Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕГЕНЕРАЦИЯ, МУТАГЕНЕЗ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ОВОЩНОГО СТАХИСА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РЕГЕНЕРАЦИЯ, МУТАГЕНЕЗ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ОВОЩНОГО СТАХИСА"

М6ГА

На правах рукописи

*

Хуссейн Исаи Абдель Сшм

РЕГЕНЕРАЦИЯ, МУТАГЕНЕЗ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ОВОЩНОГО СТАХИСА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата шшгачккп паук

МОСКВА-2000

Работа выполнена на кафедре биотехнологии МСХА нм.К.А.Тимирязева и в лаборатории генетики растений Института обшей генетики им.Н.И.Вавилова РАН.

Научные руководители -кандидат биологических наук Хадеев* Н.В.

кандидат биологических наук Кочиева Е.З.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,< профессор Майсурян А.Н., доктор биологических нау профессор Гостнмскнй С.А.

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАН.

Зашита диссертации состоится « .»_2000 г.

в часов иа заседании диссертационного Совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии . РАСХН (127550, ул.Тимирязевская, 42)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

г,

Автореферат разослан « }.»_

Ученый секретарь диссертадилжя сц ■ {(] Г ¿7

Совета, кандидат биологщч ^ких »;; ■ < С. Мел икова

п —

№

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.. . Актуальность проблемы. Культура in vitro клеток, тканей и органов растений; представляет собой! один из развивающихся разделов биотехнологии,1 который' обладает' ■ большим потенциалом для . улучшения важных сельскохозяйственных, лекарственных и декоративных культур. 'В современной биотехнологии интенсивно развиваются такие области, как ; микроразмножение, . мутагенез, получение гаплоидов, получение вторичных продуктов метаболизма растений, изменение генотипа растений методами генной инженерии. Большой интерес "представляет регенерация растений, позволяющая получить полноценный * организмч'из , единичных измененных" или неизмененных клеток. а ■

" Микроразмножение растений ■ в настоящее время рассматривается как целостное "'достаточно хорошо разработанное . коммерческое. направление современной биотехнологии. В качестве важных источников усовершенствования растений рассматриваются также мутагенез и сомаклональная вариабельность, часто возникающая при культивировании растительных тканей in - vitro. Явление сомаклональной изменчивости, как известно, при микроразмножении растений in vitro может оказывать как положительное,' так и отрицательное влияние, на* генотип. Поэтому представляет интерес ; сравнительное изучение разных способов микроразмножения растений в плане возможности возникновения сомаклональных вариаций. ' Особенно актуальна эта проблема. для вегетативно - размножаемых растений, так как любое приобретенное в культуре изменение может сохраняться : при клонировании.Важной задачей при изучении сомаклональной изменчивости также является > выбор' адекватного метода для .своевременной и быстрой идентификации возникающих вариаций. ■ '■ / ' ■ ' ;'*'. '""'"■::■'■'■:' .,■' ■"" ■■ '."'"'■*

Стахис Зибольда (Stacbys sieboldii Miq.), или овощной стахис, представляет е этом плане интересный объект исследования, так как обладает целым, рядом ценных пищевых и лекарственных, свойств. Основной проблемой, с которой сталкиваются селекционеры при выращивании стахиса 'в России, является невозможность получения всхожих семян, вследствие чего его размножают только вегетативным путем с помощью клубней. Это сопровождается накоплением в посадочном материале фигопатогенов, что приводит к снижению, его качества. С другой стороны, невозможность проведения скрещиваний затрудняет проведение программ по селекции новых'сортов стахиса. ■ В связи с изложенным представлялось интересным

использовать для улучшения данной гг^тур" 'мггппм биотехнологии.

которые позволяют решить многие из ceoflc

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА' Мрем. CMLcKoxoa. академии

*<*<- Н. А^Тииирязевд Инв. №

. ' ; , ¡ размножаемым.^.растениям-; проблем: 1«.,, дают- ^t воз можность^- f , ^ V.'. ■оздоравливать посадочный-материал, получать:клеточные^варианты и ' >'?' I'^-'растения,обладающие новыми свойствами, проводить селекцию in vitro _ -v ;:: ,. .'высокопродуктивных ' форм,. ; сохранять ', и раз'множать уникальные ••..; • ■. генотипы, а также получать стандартную биомассу а* виде клеточных " ^

■ V »' культур ■;.» шш ,>: растений,. ■ которая может,-, служить ■ сырьем4-; для ? '■ \'. Л ; :. >■ фармацевтической и пищевой п^мышленнтсти. ;^ ,^ ^ , : Л v

. ' С- V Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была -.>

- разработка. и • ,,срав|и«тельное .. изучение ¿ хразных (методов -

■ микроклонального размножения <oBomHoro;craxHca (Stachys;sieboidii > V -.'. - Miq.) и влияния-условий культивирования на качество получаемых '-V. ; ^ растений.^; Кроме ¡того, изучали ,, возможность получения ^ новых ^v " -. ! вариантов ,с помошью химического мутагенеза" iri vitro. B cвязиУс>,;.-,;' . ■ изложенным были поста вленыелёдуюшие задачи::/ - • '.V1 'V

Сравнить -эффективность' разных ^способов размножения ■ .V" V..; .., стахиса in vitro. > J;;/?.; v v'.V.%'i::

, .V L^ *'"1.2,Получить серию растений-регенерантов овощного стахиса из '

■О.'.,. j ' узловых, ч сегментов стебля л и столонов Д п^ем;У{адвенту1вного ,л. 4 ■-• побегообразования г на, средах с; низким, . и . высоким ^ содержанием ■ ' г

цитокинннов"и после никла последовательных регенераций; '. ;., Г. i- ,. ^ v возможность индукции 4 каллуса f и ,* адвентивного л ?

.■■'...* 'v.. nniwrflnAnami)»iiuii 'm , iramivca ' ^.t№hnldil • v эксплантатов nai гшчнпгл

побегообразования происхождения

шиянз - каллуса , S.sieboidii i у эксплантатов. различного„

; ; получен ных*• растений '- по ¿морфологическим,,, и ..,■ биохимическим • признакам; а также на молекулярном уровне с помошью RAPD метода.'" г u - Научная, новизна, работы. Впервые -проведено, комплексное „; .'изучений влияния'разных условий, микроразмножения .«'компонентов '' - питательной, средына,, качество патучаемых;. растений-'регенерантов • ; '-.' стахиса Зибольдз." Установлена целесообразность применения белков их; маркеров для;выявления'сомаклона1ьных• изменений уУрегенерантов ■ " . : : стахиса'. Впервые показана возможность применения RAPD метода для > ".

; ;анаяйза ^полиморфизма- ДНК^.у^^генфантов1 стахи^ *,Г ; ' различия v на; уровне й нуклеотидных "последовательностей v как,, между "

самими * растениямиурегенерантами," так ^и ,] между' регенерантами ; и ■; , - с" контрольными .растениями. Установлено,, что', размножение растённй ,v * ■; при низких концентрациях - цйтокининов ; обеспечивает, получение ■; •. мономорфного ^ поу^всем^ показат^ям потомства^Была показана'

i 1 о

« . .• черепков стахиса in vitro. .; ,- ;..{ ..• V• »-л .„' j f . , ; ' • -.>«,. Практическая значимость. .Разработана • T лабораторная . у." ' V. л,; методика'; «- микроразм ножеиия v ^овощного у,- стахиса с, .помощью V' ' , -¡.'У, У микроклубней, - индуцированных - in vitro у,, черенков, асептических,; ■ .. V V'* растений в-.течение ; всего года.\ Это позволяет,; преодолеть явление * :

- j > \ сезонности размножения,- свойственное размножению стахиса методом 7

1 ',>: ';: ; М111фочеренкования,, и избежатьпериода адаптации,к внешней'среде. , 1 , * '' •Впервые были оптимизированы методики выделения ДНК и проведения' .'Л;; • RAPD а нал иза дл h S sieboldi¡.Путем' изофер ментногои RAPD анализа ., установлено, г появление^ вариаций сред» :растений-регенерантов, ' / Ь У /* "'.полученных на средах «^повышенным содержанием цитоки'инов и при' . . ■..увеличении циклов регенерации, ■ что полезно учитывать" в работах по -.:.„■■ * - ; ' клеточной инженерии растений при выборе метода размножения.,-, -

• Г ' ■ ■ - ' ■ v-.CTpyKtypa,и - обьемдиссертацнн. Диссертационная ' работа. ; ! * > * ' ! - " ' сосгаггшввеления, обзора литературы и трех глав экспериментальной , » ; ■ " ' :' j части,-,включающих,главу материалов• и методов исследования^две'-"у ' Ъ ^. - главы. собственных,. исследований,заключение, .'выводы список, ; „: •. литераторы.. Работа изложена на 142.страницахмашинописного текста* - включая 6 таблиц й 28 рисунков. Список-использованной литературы ■¡'У.'"'С- --' включает 177 источников.":. ь. *.' -v ■ -"-'v , ■

; " ; 1 : / ^ t, : ^.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.; • ^ .. ,

Глава ¿.Материалы н методы исследования -{■■', , : . ,>.-.i:' -V.'

у;;« ■ : 1"'В качестве объекта исследования .'использовали: асептические ' ^ ';■-■ : растения овощного стахиса (Stacbys sieboldu Miq.). Исходные клубеньки. ; . стахиса были.;" любезно, предоставлены .упроф.П.Ф.Кононковым --; .'.'. .V';. ■ (ВНИИССОК). .Стерильные проб!фочные растения и чашкй Петри.с : ; - . эксплантатами поддерживали на среде В5 Гам6opra ( Gamborg e.a.,1968); - ; ' l-4-,';'" ; * - при 16-часовом люминесцентном освешении и температуре 18 25°С. . -'. '-• Каллусные, культуры'й . изолированные .столоны '.культивировали в ;*

г , 1 . ^ J." темноте в термостате при температуре 26°С. ' ,, ;t^..., t:' \ 'Л'* "-' ' ■ ' -Г"''.- • -'>;'. ,-Прн микрочеренковании стерильных растений if для удпинения ' ; ■S*;''. иподращивания регенерирующих побегов - использовали гсреду ' В5 *'

Jr i : ' ■■ . VT Vi.. ■ - f..' 1 - ■

• - ... v.- • . • :. - i. ■■'

" •••••"л".

.,'---; . - •"Для укоренения ; использовали ' среды 'безрегуляторов < роста - или>' с <

' '.'добавлением ; 0,1У ' мг/лу г ИМ К/ * 'Для•:';•/ нндукции * ; адвентивного У ■ " •. .V "У'У- побегообразования использовали среды Гам борга ¿7 и Мурасиге и Скуга;.''' -v;-"лу (Мига5{^е,5коо2, 1962) с низким ( по 1 мг/л каждого) содержанием 6- -и * : : ' - ; - БАП и кинетина, атакже высоким (10 - 20 мг/л)содержянием 6-БАП.у ( У У у ^ ¿у По. -'мере ; удлинения;"':растеньицих .отрезали ; и / поддерживали У; УУ . Г;- ; ^«рильноЙпробиротной культуре."-', '''У /У' ^--л'

! ■\'Для индукции столонов в срезы добавляли ■ 8% сахарозы, для У ¿У У * . У . индукиинуклубней• ее (концентрацию увеличивали - до >12%. • Для -. ^уУ. > '^ У^ столоно- и клубнеобразования, в среды добавляли кинетинV •''/.'у

-У _ или б-БАП в концентрации 0,5-У 10 мг/л.'абсцизовую;кислоту (0 - 5; '; V^ С • ' , мг/л); и галактозу (2,7 - 5,4%). Одноузловые сегменты? пробирочных п1/^; 1 растений погружали в среду до уровня боковых почек ¡вертикально и

; (5БДУ); ■ который ^ в . концентрации 0,25 ;.-: 0,75 ■ мг/лУ вводилиг; в , V ^ ; ■ ^' ;- п)ттёльную*фёцу/ : Одноузловые' черенки ' культивировали 'на этой -У'-'.;-;-у.Уу -среде в течение 3 недель,1 после чего эксплантаты переносили на среды , Г У У';: без мутагена./ . .; -'УУУУУ ' * *У V -Г •:•• • У;--

, ' ^З.У' Для определения катод ныхперокендаз' использовали методику, % »У

, 7 >оптимтированнутоБияшевым (1986); У ' -•••. . * ' -

■> " У У У:_ч ГОпределение стахиозы в листьях, столонах и^микрокл>6няХ ' ^ А V V стахиса проводили мегодом Харборна (НагЫнпе, 1984).; ' У • Н , : - - - ; ^. -• ;•'.• Дл* - приготовления^' временных препаратов; растительный УУ V ;

У;матерная фиксировали в аиеталкоголе'(Зг I) в течение Л суток,-после ''

^чего переносили для хранения в 70® спирт.' Окрашивали ацетокармином Уч У, "по^ общепринятой .'.методике' (Паушева, / 19S0X-фотографировали: с .У // ' -. .' помощью микрофотонасадки МФН-11 на фотопленку Микрат-300. . У'лУУ;

; У Выделение' У ядерной растительной „ДНК ^производили на -. :

у у основании' 'протокола,' предложенного * Edwardset.al; . (199!)," в . ' ■" У модификации' Дорохова и Клоке • (1997). Дляиепной» полимеразной . : V •;4. •• • V реакции использовали наборыреактивов 'производства -»"Biomaster" У-;'.' (Москва) r)i "Promega^ США). 'Для RAPD анализа ^использовали ^ ; -.1/коммерческие»'" олигоиуклеотидные V праймеры 1 'фирмы У"- Qperon .'' -

- ■ УУ ,ТесНпо1о81е5,*'А1ате(1а,,(США),';а также праймеры, ранее разработанные

^ : _ ¿ . для' маркирования' генома ; пасленовых'' и .'злаков. * Реакционная смесь У УУ •>ЧУ ' обьемом ]5 мкл'содержала буфер для; Taq-полимеразы;200м кМ dNTP,; . y i 1 2,5м M:MgCl2*,5'! м кМ' прайм ера, * 1: ед Taq-полимеразы^О нг ДНК." У

- . Полимеразную цепную реакцию проводил» в амплификаторе "РСТ-150"'. > > '' (MJResearch» США) в следующих условиях:5мин 94°С; 1,5мнн 37°С; - . ■

J V ■"S.-^'-t ^ У '.. У:;- . —л ;v • ' ; V.;;; "y'pi ; Ц .">;"

„Г *'-;.—;. ■'.■ .-»:'. ■■ ■■,„>■, ■ ; - - ■ ... ^ , ...... .• . .

■;■. ;:- • : -.'Л '•"> •• . V-- •• • -

а- -' г "У-"* ' V- * "•'"-/ч '

• • 4 1,5мин 72 С, - 1 цикл; 1 мин 94°С; 1мин 37°С; 1,5мин 72°С - 33 - V

" ' цикла;!мин 94°С; 1мин 37°С; 8 ми/1 72°С • 1 цикл., Продукты реакции - •* амплификации разделяли электрофорезом в 1.7% агарозномгеле в 1-х

, . • ТВЕ буфере, окрашивали бром истым ■этидием (1 ыкг\мл)>;

'■■'фотодокументировали. ..'„ ^ Ч - У ' ■ /'.

¿■•■'.у:, ' 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. к

7\"7'-- ■ • *. Овощной • стахис 1 (51асЬуз - ' М<д.) „ - овощное ' 4 -

)..„,,.. _ . _ -. . ... . . - ... - •• . ?

'V : '' : процессе регенерации измененных форм; а также индукции вариаций ;

' при помощи;мутагенной обработки эксплантатов стахиса /иг уг£го. и - у*,-. :

* Г г ' ^ * определению'* * возникающих ■ /изменений на,' морфологическом, ' ' .

. ; ^- '. биохимическом и молекулярном уровнях/ В целом общий план работы ' ' V ~

V V ' схематично представлен на схеме 1. о * - Г ,,*;- V '

■■'■V ■ -V " V. :• • Л ' ; ■'-:■ "-<

.-'£ ; Глава.3. Разработка и изучение эффектняностираэнызспособов/ <1„ микроклоиалыюго размножения БисЬух $1еЬо1с]Ц 1п \iiro. ^^

у ; » 3.1 Влияние цитокининовна адвентивное побегообразование

• .у¡рловыхсегментовстахисл. - . , • ц:.

.Й':/;- Было изучено влияние низких и высоких доз цитокининов на'' ^ [штслсивность образования, аавеитивныхпобсгов у-сегментов "узлов * \

• - ; ' " ' ' *••" ово^диого стахиса«^Розультйт^л иокззяхо^, что доставление восх изучеииьсс' ( ' -

концентраций 'шпокининов к среденГамборга 1 вызывало' активное ^ ' образование адвентивных почек и побегов из узловых сегментов стебля >' - > : * ^ и столонов при сталдартных условиях выращивания; Следует отметить, ; ■ ; : что образовакие адвснтивных побегов происходило только на узловых;. . ,

сегмента "(т.е. % при ' наличии уже. заложенныхмеристем , или , у

; »,' : меристематнчсскнх. зон),", из ,междоузлий или листовых, сегментов'^

• • регенераини получить не удалось. " V' • '•.*' • "У-

V . >'• " " На' 'средах с : низким уровнем цитокининов'. наблюдали ■

•• .'одновременное- *т с-- ■ ; V'• •'' V:"•' ^ г •'•

лу '^л: .■'.,. -:''.{■. '■'.■ * -' '•" • , '"•• ^ •.,

-/•••■П' Гь . Г. ..-•• ••V'^\ ' • '

V •.;': .V*.; • 'V .л:; , ;; ■

г, к ,*" - " , , •■>•' ..' у [.■■'* - '*■:,■■.. »

■.■"■■ ■;■;*"-,' ■ ■.■'.■'■■■ -¿■: :■ л :

. •:• ••• ••/.•; ■ - '*■■; л .. . - •• • ' ■*■ '.■

" ■■ ■ V" ' л./.. ■ ■.■•.-¿'Е • ■ 'V .V". . . . " .

■ '■'■ Л Л * : - V- * .л- ъ ; ■. ■ ^ г ■ . * £ *** ' ' V-, . ■ Л ' ^ ' ■

*' А : >ч\- ■ . - + \... ■ ; - ■ ^ . . ■ ■ ,. . ^ ... ч ■„ . . т-, . . ■ ■ ■ -- . л.. ь ь

ч ■ - . - : л . V ■■ > г : .... . ^ ■ . . , , ^ ■ . ■ . -ч . ^ - . ■ „1 .; -

рисунке:

Ислодные^астен!« сгахиса ■ Черенкование.;.:1' 1

пряма* регенерация

' каллу «»образование ; • (уэловые сегменты)

мутагене! (5ЕДУ)

. Чепен«£вание

. . _ . _.. .

среды ВО :М1 ЕАП20 БАП10 Б8+2.5БАП ВО М1 ВО

. Ш Ш' ШШ.Ш

растения растения - регенераты растекия-рменерангы регенераты

клубии регенер&нты

" """: " ТТТТТ

среды:ВО В8+2.5БАП ;

■ ^ + ■ ■ ■ -- . л" растения" клубни / - регенеранга

среды:^^8<-2,5БАП ' -: БАШО.

. ^ | •• : ■ Ш/

растения клубни / регенераты/

^гкческих прюнаков отЬхимкчес^ий анализ молекулярный анализ ]' "■.. ' иэояерокендаэ ;' ЛАРРРСК{выборочно)

хроматографический анализ углеводов

Результаты настоящего исследования изложены в 3 основных разделах, которые посвящены разработке и сравнительному изучению эффективности разных способов микроразмножеиия 5шсНух ¿¡еЬоШ биотехнологическимя методами, изучению вероятности получения измененных форм в процессе регенерации, а также нндукинн вариаций при помощи мутагенной обработки

Индукция адвентивных почек из узловых сегментов стебля -(концентрация 6БАП 1мг/л, 4 недели культивирования).

V . Было показано, что 6БАП был гораздо более эффективен в индукции дополнительных побегов, чем ккнетин (табл. I). Если при «стдь-ьоъашш кинетина в концентрации от 1 до 5 мг/л а число почек-от 5 до 20,1 та при тех же концентрациях 6Б АП число побегов менялось, примерно втех же пределах, но Число почек возрастало от 40 до 100,, т.е. при использовании в качестве . индуктора адвентивного побегообразования 6БАП эффективность процесса мюфоразмножения : возрастала более, чем в 5 раз.- - / . ,, )■.'

Из .иггсратурных данных известно, что применение высоких концентраций цитокининов в. питательной среде, увеличение длительности пассирования * in vitro, и многократная регенерация повышают вероятность появления сомаклональных вариантов. Поэтому. -мы использовали еше,. 2 системы регенерации: на. средах с очень * высокими концентрациями 6БАП - БАП10(10 мг/л) и БАП20(20 мг/л), а также многоступенчатую регенерацию (регенерацию из регенератов) .■■ 7 : ■ V- . ' ..':<...• ■ \

Влияние вида цитоюшина на индукцию адвентивных побегов и

плидв* пли in/nLimiBiftWiiifttiitu Ь1лпиплваиии^ РТЛПЛИЛО ¿»-г** •иле1''

Г.- Концентрация цнтокииина,, ■■■.■ мг/л ' • Среднее число адвентивных побегов и почек (в пересчете на узел) ■■ "■

- Кинетин . 6БАП г - Побегов - Почек ■

л 0 ' • 0 - - ' 0 - " ■-'

1 0 ••• •. 2,9 ± 0,4 " • 5,4 ±0,5

' « 0 - ' - 1 3,8 ± 0,9 V-.-. ^ 43,1±6,5 • -

.-:.. 0. ... . 3,2 ±0,2 v ; ... .1,8±0,5 •

.. .3,6±0,6 . ^ % : 12,5 ±1,9 - .

" 1 5 0 - V, > 1,7 ± 0,3- v • Г , 20,5 ±5,1

J 0 • .. 5 / ■. . 2,1 ±0,5 . - • 114,8 ±8,7 •

- - среда Мурасиге - Скуга, б недель культивирования, концентрация ргуко,1мг/Л ,\..,4.v';■''v'• ■■•;' :' то же,'2 недели культивирования~ „ :' чг" ' ч ; • ' Г * '' ^ ;на среде БАП10 (смххему, I ).В "этих уеловиях получены еше Зсерш' ; реген грантов -со сред БАП10| БАГОО и после 4 циклов регенерации на .средебап^О.о ; -

; - г. . ' Таким образом, можно успешно размножать овощной стахис,f_; используя адвентивное побегообразование из узловых сегментов стебля г ^ или - :столонов ■ на средах' с'.'" шгожиниками.* Эффективность ; • микроразмножения стахиса' с ■ помощью1 образования дополнительных : побегов во много раз больше, чем при микрочеренковании, tan как' из i; одного асептического растения можно получить 'б - 7 нормальных' растений,: - а из -одного ~узлового .сегментаJ при ; минимальной>'- концентрацин цитокинннов а среде (1 мг/л кннетина + 1 мг/л 6БАП }, - *; до 180регенерантоа./ f K-'^v •' * "« ""-> _ l/'

; ' • 3.2. Изучение влияния соотношения ауксина и цитокцнина в

■ , . : I

; Л

, концентрации, но и от соотношения содержания шпокинина и ауксина. Так,5, изменение^ содержания ; кинетина от О,Г до "3,5",мг/л /при ' г '7 " концентрации ауксина 'от 0,1 до Г мг/л довольно 'слабо влияло на'/ индукцию дополнительных побегов (рис.2 а); В то'же время длина"" ' : побега приэтом менялась более значительно (рис.2б). При этом • " наблюдалась явная зависимость^этого признака от содержания ауксина V • в - среде.'; _ Наиболее ярко было* выражено1; влшшие соотношения * V - ; фитогормо'нов на такой показзтель, как количество корней & пересчете С;-наэксш1антат(рис.2'в).Мч^')'7)''>" 1 Гл''-V•

Л' .■ "

1 . а—. ;

■'-.* ' V--" '*■ ^

■ ■■ ■ С,'

/К/а 'о■

г'Т,*^ ТА

■ • »л

О

# Ы1. ^¡йй^ ^ -г;;;.^ ■ЧУ^^1'^ Ц'^гу У? л|

—♦—-РЯд1 -*—РядЗ

м

концентрация кинетина,мйл

'л;';1 '■■'•>

' ■ ? V • :. -• - .

■ V 1 И V; 1 ' : '

. - Рис. I. Вдииине соотношеницуксии» я кинетии» н» проиессы морфоген«» у > \ :;*.

■? "'ч1 ; .' * ' сеГ*,<',т,>>«пи«»«»!^' ..• - -ч.\ *."■■■;'•.' '••' ■ ■.'■

- ^^ Рнс.2. Влняннесоотношети"к11нётинаи НУ К начнсло (А),длину.

• побегов (Б) , и ч колнчество V¿бракующихся г ^ корней (В) при •> ' культивировании стеблёвых чфёиков сгахиса т \itro. ; ; V' •. 1

" .'. Все эти результаты позволили; определить наимеяьшие / ^концентрации, ауксина и цитокининаГ при *которых образовывзлись ; ; более низкие, чем при обычном черенковании, кустящиеся формы сг . .хорошо развитой корневой системой. У них был несколько меньший,ч > ч«л у обычных пробирочных растёний, период адапташт ¿ условиям , ^ внешней "среды/ А; из-за того, что такие растения имели несколько...' . побегов, ' у них повышалась г вероятность образования столонов,, и, соответственно, клубней.'Использование подобных растений в качестве г. посадочного материала, может, значительно повысить . урожайность Жданной культурьи

ч- ^¿.Разработка;, микрокюнального размножения овощного

• стахиса с помощью микрокчубней ?, ; V; '. , г.:, *

Уч > , Была поставлена задача оптимизировать методику получения ' , -'столонов и микроклубней у сгахиса ш предложенную в работе■■

' ■ -г1.;■ /V.; ■ / '^■■'г-

- ч'*/' " ^ ^ ^

-í, •¿.i'*1-'';,' *

: 'V '- Хадеевой^ и Гордон* (1995).*- Было • показано,что культиви^вание* * > -V-.. t черенков стахисз в лробирхах даже при 16-часовом освещении на среде, 4 ■ .' ^ ' ^ ■ содержащей ,6% 'сахарозы • и 2'-/2,5 мг/л; кинетика,приводило' к

* замедлению роста побега^ укорочению . и - утолщению - междоузлий,'^; ; г-«./ - - - " уменьшению размера* листьев/иобразойнию »' верхушечной г части . ; '

, Ч^ стебля' клубнепояобных структур средуиироэанйыми, листьям и { рис. - ' за,б).»-> , .-w

- ; ;,. :-' При повышении концентрации сахарозы до 8 12% н кинетина - >

у ¡ * . _■■. ■-•у . ■ » (1 I - . ...у » ■JT': .«2- , ' ■

i"; ( V 11 i'- - i ¡ '"Н* • -1 ■- J'f ' "■-)' ■'■ ¿ív ivtlS - V -

• . • Г -i •• -\2iWs/ I • - ' O' --' ■.■;■; •

' 'i ' f44 "V* ■' * ss' . . t i- y,/ Sf" I J 6 • ■ ' ^

í.-' ■ ■ ■ - -, '■„■■'■ : * . -I ■ ■■-' ■ ■„; ■ -

.. f!-v, i ,-7y .V'. •:• --1.:. ■■■ ¿X ' ■■ -f. • ..,> {</

; v. ?-¿г<:л:>■ i■■"

_ ... >' .' :r - - ■ -í' -

: у.л,1 V;±«г-1 м.г^р,.;.= МЛ ■:>; м':'1 г?,"

* "'■ -У а;'-¿и''1';' /> • - ■ ■-'"; V-. ¡.V л..''.- ■ •:

. V-,.- а; ВГ\-д . 1 : • • •;«

^ ' ^ й - 1 ■ V .-у-.и*.-:■ .-.а> -.

, ' рис Л. Обргиование'кпубиеподобных'сгфуктур из верхней части. •'

-."стебля стахиса на свету на среде с 6% сахарозы н 2 мг/л'кннетина (2 ; '.*"';• . -~мес. культивирования) .. • " : V'' '.."у,.--' . ''

".I;;1 '. 'Аналогичное действие1 оказывало' добавление в'среду вместо/ >; _ '. кннетииа 6БАП.' Следует отметйть, что как и в случае адвентивного.1 " -'

С,••• _ : '. :<:. •;.'■ '.'••• .. г I . * ,^ ;

'' побегообразования;6БАП оказывал более айьное влияние на стадоно-' ; „- ; . н ■ клуб необразованней Во-первых,'" для полного 1 прекращения*' роста Ч - ч

плйап м пптмшйи^а о г*гг\пли иЛцн^итАшт й спеЛе ' . л

С У образовывалось от 2 до 5 столонов,' а'при увеличении его концентрации У . . . У:.- до 5 мг/л вместостолоновсразуобразовывались микроклубни (рис.4).У ^ V 7'

контрольных растений образование столонов начиналось; не у' всех . : " пястеннй и не оаньше. чем чеоез2 месяца культивирования и . "У *^

■ у'-1:- I. * - +

"г *

• : -. *-r ,■>«■■'■■ -.-.., i ,J r\S ./-t..--:-.: - ■. л ■... < ^ * -, -, ■,■

• ' • ' Щ- ? j rf •• •. г- : • i-; • y/., y-,

| Т " "г! ' - < ■■ L, ^ J '

V i ' ■'" - '

Ж

l'1

■■г

Г-т?-»> С.- - У ■ I- и^- у.к ^^

;•' УУ-;-: ./г: > у- у-у г V ;.• .У у

■ ; ,' Ряс.4- Образование столонов и микроклубней из сегментов стебля - ' , У. . на средах с высоким содержанием сахара . (8 - 12%)^ и "различной ■ . ' - концентрацией цитокининов.А -8% сахарозы, 5 мг/л кинетина^ неа.к- •: •,'' ^я.Б —; 12% сахаосвы.,'10 мг/л ¿синетина." 2' нед.к-я.В - контраль (2% ■1' ,

'-.х.^ Образование микроклубней можно было индуцировать также и ,

у изатироваиных столонов,' хул1ьтив1фуемых в чашках Петри на средах , У

■Л,-

у-/-';. • --г^ •;; К:':'.'

I;. »¿"высоким^ содеряаннемсахара н'шпчжинина (рнс,5).4 Стимулировало : г у ; клубнеобразование добавление абсцизовой кислоты (2 - 5мг/л). . . •* -

■ ^ + Г Оказалось возможным вызвать'пояаленне^клубией у.2'~\ 3-недельных .

''пробирочныхД'растенвй';/'у®в.'"1*8 мае;июне \без'; использования".' - фитогормонов; только * при • выдерживании растений в ; воде пр и .

■ ; . ; '' пониженной ^температуре (8"С). Это -гем .'более интересно^ что при

осенью и зимой и ускорение весной и летом (Халееван др.; 1995). У .г. ^

'.п- —________:..*_____к ___-______ л.... т.

V.-' ' • ' .' - '*■ ^ ^ ■ ;

;. '> Рнс.5.*Формирование микроклубнеЙ на изолированных столонах '.. '. 'У на среде с 12% сахарозы, 5 мг/л 6БАП и 2 мг/лабсцизовой кислоты,*2 культивирования." .V;; ;; г. :.' ^ Г••"•. . ;-,. V :. ~ . Таким, образом, используя в некоторой .модификации, основные г^у : .- методы индукшшклубнеобразования, удалось^ разработать достаточно й ^ V : У;,' простую и удобную методику клепального размножения стахиса ■ о 'У,:: у;• /•• •* ; ч*• •.. и..'1 ; -: ,*• \:1..12 •••< '' "'^У

? ** '. * V • "V ' ' < '-"■"-*■'''■?' г'*"■'■> ' .■ .■-'Т.-''

..:' экстракта'микрокл)*>ней показали наличие у индуцированных кл>бней:57'*'

\ 1 > ■;■.:7 характерной' формы и" присутствие! в*. них уникального тетрасахарйдз .»'^ 7 стахиозы.; Эти .результаты; подтверждают ' клу€невую 7. природу. '

V \' ' ' ^ ш«ушфуемых'"структур. Несмотря ¿на ; меньший ,'по . сравнению: с.'07 . д ' *-;: V "адвентивным ~побегосбразовшшем. коэффициент размножения,1' метод ; • -7^77777. индукции - мнкроклубней- представляет ; собой - весьма перспективный 77;'

. . , способ микроразмножения овощного стахнсц.4 : • ,' ' ; ,•" "'. :*• ,.'., — , • „ V ,- ;;, '„' " Изучение каглусогенеза • у стахиса и . регенерация

^Ч-Н'г/ растений м? каллуса. Д ••' ^ ''.».'^С • '.77 .. • ,' ч; -

'•;' .» - ; ■ ;~3.4.1,11ндук11ияка.щясогенезаVстахисаУ'-У ; , . '.'»О

• /..- -Как известно! при регенерации.растений из,каллусной'ткани^*; -

■'.'. " вероятность появления сомаклональных вариаций возрастает. Поэтому , ч ' нами была сделана попытка индукции каллуса у стахиса н регенерации ' > . >' . --.- из- него • растений. При изучении влияния разлнчных ауксинов на "

, (ХФУ) кислот, например, при сочетании 1 мг/л 6БАП + 1,5 мг/л ХФУ.; 5^77 '"• 7 При этом на срезах быстро появлялся белый ¡каллус,' который, тем не у 7', ;;. V менее, при дальнейшем пассировании: постепенно темнел ■ и погибал .*?: ■ у.^-- ' * через 10 недель; несмотря на введение антноксцзантов <аскорбнноваяГ' -Г'-у кислота, поливинилпирролидон, цистенн) и частую смену _ среды. ^ ' ¡¿Г : Возможно, это происходило и>за зйачитоьных "количеств фёнольных ' -I .Д^ компонентов.' С':' 7 - 7 7^'-77 ^ *77' • 'V; ^ ^7; :*;... . 77 • - > у ' Таким образом длительно; пассируемогокаллуса X, при 7 V . '"7 '■» ' ' использовании 19 различных. вариантов соотношения концентраций' 7 7 7: - 7 -7:" 6БАП и ХФУ "в среде получить не удалось. Плотный коричневатый * .;*; -нёрегенёрирутощнй каллус образовывался также*'на концах узловых" 7'

V; Х^/' сегментов растений стахиса' на среде. В5~с',2% сахарозы* при высоких " •: •; ' ;^7' 7 ь' (более 5 мг/л) концентрациях цитокининов. ;•-;'•.-/ 7' 7 ^7, ' V !

. ■■ ; ,.....ь : ■:",л, '-,-^^' -у-' **" , — " '

:Одной, нз' следующих1 шч. было получениерегенерантовнз" ¡. ч , ; ^ каллуса с: целью тушения возможности по'яаления сомаклональны!с'( > -1 ; .' . вариантов,- при таком способе микроразмноження стахнса! _;При'. у • ■ у указа ни ыхвьше соотношен нях ХФУ _ и бБАП среде 1шн -переносе' ■. V ■ - ч •образующих ' каллус " листьев 'на "среды1 ^¿/высоким содержанием!' Г • • , . ' шггЬкннинов регенерашт растений из первичного листового каллуса не % ' 'наблюдали.-Только в варианте' 1,(0,05 мг/л бБАП +'0»25 'мг/л' ХФУ) , ','- ' >Х'„V отмечено появление корней; Такого рода трудности при регенерации из • . -; -Г - ; , каллуса характерны не только дня стаяиса и описаны для ряда друптх .

г ' культур (:;<Ыагауаг\зд/ату, 1986, ,уЛ1ггеп5 , е.а.,1988 и др.).' Однако - * ~"О . у\. ^использование - других ' соотношений компонентов; среды^принесло-* , ^ --,' . положительные результаты* При пов ышения кон центра цни' сахарозы в/' V >:' среде до и, использовантгодного цитокииива (2,5 мг/л^ бБАП) в г *•

месте сопр1Гкс«'новен1«уузловото сешен7а стебля со средой удалось". ; -; инициировать интенсивное ' образование светлого каллуса, накотором^. ,: *::

^ одновременно происходила активная реген^ацщцаетений (рис.б). -.-*

V. '' ^ . -'-."V

• ' Рис.6.^~гРегёнерируюш1й7каллус, образовавшийся1 у' основан!« ■ >,\ . -.; \ ■-'.*;; сегметгуастебля ст»х>1санасредес8У»сахарозы имг/л 6БАП."- ^1 Г; / : V" ■ Кроме того^отмечалось регулярное спонтанное образованиХ ; V/, '

■ г ' \; регенерирующего галл)'« на, без гормональной" среде у - основания .*:', . основного побега, которое наблюдали также после длительной зимней - ' " задержки роста, когда черенки, пересаженные на свежую среду в ноябре

....... -^ декабре, !качинали акт«вно расти V феврале^марте. Сезонная Х-',..

' - зависимость^ поведения растений в кулыуре, наблюдается и у других" .видов ' растений (ТаЬа1а, : МоЮуозЬГ ~ 1965' ;Морозова', Мелик-' :' V,Саркисов.1982;%АнлронЬва, Лемешев,)992; 51п1, ОЬаг,1997; Вел ,7ошга' ;; е1.аК;1998),' На окрашенных ацетокармином срезах регенерирующего >. ^ .: ,: ^ .. 14с;• - :: . - • ^

i...' 0 X-'s '¿-".VV . ') ' ' - ■ * ~ ; '."" .•.»• • *-v,» ■

ввдньГ' oTienbVue .MepHCTeMaTMMecKHe очаги' и ---' развивающиеся; почки,- вкрапленные >в 4 недифференцированную V'J v - л ч каллусную массу, , т.е.*" можно сч итать, что кажды й регенер1цэуюшнй, * . ■ V 1v • I побег'происходит, да" разных клеток.'; По мере* развития,1 регенеранты, /,'. ■■

ч * ** * . iVTMWlI В4 rt U |%ЫЧЛЛА . Adi (All U1У1Л' m*hU '' гпа 'лии^ паЧЬЬЙОПит. "в . ; i f *

i .. л. ' . . ' - ',-i' > * nnriiq ч wv^HWJitf nvt<>4ivjjn ,. « iiii—■ ■ ■ 111nщ WMV^/л^иoit^iti / f .

< :.;. -^сахарозы при'добавлении только одного цитокинина (6БАП), впервые1 : ..'■удалось /ишхуцировать'■активноЧпрояиферирующий , каллуссгахиса, \ ; , -.„вызвать .в нем л образование--de r novo .мерисгематнческих - очагов :к - ,«- ^.получить.пагаоценные.растення-регенеранть!. Кроме;"того, выявлены

• Уусловия, позволяющие' вызвать' индукцию регенерир^шего каллуса -J;",>_ 7 .^сгахиса и растений-регенерантов на среде без фитогормонов.'л;. ; ^ ■ vW ■ "i ; ' ■ " 'Получение коллекции ^растений , после ^мутагенной -„"■;-\ о ^обработки 5-брамдезоксиуридином.\* ; - в,.-.-:;;../-,^-''.' г ?'

V •. ' ' Возможность получения "измененных форм у сгахиса , путем" " i v мутагенеза in, vitro1 изучали,Sвводя:'в питателъную среду в качестве",

j \ ' - мутагена 5-бромдезоксиуридик в концентрации 0,25 - 0,75 мг/л, так как^-'¿^ ■ ■ ! при ¿более > высока : дозах все ^эксплантаты ^погибалн.^В качестве V,

1 ~ , э ксплантатов исполио вали' одкоузловые / сегм енты ' лробироч н ¿1 х , . ■ ■ -. ■ ^растений * сД пазушными почкамй,'.^ которые,' культив про вали,,в ■ ¥'г:присутствии мутагена в течение 3 недспь,"после"чего переносили на ч

, - ■■ - - !'

-'.if

- . среды без. мутагена^'' Коллекцию растений,- полученных; из побегов, * ;выживших после обработки.мутагеном"на,среде без.фйтогормонов, и5 \ регенеранты. ' полученные^' из . мутагенизнрованных - эксплаитатов ' на ■ : • -,1 регенерационной , среде, V.поддерживали в стерильной ' культ>ре ; . черенкованием. г ; ¿'г '>■ • . •• •

< Глава 4. Характеристика растепий-регенерантов'овощного •; . . 'стахиса, полученных различными методами. , ,,

" / ; 4Л Морфологическая характеристикарегенерантов.

Г ;: ' . ..^ Результаты. наблюдений • за.- морфологическимипризнаками

* г'^/ . регенфнрованных :разными , способамн ' растений сгахиса показали - ^ { > Г отсутствие заметных изменений.' Ни в одном *> из' типов' обработок не ^ / -' '»было обнаружено появления -карликовых' или альбиносных- растений, '' * ."

*- и опу ше н ности.' Поэтом у дальнейшее изучение. : ' - ' "полученных', регенерантов 'проводши'.с помощью нзоферментного н ' : ■ НАРЭанализа... ''V''' . V Г'У -; 1 'V; - V ' ^. - ' Изучение спектров пероксидату исходных растений и Л -'. ре'геие'ранщовсгахиса.V- '-V. | ! V?Определение ^Пероксшазныхспектров проводил» по ¿'ранее о * ''<описанной методике (Бияшеа,1985): Наши результаты свадетельствуют . " о том; что в листьях 4<недельных растений стахиса определяется спектр' .'

^ • ' * ' . - ^^ • ч., ''.■■.*.• V ^ , - » ;, ^ .-ч,- ^; ■

- - "-у \ V 4 "" '. -V ■ ' ^ ► ■ ^ I ' ь '-0, г * ^ ^ * '

■л-.-''

из9 изомеров пероксидззы. Впервые был определен спектр пероксидазг Л '': > -г у. стахиса, состоящий та 9 изеялероъв листьях 4-недельных растений и

изомеров в «саллусной ткани/ ^у ' '^ ■ *.'"..•' 1 * ' :'•

: . , ' ^ - Спектры-.пероксгшаз; регеи^антов, пслучедаых .п р^ . .. - условиях; ^ приведены на^- рисунках - 711. При , их. анализе * ^ обнаружившись,'в основном. З тшта спектров: 1) неизмененный ( 9 у " ';•. • > ; " полос), 2) с отсутствием или ослабленнемодной илн более' полос^ 3)' с ^ V.' поя алением добавочной полосы (или усилением окраски). '•.'„-. л- С ^ •* ■. -

I© « иШЭ

, """-у . :-у":*-

"Г ; изоперо^даз у регенерзн^ов'-; ''ст^1саД-- . ;

\ получении .при прямой регенерации из .узловых сегментов < стебля на * - -.Г.*

среде с 2% сахарозы, 1 мг/л кинетина и 1 мг/л 6БАП (А^ 2% сахарозы и ^ .. 20 мг/л 6БАП (Б). К - котгтрол'ьное растение. ; ' • ч ' У.- ' -.'-У":

* ^ ■ .> ■■ -

"ч ■ : ■ * * X , ■ , 7- Т.' : ^ '' ■ ".и- '■^У ; ¿"-^г'Л . ■ * - /; К ^ ■ ^ -

— ..... У л: ^ "

* »V- I ■ ■ 1

■ " ■ ' -г.; ". ■ ". 'V."" { "■ ■:..'-г.-. ь ■ ■: -;■.;' ., ,■. у ■••*;; ■. у-

с , ■■ ■>.■ .-,--■■ ; ■■.■ --л. ; -- : - ■*! ■■■ • ■ - ■■ ; ■ ;■-"■■ .

' ' ■ 1-.';.■* : :( . .ч ч .«.» ' '•• " .

.! 1.'' • 'л/';*'' -' " 1 • ■ ■.•'--''ь ;».' г, г("м>(,;,,-":*1 ; ."..'¡г«,^:''-"■•- '■•у, .' ■

. * • • .'1<С I'--- > .<• ; .• . • •! ■ л - >■; ■■"■.■

• I '• -л.» . ■ **** ' ■ ... ^^ ^' :: , - у. • V <■ '

I ■ г*. ■ ** ^

■ ' Рис- 9. Спектры изопероксидаз регенерзнтов после 3*неяельной -обработки 0,5 мг/л БДУ ''-у".:V-. 1 на среде с! 0 м г/л бБАП/у,';.. - %

• >;.

•. . % • •• -¿.г

, ; I V '

' " 11 ^ I* ,

: г* ■

- • ' ... * : ' .л 1 "■■*■■.■■ ' ^ - ; ■

* V ' '■ " к. ' ' ' •. / ••• - 7" г • Г■:> ■"* - •• -

■ л;■ ■ь ^ / . . - ^ . '■ 1 -. ' ■ " - ^ ■ .'" '■ .■ .л . ■ I' - ■ ' г ^■

РисЛО."Спектры изопероксидаз регенерантов из каллуса со '. V среды с 8%сахарозы и 2,5 мт/лбБАГТ. К - контршь'Д:', : ' ■

' -у-

.-'72.• 'к / к '

7 :Р»«»!!." 1':'* Спектры '^юопероксидаз V ч 'регенерирующего ' "; и ^ '. ' ' : и ерегенер ируюшего каллуса стахиса. К - листья контрольного растения. -:. ' ; * 1 - регенерирующий каллус, 2 - нерегенерируюший каллус. ." • < ' - - ■

■' .V- -.,'0.- .• • - 17 > .■'.. ■

.>••:.

. Изложенные результаты свидетельствуют о . том, - что использование низких концентраций Сахаров и фитогормонов (2% сахзрозы+1-2 мг/л 6&АП, кинетина и АБК) для размножения стахиса не вызывало серьезных изменений на мифологическом и биохимическом уровнях (на гримере кзолероксндаз). Возможно, такие концентрации экзогенных фитогормонов не приводят к серьезному сдвигу внутреннего гормонального баланса в тканях эксплантатов. При более высоких (10 — 20 мг/л) концентрациях цнтокннинов .и при многоступенчатой регенерации происходило исчезновение ряда, изомеров пероксидазы. Чаще всего наблюдалось отсутствие 8-ой и 9оЙ полос, ■ а также 3-ей - и 7-Ой. Следует отметить, что увеличение концентрации цитокинина от I2 до 10 мг/л вызывало возникновение : меньшего числа изменений в спектрах пероксидаз, чем повышение его содержания с 10 до"20 мг/л или многоступенчатая регенерация: в последних случаях изменения иаблюдалнсь у всех исследованных ре ген фантов и они были сравнимы: с изменениями у регенерантов,

полученных после мутагенеза. : ,;.. _„-■ - - \ ■ ■ ■/ 1' V

Из растений, выросших на среде ВО после 3-недельной экспозиции узловых черенков на среде с добавлением 0,75 мг/л 5БДУ, у трех -^отсутствовали полосы 6, 8 и 9, остальные обладали очень низкой экспрессией. После обработки 0,5 мг/л мутагена сходный эффект наблюдался у одного растения.: При использовании 0,25 мг/л 5БДУ отмечалось только снижение уровня экспрессии ^ полос 1, 5„ н 9. Поскольку; известно, что; 5БДУ включается в ДНК, более вероятна генетическая природа , возникших после; мутагенной . обработки изменений. Возможно, высокие концентрации цнтокннинов вызывают нарушения процессов физиологической регуляции в клетках или некие: изменения на молекулярном уровне. ,

Таким образом, изучение спектров пероксидаз регенерантов овощного' стахиса, полученных' с использованием . различных концентраций фитогормонов и мутагенной обработки, показало присутствие качественных и количественных изменений, которые могут свидетельствовать о наличии сома (тональных вариаций даже в проиессе прямой регенерации растений из узловых сегментов, минуя стадию каллусообраэования. - Сходные данные об изменении пероксидазных спектров у сомаклонов кукурузы были получены ранее . (Хавкнн и др., 1994).' ; - ; . У

; Глава 15. Молекулярно-генетнческпй анализ ' исходных растений и р«тенераитов стахиса. .■■ ■ *

5,1. Разработка метода выделения ДНК из растений стахиса. • —"■у . "V-.. ■■ 18 - - ■ ■

, На сегодняшний момент не было описано методик выделения ДНК из растений рода Stachys, поэтому одной из задач был подбор наиболее эффективной методики экстракции ДНК из растений стахиса. Для выделения ДНК были выбраны методики, различающиеся, в основном, по способам очистки нуклеиновых кислот

Наиболее эффективной и быстрой была методика выделения ДНК стахиса с использованием 5М ацетата калия. (Дорохов и Клоке)! 1УУ7). Количество выделенной ДНК из 50 мг растительного материала, было достаточным и составило 19,9 — 61.3 мкг при соотношении. А260/А280 ='1.7 -1.9: Сходные результаты были получены и при использовании метода экстракции' с добавлением протенназы К. Выделенная при использовании методики с применением протсиназы К и 5М ацетата калия Д НК из растений трех видов стахиса подвергалась обработке эндокуклеазами. ДНК была высокомолекулярна и полностью гидролизовались рестриктазами HcoRI и HíndlII, что говоркт о чистоте полученной ДНК и пригодности для дальнейшего молекулярного анализа. ■;' ' -.'

S.2. Оптимизация методики ' проведения RAPD анализа для тученин генома стахиса. . ':.;■■■

V , В связи с тем, что никаких молекулярных работ на стахисе ранее не проводили, необходимо было предварительно провести отработку оптимальных'условий реакции и воспроизведения RAPD спектров ДНК Stachys sieboldii. Было показано, что для амплификации воспроизводимого RAPD паттерна ДНК стахиса наиболее оптимальными были концентрации в реакционной смеси 0.2мМ dNTP и 2.5мМ MgClj Была также подобрана оптимальная концентрация ДНК стахиса, которая составила 50 нг.

Для RAPD маркирования генома стахиса было выбрано 9 десятичленных одигонуклеотвдных праймеров. Использование большинства праймеров приводило к амплификации ДНК стахиса, число фрагментов RAPD спектра составляло и- 1Я а зависимости от выбранного праймера, длина ампликонов варьировала в пределах 1502800 н.п. Использование при проведении RAPD маркирования некоторых праймеров (ОРН1, ОРНЗ) не приводило к амплификации генома стахиса, использование других( АЗО) не выявляло полиморфизм -генома сомаклонов и мутантов Stachys sieboldii. ^

5.3 RAPD анализ ДНК каллусных культур и растений — '■.'■■'■■'■«■.■■. регенерантов стахиса. >

-"■,'■■-. 5.3.1. RAPD анализ растений •регенерантов стахиса J ' , V; При RAPD маркировании растений, регенерирующих на среде, содержащей ■ 6БАП( 1 мг\л) > - кинетин (1 мг/л) или' бБАП (|0мг/л), никаких изменений RAPD спектров анализируемых растений не было

' " " .-Г 19.' ■ -„■'.: : •":■ -г' * ■■

выявлено. Прн КАРО. анализе ; растений , сгахиса, [ полученных, при ' ■ регенерации на средес- высоким содержащим БАП (20 мг/л) или при * .: ; ' многократной, регенераций.средес 10',мг/л - БАП,; уровень детектируемого полиморфизма ДНК регенератовстахиса значительно ' : -. - повышался!*Из 54 ^ ЙАРО у. фрагментов,, амплнфицированиых . при • ; ■';■';„;. у испо.тьзованяи прзймеров.ОРОМ, ОРРЗ, АЗО+АЗ 1н ОРБб,) 17. были ; .., ■ патиморфиымн,,: то ^ есть , присутствовали... не „ во _ всех ^ спектрах . ' - анализируемых растений (рис. 12). Слезет отмстить; что иаиболос к *; . полимор(|'нь,ми были, спрсктры растения -Г, полученного^при . :

"умногократно^ регенерации | на срсдс с 6БАП 10мг/л и — одного ш ; Г регенерпнтовна | среде 6БАП-. 20 /мг/л. У- регенерата#8 также - р . , •■;_ наблюдаются значительные, изменения псроксидазного спектра. Таким.

образом, используя . КАРГ); метод; анализа,, нами у были, выявлены:" ." различия нуклеотидных послсдоцвательносгях ДНК растений стахнса,' " ' ;полненных'„в^'ре^льтатс{регенермщи^ш ¿средах

концентрациями ф1ггогормонов. Полученные нами данные согласуются ^; ,,, •

•и; 1, - ;

л'"

; №

■ * ч.'•

г VI

- Лл.-'»;

. . Рис. 12. Результаты КАРрогои анализа растений стахнса, полученных { : .* на среде с высоким содержанием 6БАП ( 20 мг\л) и при многократной<,' **' • . регенерации на среде с 6БАП (Ю'мг\л). < .ч , ¿ . , I » ; ; - " , ; ' 1- Маркёр молекулярных-масс' 1кЬ^Ы<1ет^(01Ьсо^ВКЬ),; 2- ДНКГ • контрольного растения, стахиса не введенное, а культуру 3-5 - ДНК ■ регенерантов'стахиса ва среде с бБАП, 20мг\л, 6-8 -»ДНК растений, полученных при многократной регенерации на среде 6Б АП., ' . "

ч '*- полйморфныефрашенты ДНК. '., -у ,V- >"-■■'''

; '.■'*.'■- : ^'г-'. •. 'С^-.--: г 20 • • / г : -Н;.-:- ■.{

л--- -V'4-1:' •• . • ; т . • .v.-

/'''"'I- ...; л-УУ 1v'1-- '.. ' . ^ . • 4 У ' : " < ЛГ':

.' *''■■; у '.V5, $.2.'Выявление ДИК полиморфизма у различных типов каллусов ". ¿^■г" >-;■!>■■;? стахиса и у растений, регенерировавших из катлуеных кульлтуД -■■ „~i-Vi',.. л > ■ г ¿/¿-Представлялось' интересным выяснить,, можно ли,; используя Л -/RAPD метод,' выявить.какие-либо различия'на.молекулярном,уровнеу'{• < ' С между - регенерирующим и ■ нерегенерирущим каллусами. стахиса.. Из -" * использованных для-амплификации десятичленных праймёров f,

о,; два, OPD6:и• OPD14,*выявили полиморфизм ДНК этих'двух-.

••• ••»•-•всех

■■ ' iv, ТОЛЬКО

.N У-';-/' - фрагментов,,.. которые ' отсутствовал и " в.; RAPDJ спектрах -ДНК. . .Л > экстрагированной из каллуса, способного к морфогенезу'. Полученные ,'*Л 1,"-. ': результаты, конечно,' не могут связывать напрямую наличие/отсутствие^-. , *

/У УУ^У/; Рис.13. RAPD спектры ДНК различных типов каллуса стахиса, • ' ! i .'V-V ^ ^полученных при использовании прайм еров OPD14 (а) н. OPD6(6) > У / ; -**'■-'■м" Маркер молекулярных масс Jkb ladder(GibcoBRL), 1- спектр./. ;* . амплификации ДНК морфогенного каллуса, 2- спектр амплификации'.' У'У.'';-V -У % - ДНК неморфогениогокаллусаj..* .с. • Г У„' У -.УУ1 У--У

- . .. полиморфные фрагменты ДНК. • * <У. • ./.у-У.-гГ-У .. „ : ■'

У; у- .' При ^сравнении. регенераитов 7 стахиса, полученн ых - из каллуса/\ -

У У:-оказалось, что подавляющее число амплифицироеанных фрагментов(68)'У у к были мономорфны.' Однако, при амплификации с праймерачи ОРОЗ и ; . ~

¡' .7 '' л1 •'•

. — ":(\ vW „.'■■..'■,"■.'"'-«'iV"■-,. v■ .-,,; i- - ч,

■ - T ' * * -- V.vvп :4 : i'", v L У.,!,'"" 'J *' ** ~. ■ ■■ r ' ?

-■■.-• v.\ . ■ , • -а:. ,л - • -.r. - : - ;--,■■ >.- .

-"V"5' X " .'. . -; iV- .'-.'i , •. . J . ч \,ч; sí ■■■.4

V регенерантов отличались как от: контрольного"растения,: так и. между • -собой (рис;Ч 4)'Интересно^: что«: наибольшее,- число полиморфных . фрагментов было выявлено в спектре* растения, чьи лзопероксидазные v • ■ спектры были таюке наиболее измененными.*'Нашиданные совпадали с" . результатами RAPD анализа регенерантов из каллусной культуры риса

- ■ L.' jv. - - .'■___l _ ■ ? rr " . . v. л . ■п".'...-._-.. -___

-. v* - . ■/ ..... * * _ ■ - v ■.^. ■. ч" - . -

' V.'..'у.ч: '

- '' v-

V i-.*;? , V v;v-V(-: :

Í. » ■!. i „ . - >-•,■ ■.'.*,.-r :-ii . „■""»-

í v г с-

■ . . ; '.4,'V , .."í t '..i -1 ■ ; v

' Г-r-'í.—V.-vM--.,:;; .

и a ua .*.. -r ■■.■-) -. ; >. ■, » f- ■ ■ • •

fTf^ f ^-^v^-U^:' ■ •• .. .

'.Рис.! 4. RAPD спектры ДНК расгеннй-регенерантов из каллуад, ;'.'*' ; полученных при использовании праймеров 0PD3. .Irí / - С;''*! М-маркер молекулярных^масс>lkb-.Iaddeir. (Gibéo^ BRL),, I ;- ДНК V* i контрольного, растениям стахиса' невведенное вкультуру, 2-7 -ДНК . ^ , регенерантов стахиса; полученных из каллусной культуры. -У

' , - полиморфные фрагменты ДНК/ ■ г ' . : I^'r -1:; i • * > ., '

. : J.3.J. Изменение RAPD спектров регенерантов стахиса после д».*'1',-Y обработкиЗ^рамдюоксщридином.: ,, ; / -■■'"'."•ч'.: '.'-ч^'•

V,1 При RAPD анализе был выявлен значительный полиморфизм;

'н "*' в спектрах растения,- культнвированного на среде с 0.73 мг/л 5ЕДУ,",что Л ' -^ / выражалось в появлении в RAPD паттерне'новых фрагментов длиной vr-'-j -.1 ЗООн.п. ^ и ). 470 * н.п.,' а также v отсутствием t фрагмент® !,' ЗООн.п.; , ; _ ^ V . характерного для RAPD¿pDJ~cneKTpOB как контрольных растений, так .и > '

^ растений," обработанных 0.25 и 0.5 мг/л' 5БДУ.» Следует отметить, ^ что „ р ■/^именно это растение наиболее - сильно отличалось;нтакже; и J по-' , -т пероксндазным »спектрам,' - что' может - говорить о « том, ' что ' БДУ. в *' концентрации 0.75мг/л, по'всей>видимости,' индушфует, мутационные. ^ «Ч изменения, что было показано'как биохимическими: методами, так и с -: ^ ] помошью молекулярного аналюа RAPD методом."V-;;>'- ^ -

V-^-'-.V - V" - • •••í--'-'22;:..; J ::: -V; •

, ■ , ,vr м 111фо)с10нальном - размножении " стахиса," а ' также !'np¡t s обработке ; ¿ :*„ \'"Т 1 ' мутагеном.1 Сомаклональные изменения', по всей ввдимостй,'могут быть ' ■ .

У А"'* ABAtÚÜLl ' /V ' |iMU4(ilrt4l|l ULÉlutU neiwnnnbuütiu ' FTlJI/ tt 11 <3 O TI ddll 1 10 т ППИ " -V'' •

, /- "н. ,; "первичного каллуса при использовании 2.5"мг/л 6БАП и 8% . í-Л д - V '""'-С У;(сахарозы,^ а также возможность получения морфогенного * :. • '-'■-, ■ Г ■>* ¡ '' / ." иnnvref'u» I^MivuuinHüп).шК : nnr>n>» ' ппитетЛтй

: _. ^ ~ ,1 - V ■ ^ ' J " fvejfjí JfVÍ*V*l . I hC'IM. L J V счпущ^лч y VUimU^KV, I o

1 /■ V-*¿V'/-; даснтификаиии'сомаклональной вариабельности у стахисаfу Л > r ' у v ¿помошьюбелковых маркероi;* ^ ^ >; 1 "J.'.v

средах - с' / высоким содержанием цитокининов, /

* "v v '-^V.;; многоступенчатой регенерации и химическом мутагенезе, а/ ■' l'v'V41--'V' также между регенерантами л контрольными растениями.

г.: i*.;.. ■ - Л '• - •• * •- ^ > * . ^ . , ^ ; - ,л " * - -- -'.Л-í'''

1 *., -"V, J! • (ч . V - г*' V % • ' г-'. '- ^ — ' " ^ ¿ : ••ч<

■ ^ / ■ ■ ^ ^' ; ^ ^. * ■ - Л ь ^ ■ ^ ' "■ * - у. .. ^/ V"-*

* ч" "* J4 * I Г'"* ; : * * ' »•/V '5 V •• \ * ■ ' ,.. ' * 1 » *.! ' • ; J*- * 't •' . ^ ■ »- , • " ■ •. Д-"' • ' > т . V ' " ' 1" • , í ' г . ••• • * • * ' - ' , -*

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: .. Г'- ' ;,'■/'■..■ Л

1.Хуссейн И.А.,Хадеева Н.В.,Лег'ко6ит М.П.,Кочиева Е.З. Изучение возможности получения, сомаклональных вариантов в культуре ткани овощного стахиса // Тр,Ш Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы ' : . ' их использования».Пуши но. 1999.Т. 1. С. 87 -89. -V Г1

2.Хуссейн И.А.,Легкобит М.П.,Хадеева Н.В. Разработка условий мутагенеза овощного стахиса // Тр.Ш Междунар.Симпоз. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы'ихиспользования». Пуши но. 1999.Т.I.С. 45-46. . . 7:

3.Хуссейн И.А.,Легкобит М.П.,Кочиева Е.З. Выделение ДНК из растений рода „Stachys // Тр.Ш Междунар.Симпоз.: «Новые и-нетрадиционные растения к перспективы их использования». Пушнно. 1999.Т.З.С.57-60. :; 'г7 7 л

; , , 4.Хуссейн ' И.А.Ленгкобит М.П.,Хадеева Н.В.,Кочиева Е.З. Молекулярное маркирование, ДНК различных' видов стахиса //Тр.Междунар.Симпоз. ■ «Новые, и нетрадиционные растения и перспективы их использования»Л)тцйно.1999.Т.З.С.60-62,

5.Хуссейн И.А., Легкобит М.П., Хадеева Н.В. Получение и скрининг сомаклональных вариантов при культивировании стахиса in vitro 7/ Материалы П Съезда ВОГИС. Санкт Петербург. 2000.С.165 .166.. ' ■ '.. '■;.;■■ ■; ;...:■ .

6.Хуссейн И.А., Кочиева Е.З., Хадеева Н.В. Изменение спектров листовых пероксидаз у регенерантов Stachys sieboldix (Miq.) после 'различных гормональных7 и мутагенных воздействий' // Генетика.2000. Т.36. Ks 8. С. 1093 - 1099. : : ;

Объем /t £ печ. л.

Зак. 4i.

Тираж /СО экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44