Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хлоропластных белков у соматических гибридов растений различной степени отдаленности

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование хлоропластных белков у соматических гибридов растений различной степени отдаленности"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ШЮТИТУТ ГЕНЕТИКИ и цитологии

На правах рукописи

КОВЛЕР Лидия Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ХЛОРОПЛАСТНЫХ БЕЛКОВ У СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ РАСТЕНИЯ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ОТДАЛЕННОСТИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1992

Работа выполнена в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

Научный руководитель - академик АН Украины, доктор биологических наук, профессор ГЛЕБА Ю, Ю.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

ДАВЬЩЕНКО О. Г.

кандидат биологических наук ЦЕМШИС К. К.

Ведушдя организация - Институт физиологии растений и генетики АН Украины

Защита состоится " М^Ц_1еа£ г. в

/9 час, на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук в Инотитуте генетики и цитологии АН Беларуси по адресу: 220734, г. Минск, ул. Скорины, 27

С диссертацией можно ознакомиться ' в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа.

Автореферат разослан ". // » а-г'/.г^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета К 005.02.01, кандидат биологических наук Е. В. Лобанок

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время соматическая гибридизация • растений привела к появлению самостоятельного раздела генетики - трансмиссионной генетики растений. Не вызывает сомнения успешность И практическое'вначение получения гибридов растений о помопью манипуляции соматическими клетками. С другой стороны, методы клеточной инженерии открывают новые пути получения генетических систем, отсутствующих в природе, в которых могут нарушаться сбалансированные взаимодействия и экспрессия генов, что даёт возможность получить дополнительные сведения о механизмах реализации генетической информации в растительных объектах.

Биохимический анализ ооматических гибридов является актуальным, как в связи с доказательством гибридной природы получаемых растений, так и в качестве самостоятельного исследования взаимодействия и экспрессии генов в -соматических гибридах как модельных системах.

белковые молекулы являются одним из наиболее удобных объектов исследования, поскольку, с одной стороны, исследование ведётся на уровне реализации генетической информации, включающем несколько уровней регуляции, а с другой стороны, их исследование позволяет выявлять генетические изменеяия, не проявляемые на морфологическом уровне. Условиями применения белковых маркеров в генетике являются вариабильность выбранной группы белков, достаточная для выявления генетических различий, и идентификация этих белков по кодируемости той или иной генетической детерминантой.

В исследованиях по соматической гибридизации растений наиболее широко применяется анализ изоферментов (Famelaer et al., 1989¡ Kushnlr et al., 1991). Также для оценки генетической конституции Гибридов было предложено использовать анализ белков теплового оока и вариантов коровых гистоков (Lepato, Gleba, 1985; Карпенчук и др., 1987). Однако, анализ этих белков позволяет судить лишь о состоянии ядерного генома. При исследовании хлороп-ластных белков можно получить дополнительную информацию, поскольку в хлоропластах должны скоординированно работать белки, кодируемые как хлоропластным, так и ядерным геномами. Из этой группы белков наиболее часто изучается состав большой и мйлой субъединиц рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РЮК), кодируемых соответственно пластомом и ядерным геномом.

Несмотря на то, что РБФК является классическим объектом при

изучении соматических гибридов, в современных работах этот анализ стал применяться значительно реже." Одной из причин такой тенденции является вовлечение в анализ методов и объектов исследований. в том числе и белков, позволяющих судить о как можно большей части генома.

Для анализа широкого спзктра соматических гибридов мы решили исследовать фракции тилакоидных полипепт.чдов и растворимых белков стромы. Это объясняется следующими причинами. Во-первых, они являются наиболее легко выделяемыми фракциями хлоропластных белков, что позволяет анализировать большое число растительных объектов одновременно. Во-вторых, они являются наиболее изученными группами хлоропластных белков. В-третьих, они являются наиболее репрезентативной выборкой хлоропластных белков.

В связи с вше изложенным мы поставили своей целью изучение потенциальных возможностей хлоропластных белков и их использование при анализе соматических гибридов растений. Для реализации этой Цели были поставлены следующие задачи;

1) изучить возможность использования хлоропластных белков В качестве маркерных при оценке генетической конституции соматических гибридов разной степени отдалённости;

2) изучить возможность применения анализа электрофоретичес-ких спектров хлоропластных белков для оценки асимметричности соматических гибридов растений;

3) исследовать возможность выявления и изучения ядерно-ци-топлазматических взаимодействий на уровне хлороплаотных белков.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые в качестве объекта исследования при оценке генетической конституции гибридов растений были использованы растворимые белки стромы хлоропластов, разделяемые о помощью электрофореза примерно на 70 белковых полос, что составляет значительно большую фракцию.хлоропластных белков по сравнению с тилакоидными полипептидами ( примерно 30 белковых полос). Это позволило оценить генетическую конституцию 46 кланов соматических гибридов, полученных в 7 видовых комбинациях, и том числе и таких, в которых генетические различия по тилакеидным полипептидам не выявляются.

Исследование хлоропластных белков (тилакоидных и стромаль-ных) позволяет получать большой блок информации о состоянии ядерного и хдоропластного геномов у соматических гибридов расте-

- 3 -

ний различной степени отдалённости.

Разработан метод оценки асимметричности соматических гибридов растений на основе сравнения спектров их хлоропластных белков. Данный метод анализа.может использоваться при получении соматических гибридов растений широкого спектра асимметричности.

На основании анализа тилакоидных полипэптидов межгрибных цибцидов и гибридов, полученных в четырёх видовых комбинациях, показано, что нарушение ядерно-цитоплазматических взаимодействий может происходить и у морфологически совершенных растений, что выявляется при анализе хлоропластных белков. Отмеченное явление не приводит к хлорофиллдефектности, но проявляется при экспрессии генов полипептидов еветособирающего комплекса фотосистемы II (4С II) и обнаруживается как появление укороченных полипептидов в составе этого комплекса.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на : Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пувд-но-на-Оке, июнь 1991г.)¡ Первом Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пувдно-на-Оке, ноябрь 1991 г.).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в пяти печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты 'и их обсуждение", выводов и списка использованной литературы, включз-ицего 242 библиографические ссылки, 227 из которых иностранные. Работа изложена на 130 страницах машинописи, содержит 7 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследованиях использовались различные виды и. соматические гибриды семейства паслёновых.

1, Стрептомицинустойчивый пластомный мутант Nicot lana tabacum, линия SRI (Mallga et al. , 1973).

. 2. Ni cot lana tabacum, сорт Лэхия.

3. Atropa belladonna, дикий вид, линия A.b.

4L Atropa belladonna. Линия A. b. 100-01 получена и любезно предоставлена М.К.Зубко (Зубко и др. , 1991).

5. Scopol la carníollca, дикий вид, линия Seo.

6. Scopol la carníollca, дикий вид, линия Seo*.

7. Physochlaine officinalis, дикий вид.

8. Lyclum barbarum, дикий вид.

9. Solanum tuberosum, сорт Зарево.

10. Solanum tuberosum, сеянец 80611-2.

11. Solanum chacoense, дикий вид,

12. Solanum, pinnatlsectum, дикий вид.

13. Lycopersicon esculentum Mill, линия FL.

14. L. peruvlanum var, dentatum Dun, линии 3767, 3772.

16. Цитоплаэматические гибриды, сочетающие геном табака и ПЛастомы диких видов; N. tabacum + A. belladonna, линия DS1B; N. tabacum + S. earn i ol lea, линии Seo 1 и Seo 2; N. tabaoum + P. officinalis, линии Pof 1 и Pof 4Fgi N. tabacum + L. barbarum, • линии Lio 14 и Lio 6Fr Все цибриды получены при слиянии протоп-лаотов двойного хлорофиллдефектного стрептомицинустойчивого мутанта табака линии DSR, производного от табака линии SRI, с протопластами диких видов (Кушнир, 1300; Kushnir .et al., 1991) и любеано предоставлены С. Г. Кушниром.

16. реконструированные растения табака, полученные при ели-_ янии протопластов белого растения красавки, имеющего хлоропласгы табака линии Nia 30, о протопластами двойного пдастомного отреп-

. томицинуотойчивого хлорофиллдефектного мутанта табака диндо DSR. Растения двух линиа V21 и Vi F имеют ядро табака DSR и плаотиды табака Nia 30 (Кушнир, 1900; Kushnir et al., 1G91). Линии любеано предоставлены С, Г, Кушниром.

17. Гамма-гибриды* N. tabacum + A. belladonna Линии DSR 61, DSR 63, DSR 64, DSR N6 получены при слияний протопластов хлорофиллдефектного отрептомицинуот9Йчивого табака DSR з протопластами А. belladonna ЛИНИИ Ab 2, Ab 3, Ab i, 3A3Ab5, Ab53F получены путём слияния протопластов хлорофиллдефектного табака, имеюяэго ядро нитратредуктаеного табка линии-Nia 30 и Пластиды табака линии DSR, с протопластами А. belladonna В обоих случаях протопласты красавки облучались перед слиянием (доза 300 Гр). Все линии любезно предоставлены С. Г. Кушниром.

18. Соматические гибриды N. ta^acur* + A. belladonna получены при слиянии протопластов хлорофиллдс-фектного мутанта N. tabacum, линии R-lOOa, производного от табака сорта ЛэхиЯ, и красавки, линии A.b. 100-01 (Зубко И ДР., 1991, 1992). Линии гибридов Rab 2-1, Rab 4а, Rab 11 любевно предоставлены Ы. IL Зубко.

19. Соматические гибрида N. tabacum + S. carnioii-a получакы при слиянии протопластов хлорофшддефекткоги мутанта табака ли-

- Б -

нии R-100a и протопластов дикой скополии линии Sco* (Зубко др., 1991, 1992). Линии гибридов RSC 1, RSC 3, RSC 4, RSC 7 любезно предоставлены М. К. Зубко.

20. Цитоплазматические гибриды, сочетающие ядро S. tuberosum и хлоропласты S. pinnatis^ctum, получены путём'слияния протопластов хлорофиллдефектного пластомного мутанта S. tuberosum, линии 64, производного от сеянца 80611-2, и обработанных гамма-облучением (доаа 2Б0 Гр) протопластов S. pinnatisectum (Самойлов, 1990). Линии цибридов Sp 10, Sp 13, Sp 21 любезно предоставлены В. М. Самойловым.

21. Соматические гибриды. S. tuberosum + S. chacoense получены путём слияния протопластов хлорофиллдефектного пластомного мутанта S. tuberosum Z-11, производного от сорта Зарево, и обработанных гамма-облучением (доза 200 Гр) протопластов S. chacoense (Kuchko et al. , 1990). Линии D4-9, D4-10, D4-12, D4-15, D4-16, D4-23, D4-27, D4-34 любезно предоставлена И. Ф. Холодило.

22. Дитоплазматический гибрид L. esculentum + L. peruvianum, линия 1С, имеющий ядро L. esculentum и хлоропласты L. peruvianum, получен при слиянии протопластов хлорофиллдефектного пластомного мутанта культурного томата линии Pl-alb с облучёнными (доза 200 Гр) протопластами L. peruvianum, линия 3767. Для получения гибридов этой же комбинации в качестве- растения-донора были взяты линии перуанского томата 3767 и 3772 и применена такая же доза облучения. Линии гибридов ЗС, 7С, 12С (линия-донор 3767) и ID, 2D, 3D, 4D, 7D,' 8D ( линия-донор 3772) любевно предоставлены Я. И. Ра-тушняком (Ратушняк, 1991).

Для анализа тилакоидных и стромальных белков интактные хлоропласты выделяли центрифугированием в двухступенчатом градиенте сахарозы (52-ЗОХ), следуя методике, описанной в работе (Palmer, 1986). Фракции тилакоидных мембран и растворимых белков стромы разделяли центрифугированием при 20000 g, 4°С, 20 мин. Осадок тилакоидов отмывали в бидистиллированной воде, содержащей 5 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мМ ФМСФ (20000 g, 4°С, 20 мин.), суспендировали в минимальном количестве воды и определяли концентрацию хлорофилла по (Arnon, 1949). Фракцию стромальных белков центрифугировали при 30000g, 4°С, 15 мин. до полного удаления зелёного осадка тилакоидов. Затем белки осажали на холоду добавлением 4 объёмов ацетона, охлаждённого до -20°С. Осадки высушивали с помощью вакуума. Перед проведением электрофореза тилакоиды и белли стромы растворяли в буфере для образцов, содержащем 0.06 М NagCOg, 0.06 М 2-меркаптоэтанола, 2.57. додецилсульфат лития

(ДСЛ), 12% сахарозы. Образцы тилакоидов наносили на гель, исходя из концентрации хлорофилла. Количество стромальных белков для нанесения на гель определяли, проводя пробные электрофорезы.

Для выделения светособирающего комплекса 2С II тилакоиды выделяли из хлоропластов, осажденных центрифугированием гомоге-ната при 2500 е и очитали от крахмала, который мешает выделению нативных комплексов, с помощью центрифугирования в двухступенчатом градиенте сахарозы 55-28% (100000 g, 4°, 30 мин.).

СветосоОирающий комплекс ФС II выделяли с помощью осаждения ионами магния (Krupta et al. , 1988) или используя двукратную очистку с помощью последовательных электрофорезов в 15 и 8%-ном полиакриламидном геле е неденатурирующих условиях (Deleplaire, . Chua, 1982). Комплекс экстрагировали из геля, концентрировали с помощью погружаемых мембран фирмы "Mi 1И роге" (США) и сразу анализировали.

Перед проведением электрофореза тилакочдьые полипептиды и белки светособирающего комплекса 00 II прогревали при 65°С 10 мин, а стромальные белки - при 80°С 5 мин. Электрофорез проводили в буферной системе Лэмлл (Laemli, 1970 ) в градиентных гелях 7-20% или 10-18%. Для улучшения разрешения белковых полос использовали гели, содержание мочевину. После проведения электрофореза гели окрашивали с помощью Кумасси R250 или серебром.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

^Использование тилакоидных полипептидов в качестве маркерных при определении генетической конституции межтрибных цибридов и гибридов

Одним из условий применения белков в качестве маркэров является их идентификация по кодируемости той или иной Генетической детерминантой. Наиболее исследованными из хлоропластных белт ков в этом отношении являются тилакоидныо полипептиды. Несмотря на достаточно консервативное строони"3 а состав тилакоидных мембран, белки, входящие в тог или иной комплекс, могут различаться у разных видов растений, как по количеству, так и не молекулярным массам. Поэтому для получения более надёжных данных желательно- идентифицировать эти белки для каждого конкретного вида. Из видев растений, исследуемых нами, такая работа была проделана для табака'(Chía et al., 1986). Поэтому тилакоидные полипептиды

использовались как маркеры при выявлении генетической конституции соматических гибридов, для получения которых в качестве одного из родителей брался табак, а именно, цибридов N. tabacum + S. carníol tea, N. tabacum + P. off icinal is, N. tabacum + L. barbarum и гибридов N. tabacum + A. belladonna.

Наследование тилакоидных полипептидов, идентифицированных по работе (Chia et. al. , 1086), у цибридов имело сходный характер - белки, кодируемые ядром, наследовались от табака, а белки, кодируемые пластомом - от диких видов. Эти результаты совпадали с результатами анализа изоферментов и рестрикции хлоропластной ДНК (Кушнир, 1990).

Анализ тилакоидных полипептидов у цибридов позволяет, с одной стороны, выявлять по белкам-маркерам их ядерную и пластомную конституции. С другой стороны, зная генетическую конституцию цибридов по другим биохимическим анализам, можно с большой долей вероятности устанавливать кодируемость остальных неидентифициро-ванных белков. В нашем примере мойно утверждать, что белки, наследуемые цибридами от табака, кодируются ядром, а полипептиды, наследуемые от диких видов - хлоропластами. Результаты анализа наследования всех маркерных полипептидов цибридами трёх описываемых комбинаций представлены в табл. 1.

Ещё одним результатом описанных экспериментов является обнаружение у всех цибридов дополнительных, отсутствующих у обоих родителей, белковых полос в области 27.5 - 24. Б кД, предполагаемой области"светособирающего комплекса SC II (LHC II).

Артефактная природа этого явления фактически исключается по следующим соображениям. Во-первых, проведение повторных экспериментов не изменяло наблюдаемую картину. Во-вторых, добавление различных ингибиторов протеаз в растворы, .используемые при выделении хлоропластов и тилакоидов, также не приводило к исчезновению этих полос. В-третьих, даже если это нарушение - следствие действия каких-то протеаз, то их активация происходит только в цибридах, сочетающих чужеродные ядро и цитоплазму, что и явлвет-ся, очевидно, побуждающей причиной.

Одним из предположений о возможных причинах наблюдаемого явления может служить предположение о том, что нарушение экспрессии генов этих белкоЕ происходит вследствие ядерной мутации, которая могла случайно возникнуть в процессе индукции хлорофилл-дефектности при получении мутанта табака линии DSR, который был взят для получения есех цибридов. Обнаружить изменение в составе

Таблица 1. Анализ наследования тилакоидных полипептидов у цибридов N. babacum + S. earnю1 lea, N. tabacum + P. off lclnalls, N. tabacum + L. barbarum

Маркерные Используемая комбинация Цибрид

белки родителей

N. tabacum S. carnlolica N. tab. / S. earn.

Кодируемые 15

ядерным геномом 11 16/0

Кодируемые 0 / 1

пластомом 1 1

N. tabacum P. officinalis N. tab. / P. of.

Кодируемые 13/0

ядерным геномом 13 12

Кодируемые 1 0/1

пластомом 1

N. tabacum L. barbarum N. tab/ L. bar.

Кодируемые 8 9/0

ядерным геномом 9

Кодируемые 0 / 1

пластомом 1 1

LHC II у этой линии табака не представляется возможным, в связи о отсутствием многих хлоропластных белков у подобных мутантов, в том числе и белков LHC II. Поэтому для анализа цибридов использовался аелёный предшественник этого мутанта, табак линии SRI. Для доказательства немутационной природы обнаруживаемых эффектов проводился анализ тилакоидов реконструированных растений табака, имеющих ядро табака линии DSR, а хлоропласт табака линии Nia 30, который показал, что никаких изменений в'составе .LHC II у таких растений не происходит.

Идентификации и уточнении характера распределения белковых полос этого комплекса посвящена отдельная часть исследований.

С помощью анализа тилакоидных полипептидов была также установлена генетическая конституция 9 линий гамма-гибридов N. tabacum + A. belladonna. Как и при анализе цибридов наследование пластома устанавливалось по одному маркерному белку - белку реакционного центра ÎC 11 ( м. м. 4?. 3 кД у табака и 46.8 кД у. красавки), что свидетельствует о болызей консервативности пластома по сравнению о ядерным геномом и согласуется с известными

- о -

по литературе выводами. Однако, в отличие от цибридоэ, все линии гибридов унаследовали несколько белков, кодируемых ядром, от красавки (табл.2). Кодируемость белков, неидентифицированных по работе (Chla et al., 1986), устанавливалась по их наследованию цибридами.

Таблица 2. Анализ наследования тилакоидных полипептидов у гамма-гибридов N. tabacum + A. belladonna

Маркерные белки Используемая комбинация родителей Гибриды

N. tabacum A. belladonna N. tab. / A. bel.

Кодируемые ядерным геномом 12 И- .7/6

Кодируемые пластомом 1 1 0 / 1

У всех линий гибридов обнаружено появление дополнительных полос в области ШС II. Однако, у линий 05!? 61, БЭй 63 и ОБ!? 64 состав белков ШС-П приближался к родительскому типу. Изучению ЬНС И у этих гибридов также посвящён отдельный раздел.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что тилакоидные полипептиды являются надёжными маркерами при условии ■ идентификации их по кодируемости и могут быть использованы для определения генетической конституции отдалённых гибридов.

2. Оценка асимметричности соматических гибридов с помощью анализа электрофоретических спектров хлоропластных белков

При получении высокоасимметричных гибридов требования к биохимическому анализу повышаются. Во-первых, он должен быть достаточно чувствительным для выявления совсем незначительной доли генетического материала, перенесённого от одного из родителей. Во-вторых, метод должен позволять оценивать асимметричность получаемых гибридов. Чем больше спектр анализируемых бежев, тем больше вероятность обнаружения видоспецифичных белков, а следовательно, и возможность выявления йеболыюй части генетического "материала, особенно при получении близкородственных гибридов. Кроме того, вовлечение э анализ Сольсэго числа белков позволяет судить о большей части гвкома» <*го боз'азае? достоверность пол у-

чаемых результатов.

Исходя из этих соображений, мы включили в число анализируемых белков фракцию стромальных полииептидов. В наших условиях тилакоидные и стромальные пслипептиды разделяются примерно на 30 и 70 белковых полос соответственно. Таким образом, при оценке асимметричности гибридов анализируется около 100 белков.

Однако, вовлечениэ в анализ большего числа белков и видов растений несёт дополнительные трудности по идентификации этих белков. Тем не менее эту проблему можно решить, рели кодируе-мость того или иного белка устанавливать по его наследованию цибридами с известной генетической конституцией. При этом комбинация родителей должна быть аналогичной используемой для получения асимметричных гибридов. Такой анализ мы применили для оценки асимметричности гибридов, полученных в четырёх комбинациях: N. tabacum +■ A. belladonna, N. tabacum + S. carnlollca, S. tuberosum + S. ctiacoense, L. esculentum + L. peruvlanum.

Гибриды N. tabacum + A. belladonna были получены при слиянии протопластов хлорофиллдефектного мутанта табака линии R-100a, производного от N. tabacum, сорта Лехия, и протопластов красавки линии A. b. 100-01. Кодируемость неидентифицированных белков табака и красавки устанавливали по их наследованию цибридом линии DS1B, имеющим ядро табака линии DSR и хлоропласты красавки линии А. Ь. Поскольку линии родителей в этих двух комбинациях несколько отличались между собой, необходимо было, преже всего, выяснить, различаются ли они по составу белков.

При сравнении спектров тилакоидных и стромальных белков' • различий между двумя линиями табака и двумя линиями красавки выявлено не было. Генетическая конституция гибридов оказалась очень похожей на генетическую конституцию цибрида. Подавляющее большинство белков наследовалось гибридами от табака (табл. 3).

Присутствие ядерных генов красавки в геноме гибридов выявлялось только по наследованию двух тилакоидных белков с м. м. 16.0 и 14.9 кД. Пластом гибриды унаследовали от красавки, что было определено по наследованию стромального белка с м. м. 71.4 кД и тилакоидного белка реакционного центра 5С 11 с м. м. 46.8 кД. Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемые гибриды являются высокоасимметричными.

Также при анализе тилакоидов у гибридов обнаружено изменение белкового состава в области LHC II. • Этот результат служит етг одним доказательством в пользу того, что наблюдаемое явление

не имеет мутационного харЗг*г-'.->и, псда^ку для пслучекил гибридов использовался табак другого сорта.

Таблица 3. Анализ наследования тилакоидных и стромальных полипептидов у гибридов N. tabacum + A. belladonna

Маркерные белки Используемая комбинация -родителей Гибриды

N. tabacum A. belladonna N. tab. / A. bel.

Кодируемые ядерным геномом Стро-мадь-ные 10 9 10/0

Тила-коид-ные 15 12 13/2

Итого 25 21 23/2

Кодируемые пласто-мом Стро-маль-ные 1 i 0/1

Тила- . коид- ные 1 1 0 / 1

Итого 2 2 0/2

Подобный анализ был применён для оценки асимметричности гибридов N. tabacum + S. cárnlollca

Для идентификации белков по кодируемости спектры белков гибридов сравнивались со спектрами белков цибрида линии Seo 2. имеющего ядро табака и пластиды скополии линии Seo. Для получения цибридов и гибридов этой комбинации также использовались разные табаки, линия DSR и линия R-ЮОа ссотвественно, которые, однако, не отличались по составу ни тилакоидных, ни стромальных полипептидов. В качестве второго партнёра при слиянии протопластов для получения цибрида и гибридов был взят дикий вид скополии, семена которой были получены из разных источников. Линии поддерживались в культуре в течение нескольких 'лет и условно обозначены соответственно Seo и Seo*. Как оказалось при анализе стромальных и тилакоидных белков, дье линии скополии отличались друг от друга . Для скополии линии Seo специфичными являются 1 стромачьный и 7 тилакоидных белков, а для скополии линии Seo* -

3 етромаш!--?. й 12 тедо&кшнх полипептидов. Этот результат свидетельствует о том, что анализ хлоропластных бежов позволяет выявлять не только межвидовые, но и внутривидовые различия.

Гибриды комбинации N. tabacum + S. carniollca оказались также . высокоасимметричными. Из 23 видоспецифичных для скополии белков, кодируемых ядром, только один тилакоидный белок наследуется гибридами. 27 белков наследуются гибридами от табака.

Описываемые гибриды пополнили ряд цибридов и гибридов, у которых при анализе тилакоидов обнаружено появление дополнительных полос в области LUC II.

Асимметричность гибридов S. tuberosum + S. chacoense была оценена при сравнении спектров тилакоидных и стромальных белков растений этой комбинации со спектрами бежов цибридов S. tuberosum + S.pinnatlseotum (см. табл.4).

Таблица 4. Анализ состава тилакоидных и стромальных белков у S. tuberosum, S. pinnatlseotum, S.chacoense, цибридов

S. tuberosum + S. pinnatlseotum и гибридов S. tuberosum + S. chacoense

Марке рные-белки Используемая комбинация родителей Цибриды И гибриды

I II III

S. tuberosum S. plnnatlsec -tum S. tuberosum / S.pinnatlseotum

Кодируемые ядерным геномом Тила-коид-ные 13 13 13/0

Стро-маль-ные 21 17 • 21/0

Итого 34 30 34 /.0

Кодируемые пласто-мом Тила-коид-ные 0 0 0/0

Стро-маль-ные 1 1 0/1 '

Итого 1 1 0 / 1

Сбшее число маркерных белков .35 . 31 34 / 1

- мЗ -

Таблица 4 (продолжение)

I II III

S. tuberosum S. chacoense • S. tuberosum / S. chacoense

йодируемые ядерным геномом Тила-коид-ные 12 12 10/3

Стро-маль-ные 8 6 5/3

Итого 20 18 15/6

Кодируемые лласФо-мом Тила-коид-ные 0 0 0/0

Стро-маль-ные 1 1 0 / 1

Итого 1 1 0 / 1

Оборе число маркерных белков 21 19 15/7

S. plnnatl-sectum S. chacoense -

Коди- ■ руемые ядерным геномом Тила-•коид-кые 10 12 _

Стро-маль- НЫ9 11 1Б _

итого 21 27

Кодируемые пласТо-мом Тила-коид- НЫ9 0 . 0 —— f

, Стро-. маль- ные 1 1

Итсго 1 1

Обдее число маркерных белков . 22 23 -

В первой комбинации в качестве культурного родителя анализировался S. tuberosum, сорт Зарево, а во второй комбинации -S. tuberosum, сеянец 80611-2. Анализ состава хлоропластных белков у этих родителей позволил выявить различия между ними по двум-тилакоидным и одному стромальному белку. Результаты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о том, что гибриды S. tuberosum + S. chacoense наследовали значительно большую часть..ядерного генома и пластом - от вида ; S. tuberosum,,

Сравнение количества белков, видоспецифичных для трёх видов Solanum, используемых при получении цибридов и гибридов, дало возможность провести анализ отдалённости этих видов. Наиболее отдалёнными оказались вицы S. tuberosum и S. plnnatlsectum (35 И 31 видоспецифичных белков соответственно). Затем идёт пара S. plnnatlsectum и S. chacoense (22 и 28 видоспецифичных белков соответственно). Меньше всех различий выявлено между S. tuberosum и S.chacoense (соответственно 21 и 19 видоспецифичных белков), что, очевидно, является отражением близкородственности этих видов (Hosaka et al. , 1988).

Целесообразность включения в анализ фракции стромальных полипептидов была продемонстрирована при оценке асимметричности гамма-гибридов L. esculentum + L. peruvianum. Электрофоретйческий анализ тилэкоидных полипептидов у растений этой комбинации показал, что эти виды не имеют ни одного видоспецифичного белка. Поэтому асимметричность этих гибридов оценивалась только по стро-мальным полипептидам, исследование которых позволило установить, . что исследуемые линии гибридов различаются по соотношению долей родительских геномов: линии группы С наследуют большую часть ядерного генома от культурного томата (4 белка наследуются от вида L. esculentum, 1 - от L. peruvianum), а линии группы D - от облучаемого вида-донора L. peruvianum (3' белка наследуются от -L.esculentum, 4 - от L.peruvianum).

Таким образом, представленные результаты показывают, что анализ электрофоретических спектров хлоропластных . белков мозгет быть успешно применён при исследовании соматических гибридов широкого диапозона асимметричности и позволяет получать наглядное представление о соотношении ядерных генов родителй в геноме гибрида.

3. Состав и наследуемость полипептидов светособираютего комплекса СО 11 у отдалённых цибридоЕ и гибридов

Одним из результатов исследования тилакоидных полипептидов у цибридов и гибридов, сочетающих генетический материал родителей, принадлежащих к разным трибам семейства паслёновых, а именно, табака с триба Nlcotlaneae), красавки (триба:Ьус1еае), дерезы (триба Lycieae), скополии (триба Hyoscyamlnae), !фиэохлайна (триба Hyascíaminae), является обнаружение изменения iполипептидного состава светособирающего комплекса ÍC II. Несмотря на то, что структура этого комплекса изучена достаточно хорошо, до сих пор остается нерешённым вопрос о количестве разных полипептидов, входящих в его состав. Число разных белков, которое обнаруживается в составе LHC II, зависит, как от метода,-с'Помощью которого выделяются белки этого комплекса, так и от.вида растения. Методы выделения LHC II являются одновременно.методами его идентификации.

Сравнение качества и количества комплексов•LHC И, выделяемых с помощью осаждения ионами магния и путёш проведения последовательных электрофорезов в неденатурируюших условиях, понизало, что метод электрофоретической очистки является более надёжным, с большими выходом и чистотой i комплекса. Этот метод использовался при исследовании LHC II.

Поскольку цибриды и, скорее всего, гибриды наследуют белки этого комплекса от табака, необходимио было:уточнить количество белков, входящих в состав LHC II табака,¡анализ которого пока-эал, что при обычной системе электрофореза\у табака наблюдаются две основные и две минорные полосы. ¡Включение в гель мочевины приводит к увеличению белковых полоо до1Восьш.

Однако, при исследовании LHC II цйЗрида .табак-физохлайн с помощью электрофореза в геле с 8М мочевиной было показано, что положение дополнительных белковых полос ;.у .цибрида не соответствует положению дополнительных полос, 'выявляемых :в этой системе у табака.

При анализе состава светособирающего 'комплекса СС 11 у цибридов табак-скополия (линия Seo 2), .табак-физохлайн ( линия Pof 4Fg), табак-дереза (линия Lie SF^ и гибридов табак-красавка (линии Rab 2-а, ЗАЗАЬб) было выявлено, что у всех этих растений наблюдается появление четырёх дополнительных полос с м. м. 26.7, 26.1, 24.8 и 24. 4 кД по сравнению с двумя- основными у родителей с м. м. 27.5 и 25.1 кД. распределение белковых полос у этих линий схематично представлено на ркс. 1 (а)1.

У линий гибридов DSR 63 к DCR 6'4! табаК-красада р-юпредеде-

. . * - 16 -•

ние полос несколько отличалось. Количество двух основных полос с м.м. 27.6 и 25.1 кД было таким те, как И у родителей, но и дополнительные четыре полосы такие присутствовали (рис.1 (б)). Несмотря на ' то, что различий В наследовании других тилакоидных полипептидов у этих линий по сравнению о остальными линиями выявлено не было, можно предположить, что линии, Е)5Я 63 и Е&Р 34 унаоледовали гены красавки, с помощью которых регулируетоя встройка белков табака в тилакоиды хлоропластов красавки, либо они унаоледовали структурные гены этих полипептидов Не только от табака, но и от красавки, и которые нормально экспрессируются на фоне пластид красавки.

а б

12 3 12 3

Рис. 1. Анализ наследования полипептидов LHC II (толщина линий соответствует интенсивности белковых полос): а - цибриды N. tabacum + S. carnlollca, N. tabacum + Р. offlclnalls, N. tabacum + L. barbarum и гибриды N. tabacum + A. belladonna (1,3 - родители; 2 - цибриды и гибриды); б - линии DSR63, DSR64 гамма-гибридов N. tabacum + А. belladonna (1,3 - родители, 2 - гибриды)

. Наиболее вероятным объяснением наблюдаемого изменения в. соотаве LHC II межтрибных цибридов и гибридов, моле* служить предположение о том, что при сочетании в одной генетической системе чужеродных ядра и хлоропластов_растений, весьма отдалённых друг от друга, нарушение происходит на этапе процессинга белков табака при встройке их в чужеродные тилакоиды. Это вполне допустимо, поскольку известно, что этот процесс осуществляется специфическими хлоропластными протеазами.

ВЫВОДЫ

1. Хлоропластные белки могут служить маркерами генетической изменчивости видов. Их исследование позволяет проводить сравнительный анализ отдалённости изучаемых видов.

2. Внутри- и межвидовые различия выявляются в подавляющем ■ большинстве по хлоропластным белкам, кодируемым ядром, что сви-

детельствует о большей консервативности пластома по сравнению с ядерным геномом.

3. Асимметричность гибрида выявляется по количеству белков, унаследованных от родителей. Лоля ядерных генов родителя в составе генома гибрида коррелирует с долей хлоропластных белков, кодируемых ядром и наследуемых гибридом от этого родителя.

4. У межгрибных цибридов и гибридов наблюдается изменение полипептидного состава светособирающего комплекса фотосистемы II, проявляющееся в появлении дополнительных полос.

5. Нарушение экспрессии генов полипептидов светособирающего ко шлее а фотосистемы II не имеет мутационного характера, а происходит вследствие нарушения ядерно-цитоплазматических взаимодействий при объединении генома и пластома видов, принадлежащих к разным трибам семейства паслёновых.

6. Увеличение в геноме гибрида доли ядерных генов родителя, от которого наследуется пластом, приводит к частичному восстановлению нормальной экспрессии генов полипептидов светособирающего комплекса фотосистемы II.-

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ковлер Л. А., 1!1пумуков Л. Р., Глеба Ю. Ш Анализ тилакоидных полипептидов- межгрибных цитоплазмагических гибридов семейства Solanасеае // Биополимеры и клетка. - 1991.-Т. 7, N 4.-С. 39-45.

2. Ковлер JL А., Холодило И. Ф., Кучко • А. А. Анализ хлоропластных белков соматических гибридов Solanuiri tuberosum + Solatium chaccense// Цитология и генетика. - 1992. - Т. 26, N 1.- 0.31-33.

3. Ковлер Л. А., Глеба & Ю. Ядерно-цитоплазмагическая несовместимость у межгрибных цитоплазматических гибридов семейства Sola-naceae // "Фотосинтез и фотобиотехнология". Тезисы докладов и сообщений международной конференции (16-23 июня 1991 г. ,г. Пу-щино).- Пушино, 1991.- с. 100.v

4. Ковлер "Л. А. , Самойлов Е М., Сидоров Е А., Глеба KL Ю. ' Хлоро-пластные белки цитоплазматических гибридов Solanum tuberosum + Solanum pinnatisectum// Тезисы докладов 1-го Всесоюзного симпозиума "Новые методы в биотехнологии, растений" (20-22 ноября 1991г., г. Пущаю). - Пущино, 1991. - С. 68.

5. Ковлер Л. А., Холодило И. Ф., Кучдо А, А.,. Глеба ¡й Ю. Анализ тилакоидных и строгальных полилептияов! ссйТйч'?01шх гибридов Solanum tuberosum + Solanum chaccense// ?Ш -■ С» $7-68.