Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха

Кузнецова, Оксана Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха"

На правах рукописи

Кузнецова Оксана Ивановна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ДЛИТЕЛЬНО КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КАЛЛУСОВ ГОРОХА

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Москва 2005г.

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафедры генетики Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гостимский Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Гапоненко Александр Константинович

профессор

кандидат биологических наук Хадесва Наталия Васильевна

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита диссертации состоится «^>> 2005г. в_часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д.З. Факс: (095)132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д.З.

Автореферат разослан "■/У" 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухииа

S А^З^З

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Культура клеток и тканей растений представляет большой интерес для физиологов, генетиков и селекционеров, а также специалистов в области клеточной и молекулярной биологии. Её широко используют для изучения фундаментальных проблем биологии - особенностей организации и эволюции генома, а также для микроклонального размножения и клеточной селекции, связанной с получением новых форм растений.

До недавнего времени большинство работ, посвященных изучению сомаклональной вариабельности, было связано только с описанием морфологических и цитогенетических изменений у растений - регенерантов, однако часто анализ таких признаков затруднен, а генетическая природа таких изменений остается неясной. Так, например, фенотипические изменения могут иметь как генетическую, так и эпигенетическую природу (Kaeppler et. al., 2000), а с помощью цитогенетических подходов можно обнаружить только крупные хромосомные перестройки или изменение уровня плоидности. Молекулярные маркеры позволяют устранить эти недостатки.

В последнее время для исследования сомаклональной изменчивости широко используются молекулярные маркеры, основанные на ПНР, в частности RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) маркеры, которые могут выявить изменения в нуклеотидной последовательности ДНК.

Цель исследования заключалась в изучении сомаклональной изменчивости среди растений-регенерантов трех генотипов гороха (Виола, W-1, R-9), которые были получены из каллусов разной продолжительности культивирования.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Ввести в культуру клеток и тканей разные генотипы гороха (Виола, W-1, R-9).

2. Получить растения-регенеранты из культуры in vitro разной продолжительности культивирования: 8 мерного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).

MC НАЦИОНАЛЬНАЯ ВИБЛИОТЕКА СИ 9»

3. Провести анализ морфологических и количественных признаков у регенерантов Ro и потомства сомаклонов (R) и R2).

4. Выявить полиморфные RAPD и ISSR маркеры, отличающие регенеранты (Ro) от исходной линии и проследить их наследуемость в следующих поколениях Ri и R2.

5. На основании полученных данных выяснить влияние исходного генотипа и продолжительности культивирования на накопление генетических изменений на молекулярном уровне в культуре клеток и тканей гороха.

6. Клонировать и секвенировать полиморфные фрагменты. Полученные нуклеотидные последовательности сравнить с имеющейся базой данных GeneBank, используя алгоритм blastn. На основании полученных данных сделать предположение о природе сомаклональной изменчивости.

Научная новизна. В данной работе представлена технология длительно-культивированного каллуса гороха, благодаря которой были получены две группы растений-регенерантов гороха из каллусов разной продолжительности культивирования: 8 месячного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет). Установлено, что при увеличении продолжительности культивирования каллусов с 8 месяцев до 10 лет резко снижается регенерационная способность побегов из культуры тканей, а у регенерантов гороха уменьшается жизнеспособность и продуктивность.

Впервые был проведен молекулярный анализ регенерантов гороха, полученных из длительно культивируемого каллуса с помощью RAPD- и ISSR методов. При этом было установлено, что на способность накопления мутационных изменений в культуре клеток in vitro больше оказывает влияние генотип, чем продолжительность культивирования каллуса. Однако при сравнении уровня изменчивости двух групп регенерантов было показано, что регенеранты, полученные после десяти лет культивирования, имели более высокий уровень полиморфизма по сравнению с регенерантами, полученными из более молодой культуры клеток и тканей.

Анализ сиквенса полиморфных фрагментов показал, что в большинстве случаев изменения в процессе культивирования in vitro возникают в некодирующих районах ДНК и не затрагивают функциональных генов. Последовательности секвенированных фрагментов ДНК гороха записаны в базе данных GeneBank.

Практическое значение работы: Получены новые формы растений-регенерантов с измененными количественными и качественными признаками, которые могут быть использованы в учебном процессе для демонстрации генетических изменений, возникающих в культуре клеток in vitro.

Показано, что с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- методов можно проследить генетическую изменчивость у растений-регенерантов, полученных из каллусов на разных этапах культивирования клеток и сделать предположения о времени и природе возникновения мутаций.

Результаты работы вошли в разработку практикума "Молекулярное маркирование генома растений " для студентов биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жербака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской с.х. академии имени К.А. Тимирязева (Москва, 26, 27 февраля 2002); VIII International Conference «The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology» (Saratov, September 9-13 2003); на 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова. 2003; на международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 22-24 марта 2004); на 3-ем съезде ВОГИС (Москва, 6-12 июня 2004); на международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 24-26 ноября 2004); на 3-ем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005); на ХП международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает рисунок, S/ таблицы.

Список литературы включает наименований.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 04-04-48080 и 04-04-48956) и программы поддержки ведущих научных школ (НШ-173 2005)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили растения-регенеранты, полученные из разных генотипов гороха: сорта Виола (В) и двух мутантов R-9 (рано зацветающий) и W-1 (безвосковой). В работе использовали две группы растений-регенерантов, независимо полученные после восьми месяцев культивирования каллусов гороха (первая группа) и регенераты из длительной культуры тканей - более 10 лет (вторая группа). Из растений-регенерантов путем самоопыления были получены сомаклоны гороха (семенное поколение растений-регенерантов R|-Rj).

В качестве контроля для анализа внутрилинейного полиморфизма использовали от 7 до 10 растений каждого генотипа (сорт Виола, Ранний зеленый, линии W-1 и R-9), из которых были получены растения-регенеранты и сомаклоны гороха.

Введение клеток в культуру in vitro и получение растений-регенерантов. Каллусы получали из верхушечной меристемы, гипокотиля или междоузлий, пересаживая каждые 30-45 дней на свежую среду, по методу, описанному ранее (Багрова и др., 1991). Среда для культивирования каллусных тканей имела следующий состав - макро и микросоли по Мурасиге и Скугу, витамины по Гамборгу, сахароза - 3%, агар- 0,7%, с содержание гормонов НУК- 4 мг/л, БАП - 4 мг/л (для линий R-9, W-1) и кинетин - 0,1 мг/л (для сорта Виола)

Анализ пыльцы у растений-регенерантов проводили по стандартной методике - ацетокарминовым окрашиванием.

ДНК выделяли из свежих листьев гороха методом, описанным Moller и сотрудниками (Moller et al., 1992) с незначительными модификациями.

Амплификацию ДНК регенерантов гороха проводили с использованием 34 RAPD- и 8ISSR- праймеров. Реакционная смесь объемом 15 мкл. содержала 5 мкл ДНК, 1,5 ед Taq-полимеразы ("Силекс М"), по 0,2 мМ каждого из dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и 1 мкМ праймера в 1х буфере ПЦР, содержащим 2.5мМ MgCl2. Для предотвращения испарения амплификационную смесь покрывали 20мкл минерального масла (Sigma).

Амплификацию проводили в термоциклере фирмы НПФ "ДНК-Технология" по следующей программе для RAPD праймеров: 1 цикл - 94°С, 1 мин 30 сек.; 5 циклов - 94°С, 20 сек, t отж. - 5 сек., 72°С -10 сек.; 35 циклов -94°С, 1 сек., t отж. - 5 сек., 72°С -10 сек. Для ISSR- праймеров ипользовалась программа: 1 цикл - 94°С, 2 мин; 5 циклов - 94°С, 20 сек.; torac, 10 сек; 71°С, 10 сек; 35 циклов - 94°С, 5 сек.; torac, 5сек.; 72°С, 5 сек; 1 цикл - 72°С, 1 мин.

Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 34 до 42°С для RAPD- и 46-56°С для ISSR- праймеров. Для проверки надежности опыт повторяли не менее двух раз. В качестве отрицательного контроля (К ) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл воды.

Электрофорез. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (конечная концентрация бромистого этидия 0,001%), в режиме 3 В/см в lx TBE буфере и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете (Маниатис и др., 1984). Для определения длины фрагментов использовали маркеры молекулярного веса (100 bp или 100 bp + 1.5Kb произведенные фирмой "СибЭнзим").

Выделение фрагментов из геля. Полиморфные фрагменты ДНК выделяли из 2% агарозного геля и очищали с использованием набора "QIAEXII Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Germany). Концентрацию выделенного фрагмента проверяли в 1% агарозном геле.

Клонирование фрагмента. Выделенный и очищенный фрагмент лигировали с pGEM-T (или pGEM-T-Easy) вектором из набора для клонирования pGEM-T vector system П (Promega, USA). Полученную лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток Е. coli JM 109. Все процедуры проводили согласно протоколу фирмы Promega. Клоны, содержащие вставку, отбирали на селективной среде в присутствии IPTG и X-Gal. Выделеляли плазмидую ДНК и проверяли реакцией амплификации с RAPD- или ISSR-праймером наличие нужной вставки.

Секвенирование концевых участков клонированных фрагментов ДНК было проведено в ИМБ РАН (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™

Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Для секвенирования длинных фрагментов (более 1000 п.н.) с помощью компьютерной программы Oligo 4.0 дополнительно были подобраны 20-ти (или 19-ти) членные праймеры к двум концам отсеквенированных участков ДНК фрагмента.

Математические методы обработки данных:

Статистические методы. В расчетах использовали стандартные биометрические методы. Средние значения количественных признаков растений были проанализированы на основании данных по индивидуальным растениям при помощи компьютерных программ SPSS for Windows 10.0 и Microsoft Excel. Сравнение средних значений проверяли с помощью t-теста.

Качественная и количественная оценка полиморфизма. Чтобы количественно оценить степень полиморфизма между регенерантами и исходной линией, по RAPD- и ISSR- спектрам были составлены матрицы бинарных признаков, на основе которых по Ней и Ли были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei and Li, 1979). Методом ближайшего связывания (neighbour-joining, Nj) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых регенерантов по RAPD- и ISSR- спектрам. Для расчета матрицы генетических различий и построения дендрограммы использовали компьютерную программу Тгеесоп 3.1с применением 100 реплик бутстрепа (Van de Peer and De Wachter, 1994; Felsenstein, 1985).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов и поиск гомологов проводили в базах данных GenBank, EMBL, DDBJ и PDB при помощи программы GeneBee BLAST 2.2.2. Services, используя алгоритм blastn.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение исходного материала. Разные генотипы растений и разные экспланты в одних и тех же условиях культивирования обладают неодинаковой способностью к каллусообразованию и регенерации, поэтому с целью получения длительно культивируемых морфогенных каллусов для разных генотипов гороха необходимо выбрать наиболее отзывчивый эксплант и подобрать оптимальные условия культивирования (гормональный составом). Так, для сорта Виола каллусы, полученные на среде с НУК (4 мг/л) и 2,4-Д (0,1 мг/л), имели наибольший прирост, однако регенерация побегов у таких каллусов была резко снижена. Оптимальной оказалась среда с НУК и заменой БАЛ (4 мг/л) на кинетин (0,1 мг/л). Каллусы, полученные на такой среде, не имели некрозов и обладали достаточно активным ростом и хорошей регенерационной способностью.

Отдельные этапы получения растений-регенерантов из длительно культивируемого каллуса представлены на рисунке 1.

?пс. 1. Разные этапы получения растений-регенерантов из длительно культивируемого каллуса гороха.

А) Б) В) Г)

А) неморфогенный каллус, Б) морфогенный каллус, В) регенерация побегов, Г) растение - регенерант, полученный с помощью прививки на подвой гороха.

В качестве экспланта для получения каллуса брали апикальную меристему, гипокотиль и междоузлия. Оценивали такие показатели, как регенерационная способность каллуса и некротизация. Несмотря на попытку ввести в культуру клеток три типа экспланта для всех исследуемых генотипов, только для линии \V--1 удалось получить длительно культивируемый каллус гороха (более 1,5 года) из междоузлий. Однако у линии \У-1 каллусы, полученные из междоузлий, по сравнению с каллусами, полученными из других типов экспланта, имели не только самый высокий процент побегообразования - 47%, но и довольно быстро некротизировались (табл.1.).

Табл. 1. Характеристика показателей побегообразования и некротизации восьмимесячного каллуса (в %) у разных линий гороха (ЛУ-1, К-9 и сорта Виола) в зависимости от типа экспланта.

Генотип Тип экспланта Кол-во эксплантов (шт) Средний %

побегообразования некротизации

И-9 апик. меристема 41 40 22

гипокотиль 112 43 27

междоузлие - - -

W-l апик. меристема 62 25 4

гипокотиль 44 20 13

междоузлие 59 47 26

Виола апик. меристема 133 16 8

гипокотиль 107 5 11

междоузлие - - -

Для всех изучаемых генотипов (Я-9, W-l и сорта Виола) были получены длительно культивируемые каллусы из апикальной меристемы и гипокотиля. У

линий R-9 и W-1 такие каллусы, вне зависимости от происхождения экспланта, имели приблизительно одинаковую способность к побегообразованию (40-43% у R-9 и 20-25% у W-1). Однако для всех линий наибольший процент нектротизации ткани наблюдался у культуры, индуцированной из клеток гипокотиля, по сравнению с клетками апикальной меристемы. Таким образом, несмотря на успешное введение в культуру разных типов эксплантов, оптимальным для культивирования in vitro остается использование апикальной меристемы.

Регенеранты получали путем прививки побегов на подвои гороха. Этот этап получения регенератов представлял наибольшую трудность из-за низкой приживаемости побегов. Кроме того, не все привитые и начавшие расти побеги доживали до стадии цветения, и далеко не все из зацветающих побегов завязывали семена. Наибольший процент гибели сделанных прививок наблюдался в первую неделю - растения не приживались и погибали. Так, для регенератов гороха, индуцированных из 8-месячного каллуса он составил от 15 до 28 %, а у полученных из 10-летнего каллуса был более 50% (рис.2).

Рис. 2. Процент выживших растений-регенерантов от общего количества сделанных прививок.

Как видно из графика на рис. 2, на выживаемость и жизнеспособность регенератов главным образом влияет продолжительность культивирования клеток в условиях in vitro, а потом уже генотип исходного растения.

Характеристика растений-регенерантов R«.

Все регенеранты Ro, полученные из восьмимесячного каллуса, фенотипически не отличались от исходной линии. Только у -выживших регенератов гороха сорта Виола, полученных после 10 лет культивирования каллусов, были обнаружены сильные морфологические изменения, такие как:

удлинение периода вегетации, сильное ветвление стебля (до 4-5 побегов), мелколистность, дефектное развитие цветка. Цветок имел уменьшенный размер, укороченные тычинки и вся пыльца была стерильной.

У регенерантов гороха (Я-9 и Виола) по сравнению с исходной линией наблюдалось снижение средних значений таких признаков, как количество бобов и семян на одно растение. Анализ фертильности пыльцы у регенерантов первой группы не выявил существенных различий с исходной линией, в тоже время у регенерантов второй группы наблюдали достаточно высокий процент стерильной пыльцы (в среднем около 25%), что может говорить о нарушениях мейоза. Из-за высокого процента стерильных бобов (особенно у регенерантов 11-9), в среднем количество бобов и число семян на одно растение у регенерантов оказалось значительно ниже, чем у контроля (табл. 3).

Табл. 3. Сравнение признаков продуктивности у растений-регенерантов (Rg) и контрольных растений.

Генотип Продолжительность культивирования Число Фертильность пыльцы %

исследованных растений бобов семян

на одно растение

R-9 8 месяцев 54 1,98 ±0,1 4,54± 0,86 95,5±1,47

10 лет 36 3,11 ±0,59 2,72 ± 0,78 75,25 ± 3,98

Контроль 10 4,1 ± 0,28 16,7 ± 0,25 95,00 ± 0,16

W-l 8 месяцев 35 2,77 ±0,38 7,22 ± 0,96 93,00±2,96

10 лет 24 2,66 ±0,31 4,2 ± 0,71 77,65 ±3,81

Контроль 10 3,30 ± 0,48 ИЗО ±2,10 93,00 ±0,42

Виола 8 месяцев 7 1,29 ±0,18 2,00 ± 0,61 97,3 + 1,49

Контроль 10 2,42 ± 0,25 8,2 ± 0,3 98,2 ±0,36

Очевидно, что при более длительном культивировании каллусов в клетках могут накапливаться изменения, которые приводят к полной потере жизнеспособности и фертильности, регенерировавших из них растений, как это наблюдалось у сорта Виола. Поскольку на морфологию и жизнеспособность регенерантов существенно влияет резкое изменение условий выращивания, то отмеченные изменения фенотипа регенерантов могут быть связаны как с модификационными, так и мутационными изменениями. Кроме того, часть проявившихся изменений может иметь эпигенетическую природу, связанную с изменением уровня экспрессии генов (Phillips et al., 1994).

Анализ морфологических и физиологических признаков у регенерантов гороха в потомстве - 11г.

Семена, полученные от регенерантов Яз (в количестве от 3 до 26 шт.), высаживали в полевых условиях на Звенигородской опытной станции. Среди потомства растений-регенерантов Я! и Я2, полученных после десяти лет культивирования каллусов гороха, в отличие от регенерантов, полученных из 8-месячного каллуса, следует отметить сильное отставание в росте и развитии, пониженную всхожесть семян (около 70%), высокий процент стерильной пыльцы (25 - 30%).

Среди потомства изученных растений - регенерантов (Я] - Я3), полученных из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет), были обнаружены различные морфологические изменения. Около 30% исследуемых растений Я, второй группы имели усиленное ветвление, 10% растений линии \У-1 и 15% - линии Я-9 имели ассиметричное развитие листовой пластинки. Развитие листа вместо цветоноса обнаружено от 7% у потомства регенерантов Я-9, до 11% у потомства регенерантов Изменение окраски листа

обнаружено у 2% растений линий Я-9 и Все эти признаки являлись

морфозами и не наследовались в следующих поколениях.

Анализ 31 линии сомаклонов Я-9 в поколении показал, что в одной линии Я-9 (№ 37-2) наблюдалось уменьшение или потеря воскового налета. Эта мутация, затрагивающая уменьшение воскового налёта, вероятно, имеет моногенное рецессивное наследование, что согласуется с ранее полученными данными (Багрова и др., 1991). В другой семье Я] (у линии Я-9 № 33-2) обнаружена ещё одна мутация - одно из пяти исследованных в Я( растений имело габитус, отличный от исходного генотипа. Растение имело мелкие удлиненные листья, тонкий стебель и небольшую высоту стебля. Анализ таких линий регенерантов до поколения Я3 включительно показал наследственную природу возникших изменений.

Анализ количественных признаков в потомстве регенерантов К] -

Помимо исследования морфологических изменений мы провели анализ количественных признаков. Сомаклональные вариации, связанные с изменением количественных признаков, фиксировали в поколениях регенерантов гороха Я| - Яз Учитывали следующие показатели: высоту растения, число междоузлий, число междоузлий до первого цветка, количество бобов и семян на одно растение, вес 100 семян.

Анализировали потомство (Я 0 от 16 регенерантов Я-9 и 19 регенерантов линии полученных после 8 месяцев культивирования каллусов, а также потомство 22 регенерантов линии Я-9 и 7 линии полученных после 10 лет культивирования каллусов.

По большинству признаков разнообразие среди сомаклонов Я, превышало пределы изменчивости по сравнению с контрольными (исходными) растениями, из которых они были получены (табл. 4.). В большинстве случаев

это происходит за счет снижения исследуемых показателей, однако не исключено появление форм с положительными свойствами. Так, например, по высоте у регенерантов Я-9 первой и второй группы более чем в 50% исследуемых семей сомаклонов происходило статистически значимое снижение средних значений по сравнению с исходной линией. Более стабильными были такие показатели, как количество междоузлий и узел закладки первого цветка, которые статистически сравнимы с исходными линиями. На рисунке 3 представлены средние значения показателей продуктивности сомаклонов обеих групп и исходных генотипов, из которых они были получены (11-9 и¥-1).

Табл. 4. Пределы варьирования средних значений количественных признаков в потомстве К] растеиий-регенерантов гороха, полученных после 8 месяцев культивирования и после 10 лет по сравнению с исходной линией.

Признак R-9 W-1

после 8 месяцев после 10 лет после 8 месяцев после 10 лет

исходная линия регене-ранты исходная линия регенераты исходная линия регенераты исходная линия регенераты

Высота растений,см 71-132 61,7 -92,0 67-81 30,3 -74,5 49-116 55,4-104 50-72 40,3 -78,7

Количество узлов 11-18 11,3-15,7 9-11 7,5 -14,5 12-20 11,7-15,9 7-10 8,7-15,7

Количество узлов до первого цветка 6-9 6,0 - 9,2 7-11 7,5 -10,0

Количество бобов 5-10 2,3 - 5,4 3-5 0,5-8 2-6 2,2 - 6,2 1-6 0,5 - 3,3

Количество семян 10-50 5,3 - 20,3 6-26 0,9 - 22,0 9-22 8,0 - 28,4 5-27 0,8 - 6,2

Вес 100 семян, 15,3-17,1 9,4-30,0 7,6-19,1 3,8-21,9 10,0-16,1 11,8-17,3 6-18 4,7-11,5

- исследования не проводили

При анализе двух групп растений, которые различались по продолжительности нахождения в культуре in vitro, было показано, что у сомаклонов, полученных после 10 лет культивирования, отмечены значительные вариации по большинству анализируемых показателей. Почти все регенераты R) второй группы по тем или иным признакам отличались от исходных растений, даже на протяжении следующих поколений (R2, R3) средние значения у сомаклонов были значительно ниже пределов изменчивости по сравнению с исходной линией или на уровне стандарта. Однако у сомаклонов R-9 первой группы в большинстве случаев наблюдали снижение средних значений только по одному или нескольким показателям, а для двух линий сомаклонов (№12 и 19) W-1 (первой группы) по всем исследуемым

признакам не наблюдалось статистически значимых различий.

Анализ количественных признаков для двух групп регенерантов разных генотипов гороха (Я-9 и показал, что наиболее стабильным оказался

генотип W-l. Особенно это характерно для сомаклонов W-l, полученных из регенерантов первой группы, у которых большинство исследуемых показателей статистически не отличались от исходной линии. Такая зависимость наблюдается также у сомаклонов второй группы.

Рис. 3. Диаграммы средних значений показателей продуктивности у сомаклонов ММ и К-9 в потомстве Я]. Сомаклоны \¥-1 Сомаклоны Н-9

и,и 1111

СОвтеы к+|у¥1) ОТЯ01Ш К+^1) ссизетоиы В-9(К+) оомлслоны В-9(К+)

№ № М ЯО

1 гр/ГТВ 2ЦПВ 1|й™ 2 группа

Первая группа - сомаклоны, полученные после 8 месяцев культивирования,

Вторая группа - сомаклоны после 10 лет культивирования каллусов.

Показано, что у растений-регенератов большинство изменений по морфологическим и количественным признакам носит, вероятно, эпигенетический характер, однако мутационные изменения на уровне ДНК можно выявить при использовании молекулярных методов, таких как ЛАРО и

Молекулярно-генегический анализ растений - регенерантов

При исследовании ДНК растений-регенерантов ЯАРО- и 18811- методом сначала была проведена проверка внутрилинейного полиморфизма исходных линий (Я-9, и сорта Виола), из которых были получены растения-регенеранты. Установлено, что полиморфизма между индивидуальными растениями у исходных линий не было обнаружено, что свидетельствует не только о генетической однородности, но и о надёжности данного метода для изучения сомаклональной изменчивости (рис. 4.).

В первой группе растений-регенерантов, полученных после восьми

месяцев культивирования каллусов гороха, с помощью RAPD- и ISSR- методов было исследовано 16 (RrR|6) регенерантов линии R-9, 18 (RpRis) регенерантов линии W-1 и ll(Ri-Rn) - сорта Виолы. Во второй группе регенерантов, полученых после десяти лет культивирования каллусов, исследовали 8 растений - регенерантов R-9 (R21-R28) и 7 растений W-1 (R21-R27), которые дали семенное потомство Ri и R2. а также 10 стерильных регенерантов сорта Виола(К2|-Язо).

Рис. 4. Продукты амплификации ДНК с праймером Leb 10 индивидуальных растений линии R-9 (а) и регенерантов Ro второй группы, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха.

М 1 23 4 587 2345678 9 К +

а) б)

а) 1-7 -индивидуальные растения К+ (Я-9),

б) 1- 9 - регенеранты 11-9 (№ 21, 22, 23, 24, 30, 25, 26, 27. 28), полученные после десяти лет культивирования, К исходная линия Я-9.

М- маркер молекулярной массы (100 Ьр + 1.5 КЬ СибЭнзим).

В нашей работе мы наблюдали появление мутационных изменений у растений-регенерантов по сравнению с исходной линией в виде нескольких вариантов полиморфизма ДНК фрагментов:

1) Полиморфизм между исходной линией и всеми полученными из нее регенерантами (фрагмент присутствует / отсутствует только у исходного генотипа). Такой тип полиморфизма в большинстве случаев обнаружен у регенерантов R-9 (первой группы) или у регенерантов сорта Виола (второй группы), когда различия были выявлены непосредственно с исходной линией, из которой они были получены. Так, для регенерантов R-9 (первой группы) из четырнадцати полиморфных фрагментов девять присутствовали или отсутствовали только у исходной линии, а для регенерантов сорта Виола (второй группы) из двадцати двух полиморфных фрагментов двенадцать присутствовали или отсутствовали только у исходной линии

В основном с помощью таких праймеров был выявлен только один, в редких случаях два, полиморфных фрагмента. Пример такого полиморфизма представлен на рисунке 5.А, где стрелками отмечены полиморфные фрагменты.

2) Полиморфизм между некоторыми регенерантами и исходной линией. В данном случае фрагмент может присутствовать/отсутствовать у исходного

генотипа, но присутствует только у некоторых регенерантов. Такой тип полиморфизма характерен для регенерантов (первой и второй группы) всех генотипов.

В большинстве таких случаев на один праймер был обнаружен только один полиморфный фрагмент, однако были и исключения. Например, максимальное количество таких полиморфных фрагментов (5 фрагментов: СЖ5#1500, дК5#590, (ДО#390, (ДО#290, <5Я5#240) обнаружено при использовании праймера С}115 на регенерантах Я-9, второй группы (ЯггЯгв) (рис.5.Б.). У некоторых регенерантов одновременно могла наблюдаться не только потеря фрагмента, присутствующего у исходной линии, но и появление нового фрагмента.

3) Появление уникального фрагмента, который присутствует только у одного из растений-регенерантов. Появление уникальных фрагментов -довольно редкое явление, оно было характерно для регенерантов >№-1: один уникальный фрагмент обнаружен у регенерантов первой группы),

другой - у регенерантов (Я22 второй группы) (рис.5.В.), а так же был выявлен специфический фрагмент у одного из регенерантов Виолы, полученного из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).

Рис. 5. Продукты амплификации ДНК растений-регенерантов, полученные после десяти лет культивирования каллусов гороха, по сравнению с исходной линией.

М К>1 23456789 10 К-

12345 6789 К*М

1500

850 -

liMCIIII -ffitff«i

450 - ,

390 290 240

К+ 1234567 М

А) Б) В)

М - Маркер молекулярной массы (100 Ьр СибЭнзим), К* - исходная линия из которой получены peí енерант ы, К ~ - отрицательный контроль. Номерами отмечены растения peí енеран гы, полученные после десяти лет культивирования каллусов. Стрелками обозначены полиморфные фрагменты.

A) с 1 по 10 - регенеранты гороха сорта Виола с праймером ОР04. Б) el по 8 - регенеранты линии R-9 с праймером QR5(№ 21-28)

B) с 1 по 7 регенеранты W-l(№ 21-27) с праймером В318. Отмечен специфический фрагмент длиной приблизительно 380 п.н.

Скорее всего, в первом случае мутационные изменения возникли на первом этапе культивирования клеток in vitro, так как все регенераты отличаются от исходного генотипа. Это связано с тем, что получение каллусных культур предполагает приспособление клеток к условиям существования in vitro, выходящих за пределы нормы реакции их генома. На первом этапе культивирования это приводит к действию дестабилизирующего отбора и резкому усилению генетической изменчивости. Затем, под влиянием новой окружающей среды и действием стабилизирующего отбора, формируется клеточная популяция, которой свойственен физиологический и генетический гомеостаз (Кунах, 1999).

Во втором и третьем случае изменения предположительно происходят на более поздних стадиях и возникают в процессе длительного культивирования, незадолго до инициации побегообразования.

Часть полиморфных фрагментов (например, QR5#1500, В340#1600), можно было обнаружить у регенерантов гороха R-9 и W-1 обеих групп.

Количественная оценка RAPD и ISSR полиморфизма.

На основании данных, полученных в результате RAPD и ISSR анализа, была проведена оценка полиморфизма и уровня дивергенции между регенератами и исходной линией. В таблице 5 представлены границы степени генетических различий при совместном сравнении регенератов первой и второй группы.

По матрицам генетических различий были построены дендрограммы (рис.6.), которые наглядно отражают генетическое сходство исходных линиий с полученными из них растениями-регенерантами.

Табл. 5. Степень генетических различий (в %) у регенерантов Ro разных генотипов гороха в зависимости от продолжительности культивирования каллусов.

генотип продолжительность культивирования

8мес Юлет

Виола 0-5,6 7,5-9,6

R-9 3,8-4,5 0,7-5,2

W-1 0-0,7 0,7-1,8

У регенерантов сорта Виола (рис. 6.А.) на дендрограмме четко можно проследить два кластера, которые соответствуют двум группам растений-регенератов, различающихся по продолжительности культивирования. Степень генетических различий у регенерантов первой группы по сравнению с контролем составила от 0% (у R5, Л«) до 5,6 % (у Rз), у остальных она колебалась на уровне 1-2%. Для регенератов второй группы она составила 7,5 - 9,6% Некоторые регенераты можно объединить вместе: R7, Rl1 (в первой группе) и R2|, R22, Ягз, ¿24, R28 (во второй группе). Возможно, эти регенераты имели общее происхождение от одного клона и не дивергировали

в процессе культивирования in vitro.

Рис 6. Дендрограммы, отражающие генетическое сходство исходного генотипа и полученных из него регеиерантов.

А) Регенеранты Виолы

0.02

, 63 R9

Г—1- R4

80 R7

' 751 1 R11

! 1 70,

В.1 МО

1 R8

R5 1 виола К+

R22 R21 IR24 I R23 { R28

830 Н25

Б) Регенеранты R-9 из

В) Регенеранты W-1

, »0 24

S 23

k-zIL

¡2 4

9 1} 16 1« 17 14

10 ! 6 3

!«f i

25 — 12

1 кластер - растения из 8 месячного каллуса,

2 кластер - регенеранты, полученные из длительно культивируемых (более 10 лет) каллусов гороха.

Цифрами обозначены значения бутстрепа (в %).

У регенерантов tt-9 (рис. 6.Б.) все растения также можно разделить на два кластера, которые соответствуют продолжительности культивирования. В отдельный кластер попали растения первой группы, однако степень генетических различий составила около 4 % и находится приблизительно на одном уровне с регенератами второй группы.

На дендрограмме W-1 (рис. 6.В.) большинство регенератов первой группы (№ 2, 3, 4, б, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 18) не отличались от исходной линии (степень генетических различий составили 0%). У остальных регенератов первой группы степень генетических различий сравнима с уровнем генетических изменений большинства регенератов второй группы и не превышала 1%.

Таким образом, высокая разрешающая способность RAPD- и ISSR-методов позволяет обнаружить изменения в геноме растений-регенерантов на разных этапах культивирования каллусов гороха. В нашем случае при совместном анализе регенератов первой и второй группы наблюдается увеличение уровня изменчивости в зависимости от продолжительности культивирования. Особенно это характерно для регенератов Виолы, у которых уровень изменчивости варьирует от 0-5% (у первой группы регенератов) до 10% (у второй группы регенератов). Подобные результаты по RAPD спектрам были получены на регенератах сахарного тростника (Taylor et al., 1995), кукурузы (Осипова и др., 2003).

Следует отметить также, что исходный генотип растения оказывает большое влияние на накопление мутационных изменений в условиях in vitro. Tax, даже у регенератов близкородственных линий (R-9 и W-1) степень генетических различий сильно варьировала вне зависимости от продолжительности культивирования каллусов гороха, из которых позже были получены регенераты (табл. 5).

Доказательством генетической природы обнаруженного нами молекулярного полиморфизма служит воспроизводимость результатов и наследование выявленных полиморфных фрагментов в следующем поколении. Для этого был проведен молекулярно-генетический анализ потомства регенератов R] и R2.

Анализ наследования полиморфных фрагментов.

Как известно из литературных данных, обычно RAPD- и ISSR- маркеры наследуются по доминантному типу. Поэтому по электрофоретическому спектру продуктов амплификации невозможно отличить гетерозиготы от гомозигот. В редких случаях при инсерции (делеции) происходит изменение размера продукта амплификации и поэтому фрагменты наследуются кодоминантно (Willams et.al., 1990; Малышев, Картель, 1997).

В нашей работе после выявления молекулярных различий между регенератами и исходной линией часть полиморфных фрагментов была

выбрана для более подробного изучения. Во-первых, был проведен анализ наследования фрагментов в поколениях R|, R2, а потом, если эти фрагменты наследовались, их клонировали и секвенировали.

В большинстве случаев полиморфные фрагменты, выявленные в R©, наследовались у всех растений R,, R2 без расщепления, по-видимому, в таких случаях данная мутация находилась в гомозиготном состоянии уже у растений Ro- Однако из-за небольшого числа растений R| и/или отсутствия семенного потомства R2, не всегда можно было однозначно определить, в гомозиготном или гетерозиготном состоянии находится новая мутация. Так, например, с использованием праймера В318 у регенеранта W-1 № 22 второй группы был амплифицирован уникальный полиморфный фрагмент размером 380 н.п. (рис. 4.В), который присутствовал у пяти растений Rb однако проанализировать наследование этого фрагмента в поколении R2 не удалось из-за того, что все растения были стерильны.

В других случаях наблюдалось появление нового полиморфного фрагмента в Ro, однако у растений в Ri происходило расщепление, поэтому такая мутация в Ro должна находиться в гетерозиготном состоянии. Иногда полиморфизма ДНК среди регенерантов Ro и исходной линии нет, однако в потомстве R) наблюдается расщепление близко к менделевскому расщеплению 3:1.

В редких случаях полиморфные фрагменты, выявленные у регенерантов R0, не наследовались в следующем поколении Rj. Возможно, это связано с тем, что такие мутации в нуклеотидной последовательности ДНК, возникшие в процессе культивирования in vitro, не являются стабильными. Такие изменения могут быть связаны, например, с перемещением мобильных элементов. Однако для более ясного понимания этого явления требуется дополнительное изучение.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что изменения генома у регенерантов Ro, индуцированных из культуры клеток, могут находиться либо в гетерозиготном состоянии и затрагивать только одну из гомологичных хромосом, либо в гомозиготном состоянии, что согласуется данными, полученными другими исследователями (Кокаева и др., 2000; Осипова, 2003).

Сиквенс полиморфных нуклеотидных последовательностей, выявляемых RAPD- и ISSR- методами.

С целью изучения природы сомаклональной изменчивости часть полиморфных фрагментов клонировали и секвенировали. У регенерантов R-9 и W-1 первой группы, полученных после восьми месяцев культивирования, для анализа последовательностей было отобрано девять фрагментов: В340#1600, QR5#1500, К10#1000, V03#750, V03#1300, Pll#750, VI#380, V#490, V#450. Два фрагмента В340#1600, QR5#1500 были полиморфны как для регенерантов гороха первой, так и второй группы. Для них и ещё одного фрагмента (V#450) была найдена гомология с ранее известными последовательностями из генома

растений, в том числе и гороха. У регенерантов второй группы, полученных из каллусов после десяти лет культивирования, помимо полиморфных фрагментов Р340#1600, QR5#1500, выявленных между регенерантами R-9 и исходной линией, были отобраны другие фрагменты: Lebl0#320, М1#500; у регенерантов W-1 - 0р04#300, В318#370, а у регенерантов Виолы - С5#550, С5#200, 0р04#450, В318#350. Однако из них только для фрагментов С5#550 и В318#370 была найдена гомология с последовательностями из семейства бобовых. Отдельно провели анализ полиморфного фрагмента В474#450, выделенного из сомаклона Chl-6.

Так, для шести (из 20 отобранных) полиморфных фрагментов, выявленных в RAPD- и ISSR- спектрах у растений-регенерантов, была найдена гомология с известными последовательностями, хранящимися в базах данных GenBank (табл. 6). Для одного фрагмента (QR5#1500) была найдена гомология с митохондриальной ДНК разных видов растений, а для пяти было обнаружено сходство с нуклеотидными последовательностями из генома бобовых. Для фрагмента С5#550 установлена гомология с повторяющейся последовательностью гороха (Psat 2-2), для В340#1600 - с участками последовательности хлоропластного генома гороха (23S rRNA), для фрагментов В318#370, С5#550, V#450 найдена гомология с последовательностью люцерны. Показано, что другие два полиморфных фрагмента были гомологичны последовательностям известных ретротранспозонов гороха: Ту 3 copia и Ogre (фрагмент V#450 и В474#450, соответственно). Ogre - это новый класс ретротранспозонов, который также относится к Ty3/gypsy-like LTR ретротранспозонам. Он составляет свыше 5% генома гороха и может кодировать белок с неизвестной функцией, состоящий из 546-562 аминокислот (Neumann et al., 2003).

Тот факт, что изменения, возникающие в процессе культивирования клеток в условиях in vitro, происходят чаще всего в повторяющихся последовательностях ДНК, в том числе и в последовательностях ретротранспозонов, обусловлен несколькими причинами. Во-первых, это высокая частота повторяющихся последовательностей в геноме растений (в некоторых растительных геномах они составляют более 70% от общей ДНК). Во-вторых, эти районы являются более вариабельными по сравнению с консервативными участками ДНК, которые кодируют гены.

Таким образом, анализ полиморфных RAPD фрагментов, выделенных из регенерантов, проливает свет на природу сомаклональной изменчивости. Полученные результаты свидетельствуют, что генетические изменения, возникающие в процессе культивирования клеток в системе in vitro, могут происходить как в ядерной ДНК и затрагивать повторяющиеся последовательности ДНК или последовательности ретротранспозонов, так и в митохондриальной или хлоропластной ДНК.

Табл.6. Анализ нуклеотидной последовательности полиморфных RAPD-фрагментов

Генотип Фрагмент Результаты Blast (NCBI) анализа

Гомологи Степень гомологии фрагмента (%) Гомология в участке п.и.

R-9 QR5#1500 Nicotians tabacum митохондриальная ДНК 93 2-1664

Petunia-hybrida митохоидриальные гены: rpsl9, Yrps3andYrpll6.

Helianthns annum митохоидриальные гены рибосомальный белок S19 (rps19) псевдоген, (rps3) L16 (грПб). 92

В340#1600 Pisum sativum хлоропластная ДНК рибосомального РНК оперона 23 S 97 3-1548

Medicago truncatula хлоропластная ДНК 93

V#450 Pisum sativum ретротранспозон peabody/Ty 3-tyte gag-pol псевдоген 94 8-437

Medicago truncatula 81 7-214(7-259)

Lotus corniculatus 85 20-171

W-1 В318#370 Medicago truncatula последовательность ВАС клона mth2-151ml6 81 9-345

Виола С5#550 Medicago truncatula (последовательность клона mth2-72al1,) 83 92-391

Pisum sativum повтор (Psat2-2) 96 56-474

Сомак- лон (Chl-6) В474#450 Pisum sativum клон Ps-cos 14 ретротранспозон-Ogre 85-92 192-382

Pisum sativum клон Ps-cos 16 LTR и Ogre ретротранспозон 87 37-144

Pisum sativum Ген пектин метилэстеразы (rcpmel) 83-86 39-250

Выводы.

1. Оптимизирована технология длительного культивирования морфогенных каллусов разных генотипов гороха (Виола, W-1, R-9) и последующего чолучения растений-регенерантов. Созданы две группы растений -регенерантов выращенных из каллусов гороха разной продолжительности культивирования: 8-месячного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).

2. Установлено, что увеличение продолжительности культивирования каллусов с 8 месяцев до 10 лет резко снижает регенерационную способность побегов из культуры тканей, уменьшает жизнеспособность и плодовитость регенерантов.

3. У семенного потомства регенерантов Ro (сомаклонов Ri и R2) наблюдается изменение как морфологических, так и количественных признаков. В большинстве случаев количественные показатели признаков урожайности снижаются по сравнению с контролем.

4. Использование молекулярных (RAPD и ISSR) методов для исследования регенерантов Ro показало, что на способность накопления мутационных изменений в культуре клеток in vitro главным образом оказывает влияние исходный генотип растения.

5. При сравнении уровня изменчивости ДНК у двух групп регенерантов показано, что регенеранты, полученные после десяти лет культивирования каллусов, имели более высокий полиморфизм ДНК по сравнению с регенератами, полученными из молодой культуры тканей.

6. Показано, что полиморфные RAPD- и ISSR- фрагменты наследуются в следующих поколениях (Ri и R2)KaK доминантные признаки.

7. При помощи программы GeneBee BLAST 2.2.2. установлена гомология некоторых полиморфных фрагментов с повторяющейся последовательностью гороха (Psat 2-2), с участками хлоропластного генома (23S г RNA) и ретротранспозонами гороха: Ту 3 copia и Ogre, а также гомология с

последовательностью люцерны и митохондриальным геномом высших растений.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

Кузнецова О.И., Аш O.A., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров. Генетика 2005 Т. 41. №1. С.60-65. Кузнецова О.И., Аш O.A., Хартина Г.А., Гостимский С.А. RAPD - анализ сомаклонов гороха (Pisum sativum L.) Сборник научных трудов международной научно-практической конференции (22-25 марта 2004 года). Москва. «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» стр. 161-168.

Аш O.A., Хартина Г.А., Кузнецова О.И., Гостимский С.А. Регенерация растений из длительно культивируемых каллусов гороха. Материалы научной генетической конференция посвященной 100-летию со дня рождения А.Р. Жербака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской с.х. академии имени К.А. Тимирязева. Москва, 26,27 февраля 2002. стр. 21.

Аш O.A., Кузнецова О.И., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Изучение регенерации растений из длительно культивируемого каллуса - Материалы VIII международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Саратов / VIII International Conference «The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology» (Saratov, September 9-13 2003); стр 31. Аш O.A., Кузнецова О.И., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Исследование растений-регенерантов, полученных из длительно культирируемых каллусов гороха- Материалы 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им Н. И. Вавилова. 2003. Том 2, стр 105. Кузнецова О.И., Аш O.A., Хартина Г.А., Гостимский С.А Сомаклональная изменчивость у растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) после длительного культивирования каллусов in vitro.- III ВОГиС Москва 6-12 июня 2004 : «Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития. » Том 1. стр.209.

Кузнецова О.И., Гостимский С.А 2004 Влияние продолжительности культивирования каллусных культур в условиях in vitro на накопление генетических изменений у растений-регенерантов сорта Виола. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» Минск, 24-26 ноября 2004. стр165.

Кузнецова О.И., Аш O.A., Кокаева З.Г. Генетические изменения возникающие в культуре тканей гороха (Pisum sativum L.). Третий Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва, 14-18 марта 2005. стр. 63-64. Кузнецова О.И. Полиморфизм ДНК у регенерантов гороха, полученных из каллусов после восьми месяцев культивирования. Тезисы докладов ХП международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005г.) стр. 116.

И6643

РНБ Русский фонд

2006-4 15030

Заказ №163. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Оксана Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 .Использование культуры клеток и тканей растений.

1.2. Генетические изменения, возникающие в культуре клеток и тканей растений.

1.2.1. Изменение плоидности и числа хромосом.

1.2.2. Хромосомные мутации.

1.2.3. Генные мутации.

1.2.4. Внехромосомные изменения.

1.3. Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток.

1.3.1. Гетерогенность исходного материала.

1.3.3.Условия культивирования.

1.3.4. Влияние типа экспланта растения.

1.3.5. Типы морфогенеза.

1.3.6. Продолжительность культивирования.

1.4. Механизмы сомаклональной изменчивости.

1.5. Способы выявления сомаклональной изменчивости.

1.5.1. Фенотипический (морфологический) уровень.

1.5.2. Цитогенетическое изучение.

1.5.3. Выявление полиморфизма на молекулярном уровне.

1.5.3.1. Белковые маркеры.

1.5.3.2.Методы анализа полиморфизма ДНК.

1.5.3.2.1. Молекулярные маркеры на основе ПДРФ.

1.5.3.2.2. Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции.

- RAPD анализ.

- ISSR маркеры.

- STS маркеры.

- AFLP маркеры.

Комплексный анализ сомаклональной изменчивости.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Исходный материал.

2.2.Введение клеток в культуру in vitro и получение растений-регенерантов.

2.3. Анализ пыльцы у растений - регенерантов.

2. 4. Выделение ДНК гороха для ПЦР-анализа.

2.5.Метод ПЦР-анализа с использованием RAPD- и ISSR-праймеров.

2.6. Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.7. Клонирование фрагмента.

2.7.1. Выделение фрагментов из геля.

2.7.2.Лигирование фрагментов ДНК с pGEM-T вектором.

2.7.3 .Трансформация Е. coli (штамма JM 109) плазмидной ДНК.

2.8.Выделение плазмидной ДНК из E.coli JM.

2.9.Анализ плазмидной ДНК на наличие вставки.

2.10.Секвенировани е.

2.11. Полное секвенирование длинных фрагментов.

2.12. Математические методы обработки данных.

2.12.1. Статистические методы.

2.12.2. Качественная и количественная оценка полиморфизма.

2.13. Анализ нуклеотидных последовательностей.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение исходного материала.

3.2 Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве Rj - R2.

3.3. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов (R0) и сомаклонов гороха.

3.3.1. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов первой группы, полученных после восьми месяцев культивирования каллусов в условиях in vitro.

3.3.2. Молекулярно-генетический анализ растений - регенерантов второй группы, полученных после десяти лет культивирования каллусов в условиях in vitro.

3.3.3. Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха Ro с помощью молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров.

3.3.4. Молекулярно-генетический анализ сомаклонов гороха.

3.4. Анализ наследования полиморфных фрагментов.

3.5. Сиквенс полиморфных нуклеотидных последовательностей, выявляемых RAPD- и ISSR- методами.

3.5.1. Фрагмент В340# 1600.

3.5.2.0pameHTQR5#1500.

3.5.3. Фрагмент V#480.

3.5.4. Фрагмент С5#550.

3.5.5. Фрагмент ВЗ18#370.

3.5.6. Фрагмент В474#450.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха"

Актуальность проблемы. Культура клеток и тканей растений представляет большой интерес для физиологов, генетиков и селекционеров, а также специалистов в области клеточной и молекулярной биологии. Она является уникальной экспериментально созданной биологической системой, состоящей из популяции дедифференцированных соматических клеток, которые могут регенерировать в интактное растение.

Культуру клеток широко используют для изучения фундаментальных проблем биологии - особенностей организации и эволюции генома, а также для микроклонального размножения и клеточной селекции, связанной с получением новых форм растений (например, устойчивых к абиотическим факторам, токсинам, патогенам или гербицидам).

Как известно, условия выращивания клеток (тканей) в системе in vitro и процесс каллусообразования являются стрессовыми факторами, которые приводят к появлению так называемой сомаклональной изменчивости в каллусных клетках, а также у растений - регенерантов (Larkin and Scowcroft 1981; McClintoc, 1984). Однако такие сомаклональные изменения могут иметь как наследственную -генетическую природу так и являться длительными модификациями. В связи с выше сказанным, при работе с культурой клеток необходимо знание закономерностей изменчивости и возможности ее регуляции в зависимости от цели эксперимента.

До недавнего времени большинство работ, посвященных изучению сомаклональной вариабельности, было связано с описанием морфологических и цитогенетических изменений у растений -регенерантов, однако часто анализ таких признаков затруднен, а генетическая природа таких изменений остается неясной. Так, например, фенотипические изменения могут иметь как генетическую, так и эпигенетическую природу (Kaeppler et. al., 2000), а с помощью цитогенетических подходов можно обнаружить только крупные хромосомные перестройки или изменение уровня плоидности. Молекулярные маркеры позволяют устранить эти недостатки.

В последнее время для исследования сомаклональной изменчивости широко используются молекулярные маркеры, основанные на ПЦР, которые выявляют изменения в нуклеотидной последовательности ДНК, в частности RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) маркеры, которые выявляют изменения в нуклеотидной последовательности ДНК, в том числе и нейтральные мутации.

Одна из основных причин нестабильности генома в культуре клеток растений - это длительное пассирование тканевых культур, которое приводит к накоплению в них генетических изменений. Молекулярные методы дают возможность проследить генетическую изменчивость на разных этапах культивирования клеток и сделать предположения о времени и природе возникновения мутаций. Ранее в нашей лаборатории с помощью RAPD метода был успешно проведен анализ сомаклонов гороха, полученных после двух лет культивирования каллусов и количественно определены различия в RAPD- спектрах по сравнению с исходной линией (Кокаева и др., 1997).

Цель исследования заключалась в изучении сомаклональной изменчивости среди растений-регенерантов трех генотипов гороха (Виола, W-l, R-9), которые были получены из каллусов разной продолжительности культивирования.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Ввести в культуру клеток и тканей разные генотипы гороха (Виола, W-l, R-9).

2. Получить растения — регенеранты из культуры in vitro разной продолжительности культивирования: 8 месячного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).

3. Провести анализ морфологических и количественных признаков у регенерантов Ro и потомства сомаклонов R^ и R2.

4. Выявить полиморфные RAPD и ISSR маркеры, отличающие регенеранты (Ro) от исходной линии и проследить их наследуемость в следующих поколениях R! и R2.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кузнецова, Оксана Ивановна

133 Выводы.

1. Оптимизирована технология длительного культивирования морфогенных каллусов разных генотипов гороха (Виола, W-1, R-9) и последующего получения растений-регенерантов. Созданы две группы растений - регенерантов выращенных из каллусов гороха разной продолжительности культивирования: 8-месячного каллуса и из длительно культивируемого каллуса (более 10 лет).

3. У семенного потомства регенерантов Ro (сомаклонов Rj и R2) наблюдается изменение как морфологических, так и количественных признаков. В большинстве случаев количественные показатели признаков урожайности снижаются по сравнению с контролем.

5. При сравнении уровня изменчивости у двух групп регенерантов показано, что регенеранты, полученные после десяти лет культивирования каллусов, имели более высокий полиморфизм по сравнению с регенерантами, полученными из молодой культуры тканей.

6. Показано, что полиморфные RAPD- и ISSR- фрагменты наследуются в следующих поколениях (Rj и R2) как доминантные признаки.

7. При помощи программы GeneBee BLAST 2.2.2. установлена гомология некоторых полиморфных фрагментов с повторяющейся последовательностью, с участками хлоропластного генома и ретротранспозонами гороха: Ту 3 copia и Ogre, а также гомология с последовательностью люцерны и митохондриальной ДНК растительного генома.

Заключение

Для всех изучаемых генотипов (R-9, W-1 и сорт Виола) гороха были подобраны условия для длительного культивирования каллуса. В качестве экспланта оптимальным для введения в культуру in vitro по сравнению с междоузлием и гипокотилем является использование апикальной меристемы.

В зависимости от продолжительности культивирования исходных каллусов было получено две группы растений-регенерантов гороха. Первая группа регенерантов была получена после 8 месяцев, вторая - после 10 лет культивирования каллусов.

Все регенеранты Ro, полученные из восьмимесячного каллуса, фенотипически не отличались от исходной линии, из которой они были получены. В то же время, у выживших регенерантов Виолы, полученных после десяти лет культивирования каллуса, были обнаружены сильные фенотипические изменения. Изменения связаны с удлинением периода вегетации, увеличением побегообразования - до 4-5 побегов, мелколистностью, дефектным развитием цветка (уменьшенный размер цветка, укороченные тычинки, стерильная пыльца). Увеличение продолжительности культивирования с 8 месяцев до 10 лет приводило к снижению доли жизнеспособных регенерантов и увеличению числа стерильных растений. Показано, что на жизнеспособность регенерантов, полученных после 10 лет культивирования, сильное влияние оказывает генотип исходного растения.

У семенного потомства растений-регенерантов был проведен анализ морфологических и количественных признаков. Наибольшая изменчивость была характерна для сомаклонов Rj, что говорит о высокой гетерогенности первого поколения. В большинстве случаев происходило снижение средних значений по количественным признакам, однако наблюдалось также появление форм с положительными свойствами. Анализ морфологических признаков у сомаклонов Rj и R2 показал, что мутации, связанные с изменением воскового налета и изменение габитуса растения наследуются и, следовательно, имеют генетическую природу. Однако, большинство изменений, обнаруженных на фенотипическом уровне, не наследовались и являлись морфозами, которые связанны, по-видимому, с эпигенетическими изменениями.

С помощью RAPD- и ISSR- анализа были обнаружены изменения ДНК у регенерантов обеих групп и полученных ранее сомаклонов гороха на молекулярном уровне. При изучении регенерантов гороха наблюдалось увеличение уровня изменчивости в зависимости от продолжительности культивирования каллусов и исходного генотипа. Уровень изменчивости для регенерантов гороха, полученных из каллусов после 8 месяцев культивирования, варьировал в зависимости от генотипа от 0 до 5,6 %, а для регенерантов, полученных после десяти лет культивирования - от 0,7 до 9,6%.

В проведенной работе было показано, что уровень изменчивости, выявленный у регенерантов, полученных после десяти лет культивирования каллусов, не превышал изменчивости у сомаклонов гороха, полученных из более молодой культуры клеток (после 2 лет культивирования in vitro). Возможно, это связано с тем, что большинство изменений на молекулярном уровне происходит на ранних этапах культивирования под действием приспособления клеток к условиям культивирования in vitro. Затем под влиянием новой окружающей среды и стабилизирующего отбора формируется клеточная популяция, которой свойственен физиологический и генетический гомеостаз.

При построении дендрограммы для регенерантов разных генотипов, наглядно можно было выделить два кластера, которые соответствовали двум группам растений-регенерантов, различающихся по продолжительности культивирования каллусов.

Для более глубокого понимания природы сомаклональной изменчивости полиморфные RAPD- и ISSR- фрагменты были клонировны и секвенированы. Для шести из двадцати полиморфных фрагментов по базе данных GenBank была выявлена гомология с известными последовательностями. Из базы данных GenBank установлена гомология с последовательностью ДНК люцерны, с повторяющейся последовательностью гороха, с участками хлоропластного генома ДНК гороха и ретротранспозонами гороха Ту 3 copia и Ogre; а также для одного фрагмента была найдена гомология с митохондриальной ДНК растительного генома.

Таким образом, в данной работе продемонстрировано успешное использование молекулярных RAPD- и ISSR- маркеров для изучения сомаклональной изменчивости у регенерантов трех генотипов гороха, полученных из каллусных клеток с разной продолжительностью культивирования. Анализ последовательностей полиморфных фрагментов дает возможность предположить, в каких районах ДНК локализуются мутации, возникающие в культуре in vitro.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Оксана Ивановна, Москва

1. Аникеева Н.В. Полевая оценка сомаклонов пшеницы на устойчивость к корневой гнили.// В кн. Защита растений от вредителей и болезней на юго-востоке России. Саратов. 1994. С. 90-94.

2. Бабаева С.А., Петрова. Т.Ф., Гапоненко А.К. ■ Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений-регенерантов Triticum durum Desf.// Цитология и генетика 1994. Т. 28. № 4. С. 23-30.

3. Багрова A.M., Ежова Т.А., Хартина Г.А., Гостимский С.А. Получение длительно культивируемых каллусов и анализ сомаклональной изменчивости у регенерантов зерновых и овощных сортов гороха. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16, Биология. 1991. №1. С. 28-33.

4. Башките Е.А., Александружкина Н.И., Кирнос М.Д. Метилирование ДНК в суспензионной культуре клеток табака при обработке фитогормонами. //Биол. Науки. 1980. №4. С.103-110.

5. Белянская C.JL, Шамина З.Б. Получение и характеристика клонов риса, резистентных к стрессовым факторам // Физиология растений. 1993. Т.40. № 4, С. 681-685.

6. Бутенко Р.Г. Жизнь клетки вне организма.// "Знание" серия биология. М. 1975 вып. 8. С. 1-8.

7. Гостимский С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании // Успехи современной генетики. 1987. Т 14. Москва. "Наука". С. 48-63.

8. Гостимский С.А., Багрова A.M., Ежова Т.А. Обнаружение и цитогенетический анализ изменчивости, возникающей при регенерации растений из культуры тканей посевного гороха.// Доклады Академии Наук СССР. 1985., Т.283, №4.С.1107-1011.

9. Губарь Е.К., Кунах В.А. Изменения в распределении гетерохроматина в хромосомах диплоидных клеток Crepis capillaris L. Wallr. в культуре in vitro.// Докл. АН УССР Сер.Б. 1988. № 9. С.66.

10. Дейнеко Е.В., Цевелева О.Н., Пельтек С.Е., Бабенко В.Н., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Сомаклональная изменчивость морфологических и биохимических признаков у растений-регенерантов люцерны. // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 5. С. 775-781.

11. Долгих. Ю.И., Ларина С.Н., Болонкина Ю.В. Анализ изменчивости регенерантов инбредной линии кукурузы А188.// Генетика 1992. Т.28. № 26.С. 74-82.

12. Долгих. Ю.И., Шамина З.Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. М. "Наука". 1991. С. 123-127.

13. Дорохов Д. Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. // Генетика. 1997. Т. 33. № 4. С. 445-450.

14. Ежова Т.А., Багрова А. М., Гостимский С. А. Побегообразование в каллусах из верхушек стеблей, эпикотелей, междоузлий и листьев различных генотипов гороха. // Физиология растений. 1985. Т. 32. Вып. 3. С.513-520.

15. Ежова Т.А., Багрова А. М., Хартина Г. А., Гостимский С. А. Изучение наследуемости сомаклональных изменений у регенерантов посевного гороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 1989. Т. XXV, № 5. С.878 885.

16. Ежова Т.А., Ляпкова Н. С., Ныь Ван Н.Т., Петрова Т.В., Гостимский С. А. Цитологическое изучение действия гербицидов в системе in vitro у гороха.// Генетика. 1992. Т. 28. № 8. С. 121 129.

17. Зоринянц С.Э.; Смоленская И.Н.; Носов А.В. Быстрорастущая суспензионная культура клеток и протопласты пшеницы Тимофеева. // Физиология растений, 1993. Т.40. № 2. С. 300-306.

18. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням. // Автореф. дис. д-ра биол. наук, 2003. М. С.53.

19. Кирнос М.Д.; Александрушкина Н.И.; Власова Т.И.; Ванюшин Б.Ф. Структурная и функциональная организация метилирования реплицирующегося генома растений.// Молекуляр.биология. 1995. Т. 29. вып.6. С. 1242-1257.

20. Клоконос Н. П. Клональное микроразмножение ежевики и жимолости и перспективы его использования в Казахстане. // Садоводство и виноградарство. 2004. N 4. С. 14-16.

21. Ковалева О.Н.; Дунаева С.Е. Кариотипическая характеристика пассируемого каллуса ячменя в связи с его регенерационной способностью. // Науч.-техн. бюл. ВИР, 1987; Т. 170, С. 55-60.

22. Ковеза О.В. Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха. // автореферат кандидата биологических наук. Москва 2003. С. 24.

23. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Болтенков Е.В., Лауве JI.C. Сомаклональная изменчивость Iris pseudacorus L. по данным RAPD- и цитогенетического анализа. //Биотехнология. 2004, №2, С. 13-23.

24. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д. Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng II Биотехнология. 2001, № 1, С. 19-26.

25. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха. // Доклады Академии Наук, 1997, Т 355, №1, С. 134136.

26. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Гостимский С.А., Троицкий А.В. Наследование и характеристика RAPD- маркеров, выявленных у сомаклональных вариантов гороха.// Доклады академии наук, 2000, Т. 372, № 4, С. 565 -567.

27. Кочиева Е.З., Супрунова Т.П. Идентификация видового и сортового полиморфизма у томатов.//Генетика. 1999, Т.35, №10. С. 1386-1389.

28. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 1. Изменчивость в онтогенезе. // Биополимеры и клетка. 1994. Т. 10. С. 5-35.

29. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений.// 4.Изменчивость в процессе дифференцировки и каллусообразования in vitro.// Биополимеры и клетка. 1998. Т. 14, № 4. С. 298-319.

30. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro.// Физиология растений, 1999, Т. 46, №6, С. 919-929.

31. Кунах В.А. Особенности структурного мутагенеза в популяциях культивируемых клеток растений.// Успехи современной генетики. Вып. 12./ Под ред. Дубинина Н. П. М.: Наука, 1984. С. 30-62.

32. Кучеренко JI.A.; Харченко П.Н.; Ковалева Е.Н. Использование методов биотехнологии в селекции риса. // В кн. Состояние и перспективы развития с.-х. биотехнологии. JI. 1986. С. 92-96.

33. Кучко А.А. Клеточные технологии создания исходного материала для селекции картофеля.// В кн. Создание и использование исходного материала в селекции картофеля. Киев, 1993. С. 11-20.

34. Лапинская М.П. Клональное микроразмножение промышленных сортов гладиолуса.// Автореф. дис. канд. с.-х. наук. М.1998. С. 19.

35. Легкобит М.П. Изучение генетического полиморфизма представителей рода Stachys in vitro и in vivo.// дис. канд. биол. наук. М., 2003, С. 24.

36. Легкобит М.П. и Хадеева Н.В. Особенности морфогенеза и появление вариаций при микроклональном размножении разных видов стахиса.// Генетика. 2004 Т.40, №7, С.916-924.

37. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений.// Молекулярная биология. 1997. Т.31, №2, С. 197208.

38. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. //Изд-во Мир, Москва. 1984. С.

39. Мигранова И.Г. Леонова И.Н., Салина Е.А., Чураев Р.Н., Мардамшин А.Г. Влияние генома и типа специализации тканей экспланта на способность каллусной ткани борца северногок длительному культивированию in vitro.// Биотехнология. 2002. №2. С.37-41.

40. Осипова Е.С. Вариабельность ДНК-маркеров (RAPD, ISSR) при самоклональной изменчивости у кукурузы // диссертация канд. биол. наук Москва. 2003. С. 122.

41. Осипова Е.С., Ковеза О.В., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы (Zea mays L.) и создание на их основе SCAR-маркеров. //Генетика. 2003. Т. 39. № 12. С. 1664-1672.

42. Осипова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. RAPD- анализ сомаклонов кукурузы. // Генетика, 2001, Т. 37, № 1, С. 91-96.

43. Подорожный В. Н. Производство оздоровленной рассады и товарной земляники в одной системе // Садоводство и виноградарство. 2004. № 4. С. 18-19.

44. Попов А.С., Волкова Л.А. Криосохранение и некоторые изменения культур клеток диоскореи на среде без витаминов.// Физиология растений. 1994. Т.41. № 6. С. 923-928.

45. Роджанская О.А., Агаркова З.В. Коробова JI.H. Количественные вариации признаков сомаклональной изменчивости нута (Cicer arietinum L.) Сиб. Вестн.с.-х. науки. 2002, № 3-4. С. 40-46.

46. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя, выявленный ПЦР с произвольными праймерами.// Генетика 1995. 31 (10) С. 1358-1364.

47. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев: «Наук. Думка». 1990. С.280.

48. Сидоров В.А., Сидорова Н.В. Сомаклональная изменчивость — источник генетического разнообразия у растений.// Цитология и генетика. 1987. Т. 21. № 3. С. 230-234.

49. Скаржинская М.В. Межродовая гибридизация в семействе (Solanaceae) путем слияния изолированных протопластов // Автореф. дис. канд. биол. наук . 1983. С. 22.

50. Скаукрофт У.Р. Сомаклональная изменчивость: миф о клональном микроразмножении. // В кн: Мобильность генома растений. М.: Агропромиздат 1990. С. 228-260.

51. Соболева Г.В. Использование культуры тканей in vitro в селекции гороха. //Автореф. канд. биол. наук. Орел. 2005. С. 20.

52. Таран О.П. Клональное микроразмножение картофеля: проблемы и перспективы. // Вопр. картофелеводства. М., 2001, С. 292-299.

53. Хавкин Э. Е. Молекулярная селекция растений: ДНК технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур.// Сельскохозяйственная биология. 2003. №3. С.26-41.

54. Хвырлева Ц. Д., Рыжик М.В., Ананьев Е. В., Гапоненко А.К., Искаков А.Р., Созинов А.А. Деметилирование рДНК в каллусной ткани ячменя, культивируемой in vitro.// Докл. АН СССР . 1986. Т. 290. С. 1249-1252.

55. Хвырлева Ц.Д. Изучение организации и межсортового полиморфизма кластера генов и межсортового полиморфизма кластера генов 18-26s рРНК 5s рРНК ячменя. // Автореф. дис. канд. биол. наук. Ин-т общей генетики им. Н.И.Вавилова. М. 1987. С. 18.

56. Хусейн И.А., Хадеева Н.В., Кочиева Е.З. Использование биохимических и молекулярных маркеров для выявления полиморфизма генома овощного стахиса при микроклональном размножении.// Сельскохозяйственная биотехнология. 2001. Т.2, С. 54-60.

57. Чесноков Ю.В. ДНК фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений.// Сельскохозяйственная биология. 2005. N 1. С. 20-40.

58. Чибиряев С.В. Влияние продолжительности длительного культивирования in vitro на морфологические характеристики и генетическкую стабильность линий каллусной ткани солодки голой. // Диссертация канд. биол. наук. УФА 2002. С. 140.

59. Шамина 3. Б. Генетическая изменчивость в популяциях соматических клеток растений в культуре.// Автореферат докт. биол. наук. Л. 1988. С. 34.

60. Шамина З.Б. Особенности генетической изменчивости соматических клеток растений. // Биотехнология. 1987. Т. 3. № 3. С. 361-364.

61. Шамина З.Б. Стратегия получения мутантных штаммов клеток растений- продуцентов биологически активных веществ.// Физиология растений. 1994. Т. 41. Р. 879-884.

62. Шаяхметов И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro. // Диссертация докт. биол. наук. 2001. СПб. С. 219.

63. Щербань А.Б., Филиппова Г.И., Омельянчук Н.А., Вершинин А.В. Реорганизация высокоповторяющейся ДНК генома ячменя в условиях культивирования in vitro.// Генетика. 1994. Т.30, N 7, С. 879-885.

64. Ahloowalia B.S. Production and performance of potato mini-tubers.// Euphytica, 1994; V. 75. № 3. P. 163-172.

65. Ahloowalia B.S. Transmission of somaclonal variation in wheat. // Euphytica 1985. V. 34. P. 525-537.

66. Al-Zahim M.A., B.V. Ford-Lloyd, H.J. Newbury. Detection of somaclonal variation in garlic {Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis.// Plant Cell Reports . 1999. V. 18. P. 473-477.

67. Armstrong C.L., and R.L. Phillips. Genetic and cytogenetic variation in plants regenerated from organogenic and friable, embryogenic tissue cultures of Maize.// Crop Sci. 1988. V. 28. P. 363-369.

68. Arnholdt-Schmitt, В. Physiological aspects of genome variability in tissue culture. II. Growth phase-dependent quantitative variability of repetitive BstNl fragments of primary cultures of Daucus carota L.// Theor. Appl. Genet. 1995. V. 91. P. 816-823.

69. Arnholdt-Schmitt, B. Rapid changes in amplification and methylation pattern of genomic DNA in cultured carrot root explants (Daucus carota L.).// Theor. Appl. Genet. 1993. V. 85. P. 793-800.

70. Barsby T.L., Yarrow S.A., Kemble R.J., Grant I. The transfer of cytoplasmic male sterility to winter-type oilseed rape (Brassica napus L.) by protoplast fusion .// Plant Sc, 1987. T. 53. N 3. P. 243-248.

71. Bassam B.J., Bentley S. DNA fingerprinting using arbitrary primer technology (APT): a tool or a torment.// Aust Biotechnol. 1994. V. 4. P. 232236.

72. Bayliss M.W. Chromosomal variation in tissue culture.// Intern Rev Cytol Supple. 11 A. 1980. P. 113-114.

73. Ben Chaim A., R.C. Grube, M. Lapidot, M. Jahn, I. Paran Identification of quantitative trait loci associated with resistance to cucumber mosaic virus in Capsicum annuum.// TAG 2001. V.102, P. 1213-1220.

74. Bennici A., Caffaro L. Karyological Behavior during the First Phases of Differentiation and Habituation in Nicotiana bigelovii.// Protoplasma. 1985. V. 124. P. 130-134.

75. Benzion G., Phillips R.L. Cytogenetic stability of maize tissue cultures. A cell line pedigree analysis.// Genome. 1988. V.30. P. 318-325.

76. Blair M.W., Panaud O., McCouch S.R. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (<Oryza sativa L.). // TAG. 1999. V. 98. P. 780-792.

77. Bogani P., Simoni A., Lio P. et al. Genome flux in tomato cell clones cultured in vitro in different physiological equilibria II A. RAPD analysis of variability // Genom. 1996. V. 39. P. 846-853.

78. Bogani P., Simoni A., Lio P. et al. Molecular variation in plant cell populations evolving in different physiological contexts. // Genome 2001. V. 44. P. 549-558.

79. Brears T, Curtis GJ, Lonsdale DM. A specific rearrangement of mitochondrial DNA induced by tissue culture.// Theor. and Appl. Gene. 1989. V. 77. P. 620-624

80. Brettell, R.I.S., Dennis, E.S., Scowcroft, W.R. and Peacock, W.J. Molecular analysis of a somaclonal variant of alcoholdehydrogenase. Mol. Gen. Genet. 1986. 202: 335-344.

81. Brossard D. Etude Cytophotometrique des Variations du Contenu en DNA Nucleaire au Cours de la Dedifferenceation de la Moelle de Tabak (Nicotiana tabacum) Cultivee in vitro.// Сотр. Rend. Acad. Sci. 1974. V. 278D. P. 25172520.

82. Brown P.T.H., Gobel E., Lorz H. RFLP analysis of Zea mays callus cultures and their regenerated plants. // TAG . 1991. V.81. P. 227-232.

83. Caetano-Anolles. G., B.J. Bassam and Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using short arbitrary oligonucleotide primers.// BioTechnology 1991. V. 9. P. 553-557.

84. Castillo A.M., Valles M.P., Cistue L. Comparison of anther and isolated microspore cultures in barley.// Euphytica. 2000. V. 113. № 1. P. 1-8.

85. Cecchini E., Natali L., Cavallini A., Durante M. DNA variationals in regenerated plans of pea {Pisum sativum L.). // TAG 1992. V. 84. P. 874-879.

86. Creissen S.S. and A. Karp. Karyotypic changes in potato plants regenerated from protoplasts.// Plant Cell Tiss Org Cult. 1985. V. 4. P. 171-182.

87. Cullis C.A Cleary W. DNA Variation in Flax Tissue Culture. // Can. J. Genet.Cytol.1986. V.28. P.247-251.

88. D' Amato F. Chromosome variation in cultured cell and regenerated plants.// a Frontiers of plant tissue culture. Calgari. Calgari Univ. press, 1978. P. 287-295.

89. Dan Y and Stephens CT DNA polymorphism in somaclonal variants of Asparagus officinalis L. resistant to Fusarium axysporum f. sp. asparagi. Plant Tissue Culture and Biotechnology. 1997. V. 3(2). P. 89-96.

90. De Klerk G.J. How to measure somaclonal variation.// Acta Botanica Neerlandica 1990. V. 39. P.129-144.

91. Demarly Y. Experimental and theoretical approach of in vitro variations.// In: Somaclonal Variation and Crop Improvement (Semai J. ed.), Dordrecht, Nijhoff. 1986. P. 84-99.

92. Dennis, E.S., Brettell, R.I.S. and Peacock, W.J. A tissue culture induced Adhl null mutant of maize results from a single base change. Mol. Gen. Genet. 1987. V. 210. P. 181-183.

93. Deumling, B. Clermont, L. Changes in DNA content and chromosomal size during cell culture and plant regeneration of Scilla siberica: selective chromatin diminution in response to environmental conditions .// Chromosoma 1989. V. 97. P. 439-448.

94. Dewey R.E., Tomothy D.H., Levings C. S. A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male-sterility in the T cytoplasm of mail.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 5374-5378.

95. Durante M., Geri С., Grisvard J., Parenti R., Buiatti M. Variation in DNA complexity in Nicotiana glauca tissue cultures. I. Pith tissue dedifferentiation in vitro. // Protoplasma 1983. V. 144. P. 114-118.

96. Dolezel J. S., NovaK F.J. Effect of plant tissue culture media on the frequency of somatic mutation in Tradescantia stamen hairs.// Z. Planzenphysiol. 1984. V. 114. P. 51-58.

97. Earle E.D., Kuehnle A.R., Somaclonal variation in maize.// In Biotechnology in Agriculture and Forestry. Somaclonal variation in Crop Improvement. ( Y. P. S. Bajaj ed.) 1990 V. 11. P. 326-351.

98. Evans D.A. and Sharp W.R. Single gene mutation in tomato plants regenerated from tissue culture.// Science 1983. V. 221. P. 949-951.

99. Ezhova T.A., Bagrova A.M., Gostimski S.A. Cell selection as a possible reason for the specificity of Somaclonal variation in pea. // Plant breeding. 1995. V. 144. P. 520-524.

100. Fang D.Q., Roose M.L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeats markers. // TAG. 1997. V. 95. P. 408-417.

101. Felsenstein J. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap. //Evolution. 1985. V. 38. P. 783-791.

102. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrient requirements of suspension culture of soybean root cells. //Exp.Cell Res. 1968. V. 50. P. 150-155.

103. Gaponenco A. K., PetrovaT.F., Isararov A. R., Sozinov A. A. Cytogenetics of in vitro cultured somatic cell and regenerated plants of barley {Hordeum vulgare L.)// Theor. and Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 905-911.

104. Gesteira A.S., Otoni W.C., Barros E.G., Moreira M.A. RAPD based detection of genomic instability in soybean plants derived from somatic embryogenesis. // Plant Breeding 2002, V. 121. P. 269-271.

105. Godwin I. D., Sangduen N., Kunanuvatchaidach R., Peperidis G., Adkins S.W. RAPD polymorphisms among variant and phenotypically normal Rice {Oryza sativa Var Indica) somaclonal progenies.// Plant Cell Reports. 1997. V.16. № 5. P. 320-324.

106. Griga M. Direct somatic embryogenesis from shoot apical meristems of pea, and thidiazuron-induced high conversion rate of somatic embryos.// Biologia plantarum 1998. V. 41 (4). P. 481-495.

107. Griga M. Morphological alterations in sterile mutant of Pisum sativum obtained via somatic embryogenesis.// Biologia plantarum 2000. V. 43 (2). P.161-165.

108. Griga M. Morphology and anatomy of Pisum sativum somatic embryos.// Biologia plantarum 2002. V. 45 (2). P.173-182.

109. Gubar E.K., Kunach V.A. C-banding in Zea mays.// Biotechnology in Agriculture and Forestry. V. 25. Maize/ Ed.Bajaj Y.P.S. Berlin: Heidelberg: Springer. 1994. P.366-381.

110. Gupta P.K. Chromosomal basis of somaclonal variation in plants.// In S.M. Jain, D.S. Ahloowalia (Eds.), Somaclonal variation and induced mutations in crop improvement. Kluwer Academic Publishers, Dordecht. 1998. P. 149-168.

111. Habib A., M.R. Ali, M.N. Amin and M.M. Rahman Clonal Propagation of White Mulberry (Morus alba L.) Using in vitro Technique.// Journal of Biological Sciences 2003. V. 3 (12). P.l 181-1187.

112. Hadrys, H., Balick, M., Schierwater, B. Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology. // Molecular Ecology 1992 V. l.P. 55-63.

113. Hashmi G, Huettel R, Meyer R, Krusberg L. and Hammerschlag FA. RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach.// Plant Cell Rep 1997 . V. 16. P. 624-627.

114. He С., V. Poysa, K. Yu Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars.// Theor. Appl. Genet. 2003. V.106. P. 363373.

115. Hirochika H. Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome analysis.// Plant Molecular Biology. 1997. V. 35. P. 231-240.

116. Hirochika H., Sugimoto K., Otsuki Y., Tsugawa H., Kanda M. Retrotransposons of rice involve by tissue culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 V. 93. P. 7783-7788.

117. Hartman C., Wintfield M., Core F., Davey M. R., Rode A., Karp A.A Comparative study of the mitochondrial genome organization in in vitro culturesof diploid, tetraploid and hexaploid Triticum species. II Theor. Appl. Genet. 1996. V.93.P. 968-974.

118. Jackson J.A., Dale P.J. Callus induction, plant regeneration and an assessment of cytological variation in regenerated plants of Lolium multiflorum L.IIJ. Plant Physiol. 1988. V. 132. P. 351-355.

119. Jain. Mechanisms of spontaneous and induced mutations in plants.// Radiation Res. 2000. V. 2. Cong. Proc., P. 255-258.

120. Jaligot E, Rival A, Beule T, Dussert S, Verdeil JL. Somaclonal variation in oil palm (Elais guineensis Jacq.): the DNA methylation hypothesis.// Plant Cell Rep. 2000. V. 19. P. 684-690.

121. Jha S., Sen S. 1990 Induction of Mitosis in Polytene Nuclei and Hormonal Effect on Nuclear Changes during Callus Initiation in Diploid Urginea indica Kunth. 0Liliaceae). //Genetica. 1990. V. 80. P. 9-15.

122. Joyce S. M. & A.C. Cassells. Variation in potato microplant morphology in vitro and DNA methylation. // Plant Cell Tissue and Organ Culture 2002. V. 70. P. 125-137.

123. Joyce S.M., A.C. Cassells, M. Jain. Stress and aberrant phenotypes in in vitro culture.// Plant Cell Tissue and Organ Culture. 2003. V. 74. P. 103-121.

124. Kaeppler S.M., Kaeppler H.F. and Rhee Y. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants.// Plant Mol. Biol. 2000.V. 43. P. 179-188.

125. Kaeppler S.M. Phillips R.L. Olhoft P. Molecular basis of heritable tissue culture-induced variation in plants. // In: S.M. Jain, D.S. Brar, Ahloowalia B.S. (Eds.) Somaclonal Variation and Induced Mutations in Crop Improvement. 1998. P. 467-468

126. Kaeppler, S.M. and Phillips R.L. DNA methylation and tissue culture-induced variation in plants. In Vitro Cell Dev. Biol. 1993. V. 29. P. 125-130.

127. Kaneko К. Karyological Studies on Callus Cell of Haplopappus gracilis J I Chromosoma. 1974. № 95. p. 2943-2949.

128. Karp A. On the current understanding of somaclonal variation.// Oxford Surveys of Plant Mol. and Cell Boil., 1991. V.7. P. 58.

129. Karp A. Somaclonal variation as a tool for crop improvement.// Euphytica. 1995. V. 85. P. 295-302.

130. Karp A. Maddock S. E. Chromosome variation in wheat plants regenerated from cultured immature embryos.// Theor. Appl. Genet. 1984. V.67. №3. P.249-255.

131. Karp A., Steele S.H., Parmar S., Jones M.G.K., Shewry P.R. Relative stability among barley plants regenerated from cultured immature embryos. // Genome 1987. V. 29. P. 405-412.

132. Karp, A. and Bright, S.W.J. On the causes and origins of somaclonal variation. // Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology. 1985. V. 2. P. 199-234.

133. Kidwell K.K. and Osborn T.C. Variation among alfalfa somaclones in copy number of repeated DNA sequences. Genomel993. V. 36. P. 906-912.

134. Kishor P.B.K., Reddy G.M. Callus initiation and plantlet regeneration from different explants and genotypes of Oryza sativa L. // Indian J. Plant Physiol. 1987. T. 30. №1. P. 66-70.

135. Kubis S. E., Castilho A., Vershinin A., Heslop-Harrison J. Retroelements, transposons and methylation status in the genome of oil palm (Elaeis guineensis) and the relationship to somaclonal variation.// Plant Molecular Biology. 2003. V.52. P. 69-79.

136. Larkin R.J., Scowcroft W.R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell culture for plant improvement // Theor. Appl. Genet. 1981. V.60. № 2. P. 197-214.

137. Larkin, P.J., S.A. Ryan; R.I.S. Brettel and W.R. Scowcroft, 1984. Heritable somaclonal variation in wheat. // Theor. Appl. Genet. V. 67. P. 443-455.

138. Lee S.H., Ryu J. A., Do G.S., Seo B.B. Рак J.H., Kim I.S., Song S.D. Chromosome Analysis by Fluorescence in Situ Hybridization of Callus -Deived Regenerants in Allium Cyaneum R.// Plant Cell Reports. 1998. V. 18. № 3/4. P. 209-213.

139. Lee, M. and R.L. Phillips. Genetic variants in progeny of regenerated maize plants. Genome 1987. V. 29. P. 834-838.

140. Lee, M., J.L. Geadelmann, and R.L. Phillips. Agronomic evaluation of inbred lines derived from tissue cultures of maize.// Theor. Appl. Genet. 1988. V. 75. P. 841-849.

141. Leroy X.J., K. Leon and M. Branchard. ISSR and somaclonal variation: a new molecular technique for an important in vitro phenomenon.// Electronic Journal of Biotech!ogy 2000. V. 3. P. 140-148.

142. Leroy X.J., Leon K., Branchard M. Characterisation of Brassica oleracea L. by microsatellite primers. // Plant Syst. and Evol. 2000. V. 225. P. 235-240.

143. Leroy X.J., Leon К., Hily J.M., Chaumeil P., Branchard M. Detection of in vitro culture-induced instability through inter-simple sequence repeat analysis. // TAG. 2001. V. 102. P. 885-891.

144. Leroy, X.J., Silladin, K., Branchard, M. and Jung, J.-L. Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) analysis in Cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis L.). // ISHS Symposium on Brassicas, Tenth Crucifer genetics workshop, Rennes, 23-27 September 1997.

145. Levings C.S. Ill The plant mitochondrial genome and its mutant.// Cell. 1983. V. 32. P.659-661.

146. Li Ш, Guo BH, Li YW, Du LQ, Jia X, Chu Molecular cytogenetic analysis of intergeneric chromosomal translocations between wheat (Triticum aestivum L.) and Dasypyrum villosum arising from tissue culture.// Genome 2000. V.43. P. 756-762.

147. Linacero R., Freitas Alves& A.M. Vazquez. Hot spot of DNA instability revealed though the study of somaclonal variation in rye. // Theor. Appl. Genet. 2000. V. 100 P. 506-511.

148. Ling D.H. In vitro production of male sterile rice plants.// Biotechnology in agriculture and forestry. -Berlin etc., 1996. V.36. P. 20-45.

149. Locy R.D., Chang Ch.-Ch., Nielsen B.L., Sing N.K. Potosynthesis in salt-adapted hetrotrophic tobacco cell and regenerated plants.// Plant Phisiol., 1996. V. 110. P. 312-328.

150. Lonsdale D.M. The molecular biology and manipulation of the cytoplasm of higher plants.// Genetic engineering. Ed. P.W. Rigby L: Acad. Press. 1987. V. 6. P. 48-102.

151. Lorz, H. and W. R. Scowcroft. Variability among plants and their progeny regenerated from protoplasts of Sulsu heterozygotes Nicotiana tabacumJ! Theor. Appl. Genet. 1983. V. 66. P. 67-75.

152. Macaulay M., L. Ramsay, W. Powell, R. Waugh A representative, highly informative 'genotyping set1 of barley SSRs.// Theor. Appl. Genet. 2001. V. 102. P. 801-809.

153. Mangolin C. A. , A. J. Prioli, M. F. P. S. Machado. Isozyme Variability in Plants Regenerated from Calli of Cereus peruvianus (Cactaceae).// Biochemical Genetics, 1997, V. 35, № 5 6, P. 189 - 204

154. Masuda K., Kikuta Y., Pujino K., Okazava Y. Preferential Synthesis of Mitochondrial DNA during the Initial Stage of Tissue Growth in Potato Explant Cultures. // J Fac. Agr. Hokkaido Univ. 1994. V.66. P.13-25.

155. Matthes M., R. Singh, S.-C. Cheah. A. Karp Variation in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) tissue culture-derived regenerants revealed by AFLPs with methylation-sensitive enzymes.// Theor Appl Genet. 2001. V. 102. P. 971-979.

156. McCann A.W., Cooley G., Van Dreser J. A system for routine plantlet regeneration of sunflower (.Helianthus annuus L.) from immature embryo-derived callus.// Plant Cell Tissue Organ Cult. 1988. T. 14. № 2. P.103-110.

157. McClelland M, NelsonM& Raschke E Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases.// Nucleic Acid. Res. 1994. V. 22. P. 3640-3659.

158. McClintoc B. The significance of responses of the genome to challenge.// Science 1984 V. 226. P. 792-801.

159. McClintoc В. The Significance of Responses of the Genome to Challenge.// Dyn. Genome: Barbara MacClintock's Ideas Century Genet. N.Y.: Cold Spring Harbor, 1992. P. 361-380.

160. McCoy T. J. Characterization of alfalfa (Medicago sativa L.) plants regenerated from selected NaCl tolerant cell lines. // Plant Cell Rep., 1987. V. 6. P. 417-422.

161. McCoy T. J., Pillips R., Rines H. Cytogenetic analisis of plant regenerated from oat tissue culture.// Canad. J. Genet, and Cytol. 1982. V. 24. P. 37-50.

162. Miura, A., Yonebayashi, S., Watanabe, K., Toyama, Т., Shimada, H. and Kakutani T. Mobilization of transposons by a mutation abolishing full DNA methylation in Arabidopsis.// Nature 2001. V. 411. P. 212-214.

163. Moller E.M., Bahnurg G., Sandermann H., Jeiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentos fungi, fruit bodies and infected plant tissues // Nucl. Acids Res. 1992. V.20. №22. P. 6115-6116.

164. Molnar-Lang M, Line G, Friebe BR, Sutka J Detection of wheat-barley translocations by genomic in situ hybridization in derivatives of hybrids multiplied in vitro.// Euphytica. 2000. V. 112. P 117-123.

165. Mueller U.G.and Wolfenbarger L. AFLP genotyping and fingerprinting.// Trends in Ecology and Evolution. 1999. V. 14. P. 389-394.

166. Muller E, Brown PTH, Hartke S & Lorz H. DNA variation in tissue culture-derived rice plants.// Theor. Appl. Genet. 1990. V. 80. P. 673- 679

167. Munthali M.T. Newbury H.J., Ford-Loyd B.V. The detection of somaclonal variants of beet using RAPD.// Plant Cell Report 1996. V.15. P. 474-478.

168. McCoy Т., Pillips R., Rines H. Cutogenetic analisis of plants regenerated from oat tissue culture.// Canad. J. Genet, and Cytol. 1982. V. 24. P 37-50.

169. McCoy T.J. Tissue culture selection for disease resistant plants // Iowa State J. Res, 1988. T. 62. № 4. P.503-521.

170. Negruk V. I., Eisner G. I., Redishkina T.D., et al. Diversity of Vicia faba circular mitochondrial DNA in whole plants and suspension cultures.// Theor. Appl. Genet. 1986. V. 72. P. 541-546.

171. Nei M. and Li W.-H. Matematicl model for studying genetic variation in term of restriction endonuclesses.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V.76. P. 5269-5273.

172. Neumann P, Pozarkova D, Macas J. Highly abundant pea LTR retrotransposon Ogre is constitutively transcribed and partially spliced.// Plant Mol Biol. 2003 V. 53(3), P. 399-410.

173. Newbury H.J. & Ford-Lloyd. The use of RAPD for assessing variation in plants. // Plant Growth Regulation 1993. V.12. P. 45-43.

174. Niizeki M. Somaclonal Variation in Lotus corniculatus L. (Birdsfoot Trifoil).// Biotechnology in Agriculture and Forestry. Somaclonal Variation in Crop Improvement II (ed. By Y.P.S. Bajaj) 1996. V.36. P.

175. Nilson N. O., Hallden C., Hansen M., Hjerdin A. and Sail T. Comparing the distribution of RAPD and RFLP markers in a high density linkage map of sugar beet. // Genome 1997. V.40. P. 51-58.

176. Oldenburg D.J., Bendich A.J. Most chloroplast DNA of maize seedlings in linear molecules with defined ends and branched forms. // J. Mol. Biol. 2004. V. 335 (5). P. 953-970.

177. Orton T.J. Somaclonal Variation: Theoretical and Practical Consideration.// 16th Stadler Genet. Symp. Manipul. Plant. Improv.,1984. N.Y.; L., 1984. P.478-468.

178. Orton, T. J., Chromosomal variability in tissue cultures and regenerated plants of Hordeum.// Theor. Appl. Genet., 1980. P.101-112.

179. Osifo E.O, Webb, J.K and G.G. Henshaw.// Variation among Callus derived potato plants. J. Plant Physiol 1989. V. 134. P. 1-4.

180. Palombi M.A., C. Damiano. Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting genetic variation in kiwifruit (Actinidia deliciosa A. Chev).// Plant Cell Reports . 2002 V. 20. P 1061-1066.

181. Patzak J. Assessment of somaclonal variability in hop (Humulus lupulus L.) in vitro meristem cultures and clones by molecular methods.// Euphytica. 2003. V. 131. P. 343-350.

182. Phillips R. S., S.M. Kaeppler S.M., P. Olhoft. Genetic instability of plant tissue cultures: Breakdown of normal controls. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 5222-5226.

183. Polanco C., Ruiz M. L. AFLP analysis of somaclonal variation in Arabidopsis thaliana regenerated plants.// Plant Science 2002. V. 162. P. 817824

184. PsechkeV.M., R.L.Phillips. Genetic instability of somaclonal variation in plants.// Adv Genet. 1992. V. 30. P. 41-75.

185. Peschke V.M., Phillips R.L. Activation of the maize transposable element suppressor -mutator (Spm) in tissue culture.// Theor. Appl. Genet. 1991. V.81. P. 90-97.

186. Qui J., Van Senten E., Tusan S. Optimization of DNA amplification fingerprinting to study genetic relationships of white lupin germplasm.// Plant Breeding. 1995. V. 114. P. 525-529.

187. Raimondi J.P., R.W. Masuelli, E.L. Camadro Assessment of somaclonal variation in asparagus by RAPD fingerprinting and cytogenetic analyses.// Scientia Horticulturae. 2001. V.90. P. 19-29.

188. Raina S. N., Rani V. GISH technology in plant genome research.// Methods in Cell Science 2001. V. 23. P. 83-104.

189. Reisch, B. 1983. Genetic variability in regenerated plants. In: Handbook of Plant Cell Culture. V. 1. (D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato and Y. Yamada, eds.). Macmillan Co., NY. P. 748-769.

190. Rout GR, Samantaray S, Das P. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants.// Biotechnol Adv. 2000. V. 18(2). P. 91-120.

191. Ruiz L.M., Vazquez A.M. Chromosome Number Evolution in Stem Derived Calluses Hordeum vulgare L. Cultured in vitro.// Protoplasma. 1982. V.lll. P. 83-86.

192. Sabir A, Newbery HJ, Tood G, Catty J, Ford-Lloud BW Detection of genetic stability using isozymes and RFLPs in beet plants regenerated in vitro.// Theor. Appl. Genet. 1992. V.84. P. 113-118.

193. Sadoch Z., Majewska-Sawka A., Jazdzewska E., Niklas A. Changes in sugar beet mitochondrial DNA induced during callus stage.// Plant Breeding. 2000. V.119.P. 107-110.

194. Samec P. & Nasinec V. Detection of DNA polymorphism among pea cultivars using RAPD technique.//Biologia plantarum. 1995. V. 37 (3). P. 321327.

195. Sanal Kumar P., Mathur V.L. Chromosomal instability in callus culture of Pisum sativum.!I Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2004. V. 78. P. 267-271.

196. Sato S. and Kawamura S. Cytological studies on the nucleolus and the NOR- carrying segments of Allium sativum.// Cytologia 1981. T. 46. P. 781-790.

197. Sebastiani L., Lenzi A., Pugliesi C., Fambrini M. Somaclonal variation for resistance to Verticillium dahliae in potato (Solarium tuberosum L.) plants regenerated from callus.// Euphytica. 1994; V. 80. № 1/2. P. 5-11.

198. Shepard JF. Protoplasts as sources of disease resistance in plants.// Annu RevPhytopath. 1981. V. 19. P.145-166.

199. Shepard, J. F., Bidney, D., Shahin E. Potato protoplasts in crop improvement.// Science 1980. V. 208. P. 17-24.

200. Shirzadegan M, Palmer JD, Christey M, Earle ED. Patterns of mitochondrial DNA instability in Brassica campestris cultured cells. // Plant Mol Biol. 1991. V. 16(1). P. 21-37.

201. Shoyama Y., Xuan Xuan Zhu, R. Nakai, S. Shiraishi, H. Kohda. Micropropagation of Panax notoginseng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regenerated plantlets.// Plant Cell Reports. 1997. V. 16. P. 450-453.

202. Sing В., HarveyB., Kao К., Miller R. Karyotypic changes and selection presssure in Haplollappus gracilis suspension cultures. // Canad. J.Genet. Cytol. 1975. V.17,N. l.P. 109-116.

203. Soniya E. V., Banerjee N.S. and Das M.R. Genetic analysis of somaclonal variation among callus-derived plants of tomato. // Current science, 2001. V.80. P. 1213-1215.

204. Sree Ramulu K. Genetic instability during plant regeneration in potato: Origin and implications.// Plant Physiol. 1987. V. 6. P. 211-218.

205. Srivastav S., Kothari S.L. Embryogenic callus induction and efficient plant regeneration in pearl millet.// Cereal Res.Communic. 2002; V. 30, № 1/2 P. 6974

206. Sun Z-X, Zheng K-L. Somaclonal variation in rice. In: Bajaj YPS (ed) Somaclonal Variation in Crop Improvement I. // Springer-Verlag, Berlin. 1990. P. 288-315.

207. Swarnkar P.L., Bohra S.P., Chandra N. Biochemical Studies on Initiation of Callus in Solarium surattense. И Plant Phisiol. 1986. V. 126. P. 293-396.

208. Tang S., J.-K. Yu, M.B. Slabaugh, D.K. Shintani, S.J. Knapp Simple sequence repeat map of the sunflower genome.// Theor. Appl. Genet., 2002, V. 105. P.l 124-1136.

209. Taylor PWJ, Fraser ТА, Ко HL, and Henry RJ. RAPD analysis of sugarcane during tissue culture.// In: Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology (Eds M Terzi, R. Cella, A. Falavigna. Kluwer Academic Int,) 1995. P. 241-246.

210. Van de Peer Y., De Wachter R. Treecon for Windows: a software package for construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. V.10. P.569-570.

211. Vardi, A. Isolation of protoplast in citrus.// International Citrus Congress (2nd : 1977 : Orlando, Florida), 1977, International Society of Citriculture. 2. P. 575-578.

212. Vendrame W.A., G. Kochert, H.Y. Wetzstein. AFLP analysis of variation in pecan somatic embryos.// Plant Cell Rep. 1999. V.18. P. 853-857.

213. Vendrame W.A., G.D. Kochert, D. Sparks, H.Y. Wetzstein. Field performance and molecular evaluations of pecan trees regenerated from somatic embryogenic cultures.// J. Am. Soc. Hort. Sci. 2000 V. 125. P.542-546.

214. Vidal and Garcia. Analysis of a Musa spp. Somaclonal Variant Resistant to Yellow Sigatoka. // Plant Molecular Biology Reporter. 2000. V. 18. P. 23-31.

215. Vodkin L.O. Transposable Element Influence on Plant Gene Expression and Variation.// Biochim. Plants: Comprehensive Treatise. V. 15. San-Diego etc., 1989. P. 83-132.

216. Vos P. Hogers R., Bleeker M., Rejans M., Van de Lee Т., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman j., Kuiper M., and Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.// Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 44074414.

217. Vyskot В., Gazdova В., Siroky J. Methylation Patterns of two repetitive DNA sequences in Tobacco tissue cultures and their regenerants. // Biol. Plant. 1993. V. 35. P. 321-327.

218. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of short tandem DNA repeats.// TAG. 1994. V. 88. P. 1-6.

219. Welsh J, McClelland M, Honeycutt R, Sobral B. Parentage determination in maize hybrids using arbitrarily primed PCR.// Theor. Appl. Genet., 1991. V. 82. P. 473-476.

220. Wilhelm E. Somatic embryogenesis in oak (Quercus spp.).// In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2000 V. 36. P. 349-357.

221. Williams M.E., Hepburn, Widholm J.M. Somaclonal variation in a maize imbred line is non associated with changes in the number or location Ac-homologous sequences.// Theor. Appl. Genet., 1991.V. 81. P. 272 276.

222. Williams J.G.K., Kubelik A.R. Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.// Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

223. Wolff К., E. Zietkiewicz & H. Hofstra. Identification of chrysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprint patterns. // Theor. Appl. Genet., 1995, V. 91(3). P. 439-447.

224. Xiong L.Z, Xu C.G, Saghai Maroof Qifa Zand M.A. Planterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by metylation-sensytive amplification polymorphism technique.// Mol. Gen. Genet. 1999. V. 261. P. 439-446.

225. Yang H., Tabei Y., Kamada H., Kayano Т., Takaiwa F. Detection of somaclonal variation in cultured rice cells using digoxigenin-based random amplified polymorphic DNA.// Plant Cell Reports. 1999. V.18. P. 520-526.

226. Ye J. M., Kao K.N., Harvey B. L., Rossnagel B.G. Screening salt-tolerant barley genotypes via F1-anther culture in salt stress media.// Theor. Appl. Genet., 1987, V. 74. P. 426-429.

227. Zagorska N., Shtereva L., Dimitrov В., Kruleva M., Induced androgenesis in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). I . Influence of genotype on androgenetic ability. // Plant Cell Reports. 1998. V.17. P. 968-973.

228. Zhang Y., Abdulnour J.E., Donnelly D.J., Barthakur N.N. "Norland" tuber yields are not affected by salinity treatment of parent.// HortScience, 2001. V.36. № 4. P. 770-771

229. Zheng K.L., Castiglione S., Biasini M. G. et. al. Nuclear DNA amplification in cultured cell of Oryza sativa.ll Theor. and Appl. Genet. 1987. V.74. P. 65-70.

230. Zorinyants S.E., Nosov A.V., Badaeva E.D., Smolenskaya I.N., Badaev N.S. Cytogenetic analysis of a long-term Triticum timopheevii (Zhuk.) Zhuk.cell suspension culture.//Plant Breedg. 1995. V.l 14. № 3. P. 219-225.

Информация о работе

Кузнецова, Оксана Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы