Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция морфогенеза в культуре ткани кукурузы in vitro

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция морфогенеза в культуре ткани кукурузы in vitro"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи Хиккадуве Виданаралалаге Салия ДИАС

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ КУКУРУЗЫ IN VITRO

»Специальность 03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА и в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Научные руководители — д. б. п., акад. РАСХН В. С. Ше-велуха, кандидат биологических наук, с. п. с. Ю. И. Долгих.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, в. н. с. В. В. Мазин, кандидат биологических наук, с. н. с. Г. В. Рассадина.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет, биологический факультет.

¿'"О

Защита состоится апреля'1994 г. в 14- на засе-

дании специализированного ученсэго совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан << IЬ» марта 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета —

кандидат биологических наук у л п

О/, /////7 , А. С. Лосева

Актуальность проблемы. Сочетание биотехнологических и традиционных методов селекции позволяет ускорить и облегчить получение новых сортов сельскохозяйственных- растений. Однаюз применение методов клеточной и генной инженерии часто лимитируется невозможностью регенерировать растения из перспективных клеточных культур. У кукурузы высокая эффективность морфогенеза in vitro показана для нескольких линий, как правило, не имеющих коммерческого значения, в то время как большинство практически ценных линий и гибридов имеют низкую способность к регенерации растений.

Известно, что морфогенетический потенциал культивируемых 'клеток кукурузы определяется их генотипом, а также видом тканей, из'которых, получен каллус, и условиями культивирования. Исходя их существования физиологической и генетической регуляции морфогенеза, предложено два основных способа повышения частоты регенерации. Первый основан на эмпирическом подборе питательных сред и условий выращивания клеток in vitro для каждого индивидуального генотипа. Второй направлен на изменение генотипа растения, от которого получают культуру клеток. Он предусматривает гибридизацию практически ценных, но низкоморфогенных линий с формами, обладающими высокой способностью к регенерации растений. Естественно, е этом случае требуется проведение серии возвратных скрещиваний с исходной родительской формой для сохранения генов, обуславливающих хозяйственную ценность линии.

Важно оценить, который из двух путей может обеспечить максимальное число регенерантов у широкого круга линий и гибридов кукурузы.

Цели и задачи исследования. Целями данной работы было оценить вклад генотипа и физиологических факторов в регуляцию морфогенеза in vitro и рекомендовать оптимальную стратегию регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы.

Для достижения поставленных целей было необходимо выполнить следующие задачи:

1) выбрать линии кукурузы, имеющие существенные генетические различия по способности к морфогенезу in vitro;

2) сравнить роль генотипа, эпигенетического состояния экспланта и физиологических регуляторов в формировании эмбрио-генного каллуса;

3) оценить вклад генотипа, компонентов питательной среды и

- г -

условий культивирования в регуляцию регенерации растений из эмб-риогенного каллуса;

4) разработать практические рекомендации для повышения частоты регенерации у коммерческих линий и гибридов кукурузы.

Научная новизна работы. Показано, что регуляция двух этапов морфогенеза - образования эмбриогенного каллуса и регенерации растений, осуществляется разными путями. На стадии индукции, каллуса доминирующим является влияние генотипа, на стадии регенерации более значительную роль играет физиологическая регуляция. Впервые обнаружено, что препарат грибного происхождения эмистим является стимулятором морфогенеза у кукурузы.

Практическая ценность работы. Разработаны практические рекомендации для повышения регенерационной способности линий и гибридов кукурузы с низким морфогенетическим потенциалом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

1) II Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993 г.;

2) научной конференции в МСХА;

3) заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА;

4) расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, . обзора ■ литёратуры, экспериментальной части, включающей методический'-ра^дел, . результаты и обсуждение, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на страницах текста, содержат Ютаблиц, /Зрисунков и фотографий.1 Библиография содержит (А^кстоЧНЙКов отечественной и зарубежной' литературы.

: ; I ■ '

•ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I1

работе были использованы 9 линий кукурузы, из них 6 амери-•канских: А188, А344, А654, \JA01, V®, В73, и 3 линии селевдии 'Краснодарского НИИ сельского хозяйства: Гк26, Гн83 и Гн86. Все использованные линии характеризовались высокой степенью инбридинга (не менее 10 поколений самоопыления). В каждом опыте линия была представлена 6-10 растениями.

Растения выращивали в поле или в сосудах в теплице с режимом

25±2 С и 16-часовой длиной светового дня. Для получения семян делали самоопыление со строгой изоляцией мужских и женских соцветий.

Получение и культивирование каллуса. Каллус получали из незрелых зародышей, выделенных на 11-13 день после опыления. Если на растении было несколько початков, зародыши выделяли только из верхнего. Вычлененные зерновки стерилизовали О,IX раствором сулемы в течение 20 минут и затем триады промывали стерильной дистиллированной водой. Зародыши, выделенные их зерновок в лами-нар-боксе, помещали щитком вверх на агаризованную среду в чашки ' Петри.

' Для индукции и поддержания каллуса использовали среду Му-расиге-Скуга (МС) [МигазМге, Бкоог,1962] с 500 мг/л гидролизата . казеина, 30 г/л сахарозы и 1 мг/л 2,4-Д (стандартная среда). В отдельных опытах среда содержала также 17 мг/л АдШ5, или вместо 2,4-Д были добавлены 4 мг/л дикамбы (3,6-дихлор-о-анисовая кислота) или 1 мкг/л эмистима (биостимулятор грибного происхождения). - •

Каллус пассировали каждые 3 недели, используя в качестве инокулята только эмбриогенный каллус. Клетки выращивали при температуре 26 *С, влажности 707., освещенности 3000 лк при длине светового дня 16 часов.

Регенерация растений. Кусочки каллуса с зачатками побегов переносили на среду МС без гормонов. Укоренение развившихся побегов проводили на среде без гормонов и витаминов, содержащей половинную концентрацию солей по МС, и 1 г/л сахарозы. Укоренившиеся растения переносили в почву.

Температурный стресс. Свежеизолированные зародыши инкубировали на стандартной среде при 37 *С в течение 2 дней, затем чашки Петри с зародышами переносили в обычные условия культивирования.

Элект'ростимуляция. Через каллус, помещенный на стандартную питательную среду в специальные сосуды с.электродами, пропускали постоянный электрический ток силой 2 мкА непрерывно в течение месяца. Опыты проводили в трехкратной повторности, каждая пов-торность включала по 15 инокулюмов на вариант.

Цитологический анализ. Эмбриогенный каллус фиксировали в спирт-уксусной кислоте (3:1). Размеры клеток определяли под микроскопом на давленных препаратах, окрашенных 2% ацеторсеином, с помощью окуляр- и объектмикрометра. У каждой линии анализировали

1500-2000 клеток.

Статистическая обработка. В работе приведены средние величины между показателями отдельных растений или мевду повторностями со стандартной погрешностью. Достоверность разницы мевду вариантами определена по критерию Стьюдента (Рокицкий, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Регуляция индукции эмбриогенного каллуса

Процесс морфогенеза в культуре тканей кукурузы можно разделить на два этапа: индукция эмбриогенного каллуса и регенерация растений из заложившихся проэмбриональных структур.

В зависимости от генотипа исходного растения, стадии развития, состава питательной среды и условий культивирования, изолированные незрелые зародыш кукурузы в условиях in vitro образуют два типа каллуса: эмбриогенный- и неэмбриогенный [Green, Phillips, 19751.

Для оценки роли генотипа было взято 9 линий кукурузы и, после определения способности к образованию эмбриогенного каллуса, из них выбрано четыре, различающиеся в стандартных условиях по зтому признаку. Доля эксплантов, формирующих эмбриогенный каллус, составила для линии А188 около 60% (высокоэмбриогенная), для линии А344 - около 4QX (среднеэмбриогенная), для линии VD -около 20% и для линии Гк26 -IX (низкоэмбриогенные).

Для определенияiроли физиологических факторов в регуляции каллусогенеза у выбранных линий анализировали влияние на частоту образования эмбриогенного каллуса состояния экспланта, и кокшо-нентов питательной среды. !

I

i:

I.i. Влияние эпигенетического и физиологического состояния'

экспланта

Каждая из использованных в работе линий была представлена несколькими растениями, л способность к образованию эмбриогенного каллуса учитывалась для каждого растения отдельно. Из одного початка высаживали от 30 до 100 зародышей. Показано, что индиви-

дуальные растения одной линии существенно различаются: внутрили-нейный полиморфозм по частоте каллусогенеза достигал 257. (Рис. 1). Лучшие растения менее эмбриогенной линии имели такой же морфогенетический потенциал, как худшие растения более эмбриогенной линии. Тем не'менее, средние значения морфогенетического потенциала высоко-, средне- и низкоэмбриогенных линий существенно различались, статистическая обработка подтвердила достоверность этой разницы (Р<0,05). Частота образования эмбриогенного каллуса у линии Гк2б была так низка (менее 2%), что не дала возможности оценить различия между индивидуальными растениями.

Существование внутрилинейного полиморфизма по способности образовывать эмбриогенный каллус отмечали и другие авторы ( [Bartkowiak, 1983]. Скорее всего это связано не с генетическими различиями, так как тестированные линии были инбреднымн. Кроме того, в наших экспериментах даже в пределах одного початка разница в способности к формированию эмбриогенного каллуса у зародышей, изолированных из верхней, средней и нижней частой початка, достигала 30X.

Морфогенетический потенциал клеток, их компетентность к индукции внешними регуляторами, определяется эндогенным уровнем гормонов. В то же время, известно, что содержание и соотношение гормонов быстро меняется по мере развития зародыша [Carnes, Wright, 1988]. -Вероятно, индивидуальные физиологические различил между растениями, следствием которых является разная скорость развития зародышей на початке, могут быть причиной и неодинаковой спосбности к каллусогенезу. Учитывая существование внутрилинейного полимирфиэма, следует для характеристики эмбриогенного потенциала той или иной линии анализировать не одно,а несколько растений.

Способность к образованию эмбриогенного каллуса незрелыми зародышами зависит от стадии их развития. Если судить о стадии развития по размеру, то наибольшей компетентностью к каллусогенезу обладают зародыши длиной 1-2 мм [Каш et al., 1985]. Желая добиться максимальной реализации потенции к морфогенезу у анализируемых генотипов, мы расширили исследуемый интервал, однако зародыши, менее 1 мм, как правило, погибали при изоляции, а заро-. дыши более 3 мм прорастали без образования каллуса Для всех тестированных линий оптимальным было использование для каллусо-■ генеза зародышей размером 1,5 мм (Табл.1). Выяснилось, что чем

Рис. 1 - Внутрилйнейный полиморфизм по частоте образования змбриогенного каллуса

X Эксплантов, образулдюс эмбриогенный каллус

80

1 »

Индивидуальные растения

-А188

А344

\Л/й

Средний эмбриогенный потенциал линии

- ? -

выше змбриогенный потенциал линии, тем шире интервал, внутри которого незрелые зародыши могут образовывать змбриогенный каллус. Так-у линии Л188 зародыши длиной от 1 до 2,5 мм формировали змбриогенный каллус с приблизительно одинаковой частотой. У линии А344 оптимальный интервал сузился до 1-2 мм, а у линии ТО использование зародышей больше или меньше 1,5 мм приводило к снижению змбриогенного потенциала.

Табл. 1. Влияние размера зародыша на частоту образования змбриогенного каллуса

Линия Размер Число Число зародышей', 7. зародышей,

зародыша посаженных . образовавших образовавших

зародышей эмбр. каллус эмбр. каллус

А188 3,0 54 17 31

2,5 47 23 48

2,0 60 31 - . 51

1,5 82 40 ' 55

1,0 65 32 49

А344 2,5 54 12 18

2,0 167 55 ■ 25

1,5 183 47 32

1,0 64 17 24

V® 2,0 12 2 16

1,5 36} 17 21

1,0 30 '5 .16

Полученные результаты позволяют сказать, что физиологическое состояние исходного экспЛанта сильно влияет на частоту образования морфогенного каллуса кукурузы. Однако в тех случаях, когда используются зародыши на оптимальной стадии развития, на первый план выходят генетические различия между линиями.

I . 2 Влияние компонентов питательной среды

Наряду; с физиологическим состоянием экспланта, большое значение для образования эмбриогенного каллуса имеют компоненты питательной среды, особенно фитогормоны. Поэтому каллусообразова-тельная способность исследуемых линий кукурузы была проверена на фоне сред с разными регуляторами роста: 2,4-Д, 2,4-Д + ингибитор физиологического действия этилена AgNOs, дикамба и эмистим.

Известно, что этилен является ограничивающим фактором при индукции эмбриогенного каллуса [Songstad et al., 1988]. Культивирование изолированных зародышей на среде с нитратом серебра по сравнению с вариантом, содержащим только 2,4-Д, примерно на 207. повышало частоту образования эмбриогенного каллуса у линий А188 и А344. Для линии Гк26 среда с AgN03 была единственной, на которой удалось получить эмбриогенный каллус. В то же время у линии WD отмечено лишь слабое недостоверное повышение морфогенети-ческого потенциала (Табл.2). Неодинаковая реакция генотипов на добавление в среду нитрата серебра, возможно, объясняется различным уровнем синтеза этилена у исследуемых линий. Отсутствие реакции на AgNOs у линии VD, вероятно, указ^ьсз^ет, 'что не этилен является причиной низкого эмбриогенного по^ен&йла данной линии.

Использование в питательных средад ^ . .качестве регулятора роста дикамбы позволило значительно'расширить круг генотипов, способных к регенерации -рутений из /Культивируемых клеток [Duncan et al. ,1985]. Одракод наших бПытах замена 2,4-Д на ди-' камбу оказалась эффе.ктивной'.'тоЛько для линии А344, ¡которая сравнялась с линией А188 по '"частоте образования эмбриогенного 1сал-луса. На морфогенетичёсКИй потенциал низкоэмбриогенных линий ди-камба не оказывала положительного влияния (Табл.2). ;

Эмистим ранее 'не'''использовался в качестве регулятора роста при "Индукции1 кайАуса кукурузы. Добавление его в питательные jcpe-ч'Ды'йля'линйй А188 'й А344 не привело к повышению частоты индукции 'Зюриогёййого каллуса (Табл. 2).

Результаты проведенных опытов показывают, что норма реакции 'генотипов проанализированных линий по признаку "формирование эм-'бриогенного каллуса" достаточно широка. Она позволяет, варьируя условия культивирования незрёлых зародышей и состав питательной среды, повышать" морфогенетический потенциал средне-эмбриогенных

линий до уровня высокоэмбриогенных. Однако в отношении низкоэмб-рногенных линий физиологическая регуляция не была эффективной.

Табл. 2. Влияние регуляторов роста на частоту образования эмбри-огенного каллуса

Линия Регулятор роста Число посаженных зародышей Число зародышей, образовавших эмбр. каллус % зародышей, образовавших эмбр. каллус

А188 2,4-Д 74 45 60,8 ± 5,7

2,4-i+AgN0, ' 75 62 82,6 i 4,4

дикамба 99 62 62,6 + 4.8

эмистим 39 13 33,0 ¿3.2

А344 2,4-Д 139 57 41.0 ± 4,1

2,4-fl+AgNQj 131 81 61,8 ± 4,2

дикамба 135 91 67,4 + 4,0

эмистим 34 16 ' 47,5 ± 3.0

WD 2,4-Д 181 42 23,2 ± 3,0

2,4-Д+АгШ3 61 16 26,2 ± 5,6

дикамба 29 7 24,1 ± 7.S

эмистим 48 10 20.3 i 3,4

Гк2б 2,4-Д 45 0 0,0

2,4-Д+АдШ5 167 3 1,8 ± 1,0

дикамба 140 0 0,0

II. Регуляция регенерации растений из гяйрютсшгаго iгаллуса

Эффективность регенерации растений не всегда положительно коррелирует с частотой образования эмбриогенного каллуса LNovak et al. ",19883. Поэтому необходимо было сопоставить роль генотипа, эпигенотипических особенностей и физиологических регуляторов на втором этапе морфогенеза, то есть на стадии регенерации растений из проэмбриональньи структур. Для анализа были взяты линии А188.

А344 и Ш, четко различающиеся по частоте индукции эмбриогенного каллуса.

11.1. Влияние состояния экспланта.

Каллус, сформированный эксплантами каждого растения кукурузы, культивировали отдельно, что позволило оценить число регене-рантов, полученных от индивидуального донорного растения. Оказалось, что регенерационный потенциал каллуса от отдельных"растений одной линии сильно различается. Число регенерантов, приходящееся на одно донорное растение, варьировало от 12 до 70 для линии А188, от 12 до 79 для линии А344 и от 0 до 15 для линии № (Рис.2). Различия по способности к регенерации между индивидуальными донорными растениями одной линии значительно превосходили меклинейные различия; В пределах одпий ли;;;:;; большее чиопп 'регене рантов, как правило, было получено от тех растений, которое продуцировали больше эмбриогенного каллуса. (Рис 2а) бднако, ес5Ш сравнивать число регенерантов, отнесенное к числу экспланто'в, сформировавших эмбриогенный каллус, такая корре'йцйя'отсутствуете Рис 26).

11з трех проанализированных линий наиббльше'й эффективностью регенерации обладала линия А344, которая бУла'-дреЩгёй по частоте каллусогенеза. Ранее высказывалось "Пре'дЪаю'жёнйе -о различных путях регуляции индукции эмбриогенного 'каллуса Ча ¡дальнейшего развития эмбриоидов в растения' СНоЙ^оз ¿1 а'1. , 4985]. Полученные данные дают экспериментальное ' Ьод^вйрждой1е этой гипотезы.

/. ' : I. ; I

' II. 2. : Влияние1 компонентов'я^а^еШгой среды ! ! ;

Для ьШЬлёНИк условий, способствующих максимальной реализации 'регёнерЙЦиднйого потенциала исследуемых линий кукурузы, рыли испытаны среды, содержащие физиологические регуляторы, уже применявшиеся при индукции эмбриогенного каллуса: АеИО^ в сочетании с 2,4-Д, дикамба и эмистим. Морфогенетическая реакция на АёН03 и дикамбу зависела от генотипических особенностей. У линии А188 и А344 постоянное культивирование на среде с нитратом серебра приводило к снижению числа регенерантов. У линии V® АеМОз,наоборот, увеличивал количество регенерированных растений (Табл.3).

-//1 Рис. 2- Частота образования змбриогенного каллуса и регене-; - рации у индивидуальных донорных растений кукурузы.

X Эксплантов, образующих Число растений

эмбриоген. каллус регенерантов

А188 А344 WD

1- Эмбриоген. каллус 2- Число растений

% Эксплантов,образующих Сред. Число регенерантов

эмбриоген. каллус на экоплант

1- Эмбриоген. каллус 2- Сред, число реген. на эксплант

Табл. 3. Влияние регуляторов роста на частоту регенерации растений из эмбриогенного каллуса

Линия Регулятор Число Число Число регенерантов

роста эксплантов регенерантов на эксплант

2,4-Д 74 56 1,26 ± 0,06

А188 2,4-Д+АдШ3 75 65 1,06 ± 0,03

Дикамба 99 103 1,68 * 0,10

Эмистим 39 45 3,50 ± 0,21

2,4-Д 139 84 1,47 ± 0,07

А344 2,4-Д+АеШ5 131 108 1,33 * 0,06

Дикамба 135 133 1,47 ± 0,07

•Эмистим 34 73 4,56 ± 0,69

2,4-Д 181 19 0,48 4 0,01

V® 2,4-Д+АгМ)3 61 24 . 1,51 * 0,11

Дикамба 29 12 1,72 ± 0,20

Эмистим 48 26 2,71 ± 0,31

Применение дикамбы дало положительный эффект также только для линии МХ Интересно, что дикамба не стимулировала индукцию эмбриогенного каллуса у этой линии. У линии А344 дикамба, напротив, усиливала каллусогенез, но не влияла на выход растений-ре-генерантов (Табл. 3). Это также свидетельствует о разных механизмах регуляции двух этапов морфогенеза: индукции эмбриогенного каллуса и регенерации растений.

Применение таких регуляторов роста, как АдШ, и дикамба, позволило линии Ш по числу регенерантов на исходный эксплант сравняться с высоко- и среднеморфогенной линиями А188 и А344 и даже немного опередить их.

В отличие от нитрата серебра и дикамбы, эмистим стимулировал регенерацию растений у всех проанализированных линий, при этом частЬта регенерации возрастала в 2,5-5 раз по сравнению со стандартной средой (Табл.3).

Согласно полученным результатам, замена 2,4-Д'другими регуляторами роста сильно влияет на эффективность регенерации расте-

ний из эмбриогенного каллуса. Различия, обусловленные компонентами питательной среды, превосходят различия между генотипами.

II. 3. Влияние температурного стресса. ,;

При индукции каллуса из незрелых зародышей фактором, уменьшающим частоту каллусогенеза и, следовательно, число расте-ний-регенерантов, является прорастание изолированных и помещенных на питательную среду зародышей. Мы предприняли попытку блокировать прорастание зародышей с помощью температурного стресса. Оказалось, что инкубация изолированных зародышей кукурузы линий А188 и А344' при 37*0 не повысила частоту образования эмбриогенного каллуса. Однако полученный каллус обладал большим регенера-ционным потенциалом по сравнению с каллусом, образованным эксплантами, не прошедшими температурную обработку. Если в контроле было получено в среднем 1,26 и 1,47 растений на один зксплант, соответственно для линий А188 и А344, то после температурного стресса среднее число растений увеличилось до 2,40 и 2,76 на зксплант. Интересно, что температурный стресс подействовал не на индукцию каллуса, а на отстоящий во времени процесс регенерации растений. Возможно, часть зародышей погибла при 37*0 и поэтому не смогла принять участие в образовании каллуса. Однако выжившие зародыши сформировали каллус с повышенным числом эм-бриогенных зон, которые в подходящих условиях дали начало большему числу растений-регенерантов. .

Использование температурной обработки не изменило соотношения двух тестированных генотипов по частоте регенерации: как и в контрольных условиях змбриогешшй- каллус линии А344 обладал большим регенерационным потенциалом, чем аналогичный 1саллус линии А188.

II. 4. Цитологический анализ эмбриогенного каллуса

Для того, чтобы понять причины разной регенерационной способности линий А188, А344 и был проведен цитологический анализ эмбриогенного каллуса.

Как выяснилось,каллус кукурузы состоит из клеток нескольких

тилов. Наряду с мелкими, овальными, с густой цитоплазмой клетками, отнесенными нами к меристематическому типу, присутствовали более крупные, вакуолизированные клетки и гигантские клетки вытянутой или округлой формы с большими вакуолями и крахмальными и жировыми включениями. Размеры клеток варьировали от 20 до 200 мкм. Для характеристики линий кукурузы мы разделили клетки по размеру на три класса: мелкие меристематические (менее 30 мкм), промежуточные по размеру клетки переходного от меристематическо-. го к ларенхимному типу (от 30 до 60 мкм) и крупные клетки парен-химного типа (более 60 мкм).

Каллус линии А188 состоял, в основном, из мелких клеток ме-ристематического типа, доля крупных клеток составляла менее 5%. Каллус линии А344 включал больше крупных клеток (26%) и меньше клрток меристематического типа (60,6%). У линии WD лишь половина каллусных клеток могла быть отнесена к меристематическому типу и столько же клеток имело диаметр более 60 мкм. Таким образом, несмотря на одинаковую морфологию змбриогенного 1шллуса, ткани тестируемых линий различались по клеточному составу.

Цитологический анализ выявил противоречие между долей ме-ристематических клеток в каллусе и частотой регенерации. Так каллус линии А188 содержит почти исключительно клетки меристема-. тического типа, но по числу растений-регенерантов уступает куль- тивируемым тканям линии А344, у которой мелкие клетки составляют только 60% от общего количества Возможно, в ¡саллусе А188 формируется больше проэмбриональных структур, но не все они способны в данных условиях развиваться в растения.

Известно, что слабый электрический ток, пропущенный через каллус, увеличивает частоту регенерации растений. При этом ток действует только на компетентные к морфогенезу клетки [Китлаев и др., 1993]. Поэтому можно было предположить, что электрообработка стимулирует к развитию заблокированные проэмбриональиые структуры в каллусе линии А188.

II. 5. Влияние электрического тока

Кусочки змбриогенного каллуса одинаковой массы подвергали действию электрического тока и в конце пассажа учитывали индекс ■ роста каллуса и число образовавшихся побегов. У линии А188 число образовавшихся из каллуса побегов увеличилось под действием тока

в 2,5 раза У двух других линий стимуляция побегообразования не превышала 20% (Табл.4). Эти данные подтверждают высказанное ра-

Табл. 4. Влияние электрического тока на рост каллуса и побегообразование

Линия Индекс роста каллуса Средн. число побегов на экспл.

контроль опыт X к контр. контроль опыт % к конролю

А188 11,5 23,9 219 ± 24 1,20 2,83 261 ± 30

А344 8,8 25,6 265 ± 31 1,98 2,25 119 ±. 17

V® 2,0 14,3 783 ± 109 1,93 1,45 118 ± 8

нее предположение о существовании блока развития прозмбриональ-ных структур у линии А188. В каллусе А344 и № большинство про-эмбрио развивается в обычных условиях, поэтому электрообработка не вызвала усиления регенерации. Если сопоставить число растений- регенерантов у тестируемых линий после действия тока, когда их морфогенетический потенциал реализован полностью, с долей ме-ристематических клеток в каллусе, будет получена прямая зависимость (Табл.5).

Обработка электрическим током, помимо стимуляции побегообразования, значительно усиливала рост каллуса. Масса эмбрйогенного каллуса увеличивалась у линий А188 и А344 в 2-2,5 раза, а у линии № - почти в 8 раз. Поскольку число регенерантов, которое может быть получено, часто бывает пропорционально массе эмбрйогенного каллуса, ускорение роста культивируемых тканей может иметь большое значение для низкоэмбриогенных линий.

II. 6. Жизнеспособность растений-регенерантов

Условия культивирования каллусных тканей и регенерации растений часто влияют на жизнеспособность растений-регенерантсв.

Табл.5. Доля меристематических клеток и частота-регенерации из обработанного электрическим током каллуса кукурузы

Линия Доля меристематических Среднее число побегов

клеток, 7. на эксплант

А188 86,3 ± 3,4 2,83 ± 0,32

А344. 60,0 ± 4,8 2,25 ± 0,13

WD 47,7 ± 4,9 1,45 ± 0,09

Поэтому выбор наиболее эффективной системы регенерации должен основываться на количестве выживших после пересадки в почву и нормально развивающихся растений, а не на данных in vitro.

По 30 растений, полученных из каллуса, выращенного в различных условиях, переносили в почву и оценивали их выживаемость и морфологию. Было определено, что регенеранты из"каллуса, культивировавшегося на среде с 2,4-Д, выдерживали пересадку в почву почти в 100Z случаев. Использование сред с нитратом серебра, ди-камбсй и эмистимом, а также температурный стресс приводили к снижению жизнеспособности растений-регенерантов на 15-30Z (Табл. 6). Показатели выживаемости были сходными у трех анализируемых линий кукурузы. Все выжившие растения имели нормальную морфологию и успешно развивались.

Из приведенных данных видно, что культивирование каллуса на среде с эмистимом обеспечивает максимальный выход жизнеспособных растений для всех тестируемых линий кукуруза

Табл. 6. Влияние условий выращивания каллуса на выживаемость растений-регенерантов

Линия Вариант среды и условия культивирования Ср. число регенерантов на эксплант Ср. число выживших в почве растений на эксплант Выживаемость, 7.

2,4-Д 1,26 • 1,26 100

2,4-Д + АеШ3 1,06 0,76 71

А188 Дикамба 1,68 1,46 87

Эмистим 3, БО 3,03 86

Темп, стресс 2,40 1,67 69

Электр, ток 2,83 2,75 97

2,4-Д. 1,47 1,43 97

2,4-Д + АеЮ, 1,33 0,87 65

А344 Дикамба 1,47 1,02 69

Эмистим 4,56 3,68 ' 80

Темп, стресс 2,76 2,03 73

Электр, ток 3,20 2,72 85

2,4-Д 0,48 0,45 94

2,4-Д + АгШ3 1,51 1,00 66 '

V® Дикамба 1,72 1,41 82

Эмистим 2,71 2,15 79

Темп, стресс 1,20 0,92 .76

Электр, ток 1,83 1,75 94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ роли генотипа и физиологических факторов

линий и гибридов.

Основываясь на данных о значительном внутрилинейном полиморфизме по способности к регенерации, следует брать экспланты для получения каллуса с возможно большего числа исходных растений.

Наилучшей средой для индукции каллуса является среда MC, содержащая в качестве регуляторов роста 2,4-Д и AgNOs.

В том случае, когда доля зародышей, формирующих эмбриогенный каллус, выше 10%, можно рассчитывать на получение достаточного количества каллуса для проведения клеточной селекции и успешную регенерацию растений. Если морфогенетический потенциал линии меньше 10%, вероятность получить каллус с достаточной регенера-ционной способностью, используя физиологические регуляторы, очень мала. Для таких генотипов кукурузы лучше.использовать гибридизацию с линиями-донорами высокой способности к морфогенезу in vitro.

Длительное сохранение каллусом способности к регенерации растений обеспечивается частым суокулыиькрова:;;:с»: :: использованием в качестве инокулюма для следующего пассажа только эмбрио-генного каллуса Воздействие слабым электрическим током способствует росту эмбриогенного каллуса и может быть очень полезным для наращивания массы клеток низкоэмбриогенных линий.

Культивирование каллуса на среде с эмистимом способствует получению наибольшего количество жизнеспособных растений-регене-рантов.

Использование такой схемы индукции каллуса и регенерации растений позволяет получать в течение полугода на каждые 100 изолированных зародышей промерно 250 растений для линии А188, 150 растений для линии А344 и 50 регенерантов для линии VD. Увеличение продолжительности культивирования каллуса дает возможность регенерировать дополнительное количество растений., \

ВЫВОДЫ

1. При анализе регуляции морфогенеза в культуре ткани кукурузы in vitro показано, что на стадии индукции эмбриогенного каллуса доминирующее влияние оказывает генотип. На стадии формирования растений из проэмбриональных структур большее значение имеет физиологическая регуляция.

2. Показано, что регенерационная способность зависит от физиологического и эпигенетического состояния экспланта. Обнаружено, что индивидуальные растения одной инбредной линии различались по способности к индукции эмбриогенного каллуса в 1,3 раза, а по

■ числу регенерантов на эксплант - в 10 раз.

3. Добавление нитрата серебра в среду для получения культуры клеток на ZOZ увеличивает частоту образования эмбриогенного каллуса у лини^А188 и А344 с высоким и средним змбриогеннм потенциалом, тогда как линия WD с низкой способностью к каллусогенезу оказались нечувствительной к физиологической регуляции.

4. Использование нового регулятора роста эмистима повысило частоту регенерации растений из -эмбриогенного каллуса всех проанализированных линий кукурузы в 2-6 раз.

5. Слабый постоянный электрический ток стимулирует рост каллуса и морфогенез, при этом величина стимуляции зависит от гено-типических особенностей клеток.

Работы, опубликованных по теме диссертации

1. Диас С., Долгих Й1 И. , Шевелуха В. С. Взаимодействие генетической и физиологической регуляции морфогенеза в культуре Tica-ней кукурузы in vitro. / Тезисы докладов II Всероссийского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993.

2. Диас С., Долгих Е И. , Шамина 3. Б., Шевелуха В. С. Роль физиологических и генетических факторов в индукции эмбриогенного каллуса у разных линий кукурузы. / Доклады РАСХН, 1994, N 2.