяницы красной (сорт Татьяна) и райграса пастбищного (сорт Дуэт) колебалась в течение вегетации в пределах от 106-Ю7КОЕ/г корней (фаза первого листа) до Ю2-Ю4КОЕ/г корней (конец сезона, сентябрь) во всех вариантах опыта (рис.1).

Концентрации ЫаС1 - 0,05 и 0,1% к массе почвы не оказывали ингибярующего влияния на К. р1апИсо!а. Однако, внесение ИаС1 в концентрации 0,2% к массе почвы подавляло размножение этих бактерий в ризоплане газонных трав. При этом численность К. р1аШсо1а была в 10-100 раз ниже, чем в контроле. После прохождения зимнего периода было проведено определение численности К. р1апНсо1а в ризоплайе, филлосфере и ризосфере. Впервые обнаружено, что К. р\апйсо\а сохраняет свою жизнеспособность в ризоплане в вариантах с засолением после прохождения зимнего периода хранения сосудов в полевых условиях и составляет 102-103 КОЕ/г корней. В контрольном варианте (без засоления) К.р1атШсо1а не обнаружена. Поэтому в 2004 г. проводили повторное засоление почвы и обработку вегетирующих растений К.р1апИсо1а для изучения динамики численности бактерий не только в ризоплане, но в ризосфере и филлосфере (рис.1 д, е, в, г). В этом случае учет количества бактерий проводили через 7 дней после инокуляции.

Выявлено, что К. р1апйсо1а высевалась из .ризосферы и филлосферы газонных трав, причем ее численность была больше в ризоплане (после инокуляции 106-107 КОЕ/г корней, после созревания растений 102-104 КОЕ/г корней), чем в филлосфере и ризосфере (10 - Ю6КОЕ/г корней и 102-103 КОЕ/г корней, соответственно).

КОЕ/г сухой массы 10'

КОЕ/г сухой массы

NaCI 0% •---♦

(б) NaCI 0 05% *

NaCI 0 1%

NaCI 0 2%'

\я V» v» к *

Срок» наблюдений

vi vii viii

КОЕ/г сухой массы ^ ю' í t

ю11 I

vi vii viii

КОБ г сухой массы ^ Ю*

Сроки наблюдений

I

,о> J

vii viii ix

Сроки наблюдении

vi vii viii

Сроки наблюдении

Рис 1 Динамика численности бактерий К planttcola штамм ТСХА-91 Rif по фону засоления почвы различными концентрациями NaCI Вегетационный опыт (почвенная культура) 2003 - 2004 гг Варианты опыта овсяница красная, сорт Татьяна наблюдения в ризоплане (а), филлосфере (в), ризосфере (д), райграс пастбищный, сорт Дуэт наблюдения в ризоплане (б), филлосфере (г), ризосфере (е) Концентрация NaCI указана в процентах по отношению к массе почвы Римскими цифрами 1-Х обозначены сроки наблюдений первый лист (I), второй лист (II), третий лист (III), кущение (IV), окончание периода вегетации (V), после прохождения зимнего периода (VI), инокуляция растений К planticola (VII), колошение (VIII), цветение (IX), созревание (X) Определение динамики численности бактерий в филлосфере и ризосфере проводилось в 2004 году

Следовательно, бактерии обнаруживаются в ризоплане газонных трав в течение не только вегетационного периода, но и сохраняют свою жизнеспособность в течение всего осенне-зимнего периода

3. Изучение влияния К. р1апИсо1а на морфофизиологнческие показатели газонных трав в условиях засоления

Установив, что К. р1апйсо1а стимулирует рост газонных трав в условиях засоления, нам представлялось важным провести эксперименты по определению митотического индекса и распределению ДНК по фазам клеточного цикла, которые могут изменяться под действием стрессорных факторов, в частности, засоления. Исследование проводили с помощью цитофотометрического анализа давленных препаратов апикальных корневых меристем райграса пастбищного сорта Дуэт.

Выявлено, что К. р!апйсо!а по фону засоления оказывает позитивное влияние на митотическую активность меристем корней проростков райграса пастбищного (табл.4).

Таблица. 4

Митотический индекс клеток апикальной меристемы корней райграса пастбищного сорт Дуэт при применении К. р1апЫсо1а ТСХА-91 в условиях засоления

№ п/п Вариант опыта Митотический индекс, %

1 Контроль (НгО) 8,9±0,6

2 К. р1апйсо1а 9,1±0,3

3 0,1М№С1 8,1±0,2

4 0,2МЫаС1 4,8±0,2

5 0,ЗМ №С1 2,4±0,1

6 К. р1апИсо1а + ОДМ №01 8,5±0,2

7 К. р1апНсо1а + 0,2М ЫаС1 7,6±0,2*

8 К. р1апйсо1а + 0,ЗМ ЫаС1 3,8±0,1*

Примечание. 1) Митотический индекс (МИ) - это процентная доля делящихся клеток от общего числа клеток исследуемой ткани; 2) достоверность разности показателей в сопряженных вариантах 8 и 5; 7 и 4 *-р<0,01

При максимальной концентрации КаС1 (0,3 М), у сорта Дуэт К. р1апйсо1а стимулировала клеточные деления, приводя к увеличению МИ корневых меристем на 53,7% по сравнению с вариантом без бактерий.

Важным информационным параметром при исследовании функциональной активности клеток, апикальной меристемы корня райграса пастбищного сорта

Дуэт, является распределение ДНК по фазам клеточного цикла и вариации лтого распределения Резутьтаты анализа клеток показали, что №С1 изменял распределение клеток корня у сорта Дуэт по периодам интерфазы (рис 2 )

а Контроль б К. рЫпЧсо1а

г.!

О- I ф

г I

И

2С 4С 2С 4С Содержание ДНК усл ея

в 0,1 М ,\аС1 г. К р1апНсо!а+ 0,1 М МаС|

Р| 5 О? (л Б (Ь

I. 4.

2С 4С 2С 4С

Содержание ДНК, vcл ед

д. 0,2М ИаС1 е Кр1аМ1со1а+ 0,2М N301 ж 0.3М ЧаС1 г. Кр1аписо1а+ 0,ЗМ N801

(м в С.-. 0|8__С2

р| 5 С;

«» с ь

_ I £ 20

1.

II

л

2С 4С 2С 4С Содержание ДНК )чл ед

:С 4С 2 4С Содержание ДНК, уст ед

Рис 2 (а- ¡) Распределение клеток апикальной меристемы корней райграса пастбищного сорта Дуэт при применении Кр1апПсо1а ТСХА-91 и 0,1-0,2-0,3 М №С1 во время интерфазы

Под действием 0,2 М №С1 число клеток увеличивалось до 72%, удлиняя О; фазу, а при 0,1 М и 0,3 М концентрации происходило увеличение в] фазы Это

может свидетельствовать об адаптации корневой меристемы райграса пастбищного сорта Дуэт к действию солевого стресса, путем перехода клеток в состояние покоя, необходимых для выживания в стрессорных условиях (Луценко O.K. с соавт.,2005; Georgieva E.I. et al., 1994). Применение К. planticola под растение по фону засоления, приводило к перераспределению клеток в период интерфазы с преобладанием клеток в постсинтетической фазе. При этом изменения параметов носили дозозависимый характер.

Таким образом, хлорид натрия снижает митотический индекс, а внесение К. planticola увеличивает количество митозов в апикальной меристеме корней райграса пастбищного. При применении бактерий по фону хлоридного засоления пгроисходит менее интенсивное снижение митотического индекса. При этом в период интерфазы клеточного цикла отмечается перераспределение клеток с их преобладанием в постсинтетической фазе (G2), что в целом обусловливает формализацию ростовых процессов в растениях.

4. Исследование бездействия К. planticola на некоторые показатели качества газонных трав, культивируемых в условиях засоления почвы

Полученные результаты выявили, что бактерии К. planticola существенно улучшают состояние газонных трав, выращиваемых в условиях хлоридного засоления, и поэтому представлялось, необходимым выяснить, изменяются ли при том показатели химического состава растений, культивируемых по фону засоления почвы.

При анализе газонных трав использовали листья растений. В них определяли содержание сухого вещества, нитратов, селена, аскорбиновой кислоты, пролина, хлорофилла, В-каротина, ионов калия, натрия, бария, хлора и ионов кадмия, рассчитывали отношение калия к натрию.

Было обнаружено, что в ответ на солевой стресс происходило увеличение

содержания пролина в листьях газонных трав в 2,5-14 раз по сравнению с

контролем. Известно, что увеличение содержания пролина, может защищать белки

от денатурации ионами солей, благодаря повышению растворимости последних

Olmos Е. et al., 1996; Пронина Н.Б., 2000; Мутлу Ф. с соав., 2005). При

концентрации 0,2% NaCl к массе почвы на фоне использования К. planticola

1б

происходило увеличение содержание пролина в 3-19 раз по сравнению с контролем, что говорит о повышении солеустойчивости растений

Следовательно, протекторный эффект инокуляции бактериями К р1аппсо1а растений, в условиях засоления почвы, может быть обусловлен повышением содержания пролина в газонных травах

Существенных изменений других анализируемых показателей газонных трав, выращиваемых в условиях засоления и инокуляции бактериями не обнаружено

Впервые обнаружено действие бактерий К р1апПсо1а на снижение содержания кадмия в газонных травах по фону засоления почвы, которое уменьшилось при этом в 1,5—2,3 раза

Для подтверждения выявленной способности К р1аппсо1а снижать содержание кадмия в других растениях был поставлен вегетационный опыт с капустой китайской сорта Ласточка, результаты которого представлены в таблице 5

Таблица 5

Действие К. р1апПсо1а ТСХЛ-91 на содержание кадмия в корнях и листьях капусты китайской в условиях засоления и загрязнения почвы кадмием

Вариант опыта Кадмий, мг/кг Кадмий, мг/кг

сырой массы корней сырой массы

листьев

Контроль 0,91 0,03

Сс1 5,64 0,25

ЫаС1 2,36 0,19

ЫаСЬСс! 2,62 0,53

К р1аписо1а 1,93 0,06

К р1аппсо1а+С& 1,05* 0,05*

К р/аипсо/йг+ЫаС1 1.20* 0,04*

К р1апПсо1а+ЫаСЬСс! *> од* 0,13*

Примечание 1) Сё - 10 мг/кг Сс1(СНзС00)2*2Н20, 2) МаС! - 500мг/кг, 3) достоверность разности показателей в сопряженных группах *-р<0,01

Результаты показали, что при инокуляции семян капусты китайской К р1апПсо1а по фону хлорида натрия также наблюдалось снижение концентрации кадмия в корнях - 1,14 раза, в листьях - в 4 раза по отношению к варианту без инокуляции семян К р1аппсо1а Данный эффект можно объяснить, тем что,

микроорганизмы рода Klebsiella, по-видимому, обладают способностью к ингибированию действия кадмия в результате осаждения кадмия H2S переводя его в недоступную для растений форму CdS (Sharma Р.К. et al., 2000).

Следовательно, впервые для К. planticola штаммов Rif200 и ТСХА-91 была обнаружена способность снижать содержание кадмия в растениях в условиях засоления и загрязнения почвы кадмием.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали целесообразность применения под газонные травы бактерий рода Klebsiella, обладающих способностью адаптироваться к экстремальным условиям среды (благодаря своим физиолого-биохимическим особенностям), что обусловливает их протекторное влияние на растения в условиях солевого стресса.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлен протекторный эффект инокуляции бактериями рода Klebsiella газонных .трав, культивируемых в условиях засоления. Бактерии снимают фитотоксическое действие различных солей (NaCl, КС1, CaClj), что положительно сказывается на всхожести семян, длине растений газонных трав.

2. Сравнительное изучение способности двух видов бактерий рода Klebsiella (К. planticola и К. pneumoniae) обеспечивать нормальный рост растений в условиях засоления, показало, что даже при достаточно высокой концентрации хлорида натрия (0,3 М) как К. planticola, так и К. pneumoniae способствуют прорастанию семян газонных трав, всхожесть достигает 57-93%. В данном случае проявилась неизвестное ранее для К. pneumoniae свойство нормализовать рост растений в условиях высокой концентрации NaCl.

3. Выявлено, что инокуляция семян газонных трав К. planticola совместно с регуляторами роста растений (6-БАП и крезацин) способствует взаимному усилению роста растений по фону засоления. Так, применение бактерий с крезацином по фону 0,3 М концентрации хлорида натрия усиливало рост проростков газонных трав в 1,6-2,5 раза.

4. Установлено, что инокуляция семян газонных трав бактериями в условиях засоления почвы хлоридом натрия обусловливает колонизацию всего

фитоплана растения (корни, стеб та, тистья) Однако, после осенне-зимнего хранения сосудов с газонными травами в полевых условиях, жизнеспособными остались только те бактерии, которые находились в ризоплане растений (10*103 КОЕ/г ), выросших по фону засоления В незаселенной почве бактерии не были обнаружены

5 Показано, что хторид натрия в 0,3 М концентрации приводит к существенному снижению (в 4 раза) митотического индекса растений Внесение бактерий увеличивает количество митозов в апикальной меристеме корней, что приводит к менее интенсивному падению митотического индекса, несмотря на засоление Происходит перераспределение клеток в интерфазе клеточного цикла с преобладанием клеток в постсинтетической фазе

6 Установлено, что в условиях засоления почвы хлоридом натрия инокуляция семян газонных трав бактериями К р1апнсо1а, повышала в растениях содержание пролина, способствуя повышению солеустойчивости растений

7 Впервые показано, что инокутяция семян растений (газонных трав, китайской капусты) бактериями К р1аппсо1а при выращивании по фону хлорида натрия и кадмия приводит к снижению концентрации кадмия в корнях и листьях растений

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1 Соколова А Я, Бурматов Б Б, Калиниченко В В Влияние биологически активных веществ на рост и развитие газонных трав в стрессовых устовиях В сборнике тез докл 6 Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях »-М -2001-С 192

2 Соколова А Я, Бурматов Б Б, Сечицкая О В, Емцев В Т Действие бактериального препарата «Биоплант-К» на рост и развитие газонных трав в стрессовых условиях В сборнике тез докл 6 Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях »-М -2001-С 122-12Я

3. Соколова АЛ., Бурматов Б.Б., Калашникова Е.А., Селицкая О.В., Емцев В.Т., Голубкина H.A. Влияние биологически активных веществ на рост и развитие газонных трав в стрессовых условиях. Материалы IV Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования.» 20-24 июня 2001г. Москва-Пущино-2001-Т.1.-С.438-440.

4. Голубкина H.A., Соколов Я.А., Соколова АЛ., Удельнова Т.М., Торшин С.П., Машкова Т.Е., Ягодин Б.А.. Гинс В.К., Кононков П.Ф. Патент на изобретение №2189155 от 20 сентября 2002. Способ обогащения чеснока и корнеплодов селеном.

5. Соколова АЛ., Голубкина H.A., Емцев В.Т., Селицкая О.В. Влияние бактериального препарата "Биоплант-К" на прорастание, накопление аскорбиновой кислоты и развитие семян газонных трав в стрессовых условиях. Метериалы V Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» 9-14 июня 2003-Т.1.-С.338-340.

6. Sokolova A.Ya. Bacterial preparation "Bioplant-K" influence on plant salt-stress resistance. 11-th International congress on molecular plant-microbe interactions. Abstracts. St-Petersburg-18-26 july 2003-P.357.

7. Соколова АЛ., Курбатова E.A. Выявление общих иммунобиологических свойств сапрофитных и клинически значимых видов Klebsiella. Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология- XXI век".-Саратов-2004.-С.210-211.

8. Соколова АЛ. Влияние Klebsiella planticola на антиоксиданты газонных трав в условиях засоления. Материалы VIII Международного симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов. "Техника экологически чистых производств в XXI веке: Проблемы и преспективы". 12-13 октября 2004. Москва ЮНЕСКО, МГУИЭЛТод ред. Беренгартена М.Г., Вайнштейна С.И.,-М.:МГУИЭ-2004-С.111-112

9. Соколова АЛ. Сравнение состава жирных кислот баьстерий Klebsiella planticola штамма ТСХА-91 и штамма ТСХА-91 Rif 200.-М.: Известия ТСХА.-2004-№ 4-С.69-73.

10 Соколова АЛ, Курбатова ЕА Сравнительное изучение некоторых иммунобиологических свойств штаммов Klebsiella planticola и Klebsiella pneumoniae -М ЖМЭИ-2005-№3-С.11-15

11 Соколова АЛ Динамика чистенности Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 Rif200 и ее влияние на некоторые биохимические показатели растений газонных трав, на фоне засоления почвы Материалы международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летаю РГАУ -МСХА имени К А Тимирязева 1-2 июня 2005 г -М -2006-С 707-713

Объем 1,25 печ л

Тираж 100 экз

Зак 637

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44