Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регенерация, мутагенез и соматоклональная вариабельность при клональном микроразмножении овощного стахиса

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Регенерация, мутагенез и соматоклональная вариабельность при клональном микроразмножении овощного стахиса"

На правах рукописи

Хуссейн Исам Абдель Салам РГВ од

2 0 ипя

РЕГЕНЕРАЦИЯ, МУТАГЕНЕЗ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ОВОЩНОГО СТАХИСА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2000

Работа выполнена на кафедре биотехнологии МСХА им.К.А.Тимирязева и в лаборатории генетики растений Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН.

Научные руководители -кандидат биологических наук Хадеева Н.В.

кандидат биологических наук Кочиева Е.З.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мансурян А.Н., доктор биологических наук, профессор Гостнмскин С.А.

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАН.

Защита диссертации состоится « .»_2000 г.

в часов на заседании диссертационного Совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (127550, ул.Тимирязевская, 42)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан « .»_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук С.А.Меликова

/7Ш о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Культура in vitro клеток, тканей и органов растений представляет собой один из развивающихся разделов биотехнологии, который обладает большим потенциалом для улучшения важных сельскохозяйственных, лекарственных и декоративных культур. В современной биотехнологии интенсивно развиваются такие области, как микроразмножение, мутагенез, получение гаплоидов, получение вторичных продуктов метаболизма растений, изменение генотипа растений методами генной инженерии. Большой интерес представляет регенерация растений, позволяющая получить полноценный организм из единичных измененных или неизмененных клеток.

Микроразмножение растений в настоящее время рассматривается как целостное достаточно хорошо разработанное коммерческое направление современной биотехнологии. В качестве важных источников усовершенствования растений рассматриваются также мутагенез и сомаклональная вариабельность, часто возникающая при культивировании растительных тканей in vitro. Явление сомаклональной изменчивости, как известно, при микроразмножении растений in vitro может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на генотип. Поэтому представляет интерес сравнительное изучение разных способов микроразмножения растений в плане возможности возникновения сомаклональных вариаций. Особенно актуальна эта проблема для вегетативно размножаемых растений, так как любое приобретенное в культуре изменение может сохраняться при клонировании. Важной задачей при изучении сомаклональной изменчивости также является выбор адекватного метода для своевременной и быстрой идентификации возникающих вариаций.

Стахис Зибольда (Stachys sieboldii Miq.), или овощной стахис, представляет в этом плане интересный объект исследования, так как обладает целым рядом ценных пищевых и лекарственных свойств. Основной проблемой, с которой сталкиваются селекционеры при выращивании стахиса в России, является невозможность получения всхожих семян, вследствие чего его размножают только вегетативным путем с помощью клубней. Это сопровождается накоплением в посадочном материале фитопатогенов, что приводит к снижению его качества. С другой стороны, невозможность проведения скрещиваний затрудняет проведение программ по селекции новых сортов стахиса.

В связи с изложенным представлялось интересным использовать для улучшения данной культуры методы биотехнологии, которые позволяют решить многие из свойственных вегетативно

1

размножаемым растениям проблем: они дают возможность оздоравливать посадочный материал, получать клеточные варианты и растения, обладающие новыми свойствами, проводить селекцию in vitro высокопродуктивных форм, сохранять и размножать уникальные генотипы, а также получать стандартную биомассу в виде клеточных культур или растений, которая может служить ■ сырьем для фармацевтической и пищевой промышленности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка и сравнительное изучение разных методов микроклонального размножения овощного стахиса (Stachys sieboldii Miq.) и влияния условий культивирования на качество получаемых растений. Кроме того, изучали возможность получения новых вариантов с помощью химического мутагенеза in vitro. В связи с изложенным были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить эффективность разных способов размножения стахиса in vitro.

2.Получить серию растений-регенерантов овощного стахиса из узловых сегментов стебля и столонов путем адвентивного побегообразования на средах с низким и высоким содержанием цитокининов и после цикла последовательных регенераций;

3.Изучить возможность индукции каллуса и адвентивного побегообразования из каллуса S.sieboldii у эксплантатов различного происхождения;

4.Разработать условия мутагенеза S.sieboldii in vitro, получить серию мутагенизированных растений-регенерантов;

5.0пределить наличие (или отсутствие) изменений у полученных растений по морфологическим и биохимическим признакам, а также на молекулярном уровне с помощью RAPD метода.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение влияния разных условий микроразмножения и компонентов питательной среды на качество получаемых растений-регенерантов стахиса Зибольда. Установлена целесообразность применения белковых .маркеров для выявления сомаклональных изменений у регенерантов стахиса. Впервые показана возможность применения RAPD метода для анализа полиморфизма ДНК у регенерантов стахиса. Выявлены различия на уровне нуклеотидных последовательностей как между самими растениями-регенерантами, так и между регенерантами и контрольными растениями. Установлено, что размножение растений при низких концентрациях цитокининов обеспечивает получение мономорфного по всем показателям потомства. Была показана зависимость количества изменений от использованных концентраций

2

цитокининов. Так, увеличение концентрации цитокинина от I - 2 до 10 мг/л вызывало возникновение меньшего числа изменений в пероксидазных и RAPD спектрах, чем повышение его содержания с 10 до 20 мг/л или многоступенчатая регенерация: в последних случаях изменения наблюдались у всех исследованных регенерантов и они были сравнимы с изменениями у регенерантов, полученных после мутагенеза. Разработана принципиально новая методика индукции микроклубней у черенков стахиса in vitro.

Практическая значимость. Разработана лабораторная методика микроразмножения овощного стахиса с помощью микроклубней, индуцированных in vitro у черенков асептических растений в течение всего года. Это позволяет преодолеть явление сезонности размножения, свойственное размножению стахиса методом микрочеренкования, и избежать периода адаптации к внешней среде. Впервые были оптимизированы методики выделения ДНК и проведения RAPD анализа для S sieboldii. Путем изоферментного и RAPD анализа установлено появление вариаций среди растений-регенерантов, полученных на средах с повышенным содержанием цитокиинов и при увеличении циклов регенерации, что полезно учитывать в работах по клеточной инженерии растений при выборе метода размножения..

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и трех глав экспериментальной части, включающих главу материалов и методов исследования, две главы собственных исследований, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 28 рисунков. Список использованной литературы включает 177 источников.

2.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Глава 2.Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали асептические растения овощного стахиса (Stachys sieboldii Miq.). Исходные клубеньки стахиса были любезно предоставлены проф.П.Ф.Кононковым (ВНИИССОК). Стерильные пробирочные растения и чашки Петри с эксплантатами поддерживали на среде В5 Гамборга ( Gamborg е.а.,1968) при 16-часовом люминесцентном освещении и температуре 18 - 25°С. Каллусные культуры и изолированные столоны культивировали в темноте в термостате при температуре 26°С.

При микрочеренковании стерильных растений и для удлинения и подращивания регенерирующих побегов использовали среду В5 Гамборга без фитогормонов, которая содержала полную, Уг или Ул дозы макро-, микроэлементов и органических добавок по прописи.

3

Для укоренения использовали среды без регуляторов роста или с добавлением 0,1 мг/л ИМК. Для индукции адвентивного побегообразования использовали среды Гамборга или Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) с низким ( по 1 мг/л каждого) содержанием 6-БАП и кинетина, а также высоким (10 - 20 мг/л) содержанием 6-БАП. По мере удлинения растеньиц их отрезали и поддерживали в стерильной пробирочной культуре.

Для индукции столонов в среды добавляли 8% сахарозы, для индукции клубней ее концентрацию увеличивали до 12%. Для стимуляции столоно- и клубнеобразования, в среды добавляли кинетин или 6-БАП в концентрации 0,5 - 10 мг/л, абсцизовую кислоту (0-5 мг/л) и галактозу (2,7 - 5,4%). Одноузловые сегменты пробирочных растений погружали в среду до уровня боковых почек вертикально и культивировали при 8-12-часовом освещении и температуре 18 - 22°С в течение 4-8 недель.

Для мутагенной обработки использовали 5-бромдезоксиуридин (5БДУ), который в концентрации 0,25 - 0,75 мг/л вводили в питательную среду. Одноузловые черенки культивировали на этой среде в течение 3 недель, после чего эксплантаты переносили на среды без мутагена.

Для определения катодных пероксидаз использовали методику, оптимизированную Бияшевым (1986).

Определение стахиозы в листьях, столонах и микроклубнях стахиса проводили методом Харборна (Harborne, 1984).

Для приготовления временных препаратов растительный материал фиксировали в ацеталкоголе (3: 1) в течение 1 суток, после чего переносили для хранения в 70° спирт. Окрашивали ацетокармином по общепринятой методике (Паушева, 1980), фотографировали с помощью микрофотонасадки МФН-11 на фотопленку Микрат-300.

Выделение ядерной растительной ДНК производили на основании протокола, предложенного Edwards et.al; (1991), в модификации Дорохова и Клоке (1997). Для цепной полимеразной реакции использовали наборы реактивов производства "Biomaster" (Москва) и "Promega"( США). Для RAPD анализа использовали коммерческие олигонуклеотидные праймеры фирмы Operon Technologies, Alameda, (США), а также праймеры, ранее разработанные для маркирования генома пасленовых и злаков. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала буфер для Taq-полимеразы, 200мкМ dNTP, 2.5мМ MgCl2 ,5 мкМ праймера, 1 ед Taq-полимеразы,50 нг ДНК. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе "РСТ-150" (MJResearch, США) в следующих условиях:5мин 94°С; 1,5мин 37°С;

4

1,5мин 72°С - 1 цикл; 1 мин 94°С; 1мин 37°С; 1,5мин 72°С - 33 цикла; 1 мин 94°С; 1мин 37°С; 8 мин 72°С - 1 цикл. Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1.7% агарозном геле в 1 х TBE буфере, окрашивали бромистым этидием (1 мкг\мл) и фотодокум ентировали.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Овощной стахис (Stachys sieboldii Miq.) - овощное клубнеобразукмцее растение, используемое также в народной медицине многих стран благодаря наличию ряда биологически активных веществ. В связи с особенностями размножения стахиса настоящая работа посвящена разработке и сравнительному изучению эффективности разных способов микроразмножения Stachys sieboldii биотехнологическими методами, изучению вероятности получения в процессе регенерации измененных форм, а также индукции вариаций при помощи мутагенной обработки эксплантатов стахиса in vitro и определению возникающих изменений на морфологическом, биохимическом и молекулярном уровнях. В целом общий план работы схематично представлен на схеме 1.

Глава 3. Разработка и изучение эффективности разных способов мнкроклоналыюго размножения Stachys sieboldii in vitro.

3.1 Влияние цитокипинов на адвентивное побегообразование у узловых сегментов стахиса.

Было изучено влияние низких и высоких доз цитокининов на интенсивность образования адвентивных побегов у сегментов узлов овощного стахиса. Результаты показали, что добавление всех изученных концентраций щггокининов к среде Гамборга вызывало активное образование адвентивных почек и побегов из узловых сегментов стебля и столонов при стандартных условиях выращивания. Следует отметить, что образование адвентивных побегов происходило только на узловых сегмента (т.е. при наличии уже заложенных меристем или меристематических зон), из междоузлий или листовых сегментов регенерации получить не удалось.

На средах с низким уровнем цитокининов наблюдали одновременное

рисунке:

Исходные растения стахиса

Черенкование

ЧеренЛвание

прямая регенерация

среды ВО :М1 БАШ О БАПЮ

AL 11111 1111 ЩИ Tf rrttf ttrr ттттт

растения растения - регенеранты

раст^^я^клуони регенеуцнты среды:ВО В8+2.5БАП БАПЮ

/ \ иш

растения клубни регенеранты среды: ВО В8+2.5БАП БАПЮ

S I !Ш

растения клубни регенеранты

анал

каллусообразование мутагенез (узловые сегменты) (5БДУ)

В8+2.5БАП ВО М1 ВО

| i i i i щи щи i i i i | ТТТТТ ттттт ттттт ттттт

растения-регенеранты регенеранты

охимическии анализ молекулярный анализ нзопероксидаз RAPD РСК(выборочно)

хроматографический анализ углеводов

Результаты настоящего исследования изложены в 3 основных разделах, которые посвящены разработке и сравнительному изучению эффективности разных способов микроразмножения &ас/у>5 яеЬоШИ биотехнологическими методами, изучению вероятности получения измененных форм в процессе регенерации, а также индукции вариаций при помощи мутагенной обработки

Рнс.1. Индукция адвентивных почек из узловых сегментов стебля (концентрация 6БАП 1м г/л, 4 недели культивирования).

Было показано, что 6БАП был гораздо более эффективен в индукции дополнительных побегов, чем кинетин (табл.1). Если при использовании кмнетина в концентрации от 1 до 5 мг/л а число почек -от 5 до 20, то при тех же концентрациях 6БАП число побегов менялось примерно в тех же пределах, но число почек возрастало от 40 до 100, т.е. при использовании в качестве индуктора адвентивного побегообразования 6БАП эффективность процесса микроразмножения возрастала более, чем в 5 раз.

Из литературных данных известно, что применение высоких концентраций цитокининов в питательной среде, увеличение длительности пассирования in vitro и многократная регенерация повышают вероятность появления сомаклональных вариантов. Поэтому мы использовали еще 2 системы регенерации: на средах с очень высокими концентрациями 6БАП - БАП10(10 мг/л) и БАП20(20 мг/л), а также многоступенчатую регенерацию (регенерацию из регенерантов)

7

Таблица1.

Влияние вида цитокинина на индукцию адвентивных побегов и почек при культивировании изолированных столонов стахиса*.

Концентрация цитокинина, мг/л Среднее число адвентивных побегов и почек (в пересчете на узел)

Кинетин 6БАП Побегов Почек

0 0 1,2 ±0,2 0

1 0 2,9 ± 0,4 5,4 ±0,5

0 1 3,8 ± 0,9 43,1 ±6,5

2 0 3,2 ± 0,2 1,8 ±0,5

0 2** 3,6 ± 0,6 12,5 ± 1,9

5 0 1,7 ±0,3 20,5 ±5,1

0 5 2,1 ±0,5 114,8 ±8,7

• - среда Мурасиге - Скуга, 6 недель культивирования, концентрация

НУ К 0,1 мг/л ** то же, 2 недели культивирования

на среде БАП10 (см.схему 1). В этих условиях получены еще 3 серии регенерантов -со сред БАШ О, БАП20 и после 4 циклов регенерации на среде БАП10.

Таким образом, можно успешно размножать овощной стахис, используя адвентивное побегообразование из узловых сегментов стебля или столонов на средах с цитокининами. Эффективность микроразмножения стахиса с помощью образования дополнительных побегов во много раз больше, чем при микрочеренковании, так как из одного асептического растения можно получить 6-7 нормальных растений, а из одного узлового сегмента при минимальной концентрации цитокининов в среде (1мг/л кинетина + 1 мг/л 6БАП ), -до 180 регенерантов.

3.2. Изучение влияния соотношения ауксина и цитокинина в среде на морфогенетические процессы у узловых эксплантатов стахиса.

Эффективность морфогенеза зависела не только от концентрации, но и от соотношения содержания цитокинина и ауксина. Так, изменение содержания кинетина от 0,1 до 3,5 мг/л при концентрации ауксина от 0,1 до 1 мг/л довольно слабо влияло на индукцию дополнительных побегов (рис.2 а). В то же время длина побега при этом менялась более значительно (рис.2б). При этом наблюдалась явная зависимость этого признака от содержания ауксина в среде. Наиболее ярко было выражено влияние соотношения фитогормонов на такой показатель, как количество корней в пересчете на эксплантат (рис. 2 в).

Рис. 8. Влияние соотношения ауксина и кинетина на процессы морфогенеза у узловых сегментов сгахиса.

Рнс.2. Влияние соотношения кинетина и НУК на число (А), длину побегов (Б) и количество образующихся корней (В) при культивировании стеблевых черенков стахиса in vitro.

Все эти результаты позволили определить наименьшие концентрации ауксина и цитокинина, при которых образовывались более низкие, чем при обычном черенковании, кустящиеся формы с хорошо развитой корневой системой. У них был несколько меньший, чем у обычных пробирочных растений, период адаптации к условиям внешней среды. А из-за того, что такие растения имели несколько побегов, у них повышалась вероятность образования столонов, и, соответственно, клубней. Использование подобных растений в качестве посадочного материала может значительно повысить урожайность данной культуры.

З.З.Разработка микрокчонального размножения овощного стахиса с помощью микроклубней

Была поставлена задача оптимизировать методику получения столонов и микроклубней у сгахиса in vitro, предложенную в работе

9

Хадеевой и Гордон (1995). Было показано, что культивирование черенков стахиса в пробирках даже при 16-часовом освещении на среде, содержащей 6% сахарозы и 2 - 2,5 мг/л кинетина, приводило к замедлению роста побега, укорочению и утолщению междоузлий, уменьшению размера листьев и образованию в верхушечной части стебля клубнеподобных структур с редуцированными листьями ( рис. За,б).

При повышении концентрации сахарозы до 8 - 12% и кинетина до 10 мг/л даже при 16-часовой продолжительности светового периода рост побегов вверх еще более замедлялся. При наивысшей концентрации сахара и цитокини-

на рост прекращался совсем, и вместо растущего вверх стебля через 1 -3 недели начинали образовываться клубнеобразные утолщенные побеги, направленные вниз, и не имеющие листьев.

Рис.3. Образование клубнеподобных структур из верхней части стебля стахиса на свету на среде с 6% сахарозы и 2 мг/л кинетина (2 мес. культивирования)

Аналогичное действие оказывало добавление в среду вместо кинетина 6БАП. Следует отметить, что как и в случае адвентивного

10

побегообразования, 6БАП оказывал более сильное влияние на столоно-и клубнеобразование. Во-первых, для полного прекращения роста побега и превращения его в столон требовалась концентрация в среде 6БАП 2,5 мг/л, т.е. в 4 раза ниже, чем концентрация кинетина. Во-вторых, при использовании 6БАП из одного узла обычно образовывалось от 2 до 5 столонов, а при увеличении его концентрации до 5 мг/л вместо столонов сразу образовывались микроклубни (рис.4). У контрольных растений образование столонов начиналось не у всех растений и не раньше, чем через 2 месяца культивирования

Рис.4. Образование столонов и микроклубней из сегментов стебля на средах с высоким содержанием сахара (8 - 12%) и различной концентрацией цитокининов.А - 8% сахарозы, 5 мг/л кинетина,2 нед.к-я,Б - 12% сахарозы, 10 мг/л кинетина, 2 нед.к-я,В - контроль (2% сахарозы без фитогормонов), 2,5 мес.к-я. Сс - сегмент стебля, Ст -столон, Мк - микроклубень

Образование микроклубней можно было индуцировать также и у изолированных столонов, культивируемых в чашках Петри на средах

11

с высоким содержанием сахара и цитокинина (рис.5). Стимулировало клубнеобразование добавление абсцизовой кислоты (2 - 5мг/л). Оказалось возможным вызвать появление клубней у 2 - 3-недельных пробирочных растений уже в мае-июне без использования фитогормонов, только при выдерживании растений в воде при пониженной температуре (8°С). Это тем более интересно, что при черенковании стахиса in vitro даже в стандартных условиях выращивания (16-часовое освещение, температура 18 - 22°С) у этой культуры обнаруживалась заметная сезонность - замедление роста осенью и зимой и ускорение весной и летом (Хадеева и др., 1995). У растений, росших в воде при комнатной температуре, такие клубни формировались только к сентябрю.

Рис.5. Формирование микроклубней на изолированных столонах на среде с 12% сахарозы, 5 мг/л 6БАП и 2 мг/л абсцизовой кислоты, 2 мес. культивирования.

Таким образом, используя в некоторой модификации основные методы индукции клубнеобразования, удалось разработать достаточно простую и удобную методику клонального размножения стахиса

12

с помощью мнкроклубней. Использование Выбор в качестве посадочного материала не пробирочных растений, а микроклубней более перспективно, так как это облегчает хранение и снимает проблему адаптации к условиям внешней среды. По сравнению с методом индукции столонов и клубней у целых пробирочных растений (Хадеева. Гордон, 1998), предложенная методика позволяет в 2 - 3 раза ускорить клубнеобразование, а также вызвать появление клубней в несвойственный период - весной. Кроме того, возможна индукция клубней у пробирочных растений в воде, без использования богатых сред и фитогормонов.

Данные цитологического анализа и хроматографии на бумаге экстракта микроклубней показали наличие у индуцированных клубней характерной формы и присутствие в них уникального тетрасахарида стахиозы. Эти результаты подтверждают клубневую природу индуцируемых структур. Несмотря на меньший по сравнению с адвентивным побегообразованием коэффициент размножения, метод индукции микроклубней представляет собой весьма перспективный способ микроразмножения овощного стахиса.

3.4. Изучение каллусогенеза у стахиса и регенерация растений из каллуса.

3.4.1. Индукция каллусогенеза у стахиса.

Как известно, при регенерации растений из каллусной ткани вероятность появления сомаклональных вариаций возрастает. Поэтому нами была сделана попытка индукции каллуса у стахиса и регенерации из него растений. При изучении влияния различных ауксинов на каллусообразование у листовых сегментов .наиболее эффективными для индукции каллусогенеза у растений стахиса оказалось применение 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной ( ТХФУ) или 4-хлорфеноксиуксусной (ХФУ) кислот, например, при сочетании 1 мг/л 6БАП +1,5 мг/л ХФУ. При этом на срезах быстро появлялся белый каллус, который, тем не менее, при дальнейшем пассировании постепенно темнел и погибал через 10 недель, несмотря на введение антиоксидантов (аскорбиновая кислота, поливинилпирролидон, цистеин) и частую смену среды. Возможно, это происходило из-за знач!гтельных количеств фенольных компонентов.

Таким образом длительно пассируемого каллуса при использовании 19 различных вариантов соотношения концентраций 6БАП и ХФУ в среде получить не удалось. Плотный коричневатый нерегенерирующий каллус образовывался также на концах узловых сегментов растений стахиса на среде В5 с 2% сахарозы при высоких (более 5 мг/л) концентрациях цитокининов.

13

3.4.2. Регенерация из каллуса

Одной из следующих задач было получение регенерантов из каллуса с целью изучения возможности появления сомаклональных вариантов при таком способе микроразмножения стахиса. При указанных выше соотношениях ХФУ и 6БАП в среде или переносе образующих каллус листьев на среды с высоким содержанием цитокининов регенерации растений из первичного листового каллуса не наблюдали. Только в варианте 1 (0,05 мг/л 6БАП + 0,25 мг/л ХФУ) отмечено появление корней. Такого рода трудности при регенерации из каллуса характерны не только для стахиса и описаны для ряда других культур ( (№гауапз\уату,1988, \Vitrzens е.а.,1988 и др.). Однако использование других соотношений компонентов среды принесло положительные результаты. При повышении концентрации сахарозы в среде до 8% и использовании одного цитокинина (2,5 мг/л 6БАП) в месте соприкосновения узлового сегмента стебля со средой удалось инициировать интенсивное образование светлого каллуса, на котором одновременно происходила активная регенерация растений (рис.6).

Рис.6. Регенерирующий каллус, образовавшийся у основания сегмента стебля стахиса на среде с 8% сахарозы и 2,5 мг/л 6БАП.

Кроме того отмечалось регулярное спонтанное образование регенерирующего каллуса на безгормональной среде у основания основного побега, которое наблюдали также после длительной зимней задержки роста, когда черенки, пересаженные на свежую среду в ноябре - декабре, начинали активно расти в феврале - марте. Сезонная зависимость поведения растений в культуре, наблюдается и у других видов растений (Tabata, Motoyoshi 1965 ; Морозова, Мелик-Саркисов,1982, Андронова, Лемешев, 1992; Siril, Dhar,1997; Ben Jouira et.al.,1998). На окрашенных ацетокармином срезах регенерирующего

14

каллуса отчетливо видны отдельные меристематические очаги и развивающиеся почки, вкрапленные в недифференцированную каллусную массу, т.е. можно считать, что каждый регенерирующий побег происходит из разных клеток. По мере развития регенеранты отсаживали на свежую безгормонную среду, где они развивались в нормальные полноценные растения.

Таким образом, используя среду с повышенным содержанием сахарозы при добавлении только одного цитокинина (6БАП), впервые удалось индуцировать активно пролиферирующий каллус стахиса, вызвать в нем образование de novo меристематических очагов и получить полноценные растения-регенеранты. Кроме того, выявлены условия, позволяющие вызвать индукцию регенерирующего каллуса стахиса и растений-регенерантов на среде без фитогормонов.

3.5. Получение коллекции растений после мутагенной обработки 5-бромдезоксиуридином.

Возможность получения измененных форм у стахиса путем мутагенеза in vitro изучали, вводя в питательную среду в качестве мутагена 5-бромдезоксиуридин в концентрации 0,25 - 0,75 мг/л, так как при более высоких дозах все эксплантаты погибали. В качестве эксплантатов использовали одноузловые сегменты пробирочных растений с пазушными почками, которые культивировали в присутствии мутагена в течение 3 недель, после чего переносили на среды без мутагена. Коллекцию растений, полученных из побегов, выживших после обработки мутагеном на среде без фитогормонов, и регенеранты, полученные из мутагенизированных эксплантатов на регенерационной среде, поддерживали в стерильной культуре черенкованием.

Глава 4. Характеристика растеннй-регенерантов овощного стахиса, полученных различными методами.

4.1 Морфологическая характеристикарегенерантов.

Результаты наблюдений за морфологическими признаками регенерированных разными способами растений стахиса показали отсутствие заметных изменений. Ни в одном из типов обработок не было обнаружено появления -карликовых или альбиносных растений, изменения формы и опушенности. Поэтому дальнейшее изучение полученных регенерантов проводили с помощью изоферментного и RAPD анализа.

4.2. Изучение спектров пероксидаз j исходных растений и регенерантов стахиса

Определение пероксидазных спектров проводили по ранее описанной методике (Бияшев,1985). Наши результаты свидетельствуют о том, что в листьях 4-недельных растений стахиса определяется спектр

15

из 9 изомеров пероксидазы. Впервые был определен спектр пероксидаз у стахиса, состоящий из 9 изомеров в листьях 4-недельных растений и 4 изомеров в каллусной ткани.

Спектры пероксидаз регенерантов, полученных в разных условиях, приведены на рисунках 7 - 11. При их анализе обнаруживались, в основном, 3 типа спектров: 1) неизмененный ( 9 полос), 2) с отсутствием или ослаблением одной или более полос, 3) с

появлением добавочной полосы (или усилением окраски).

- «* *

А к —» "

Рис.7. Спектры изопероксидаз регенерантов стахиса, полученны при прямой регенерации из узловых сегментов стебля на среде с 2% сахарозы, 1 мг/л кинетина и 1 мг/л 6БАП (А), 2% сахарозы и 20 мг/л 6БАП (Б). К - контрольное растение.

< о «и» *«•»£• «3 «ф

К

к ^

Рис. 8 Спектры изопероксидаз регенерантов, полученных путем прямой регенерации из узловых сегментов столонов на среде с 8% сахарозы и 1 мг/л 6БАП (А), и с 8% сахарозы, 1 мг/л 6БАП и 5 мг/л АБК (Б). К - контрольное растение.

к.

С7

«г-

о с и

Рис. 9. Спектры изопероксидаз регенерантов после 3-недельной обработки 0,5 мг/л БДУ I на среде с 10 мг/л 6БАП.

ПооЙПо! (1 ио^иис

с? ы

Сэ

К

Рнс.10. Спектры изопероксидаз регенерантов из каллуса со среды с 8% сахарозы и 2,5 мг/л 6БАП. К - контроль

О

1 2. к К

Рис.11. Спектры изопероксидаз регенерирующего и нерегенерирующего каллуса стахиса. К - листья контрольного растения. 1 - регенерирующий каллус, 2 - нерегенерирующий каллус.

17

Изложенные результаты свидетельствуют о том, что использование низких концентраций Сахаров и фитогормонов (2% сахарозы+1 - 2 мг/л 6БАП, кинетина и АБК) для размножения стахиса не вызывало серьезных изменений на морфологическом и биохимическом уровнях (на примере изопероксидаз). Возможно, такие концентрации экзогенных фитогормонов не приводят к серьезному сдвигу внутреннего гормонального баланса в тканях эксплантатов. При более высоких ( 10-20 мг/л) концентрациях цитокининов и при многоступенчатой регенерации происходило исчезновение ряда изомеров пероксидазы. Чаще всего наблюдалось отсутствие 8-ой и 9ой полос, а также 3-ей и 7 ой. Следует отметить, что увеличение концентрации цитокинина от 1 - 2 до 10 мг/л вызывало возникновение меньшего числа изменений в спектрах пероксидаз, чем повышение его содержания с 10 до 20 мг/л или многоступенчатая регенерация: в последних случаях изменения наблюдались у всех исследованных регенерантов и они были сравнимы с изменениями у регенерантов, полученных после мутагенеза.

Из растений, выросших на среде ВО после 3-недельной экспозиции узловых черенков на среде с добавлением 0,75 мг/л 5БДУ, у трех ^отсутствовали полосы 6, 8 и 9, остальные обладали очень низкой экспрессией. После обработки 0,5 мг/л мутагена сходный эффект наблюдался у одного растения. При использовании 0,25 мг/л 5БДУ отмечалось только снижение уровня экспрессии полос 1, 5 и 9. Поскольку известно, что 5БДУ включается в ДНК, более вероятна генетическая природа возникших после мутагенной обработки изменений. Возможно, высокие концентрации цитокининов вызывают нарушения процессов физиологической регуляции в клетках или некие изменения на молекулярном уровне.

Таким образом, изучение спектров пероксидаз регенерантов овощного стахиса, полученных с использованием различных концентраций фитогормонов и мутагенной обработки, показало присутствие качественных и количественных изменений, которые могут свидетельствовать о наличии сомаклонапьных вариаций даже в процессе прямой регенерации растений из узловых сегментов, минуя стадию каллусообразования. Сходные данные об изменении пероксидазных спектров у сомаклонов кукурузы были получены ранее (Хавкин и др., 1994).

Глава 5. Молекулярно-генетическин анализ исходных растений и регенерантов стахиса.

5.1. Разработка метода выделения ДНК из растений стахиса.

18

На сегодняшний момент не было описано методик выделения ДНК из растений рода 81ас11у5, поэтому одной из задач был подбор наиболее эффективной методики экстракции ДНК из растений стахиса. Для выделения ДНК были выбраны методики, различающиеся, в основном, по способам очистки ну клеиновых кислот

Наиболее эффективной и быстрой была методика выделения ДНК стахиса с использованием 5М ацетата калия. (Дорохов и Клоке). 1,),)7) Количество выделенной ДНК из 50 мг растительного материала, было достаточным и составило 19.9 - 61.3 мкг при соотношении А260/А280 = 1.7 - 1.9. Сходные результаты были получены и при использовании метода экстракции с добавлением протеиназы К. Выделенная при использовании методики с применением протеиназы К и 5М ацетата калия ДНК из растений трех видов стахиса подвергалась обработке эцдонуклеазами. ДНК была высокомолекулярна и полностью гидролизовались рестриктазами ЕсоШ и НтсИН, что говорит о чистоте полученной ДНК и пригодности для дальнейшего молекулярного анализа.

5.2. Оптимизация методики проведения ИАРЭ анализа для изучения генома стахиса.

В связи с тем, что никаких молекулярных работ на стахисе ранее не проводили, необходимо было предварительно провести отработку оптимальных условий реакции и воспроизведения ЯАРБ спектров ДНК 51ас11уз 51еЬо1сШ. Было показано, что для амплификации воспроизводимого ЯАРО паттерна ДНК стахиса наиболее оптимальными были концентрации в реакционной смеси 0.2мМ <1ЫТР и 2.5.мМ Г^СЬ Была также подобрана оптимальная концентрация ДНК стахиса. которая составила 50 нг.

Дтя ЯАРО маркирования генома стахиса было выбрано 9 десятичленных олигонуклеотидных праймеров. Использование большинства праймеров приводило к амплификации ДНК стахиса. число фрагментов 11АРО спектра составляло х- 1 х и зависимости от выбранного праймера. длина ампликонов варьировала в пределах 150- 2800 н.п. Использование при проведении ЯАРО маркирования некоторых праймеров (ОРН1, ОРНЗ) не приводило к амплификации генома стахиса, использование других( А30) не выявляло полиморфизм генома сомаклонов и мутантов 51асЬу5 бюЬо1с1п.

5.3 ЯАРй анализ ДНК каллусных культур и растений -регенерантов стахиса.

5.3.1. КАРО анализ растений-регенерантов стахиса.

При ЯАРЭ маркировании растений, регенерирующих на среде, содержащей • 6БАП(1мг\л) + кинетин (1мг/л) или 6БАП (10мг/л), никаких изменений ЯАРО спектров анализируемых растений не было

19

выявлено. При RAPD анализе растений стахиса, полученных при регенерации на среде с высоким содержанием БАП (20 мг/л) или при многократной регенерации на среде с 10 мг/л БАП, уровень детектируемого полиморфизма ДНК регенератов стахиса значительно повышался. Из 54 RAPD фрагментов, амплифицированных при использовании праймеров OPD14, OPD3, А30+А31и OPD6, 17 были полиморфными, то есть присутствовали не во всех спектрах анализируемых растений (рис. 12). Следует отмстить, что наиболее полиморфными были RAPD спректры растения # 4, полученного при многократной регенерации на средс с 6БАП 10мг/л и # 8 - одного in регенератов на среде 6БАП 20 мг/л. У регенеранта #8 также наблюдаются значительные изменения псроксидазного спектра. Таким образом, используя RAPD метод анализа, нами были выявлены различия нуклеотидных последоцвательностях ДНК растений стахиса, полученных в результате регенерации на средах с различными концентрациями фитогормонов. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований полиморфизма ДНК у сомаклонов гороха ( Кокаева и др., 1997), персика (Hashimi et al., 1997), томатов (Bogani et al., 1995)., риса (Godwin et.al; 1997) и ряда других растений.

Рнс.12. Результаты RAPDopdh анализа растений стахиса, полученных на среде с высоким содержанием 6БАП ( 20 мг\л) и при многократной регенерации на среде с 6БАП (10 мг\л).

1- Маркер молекулярных масс lkb ladder (Gibco BRL), 2- ДНК контрольного растения стахиса не введенное в культуру 3-5 - ДНК регенерантов стахиса на среде с 6БАП 20мг\л, 6-8 - ДНК растений, полученных при многократной регенерации на среде 6БАП. *- полиморфные фрагменты ДНК.

5.3.2. Выявление ДНК полиморфизма у различных типов каллусов стахиса и у растений, регенерировавших из каллусных культур.

Представлялось интересным выяснить, можно ли, используя RAPD метод, выявить какие-либо различия на молекулярном уровне между регенерирующим и нерегенерирущим каллусами стахиса. Из всех использованных для амплификации десятичленных праймеров только два, OPD6 и OPD14, выявили полиморфизм ДНК этих двух типов каллусов (рис 13 а,б). RAPD спектр нерегенирирующего каллуса характеризуется присутствием фрагментов 1800 н.п., 850 н.п. (оба амплифицированы с праймером OPD14), 900 и 930 н.п. (амплифицированные с праймером OPD6) , а также ряда минорных фрагментов, которые отсутствовали в RAPD спектрах ДНК, экстрагированной из каллуса, способного к морфогенезу. Полученные результаты, конечно, не могут связывать напрямую наличие/отсутствие полосы спектра со способностью каллуса к регенерации, но отражают на молекулярном уровне различия между типами каллуса

М 1 2.

I*

Рис.13. RAPD спектры ДНК различных типов каллуса стахиса, полученных при использовании праймеров OPD14 (а) и OPD6(6) М- Маркер молекулярных масс lkb ladder (Gibco BRL), 1- спектр амплификации ДНК морфогенного каллуса, 2- спектр амплификации ДНК неморфогенного каллуса *- полиморфные фрагменты ДНК.

При сравнении регенерантов стахиса, полученных из каллуса, оказалось, что подавляющее число амплифицированных фрагментов(68) были мономорфны. Однако, при амплификации с праймерами OPD3 и OPD14 в "спектрах регенерантов детектировались полиморфные фрагменты ДНК. При этом полученные RAPD спектры растений-

21

W \ 1

регенерантов отличались как от контрольного растения, так и между собой (рис 14). Интересно, что наибольшее число полиморфных фрагментов было выявлено в спектре растения, чьи изопероксидазные спектры были также наиболее измененными. Наши данные совпадали с результатами RAPD анализа регенерантов из каллусной культуры риса и томатов, для которых также была выявлена высокая степень полиморфизма ДНК (Godwin et.al; 1997,Bogani et al., 1996).

Piic.14. RAPD спектры ДНК растений-регенерантов из каллуса, полученных при использовании праймеров OPD3. М-маркер молекулярных масс lkb ladder (Gibco BRL), 1 - ДНК контрольного растения стахиса невведенное в культуру, 2-7 -ДНК регенерантов стахиса, полученных из каллусной культуры. *- полиморфные фрагменты ДНК.

5.3.3. Изменение RAPD спектров регенерантов стахиса после обработки 5-бромдизоксиуридином.

При RAPD анализе был выявлен значительный полиморфизм в спектрах растения, культивированного на среде с 0.75 мг/л 5БДУ, что выражалось в появлении в RAPD паттерне новых фрагментов длиной 1300н.п. и 470 н.п., а также отсутствием фрагмента ЗООн.п., характерного для RAPD0pd3 спектров как контрольных растений, так и растений, обработанных 0.25 и 0.5 мг/л 5БДУ. Следует отметить, что именно это растение наиболее сильно отличалось также и по пероксидазным спектрам, что может говорить о том, что БДУ в концентрации 0.75мг/л, по всей видимости, индуцирует мутационные изменения, что было показано как биохимическими методами, так и с помощью молекулярного анализа RAPD методом.

м I 2. Ч А * 6 -г

яш-ют «

Таким образом, полученные нами результаты могут говорить об эффективности использования спектров изопероксидаз и RAPD метода для изучения сомаклональной изменчивости при микроклональном размножении стахиса, а также при обработке мутагеном. Сомакпональные изменения, по всей видимости, могут быть связаны с незначительными перестройками ДНК, выявляемые при RAPD маркировании и анализе изопероксидазных спектров.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показана возможность индукции in vitro микроклубней из одноузловых черенков пробирочных растений посредством увеличения содержания сахара и цитокинина в питательной среде.

2. Изучено влияние условий микроразмножения на возникновение сомаклональной изменчивости у стахиса Зибольда. Установлено, что применение высоких доз цитокининов и многократной регенерации способствует появлению изменений, выражающихся в полиморфизме изоферментов пероксидаз и RAPD спектров ДНК.

3. Впервые определены условия получения регенирируюшего первичного каллуса при использовании 2.5 мг/л 6БАП и 8% сахарозы, а также возможность получения морфогенного каллуса на безгормональной среде после длительной осенне-зимней задержки роста.

4. Определены условия проведения мутагенеза у S. sieboldii 5БДУ и как на биохимическом, так и на молекулярном уровнях показаны изменения, возникающие у мутантных растений.

5. Впервые определен спектр изопероксидаз овощного стахиса. состоящий из 9 изомеров у растений и 4 изомеров у каллусной ткани. Установлена возможность идентификации сомаклональной вариабельности у стахиса с помощью белковых маркеров.

6. Подобраны методики экстракции и впервые выделена ДНК из растений рода Stachys; оптимизирована методика проведения RAPD анализа для видов стахиса и подобраны праймеры, позволяющие маркировать геном стахиса.

7. С помощью RAPD анализа были выявлены различия на уровне нуклеотидных последовательностей между регенерантами стахиса, полученными при регенерации на средах с высоким содержанием цитокининов. Многоступенчатой регенерации и химическом мутагенезе, а также между регенерантами и контрольными растениями.

23

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.Хуссейн И.А.,Хадеева Н.В.,Легкобит М.П.,Кочиева Е.З. Изучение возможности получения сомаклональных вариантов в культуре ткани овощного стахиса // Тр.Ш Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования».Пущино. 1999.Т. 1. С. 87-89;

2.Хуссейн И.А.,Легкобит М.П.,Хадеева Н.В. Разработка условий мутагенеза овощного стахиса // Тр.Ш Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Пущино. 1999.Т. 1.С. 45-46.

3.Хуссейн И.А.,Легкобит М.П.,Кочиева Е.З. Выделение ДНК из растений рода Stachys // Тр.Ш Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Пущино. 1999.Т.З.С.57 -60.

4.Хуссейн И.А.,Ленгкобит М.П.,Хадеева Н.В.,Кочиева Е.З. Молекулярное маркирование ДНК различных видов стахиса //Тр.Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования».Пущино.1999.Т.З.С.60 - 62.

5.Хуссейн И.А., Легкобит М.П., Хадеева Н.В. Получение и скрининг сомаклональных вариантов при культивировании стахиса in vitro // Материалы П Съезда ВОГИС. Санкт Петербург. 2000.С.165 -166.

6.Хуссейн И.А., Кочиева Е.З., Хадеева Н.В. Изменение спектров листовых пероксидаз у регенерантов Stachys sieboldii (Miq.) после различных гормональных и мутагенных воздействий // Генетика.2000. Т.36. № 8. С.1093 - 1099.