Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическая и генетическая регуляция морфогенеза и регенерации кукурузы IN VITRO

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологическая и генетическая регуляция морфогенеза и регенерации кукурузы IN VITRO"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК / 3 МАЯ 19Ф&ЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ 1IM. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

БОГУНОВА Валентина Георгиевна

«ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ II ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА II РЕГЕНЕРАЦИИ КУКУРУЗЫ IN VITRO».

03.00.12 — физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнила I! Институте физиологии растений имени К. Л. Тимирязева РАН.

Научный руководитель: доктор биологических паук 3. Б. ШАМИПА

Официальные оппонент ы: доктор биологических наук В. В. МАЗИН, кандидат биологических наук И. Д. НИКИФОРОВА

Ведущее учреждение: Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра физиологии растений.

Защита состоится >>................1993 года в 10 часов

па заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 002.45.01) в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: Москва, И-276, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан ...........1993 г.

Ученый секретарь Специализированного сонета, кандидат биологических паук

Л. И. СЕРГЕЕВА

Актуальность проблемы.

■Культивирование клеток растений в условиях in vitro - та область биологии, которая может иметь большое значение для теоретических и прикладних исследований. Системы культивируемых клеток позволяют изучать физиолого-биохимические и генетические аспекты роста и развития растений, регуляцию метаболических процессов, механизмы устойчивости к стрессам и др. -Создание клеточных технологий дает возможность получения ряда важных продуктов растительного происхождения, позволяет создавать генетически-из-мененные формы растений, ускорять размножение новых сортов.

Практическое использование культуры меток in vitro определяется двумя особенностями., культивируемых клеток растений: во-первых, способностью к'дедифференцировке и образованию клеточной массы с сохранением'биосинтетического потенциала вида и, во-вторых, возможностью реализации тотипотентности и регенерации растения от индивидуальной измененной клетки (Вутенко Р. Г. ,1974).

При культивировании клеток растений в процессе дедифференци-ровки < образуются гетерогенные клеточные популяции, которые характеризуются высокой степенью изменчивости (Шамина 3. Б. , 1970, 1988). Многие типы генетической изменчивости в клетках каллусной ткани могут реализоваться в растениях-регенерантах и в некоторых случаях наследоваться в их потомстве. Такое явление было названо сомаклональной вариабельностью (Larkin P.J. .Scowcroft W.R. ,1981). Все это делает систему "растение - клетка in vitro - растение" хорошей моделью для изучения возможностей контроля программы развития и закономерностей реализации'Измененной in vitro наследственной информации в растениях-регенерантах. На этой основе создается возможность поиска и отбора новых форм растений с определенными свойствами, что очень важно при решении некоторых селекционных проблем, в том числе и для кукурузы - одной из важнейших зерновых культур в мире.

Для работы с кукурузой на клеточном уровне необходимо, во-первых, изучение основных характеристик морфогенеза in vitro, что позволит оптимизировать процесс регенерации и, во-вторых, исследование ряда поколений сомаклональных вариантов, что дает возможность прогнозировать наследование измененных in vitro признаков.

- 4 -

Цель и задачи исследования.

Целью работы является изучение вклада физиологических и генетических факторов в системе морфогенеза кукурузы In vitro.

Были поставлены следующие задачи:

- изучение влияния различных условий на процессы дедифферен-цировки ряда генотипов кукурузы;

- изучение генетической регуляции морфогенеза in vitro-,

- получение сомаклональных вариантов кукурузы;

- выявление общих закономерностей наследования в популяции сомаклональных вариантов.

Научная новизна работы.

Оптимизированы условия для максимальной реализации морфоген-ного потенциала кукурузы. Показано соотношение физиологических и генетических факторов в регуляции каждого этапа системы "растение - клетка in vitro - растение". Доказана генетическая регуляция соматического эмбриогенеза, выявлен цитоплазматичеекий инги-бирующий фактор и показана его локализация в митохондриальноы геноме. Предложена система анализа измененных in vitro признаков в последовательных поколениях сомаклональных вариантов. Показана значительная изменчивость по'признака», определяющим урожай.

Кратэтеская ценность работы.

Разработана система регенерации кукурузы, которая может быть использована для получения генетически-измененных растений. Выделенные сомаклоналыше варианты кукурузы линии 346 предложены для включения в селекционные программы.

Агфобацкя работу^

Материалы диссертации долокены на:

1. 2 Всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (г. Ленинград, 1986 г.).

2. 5 Огеоде ВОГИС (г.Москва, 1987 г.).

3. Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (г. Новосибирск, 1988 р.).

4. Всесохеной конференции по генетике соматических клеток в-культуре, посвященной памяти 1L И. ИЬпиро (г.Звенигород, 1989 г.).

° - 5 :

5. 7 Международном конгрессе по культуре ткани (г. Амстердам, 1990 г.).

6. Расширенном семинаре отде-ла биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН им. 11 А.Тимирязева (г.Москва, 1991 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы из 157 наименований и приложения из- 7 таблиц и 1 рисунка. Диссертация изложена а 132 страницах, содержит 25 таблиц, 3 фотографии, 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовались инбредные линии кукурузы мировой [ AI88, А334, А344, А619, В73, F2, F7, W8, С123 ] и отечественной [ (RD3)4Т-412, (0W) 1Т-513, ДК66, ДЭЗ, 346, 6124-5-6 ] селекции. Семенной материал был предоставлен лабораторией генетики НПО по кукурузе "Днепр" (зав. лаб. д. б. н. Гонтаровский В. А.).

Влияние ряда факторов на основные этапы культивирования in vitro и отработка системы регенерации изучалась на трех инбред-ных линиях:

AI88 - американского происхождения; Эта линия практически не используется в селекции в связи с её сильной поражаемостью пузырчатой и пыльной головнёй, однако она признана лучшим генотипом для получения эмбриогенной каллусной ткани, её поведение in vitro детально изучено и описано (Green С. Е. , Rhodes С. А. , 1982; Кал» К. К. et al. , 1985).

346 - является аналогом американской инбредной линии А654. ■ Это - среднеранняя линия, обладающая высокой устойчивостью к полеганию и ломкости стебля, пузырчатой, и пыльной головне. На её основе получен гибрид "Славутич".

ДК66 - инбредная линия селекции НПО по кукурузе "Днепр" ■ (г.Днепропетровск). Получена на основе американской линии А619 и линии отечественной селекции 6124-5-6. Линия среднеранняя, засу-

хоустойчивая, среднехолодостойкая. Высокоустойчива к полеганию и ломкости стебля, пузырчатой и пыльной головне. Также использовалась для получения гибрида "Славутич".

В экспериментах использовали несколько вариантов эксплантов: незрелые зародыши, мезокотиль, мезокотиль+вдток, гипокотиль, корни, щиток зрелого семени, зрелые семена.

Для выделения незрелых зародышей из початков на 13 день после опыления вычленялись семена и стерилизовались 0.1% р-ром дио-цида. В стерильных условиях выделялись зародыши 1-2 мм длиной.

Для выделения мезокотиля, гипокотиля и корней семена стерилизовались О. IX раствором диоцида и проращивались при 27-28 С, 16-ч фотопериоде в течении трех дней. Части проростка выделялись в стерильных условиях и разрезались на экспланты толщиной 1 мм.

Все варианты эксплантов размещались на поверхность агаризо-ванной модифицированной среды Мурасиге и Скуга (МигазЫее Т., Зкоов Г. ,1962) на чашки Петри по 15 .эксплантов на чашку и инкубировались при 26+1 С , относительной влажности 70% и 16-ч фэто-периоде. Учет эксплантов, индуцирующих каллусную ткань, проводился на 14-й день культивирования. ЭмСриогенный потенциал линии оценивался но числу зародыиой, и^дуцируюший эмбриогенный каллус. Полученные результаты обрабатывались статистически.

Для пролиферации кусочки каллусной ткани диаметром 2-3 мм переносили на среду того же состава. Для получения регенерзнтон эмОриогенную каллуснуы ткань с зачатками побегов переносили ка . свежую среду. Укоренившиеся регенеранты длиной 5-7 см высаяша-лись в горшки со смесью почва: песок-1:1. Дальнейшее развитие производилось в теплицах при температуре 26+1 С/ относительной ■ влажности 707. и 16-ч фотопериоде.

Анализировали первое (Ио), второе (М) и третье (И2).поколения сомаклоналышх вариантов инбредной линии 346.

Посадка растений в теплицах и в поле, . а также уход за ними осуществлялся согласно агроправилам (Справочник кукурузовода, 1963). Опыление производилось стандартно, со строгой изоляцией муяских и женских соцветий.

ИзоФерментный анализ проводился второго семенного поколения регенерантов в лаборатории д. б. н. Хавкина 3. Е. (ВНИИСЕ РАО:о. Анализу в полиакриламидном геле подвергали бесклеточныо

' - 7 :

экстракты щитков и мезокотилей 3-х и 5-ти дневных проростков, приготовленных путем растирания на холоду в 0.125 М трис-глице-риновом буфере, содержащем 0.05 ■ М 2-меркаптоэтанола и 10-15% глицерина. Электрофорез проводили в анодной системе Табера и Шермана (Маурер Г. ,1971).

Экспериментальная работа была проведена в 1985-1989 гг. в лаборатории генетики культивируемых клеток ИФР -РАН им. К. А. Тимирязева, в лабораториях генетики и культуры ткани и на полях НПО по кукурузе "Днепр'Чг. Днепропетровск).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .

1. Влияние физиологических факторов и генетических харат'е-рнстик па основные этапы систены регенерации кукурузы.

1.1. Зависимость индукции каллусогенеза от типа экспланта.

По схеме дробного факторного эксперимента (Максимов A.B., 1980)(таб. 1) анализировались тип и степень каллусогенеза от разных эксплантов (эпигенотипов) трех генотипов кукурузы (AI88, 346, ДК66) на агаризованной среде Мурасиге и Скуга с различными фитогормонами в разных сочетаниях.

Таблица 1.

Схема дробного факторного эксперимента.

1 | Фитогормоны Варианты сред 1 1 | Уровень фактора |

1 2 3 4 5 6 7 8 1 С+] МГ/Л [-] |

I НУК -+- + - + - + 1 5 0.5 |

| кинетин - - + + - - + + 1 2 0.2 |

| зеатин . + + I 0.5 0.05 |

| БАП - + + - + - - + I 1 0. 1 |

1 2.4Д | + - + -- + - + 1 1 1 0. 1 | 1

При культивировании эксплантов всех типов, кроме щитков зрелого семени, в условиях in vitro на всех вариантах сред с 3-5 дня культивирования отмечалась дедифференцировка тканей экспланта и формирование рыхлой каллусной ткани серо-желтого цвета с

Влияние фитогормонов на каллусогенез эксплантами гипокотиля кукурузы.

частота м миОыкццм

Уровень фитогормона + шах min

AI 88 346

ДК66 генотипы кукурузы

+ -заагамм

Рисунок 2.

Влияние фитогормонов на индукцию эмбриогенноЯ каллусной ткани незрелыми зародышами кукурузы.

чпсмопа 'л мийыкимм

Уровень фитогормона + пак nt п

AI 88 346

ДК66 генотипы кукурузы

' - Заразной частотой в зависимости от тина экспланта. Частота индукции 'каллусогенеза возрастала в ряду: зрелые семена (3.6%) - корни (6.2%) - гипокотиль (55.9%), 'мезокотиль (56.2%), незрелые зародыши (59.8%), мезокотиль+щиток (61.1%). Генотип материнского растения практически не влиял на частоту формирования каллусной ткани, как показано на примере эксплантов гипокотиля (рис.1). Во всех случаях цитокинины оказывали ингибирующее действие, ауксины только в некоторых случаях стимулировали этот процесс (рис.1).

Различная реакция разных эксплантов на определенный гормональный состав среды, вероятно, связана с различными уровнями эндогенных фитогормонов в разных тканях in vivo. Формирование рыхлой каллусной ткани, по-видимому,. является естественной реакцией любого экспланта на условия in vitro, и тип экспланта влиял только на величину индукции каллусогенеза.

При культивировании незрелых зародышей, помимо описанной выше, отмечено появление плотной, компактной, бело-желтой, глобулярной каллусной ткани, которая в литературе известна как эмбри-огеннйя Каллусная ткань (Green С. Е.,Phillips R. L. ,1975). Этот тип ткани отмечен для всех изученных генотипов, однако частота его возникновения была разной (рис.2). Таклк как и для неэмбри-огенной каллусной ткани, цитокинины во всех случаях оказывали ингибирующее действие. Среди ауксинов только 2. 4Д стимулировала

этот процесс.

: ¡i

.1.2. Влияние физиологических факторов на формирование эмбрио-генной каллусной ткайи кукурузы.

Для оптимизации индукции каллусогенеза изучалось влияние ряда факторов: положение, экспланта на поверхности среды, его возраст, концентрация в среде 2. 4Д и сахарозы, длина светового дня и условия выращивания материнского растения.

Вследствии ассиметричности строения, зародыш может быть ' расположен на поверхности среды в двух разных положениях: щитком вверх и вниз'., Эмбриогенная каллусная ткань (ЕК) формировалась только при положении зародыша на среде щитком вверх. При контакте щитка со средой наблюдалось прорастание зародыша (*) и дедш^- 1 ференцировка по типу неэмбриогенного каллуса (НК) (рис. За).

При использовании зародышей разного возраста показано, что

Влияние физиологических факторов на индукцию эмбриогенного каллуса кукурузы.

а)

положение зародыша на среде

........... .....- ------ '.V и =1 н =1 <•>

и 1

мае ж кал шипом васкх

А10О ■ КТ10И яякз

ЕК

эмбриогенный каллус

незмбриоген. каллус

прорастание зародыша

б)

возраст зародша

в)

уровень 5 среде

час«»«*

г) длина светового

дия

•отопсриод

л)

условия рьуящваиня материнского растения

19«

попе

ч*смо«а к им&ухнйм

е)

содержание сахарозы в срез?

Т I» ь<

С Л X Л Р о э

Влияние 2. 4Д на регенерацию кукурузы.

«.1 0.5

2.4 Д < *»/« >

А188 346 ДК66

генотипы кукурузы

Рисунок 5.

Влияние сахарозы на регенерацию кукурузы.

частот» ■л реавнврвнми

Л180 345

генотипы кукурузы

КС-среда для

индукции ГС-среда для регенерации

К Ь* Ш ЕС 12Х «»С

СДКСРОЭЛ

максимальная частота индукции каллусогенеза соответствовала стадии ' 13-15 дней поело опыления. Созреыш, зародыш кукурузы терял способность к каллусогенезу, а период, в течении которого незрелые зародыши сохраняли змбриогенный потенциал, зависел от змбри-огенных потенций линий: чем выше способность линии формировать змбриогенный каллус, тем длиннее период, в течении которого может осуществляться этот процесс (рис. 36).

От концентрации 2. 4Д в среде зависело протекание двух альтернативных процессов - индукции каллусогенеза и прорастания зародыша. При концентрации 2. 4Д в среде выше 0. 5 мг/л отмечалась максимальная индукция эмбриогенной каллусной ткани, независимо от генотипа (рис.Зв).

Свет оказывал незначительный стимулирующий эффект на процесс индукции эмбриогенной каллусной ткани, но ингибировал формирование рыхлого неэмбриогенного каллуса (рис. Зг). Вероятно, разные типы дедифференцировки регулируются разными системами, которые различаются, в частности, чувствительностью к освещению.

Условия выращивания донорных растений у всех трех генотипов не влияли на степень каллусогенеза (рис. Зд). Вероятно, используемые линии обладали высокой пластичностью и измененные условия экспериментов не были стрессорными.

Влияние сахарозы изучалось в диапазоне 0-12%. Отсутствие сахарозы резко ингибировало формирование эмбриогенной каллусной ткани. Различия в частоте каллусогенеза любого типа в диапазоне концентрации сахарозы 3-12% не обнаружены (рис. Зе).

1. 3. Влияние физиологических факторов на ^'генерацию растений.

Значимыми факторами для стимуляции процесса регенерации и нормального его протекания является, как правило, снижение уровня фитогормонов и сахарозы в среде (Бутенко Р. Г. , 1У74). Действительно, при снижении уровня 2.4Д возрастала частота регенерации растений у всех генотипов (рис.4).

Максимальная частота регенерации происходила в присутствии 3% сахарозы. Однако важно, на какой среде предварительно получен змбриогенный каллус: в том случае, когда его образование происходило на среде с 6Х сахарозы, отмечалась максимальная частота нормальной регенерации с 3% сахарозы (рис. 5).

Вариации эмбриогенного потенциала в ряде генотипов кукурузы.

эябрноавимый и потаиниад

Г«»о»мп

Генотипы: 3-Л344, 6-А619, «ЛЕЗ, 12-1гПЗ -4Т-412

1-А188, 4-0\т513, 7-346, 10-Г2, 13 - Р?

2-6124-5Л. 5-А334 8-С123. 11-ОК66. 14-М/8

Рисунок V.

Наследование эмбриогенного потенциала в Р1-поколении.

пол^иини)

ГкОридл Р1-пагеолцкщ1

1. 2-А188хо4С

2. 1-34бхА1>:'3 1.3-А188хОКбб 3.1-0Кб6хА103

2. 3-346хОК66

3. 2-БК66х346

рузы: 1 - АШ, 2 - 346, 3 - 0166

- 15 -

2. Генетический контроль соматического эмбриогенеза кукурузы.

2.1. Вариации эмбриогенного потенциала в ряде генотипов.

Различия по эмбриогенному потенциалу в анализируемых линиях

И данные литературы (Duncan D.R. et al. ,1985;Phillips R. L. et al.,1988) говорят о возможности генетического контроля процесса соматического эмбриогенеза у незрелых зародышей кукурузы. .

При анализе эмбриогенного потенциала инбредных линий ..разного происхождения выделено три группы: с высоким (40-80Х), средним (10-40%) и низким (до 10%) эмбриогенным потенциалом (рис.6).

2.2. Наследование эмбриогенного потенциала. ■ , .

Анализировались F1 и F2 поколения реципрокных гибридов 'высо-

коэмбриогенной (А188), среднеэмбриогенной(346) и низкоэмбриоген-' • ной (ДК66) линий кукурузы.

В исследуемых комбинациях F1 поколения всегда наследовалась Еысокоэмбриогенная способность (рис. 7) .

При использовании в качестве материнского растения линии А188 (1.2; 1.3), не зависимо от генотипа отцовского растения, эм-.' бриогенный потенциал гибрида не изменялся, а при использовании этой линии в качестве отцовского растения (2.1; 3.1) - был не ниже, чем материнского растения. ' "

При использовании в качестве материнского растения линии 346, эмбриогенный потенциал гибрида зависел от генотипа отцовского растения: в гийриде 346хДК6б (2.3) он повышался, а в гибриде 34бхЛ188 (2.1) - оставался без изменений. При использовании линии 346 в качестве отцовского растения (1.2;3.2) в -гибриде всегда наследовалась высокая эмбриогенная способность.

При использовании линии ДК66 в качестве материнского растения (3.1;3.2), эмбриогенный потенциал был всегда выше, а. при ис- ■ пользовании в качестве отцовского растения (1.3; 2.3) он либо не менялся, либо повышался.

Предполагается, что цитоплазма клеток линии ДК66 содержит некий ингибитор морфогенеза, который делает саму линию ДК66 низ-коэмбриогенной и снижает способность к морфогенезу у гибридов. Причем, 'видимо, имеет значение взаимодействие геномов родительских линий.

Во втором поколении при анализе всех возможных сочетаний ре-.ципрокных скрещиваний била принята нулевая гипотеза о моногенном кодоминантном наследовании эмбриогенных потенций без учета влияния цитоплазматического фактора и рассчитаны теоретически ожидаемые величины по результатам скрещиваний в П поколении. Результаты эксперимента оценивались методом (таб.2).

.Таблица 2.

Генетический анализ соматического эмбриогенеза кукурузы.

NN Генотип-п\п комбинации

1 - 346 |

2 - ДК66 |

3 - 346 X ДКбб |

4 - ДК66 х 346 |

5 - (346 X ДК66) X 346 | 0.5 > Р > 0.2

6 - 346 х (346 х ДКбб) | 0.5 > Р > 0.2

7 - (346 * ДКбб) х ДКбб | Р < 0.01

8 - ДКбб х (346 х ДКбб) | Р < 0.01

9 - (ДК66 х 346) х 346 1 0.8 > Р > 0.5

10 - 346 х (ДК66 х 346) | 0.8 > Р > 0.5

11 - (ДКбб х 346) X ДКбб 1 Р < 0.01

12 - ДКбб. X (ДК66 X 346) 1 0.5 > Р > 0. 2

13 - (346 X ДКбб) X (346 х ДКбб) | 0.05 > Р > 0.01

14 - (ДКбб х 346) х (ДК66 х 346) | 0.8 > Р > 0.5

16 - (346 х ДК66) X (ДКбб х 346) | 0.05 > Р > 0.01

16 - (ДК66 X 346) X (346 х ДК66) | 0. 5 > Р > 0.2

Вероятность нулевой гипотезы

В 7 вариантах скрещиваний эмбриогенный потенциал не отличался, а в 5 гибридных комбинациях он был выше теоретически ожидаемого (рис.8), что может быть результатом,во-первых, взаимодействия генов в гибридах, и во-вторых, участия плазмогена в детерминации морфогенныых потенций.

- 1.7 -

Генетический анализ соматического эмбриогенеза кукурузы (пояснение в тексте, таб.2).

эмбрноламиыА петиция«

ЕР

наблюдаемый эмбриогенный потенциал дЕР Теоретически ожидаемый■ , эмбриогенный потенциал

Рисунок 9.

Влияние ЦШ на зибриогешшй потенциал кукурузы.

»мбриогеипмв потанкиал

Диалоги генотипа

М-фертильный

Типу ЦМС т-трхасскнй Б- молдавский С-парагвайский В-бОЛИВИЙСКЙЙ

2.3. Влияние цит о плаз мат иче ско й мужской стерильности на эмбриогенный потенциал кукурузы.

Анализировались' три инбредные линии кукурузы с разным уровнем эмбриогенного потенциала и разными типами цитоплазмы. Внесение стерильной цитоплазмы во всех случаях приводило к снижению эмбриогенного потенциала от 30 до 70Z (рис.9). Значительных вариаций между уровнями снижения эмбриогенного потенциала различных типов ЦМС не наблюдалось. Вероятно, цитоплазматический фактор, ингибирующий соматический эмбриогенез, локализован, также как и гены мужской стерильности, в митохондриальном геноме, а его экспрессия определяется не столько типом ЦМС, сколько генотипом линии.

3. Сонаклональные варианты кукурузы.

' Для получения сомаклоналышх вариантов была отобрана линия 346 селекции НПО по кукурузе "Днепр", поскольку она имеет высокую степень инбредности и используется в отечественной селекционной практике. Анализировалось три поколения растений.

3.1. Характеристика растений- регенерантов.

При анализе растений-регенерантов (Ro) было обнаружено большое количество аномалий: скрученные и гофрированные листья, изменение знака тропизма, аномалии, связанные с закладкой репродуктивных органов и др. Многие из них исчезали ещё до начала репродуктивной фазы и не наследовались в потомстве. Вероятно, аномалии такого типа являются модификациями на условия in vitro и связаны с воздействием 2.4Д на разных этапах дифференцировки.

Пять растений-регенерантов, у которых при строгом самоопылении завязались семена, были охарактеризованы по количественным и качественным признакам (таб. 3) и анализировались во втором и третьем поколениях.

Таблица 3.

Вариации в Ио поколении сомаклональных вариантов кукурузы.

| Признаки 1 2 3 4 1 5 1

| 1. Высота растения (см) 81 78 70 76 102 (

| 2. Размер метёлки (см) 17 ■6 18 11 21. |

| 3. Число листьев 8 4 5 4 6 |

| 4. Высота закладки 1-го початка 9 3 5 •з 12 |

| 5. Число початков 1 2 2 3 1 |

| 6. Число семян в початке 2 6 14 ' .5' • 22 |

| 7. Окраска колосковых чешуй желт. жёлт. ант. ант. ант. - |

| 8. Окраска пыльников жёлт. желт. ант. ант. ант. |

| 9. Окрааса стержня початка 1 жёлт. желт. ант. ант. ант.. |

3. 2. Характеристика И и Е поколения сомаклональных вариантов.

Растения потомства регенерантов. были выращены в теплице (!Ш и в поле (КО. В каждом случае для контроля использовались растения исходной 346 линия, выращенные в аналогичных условия*". Для анализа изменчивости были выбраны те количественные признаки, которые являются стабильными по описанию стандарта, в том чнгл" признаки, определнтаие урожай.

По основным стабильным количественным признакам (высота растений, размер метелки, число веточек метелки, число листьев и початков, высота закладки первого початка) эти растения суг.ест-венно не различались между собой и не отличались от контроля, как показано на примере числа листьев на растении (рис. Юл).

Показана значительная фенотипическая вариабельность (до 60%) по признакам, определяющим урожай: размер початка , число ряде в початке (рис.106), число семян в ряду и в початке (рпс. 10в), причем в И поколении отмечается- депрессия, а в Р.2 поколении, как правило, усиление проявления признаков.

Для выявления общих закономерностей наследования и определения вклада физиологических (паратипических) и генетических фчк-

Рисунок 10.

С.омаклональные варианты кукурузы.

а)

0)

в)

7ГТГ7Г7Г семьи

число листьев

к - контроль

число рядов семян

я - контроль

к )-| 1-г г-о а-« 4-е 6-е «-е я5 СвМЬИ

1вО 140 120 100 №1 во «о го о

ЧИСЛО

семян в початке

к - контроль

к н - 1-г г-в а-« »-в 4-в »-I 6-в «<

№ СвМЬИ

торов в формировании фенотипической изменчивости применялась система анализа всей популяции сомаклональных вариантов с использованием дисперсионного анализа (Плохинский,1980).

Природа вариабельности в популяциях растений может быть разной. В трех семьях сомаклонов 1?(4-7), Я(5-8) и К(5-9) фенотипи-ческая изменчивость была вызвана только действием физиологических факторов, а в семьях Р?(1-1), Р(1-2) и й('3-5) сомаклональная вариабельность была связана с проявлением генетического разнообразия. В потомстве регенеранта (?о-3 сестринские семьи различались между собой: в семье 1?(3-4) растения фенотипически не отличались от контроля, а в семье 13(3-5) обнаружена значительная фе-нотипическая изменчивость, обусловленная изменениями в генотипе..-Среди растений-регенерантов и их потомства показано появление признака антоцианового окрашивания. Сохранялась строгая корреляция по наличию антоциана в колосковых чешуях, пыльниках и стержн-э початка. Семьи, имеющие единую родительскую форму, могли различаться мо.гду собой характером наследования признака. Пови-дкмому, это - результат 1!зменений, затрагивающих регуляторные локусы синтеза антоциана на ранних этапах онтогенеза или следствие дестабилизации генома

3. 4. Изоферментный анализ сомаклональных вариантов.' "* ' Для исследования генетической природы изменений, происходящих в изучаемой системе , проводился анализ изоферментного состава зстеразы н пероксидазы, что позволяет непосредственно оЯна-руэт!ть продукта кодеминантных ферментных локусов.

В щитках пяти из одиннадцати исследованных проростков семян второго поколения регенерантов были обнаружены изменения в спектре кислой зстеразы в виде двух новых зон, одна из которых присутствует также в спектре эстераз в мезокотилях стандарта и всех изученных регенерантов. Индивидуальный анализ щитков стандарта не выявил изменчивости, т. е. дополнительные зоны эстеразы - несомненный результат сомаклональньй изменчивости.

В мезокотилях у трех растений били также обнаружены изменения в спектре анодных пероксидаз.1 Новые зоны пероксидазной активности можно предположительно отнести к локусам РгЗ и Рг7. .

- 22 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Система "растение - клетка in vitro -растение" представляет собой ряд последовательных этапов: индукция каллусогенеза, пролиферация каллусной ткани, морфогенез и регенерация растений. Каждый этйп системы характеризуется рядом специфических параметров (тип индуцируемой каллусной ткани, скорость роста каллуса, особенности морфогенеза и др.) и реализуется при взаимодействии физиологических, эпигенетических и генетических факторов. На всех этапах этой системы показано наиболее существенное влияние условий культивирования, т.е. главенствующая роль физиологической регуляции. Индукция- морфогенной каллусной ткани регулируется также эпигенетически, а степень проявления морфогенных потенций связана с особенностями генотипа.

Было показано, что система генетического контроля морфогенеза т vitro у кукурузы локализована в ядре и цитоплазме, причем основная роль в формировании морфогенных потенций- принадлежит ядру. Наследование признака носит моногенный кодоминантный характер, однако не исключена возможность, что детерминанты морфогенеза представлены блоком генов, наследуемых сцепленно. Цитоплазма выполняет, очевидно, лишь вспомогательную роль. В некоторых случаях она может нести дополнительные факторы системы контроля морфогенеза, в том числе и супрессоры, ингибирувдие экспрессию морфогенетических реакций. Возможно, что плазмоген локализован в митохондриях и является одним из регуляторных локусов системы детерминант ЦМС.

При анализе растений в трех поколениях сомаклональных вариантов кукурузы показано, что реализация измененной in vitro наследственной информации в растениях-регенерантах и их потомстве определяется и физиологическими и генетическими факторами.

Проведенная работа показывает, что система "растение - клетка in vitro - растение" является удобной моделью для изучения вклада физиологических, генетческих и эпигенетических факторов при реализации программы развития. Высокий уровень изменчивости в'потомстве растений-регенерантов, связанный с генетической вариабельностью, может представлять интерес для использования системы сомаклональных вариантов в селекционной работе.

- 23 -ВЫВОДЫ.

1. Проанализирован вклад физиологических, эпигенетических и генетических факторов на всех этапах дедифференцировки и морфогенеза in vitro и при возникновении сомаклональных вариантов.

2. На этапе индукции морфогенной каллусной ткани существенным является выбор экспланта. Только щитки незрелых зародышей до стадии вызревания колеоптильного апекса побега обладают морфо-генными потенциями. : .

3. В системе регуляции морфогенеза in vitro существенную роль играют физиологические факторы, в частности, содержание в среде 2.4Д и сахарозы, причем, на каждом этапе от. йндукции эмб-риогенной каллусной ткани до укоренения регенерантов • требуются-различные концентрации этих веществ.

4. Установлено, что генотип исходной линии определяет степень выражения морфогенных потенций (частоты индукции эмбриоген-ной каллусной ткани). В серии генотипов выделены три группы с высокой, средней и низкой эмбриогенной способностью.

5. Показана генетическая регуляция соматического эмбриогенеза. Высокоэмбрмогеиная способность наследуется моногенно кодоми-нантно. Система.генетического контроля морфогенеза in vitro локализована з ядре • и цитоплазме. Основная роль в формировании морфогенных потенций принадлежит ядру. Выявлен цитоплазматичес-кнй ингибирующий фактор, который, видимо, локализован в митохон-дриальном геноме и сцеплен с системой детерминант цитоплазмати-ческой мужской стерильности.

6. В сома1аоналышх вариантах выделены наследуемые измененные признаки: модификаций онтогенеза и появление антоциана. Показана возможность изменения сомаклональных вариантов по количественным признакам, варьирующим при разных условиях выращивания..

7. При анализе двух поколений растений-регенерантов • показа- • но, . что изменчивость в сомаклональных вариантах затрагивает признаки, определяющие урожай: число рядов в початке и число семян в ряду, общее число семян .в .'початке и размер початка.

8. Обнаружена вариабельность по изозимным спектрам зстеразы и пероксидазы. которая связана с'изменениями регуляторных зон, определяющих становление органспецифических спектров в процессе развития.

ПУБЛИКАЦИИ.

1. Е Чернышева, ¡0. И. Долгих, 3. Б. Шамина, чл. корр. АН СССР ' Р. Г. Бутенко. Влияние генетических характеристик исходных растений на шрфогенный потенциал каллусных клеток кукурузы. -Доклады Академии наук СССР, 1.988, т. 300, N1, с. 227-229.

2. В. Г. Чернышева, Ю. И. Долгих. Влияние генотипа на способность к морфогенезу в культуре тканей кукурузы. Тезисы международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск, 1988, с. 107

3. В. Г. Чернышева, Ю. И. Долгих, 3. Б. Шамина. . Генетический конт-рль соматического эмбриогенеза в культуре клеток кукурузы. Тезисы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. М. , 1989, с. 76.

4. В. Г. Чернышева, 3. Б. Шамина. Влияние ЦМС на индукцию эмбри-огенной каллусной ткани кукурузы. - Генетика, 1990, т.26, N8, д. 1435 - 1439 .

б. 3. В.Шамина, В. Г.Чернышева, Э. Е. Хавкин, НИ.Орлова. Изо-ферментный анализ сомаклональных вариантов кукурузы. . - Доклады ВАСХНИЛ, 1990, N7, с. 14-17 ..

6. Е. Е. Khavkln, М. Ч. Orlova, Z. В. Shamina and V. G. Chernysheva. Isozyme patterns of inbred 346 somaclonal variants. - Maize Genet. Newsletter, 1990, N64, p. 91-92.

7. Z.B. Shamina, Yu. I. Dolgykh, V. G. Chernysheva. Genetic control of maize somatic embryogenes is. Abstr. 7 Intern. Congr. PTCC, Amsterdam, 1990, p. 268.