Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наследование и организация рДНК при соматической гибридизации растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Наследование и организация рДНК при соматической гибридизации растений"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУ1БЫ НАРОДОЗ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

БОРИСЮК Николай Владимирович

УДК 577.123

НАСЛЕДОВАНИЕ И ОРГАНИЗАЦИЯ рДНК ПРИ СОМАТИЧЕСКОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ РАСТЕНИЙ

ОЗ.ОО.ОЗ - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии Института ботаники им. Н.Г.Холодного АН УССР и в отделе эволюционной биохимии. Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского МГУ

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

академик АН УССР,

доктор биологических наук

Ю.Ю.Глеба

доктор биологических наук С»С.Калита

доктор биологических наук Т.Г.Беридзе

Отдел биохимии и цитохимии Банкирского Научного центра АН СССР

Защита диссертации состоится -М- (¡4,кМ- 1988 /О часов на заседании специализированного совета

г.

К 016ЛГ.01 при Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627 Киев 143, ул. Заболотного, гч

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан " " _______ 1988 г.

Учений секретарь Ц

специализированного совета /(/UCi.it 1'\ Л.Л.Лукеа

" 'ä ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

: Актуальность темы. Гибридизация растений на основе слияния изолированных протопластов добилась ряда существенных успехов в конструировании генетически новых форм растений. Получены фер-тилышс гибриды между видами, которые невозможно было скрестить традиционным половим путем. Показана возможность получения соматических гибридов между филогенетически отдаленными видами, принадлежащими к разным родам, трибам и семействам. Соматические гибриды обычно существенно отличавтся по своим морфо-генетичес-ким характеристика!! от родительских видов. Кроме того, сан процесс перехода клеток из существования в составе цельного растения к культивированию на искусственной среде приводит в ряде случаев к полтонне среди регенерировавших из клеток растений, линий с измененными характеристиками, наследуемыми в поколениях. Очевидно, что в основе наблюдаемой вариабельности лежат изменения генетического аппарата клеток, индуцируемые процессами гибридизации и/или культивирования клеток in vitro, что подтверждается наблюдаемыми на цитологически:-: препаратах перестройками хромосом. Для дальнейшего ус генного развития клеточной биотехнологии и генетпчссксГ. мнженерии растений необходимо понимание за-ко'.'оморност-я изменения геномов на уровне последовательностей ДНК.

Одним из наиболее изученных у растений является семейство ти'лдени ■ повторявшихся последовательностей ДНК, кодирующих цито-пдазматические ^ибосомальныс РНК. Повторы рДНК состоят из консервативной части, кодирующей 1SS рРНК, 5-8S и 26S рРНК, и так называемого не транскрибируемого спейсера. Спейсерние последовательности рДНК значительно различается как по длине, так и по последовательности нуклеотздов между растениями разных родов, лидоз и в некоторых случаях сортов и разновидностей. На основе различия длины рестриктнах фрагментов рДНК родительских видов в геномах соматических гибридов можно различать специфичные для каждого родителя последовательности рДНК и выявлять количественные и качественные изменения, происходящие в этих последовательностях .

Резкое изменение условий существования растительных клеток в результате культивирования ¿я vitro и гибридизации соматических клеток является сильным генетическим стрессом, дестабилизи-

рукщкм гомеоетаз генома и значительно ускоряющим процесс» перестроек генетического материала. Следовательно, соматические гибриды могут бить исг.ользозашд в качестве модельной системы для изучения фундаментальных механизмов молекулярного ззолацпонпроза-ния геномов растений.

Ноль ;i задачи наследования. Цель карего исследования - разработка надежней сиотеки доказательства гибрпднсстп форм растеши!, получешшх в результате соматической гибридизации, на основе анализа ядернпх последовательностей рДНК; изучение гетерогенности рД'ЛК растении родительских л книг» при соматической гибридизации и организации рДНК в генома;: соматических гибридов.

В задачи кеедлдезапия: входило: I) изучить гетерогенность повторов рДНК всех растительных видов, использованных в к&чсотае родителей при получении соматических гибридов; 2) пронести анализ наследования и организации рДНК ряда линий меквидоБж и ке;>-тpudних гибридов и "гакка-гибридоз"; 3) провести количественной анализ видоспецпфпческпх последовательностей рпо'ссо:;&льних генов сонатичсскнх гпо'ридов.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые построены рестриктнис карты повторов рДНК пяти видов семейства пасленовых s; дт:ух видов крестоцветных- В рДНК пасленоьих к крсстсцзетпих выявлено специфичное для стих семейств расположенно сайтов рсот-риктази 2ооШ в кодирующих областях.

Обнаружена и количественно оценена значительная деа^плифихг.-' ция рДНК, происшедшая в результате соматической гибридизации в некоторых комбинациях видов. Получено экспериментальное доказательство модели эволюционирования последовательностей рДНК растении путем неравного кроссинговера.

Впервые й соматических гиирндау. обнаружен новий класс повторов рДНК, отсутствующих у родительских видов. Впервце показана преимущественная сохранность рДНК облучавшихся суперлетальньн-т дозами родительских клеток в "гамма-гибридах".

Полученные результаты углубляют представления о молекулярных механизмах эволюционирования геномов растении к могут найти применение в практической селекции Табаков, капуст;;, рапса, турнепса. Последовательности рДЧК могут бить использованы в качестве маркеров ядерных геномов при получении гибридов. Способность ?ДНЧ отвечать на стрессовые воздействия изменением количества кеп«!. сг.чрир&ет зсз^оккссгь использования последовательностей ра-

з

боссиальних генов с целью конструирования амплифицирукщихся векторов для -трансформации растении.

Апробация работ;!. Материала диссертации долоданя на республиканском симпозиуме "Биохимические механизмы регуляции генетической активности" (Канев, май 193'* г.); на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнология" (Пущпнс-на-Оке, октябрь 1956 г.); на Всесоюзной конференции "Хе.чооястемятима и эволюционная: бпохи-.нш растений" (Mocr.cn, ноябрь 1956 г.); па У1 Всесоюзном си!!;юзи}'г;е "У:олг::у:;ярнио .чехан.чзкн генетических процессов" (Москва, февраль IS6? г.); на Всесоюзной конференции "Структура и Функции клеточного ядра" (Черноголовка, апрель [<J37 г.); на Х1У Международном ботаническом конгрессе (Зап.Берлин, август 1937 г.); на Мскдутподиок сикпозкуис "Ргивг/.ческая инженерия растонн.п" (Пукпшо-ип-Оке, октябрь 1937 г.); на конференции молодых ученых "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, октябрь 1У87 г.), а также на научиих семинарах отдела цито-физиологи» и клеточной шю&нерки Института. ботаники им. Н.Г.Холодного АН УССР и отдела околздюнноП биохимии Меж-факультетскоИ проблс.»Lfioii научно-неиледовательскои лаборатории МГУ.

Публикации. Сеи^пнне результаты диссертации отражена в сени печатных работах, слиоок которых приводится в кекце автореферата.

Структура и объем работы, диссертация состоит из введения, глаз "Обзор литература", "Материали и метод«", "Результаты я обсуждение", выводов и списка попользованной литератури, вклочаи-аего 203 5нс'миографические ссклхи. 134 из которых иностранна:;. работа иаломсна на 125 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка , вкльчагдих 43 фотографии, и ? таблицы.

МАТЕРИАЛА И MF.TOjU

Зое использойоннне линии соматических гибридов получени в отделе цитофиглюлогии и клеточной инженерии Института ботаники им. Н.Г.Холодного АН УСС?. Растения Brnssica caitpo.Ttric, В. э1о-гасса, В. парне вираиивались в тегтлице из семян, любезно предо-стаилекни у. проф. :1.?.Пйвесапкиннм (7СХА, Киев).

ДМЧ виаеляли на различных этапах работы тремя методами (Bendich eu ol., 19'30} Murray, ТЬоярсоа,1980; Ohurc е« л1. ,193?). Во всех случае для получения иисоксполимсриой ДНК, хорошо расцепляем он рестрнктазак.!, проводили очистку н градпенч е нлотихти CsUl. Рестрикцию. электрофоре:;, перенос фрагментов ДЕК на нитго-

J>

целлюлозный фильтр и гибридизации по Саузерну проводили как описано (Маниатис и др., 198*1 ).

•S2

В качестве зондов использовали нечешшс Р 13S рРНК и 2бз рРНК кукурузы и плазмиду PUL7, содержащую 5-концевой фрагмент последовтаельиосги 26s рДНК лимона длиной около 500 гш (плазмида любезно предоставлена И.Фодором » В.О.Колоией, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов; Пуцино-на-Оке). 18S и 26s рРНК выделяли по методике (oono, sugiura, -I9SO) из отполированных проростков кукурузы и метили с использованием г.олпнуклеотид-киназы (Bedbrook, 1982).

Денситометрирование радиоавтографов проводили на микродеиси-тометре с интегрирующим устройством ("Joycc-ioebl", Англия).

Гибридизацию в пятнах проводили как описано (Anderson, ïoung, 19&5) с некоторыми модификациями. Аналитическое ультрацентрифугирование ДНК с цель» выявления сателлнишх компонентов проводили на ультрацентрифуге apinco-E ("Bookman", США) со сканирующим устройством.

РЕЗУЛЬТАТУ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Рестриктное картирование повторов рДНК родительских видов.

Для всех растительных вндоз,- использовавших с я. з качестве родителей при получении соматических гибридов, построены рестрикт-ние карты рДНК. Выявленные мекзидовие- различия в организации р-повторов позволили использовать рДНК в качестве маркеров ядерных геномов родительских линий при анализе соматических гибридов, а такие сделать некоторые выводи о филогенетических взаимоотношениях изучаемых' видов.

, Зыбор рестриктаз был обусловлен их доступность», способностью полностью переваривать растительную ДНК и наличием в кодируемой части рДНК консервативных сайтов. Основываясь на от их соображениях, картирование проводили по сайтам узнавания рестрик-таэ ЕсоК! и EcoRV (рис. I). В качестве зондоа,специфичных к рДНК., использовали меченные V 183 рРНК, 26s рРНК кукурузы и плазмиду pin,?.

У всех пяти видов Табаков и красавки обнаружены Ее oui сайты в последовательности 26s рДНК, примыкающей к внутреннему транскрибируемому спейсеру, в дополнение к общим для большинства растение сайтам EooRi в 3-кониезчх последовательностях 183 и 26S р?.НК. kîsr1 сайты в ^'-косаевои последовательности 2£з рДНК еыяв-

18S ^ xj ',>7 25S \! M. g loue a

18S

1ÖS _____

v.

lös

Mi. tahneum

10:

'U-

-lâ^Jt .7,__r?

M. sylvestr i r,

ias r ^тт г

10S 2oS -S

N. plumb aginiiol.a

A. belladonna

____Í8 S__

18 S ^ y 7

1ßS T? у т7

13S 7 \7 T7

-7-r—«-5» rh j^^Tî^

0 1 2 3 4 5 G 7 3 9 10 11 ТПН

v i i ' ' ' « «_í_i, ,„■„ l- i

Рис .1. PiíCTO.'.STüaii нартн рДНК :îicotiana glauca, H. t.iba-cua, n. r.ylvcatris, lu pluEiiarjinifolia и красавки, Atropa ballado.mrt. т-саЛт узиаааиил рсстр'.'.итази eooR1, V-ca:iT узнавания iviuRV.

лени также у петунии (Waldren et al., 1933) и томата (Vallejos et al., 1986) и, видимо, являются специфичными для пасленовых. Наличие двух сайтов ЕсоШ в 5-облости 2GS рДНК обоих повторов рДНК красавки было подтверждено анализом рДНК линий КА-6 и da-1, каждая из которых содержала лишь один из двух р-повторов красавки, линия МА.-6 - повтор длиной 9,<( тпн, а линия ДЛ-1 - повтор длиной Ю,2 тпн. Приведенная на рис.2 схема Есоя1~фрагменточ рДНК 5 видов Табаков и красавки свидетельствует о значительной гетерогенности генов рибосомалышх РНК пасленовых, обусловленной варьированием длины нетранскрибируемого спейсера. Кроме того у и. syl-vectria и и. plumbaginifolia выявлены изменения в транскрибируемых последовательностях рДНК.

Ab Np Ns Ng Nt Ne

Рис .2. Распределение по длине £cor1 -фрагментов ДНК пасленовых, гибрндизуяцихся с 18S и 263 р?НК.

Обнаруженная нами гетерогенность длины повторяющихся единиц pîHK табак on ?ыг;е, чем в роде Vicia (Lannpa et al., 1904) и у тркхлиг^ых (Sakurà et «1., 19S5) и сравнима с гетерогенное ты? рДКл тыхьенчых (ЗгояХ, Honlebeu, 1?S6) и трибы Cynarea (?ucei,

Haggini, 1986).

Построены также рестриктные карты рибосомальных повторов двух видов семейства крестоцветных - ВгаозЛса ctmpestris и В. oleracea. Как следует из рис.3, в геноме турнепса кроме р-пов-тора длиной 10.0 тпн, идентичного повтору рДНК в. oleracea, содержится еще один класс рДНК с длиной повторов 9.15 тпн.

В. с ampestris 18S 26S 18S

тГ ТГ Х7 V _W w г V V

■■•»•.»-г ..i. . W—-I F- ,«• ч

18S 26 S 10S

В. oleracea

^ V jT ^_7 гт T? r? w

18 S 26 S 18S

01 23A 56789 10 11 ТПН i i i i i i ' ' ' ■ '_i

Рис. 3. Рс-стриктмыс карта повторов рДНК Вгаззгсп cnmpasfcris и Вгаззз.сч olerácea. 7-саПт узнавания рсотриктаэы EcoR1, 7-сайт ЕоойУ.

В геноме рапса, природного гибрида В. ооарег,tría и Б. oleracea кроме специфичных для родителей фрагментов рДНК, выявлен новый Ecojíl-фрагмент, содержащий последовательность НТС. Видимо, появление нового фрагмента рДНК, по сравнению с родительскими геномами, обусловлено возникновением нового сайта узнавания рест-риктазы в области нптранскркбируемого спейсера рапса в про-

цессе независимого эволюционирования.

3 повторах рДНК капусты, турнепса и рапса, также как у арабидопсиса (Pruit;'-, Kcyorovits, 1936) и редиса (Dolaony ct al,, 193¿) имеются специфичные для семейства крестоцветных сайты реотриктазн seoHl в 5-области гена 183 рРНК и во внутренней чг.о-ти последовательности 2G5 рДНК.

2. Наследование рДНК у меквидовых соматических гибридов.

Анализ последовательностей рДНК межвидовых соматических гибридов Nicotiana tabacum + и. plumbaginifolia, н. tabaeum +

К. glauca, tu plumbaginifolia + Ii. sylvestris проводили с использованием зонда pUi/7» содеркащего последовательность 26S рДНК, примыкающую к НТС. Как било показано при построении рестриктиих карт, спейсерц, разделяющие кодирующие последовательности пДНК Табаков, проявляют значительную гетерогенность по длине, что легло в основу использования рДНК в качестве маркера родительских геномов. Во всех проанализированных линиях межвидовых соматических гибридов выявлены последовательности рДНК обоих родителей.

Соматический гибрид мекду nicotiana tabacum и древовидным табаком н. glauca содержит примерно в два раза меньше последовательностей рДНК и. tabacuя, чем N. glauca, что отличает его от полового гябрчда тех же видов, содержащего рибосомальние последовательности обоих родителей в аквивалентних количествах (рие.'О.

3. Наследование и организация рДНК у отдаленных соматических гибридов.

При анализе соматических гибридов филогенетически отдаленных видов в гибридных геномах выявлены значительные перестройки последовательностей рДНК родителей.

У кектрибного гибрида Arabidobrassica, полученного в результате слияния протопластов Arabidopais thaliana и Braucica campeotrio (Globa, Hoffmn, 19?8 ),выявлена рДНК арабидопеиса и лиаь одни из двух классов повторов рДНК турнепса .(рис.5). Известно, что в геномах пвеници (Appolc ot al., 4980), ячменя (Appels et al., 1980), гороха (вша et al., 1934) ркоосомаяыше повторы разной длины локализованы на разных хромосомах. Анализируемая линия содержит 30—'¡0 хромосом арабидопсиса и лишь од ну-две хромосомы турнепса (Глеба, Ситник, 193*0. Очевидно, в геноме Arabi-dobrassica сохранилась только одна из двух ядриикосодераащих хромосом турнепса. Такие асимметричные гибриды, несущие весь набор хромосом одного родителя и только одну или несколько хромосом другого, могут быть полезными при составлении хромосомных карт хозяйственно ваккых культур. Большинство генов человека картировано на хромосомах о применением именно такого "клонирования" отдельных человеческих хромосом в клетках мыгаи или китайского хо-мi4K& (Као et si-, 1?S0).

t C П g

11.2—

I*

5.8 — c*

A.

Pitc.-'t. Наследование рДНК соматическим (с) и половим (п) гибридами líicotiaua tabacun +• líicofciana glauca. А. Радиоавтограф гибридизации EcoliV-фрагментоз ДНК родительских видов и гибридов с печенным -^Р зондом риь?. Б. Результат- денситометрнровання радиоавтографов треков полового (п) и соматического (с) гибридов. Результат интегрирования пиков отражен в цифрах иод пиками.

На рис.б представлены результаты аналитического ультрацент-рифугирозания ДНК арабидопсиса, турнепса и Arabidobracsica в нейтральней градиенте cocí. Б ДНК турнепса выявляется четко гшра-sennufi сатеялитний компонент. 3 работе Бервдзо (197б) показано, что 21\% ядерной ДНК турнепса входит в состав сателлитного компонента.

О присутствии скрытого сателлита в ДНК арабидопсиса свидетельствует асимметричность пика. При анализе на ЭВМ-(по программе, лгбезно предоставленной ТЛ'.Беридзе) этот пик удалось разлепить на три компонента, что подтверждает наличие у арабидопс«а обогащенной Щ-парами сателлитнс.1 фракции. Симметричность ликл ¿Ш Л.п. b ido с г а с с i.c а свидетельствует об утрате соматические тлЛ-

В А ЛВ

ю.о_ ^

9.156.5-

¡ti "yVj/v

fírebido érta»1 Lea

Ar. íM¿Ai14

M CfiotUíciicm

I i

5.

6.

.4-

■t

Рис .5. Радиоавтографы полос гибридизации глону-фрагментов ДНК арабидопсиса (А), турнепса (В) и АгаЬ1<1оЬгазз1са (ЛВ) с Синдом рШ17- Цифрами обозначены размеры фрагментов в тпн.

Рис.6. Выявление оателлитных компонентов в ДНК турнепса, арабидопсиса и АгаЫаоЪгаааа-са. В качестве стандарта плотности использовали ДНК М1сгососсца сие. 3 нижней части ри-

сунка представлено разложение пика ДНК арабидопсиса ка составные компоненты.

ридом хромосом или фрагментов хромосом, несуцих сатДНК.

Анализ организации рибосомальных генов у четырех гибридных линий, полученных в результате слияния протопластов китайского табака и красавки (Gleba et al., 1982) выявил значительное уменьшение количества последовательностей рДНК у гибридов по сравнения с родительскими линиями (рис.7).

Исходя из результатов количественного определения на фильтрах связывания ДНК родительских видов и гибридов с рДНК-специфич-нш1 зондом, цитофотометричесхого определения количества ДНК в ядрах гибридов и родительских клеток, а также результатов денси-тометрирования радиоавтографов полос гибридизации Есоя1 фрагментов ДНК гибридных линий с зондом pUl7 и интегрирования пиков показано, что гибридные линии содержат лиаь 10-20;' последовательной тай рДНК табака, 5-IÚÍ г.ослег.оьатс.п!.костей рДНК героаяки.

N

(.V

к

Г'

I

i

К- -г;:;

А 6 12 15

л

и

и

».дгз 0

N А 6 1215 5

N А 6 12 15 5

л-^**

а!а

.7. Уменьшение количества последовательностей рДНК у соматических гибридов К. сЫд^п.-А. ЬйНайоапа., А. Электрофореграмма разделения ЕсоН1-фрагментов ДНК табака (Н)лI кра-

оавкм (А) и гибридных линий 6. 12, 15, 5. М - всоШ-фрагменты ДНК фага Л , использовавшиеся а ;;ачеотвз стандартов молекулярной массы. На гель наносили по 3 мкг ДНК родительских видов л г,о \5 икг ДНК гибридов. Б, В. Радиоавтографы гкбридизующихся с зондом р1ГЬ? фрагментов ,ДНК. V;. Лречч мспозицла 48 часов; В. Зрекя экспозиции треков, содержащих ДНК гибридов, 20 суток.

Следует 'отметить, что во всех линиях выявляется только одна полоса гибридизации с видрепецифичннм для Л. belladonna фрагментом рДНК, принадлежащим меньшему по размеру р-повтору красавки. Очевидно, во всех проанализированных линиях хромосома, несущая рибосомннй повтор красавки длиной 10,2 тпн, была олимипировгиа.

Наши результаты по значительной деамплификации рДНК у соматических гибридов согласуются с данными других авторов об изменении числа рибосомальных генов в результате гибридизации и культивирования iu vitro. У сомаклонов картофеля показана потеря 70% последовательностей рДНК (Landanan, Uhrig, 1935 )• Молекулярные механизмы такой значительной деамплификации последовательностей рДНК неизвестны. Однако, ото могут быть или делец;;" болызих фрагментов тандемных позторог рДНК посредством рсциг.рокной рекомбинации (piaveil, 1985 ), либо неравный кроссингопор.

При анализе рДНК мемтрибных гибридов Atropa belladonna + Nicptiana tabacuffl не било выявлено таких количественных пазлк-чин, как в случае А, belladonna + п. chinonsiö. В линиях I и Ю, полученных в результате слияния опухолевых клеток табака и грото-пластоз мезофила красавки (Каневский и др., 1955), выявлены последовательности рДНК обеих родителей, причем в обоих линиях количество рДНК табака было значительно меньше, чем рДНК красавки.

Такое отношение количества последовательностей рибосомалъ-них хренов родительских видов является довольно неониданным, так как клетки линий I содержали только треть набора хромосом красавки и все хромосомы табака (Каневский и др., 1985). Воэмокно, увеличенное количество рибосомалышх генов красавки в данном случае является частью механизма, приостанавливающего процесс элиминации хромосом красавки на определенном количественном уровне.

3 гибридной линии 2, кроме EcoRl-фрагмента рДНК красавки длиной 5,5 тпн и двух слабых полос гибридизации с фрагментами 6,5 и 7,Ц тт, соответствующих рДН;( табака, обнаружена новые фрагменты рДНК, отсутствующие у родительских линий. Специфичные для линии 2 фрагменты рДНК длиной 6,15 и в,'б тпн, соответственно на 150 нуклеотидов меньше и больше фрагмента размером 6,3 тпн, обычно выявляемого в геноме красавки (рте.8).

Обнаруженная нами дупликация фрагмента рДНК красавки в геноме соматического гибрида является, видимо, первцм экспериментальным доказательством гипотеза флейвел^а (Flavoll, 1у&5 осяясня-ад?й образование новых классов поьторм» рДНК растений норааым

N А

13-

Рис.8. Радиоавтограф, щбридизации Ееои1 -фрагментов. ДНК} красавки. (А), табака (к) и. их соматического гибрида линии 2(2) с зондом, риь?,.. У^сомати-ческох'о гибрида линии,2 вместо фрагмента рДНК красавки длиной 6,3 тпн обнаруживаются два новых фрагмента 6,15 и 6,^5 тпн, которые, видимо, яв-ляэтея результатом неравного кроссин-говера

252 ЮБ 20Б 185

ЯКагО?» ) и ■ 1.аЕ£55=3 СЗаВУГД ими (ГУгПЯЭ

V .—-

крсссинговерон.

В линии '¡ь"Л;:-1 обнаружен новый класс повтороз рДНК, не выявляемый у родительских видов (рис.9).

Образование нового класса рДНК у линии ньаъ-1 показано такие при гибридизации ЕооШ-фрагмзнгов с зондсм рт,7 и 18Я рРНК. Новый фрагмент ДНК длиной 8,3 тпн выявляется у гибридной линии ЯЪАЪ-*! тепле при гибридизации ДНК рсстрицированной эндонуклеа-зей 2ааа11 с зондом рЦЬ7- Зозноясны несколько механизмов, объясняющих образование- нового' класса рДНК в процессе соматической гибридизации: I) повтор рДНК, обнаруженный в гибридной линии ИйАЬ-1, присутствовал в геноме одного из родителей в малой количестве копил (следовательно не обнаруживался с помочь» блот-гибрадизаиии}, однако амплифкцироэадся э гибридных клетках. 3 мутантах Хеаория Ьиоухз, лишенных ядрышек, были обнаружены низкокопийнае последовательности, гомологичные рДНК; (?азЬ1го а1., 1966); 2) новый

N 1 A

Рис.9. Новый класс «озторсв рДНК длкной 12,5 тпн у соматического гибрида ; iikAb-1 (1) между табакем (к) и красав-; кой (Л). EcoRV-фрагментц ДНК гибридизова-ли по Саузериу с зондом pul?.

EcoRV

вариант повтора рДНК обусловлен инсерцией транспазоноподобного элемента в один или несколько р~повторов одного из родителей с последующей его амплификацией; 3) возникновение нового класса рДНК у соматического гибрида обусловлено неравны»! кроесинговером.

Клонирование и секвенирование образовавшейся в процессе соматической гибридизации последовательности рДНК представляет чрезвычайный интерес, так как данная модельная система позволяет выязить механизмы образования и размножения в геноме новых вариантов генов, что является основой эволюционирования кивых систем.

Ц. Наследование рДНК у "гамма"-гчбридов.

Были исследованы гибридные линии, полученные в результате слияния протопластов Hicotiana plunbaginifolia и клеток И. sylvestris, облучавшихся дозами 500 и ГООО Гр, а такие линии мек-трибных гибридов II. plurabaginifolia + Atropa belladonna, при создании которых клетки красавки облучались дозами 100, 300, 500 и 1000 Гр (Глеба и др., 1987). Эти дозы на одим, два порядка пре-выиают ]!Д 100, равную для протопластов Hicotiana sylvestris 50 Гр. Гибридизация соматических клеток является, таким образом, еяоего рэ/,а спасительно:'; мерой для генетического материала зтих "м'фтвых" з фи»иодог и,йтком отиошсни»-. ¡слеток. Практически во

всех проанализированная линиях "гемма "-гибридов. кроме рДЯК К. plunbaglriiCcXia, выявлялись таккз р-повторы облучавшихся родителе;1.. Количество последовательнеетей рДНК облученного, родителя

4'лтельно варьировало кехду разними линиями. Каких-либо закономерностей мс«;ду степенью амплификации рДНК облучавшихся родителей з геномах гибридных линий и количеством хромосом или дозой гамма-излучения, которыми обрабатывались клетки и. sylvestris и к. bolladori»a, не выявлено.

Таким образом, показано преимущественное сохранение в геномах "гамма"-гкбридоз рДНК облучавшихся родителей, по сравнения с другими ядерии::» маркерами, изоформамп ряда ферментов, малой субгедвници рнбулозодифосфатхарсог.оилазн, а теки© ДНК оргапелл (Глеба и др., 1957).

В1Ш0Д.!

т. Построен« рсстрпктиие. карг.4 генов кодирувчих рибооомаль-нуа РНК пяти вил,оз семейства паеленовмх и двух видов семейства крестоцветных. Показана специфичная для каждого семейстза локализация сайтов рестрчктази нсоЛ1 в кодируй);;!;;', последовательностях рДНК.

2. Показано, что рибссомныс повтори исследованных видов пас-лск-юзих достаточно дгоергзшш по длине, благодаря варьировании дг.'дш нетранехр^бируедах спейсороз, разделивших кодирующие последовательности.

3. Последовательности рДНК могут бить использованы в качестве маркеров ядерных генсмоз родительских видов как яри близкородственней таг. и при отдаленной гибридизации растений.

•I. При ме;г:гпдойой соматической гибридизации рДНК наследуется двуродптельски, как сумма рпбоосмальнух генов обоих родителей.

5. В геномах отдаленных гибридов происходят значительные перестройки последовательностей рДНК:

а) в мжтрибпен гибриде Arabidobraoaica, несущем полный набор хромосом арабидопсиса и лиль несколько хромосом турнепса показано наследование рибосо:мшх повторов арабидопсиса к лизь одного из двух классов р-повтороп турнепса;

б) в нескольких линиях гибридов liicotiana + Atropa обнаружена значительная "дёамплифнкацкя рибссомальноЯ ДНЯ.

6. Впервые обнаружен факт образования новых классог повторов рДНК в процессе соматической гибридизация растений.

7. 3 асимметрических гибридах, полученных результате

ния протопластов N. plumbaginifolia с облученными (дозы I00, 300, 500 и ЮООГр) клетками К. sylvestris и А. belladonna, кроме генов рибосомной РНК Н. plumbaginifolia, почти в 100$ случаев обнаруживается рДНК облучавшихся родителей.

8. Соматические гибриды могут быть использованы в качестве модельной системы при исследованиях молекулярных механизмов эволюционирования геномов.

к

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мирошниченко Г.П., Волков P.A., Борис «ж Н.В. Структура генома турнепса, арабидопсиса и их соматического гибрида // Биохимия. - 1966. - 51,И. - С. 84-94.

2. Борис'.к U.E., Волков P.A., Мирошниченко Г.П. Полинук-И*--тидные последовательности ДНК пасленовых при половой и соматической гибридизации / Молекулярные механизмы генетических процессов: Тез.докл. У1 Всес. симпозиума. Москва, февраль 1987 г. -Москва: Г937. - С. 112-113.

3. Мирошниченко Г.П., Волков P.A., Борисшс Н.В. Организация повторявшихся единиц в генах pPHií пасленовых / Структура и функции клеточного ядра: Тез. докл. Всес. конференции. Черноголовка, май 1987 г. - Москва: 1987. - С. 118.

4. Борисвк H.D., Каневский И.В., Глеба Ю.Ю. Наследование и организация рДНК в соматических гибридах îlicotiana tabacuc + Atropa belladonna // Доклады AH УССР. Сер. Б. - 1987. - X' 10. -С. 60-63.

5. Глеба Ю.Ю., Каледа В.А., Пароконный A.C., Борисяк Н.Э., Лопато C.B., Негруцу И., Нанобс М. Фертильные ядерные мвжтрибкые гибриды Kicctiana + Atropa, получении-' путем слияния нормальной и («¡активированной облучением соматических клеток // Доклады АН СССР. - 1987. - 297, Ü 6. - С. ШЗ-Ш5.

6. Борисюк Н.В., Миролниченко Г.П. Гены рибосомальных РНК у красавки, Atropa belladonna I! Биополимеры и клетка. - 1958. -jt, № 2. - С. 79-84.

?. Gleba D., Kaioda V., Parolconny A., Pcrysjuk H.» ûleba ïu,, liegrutiu J., Jacobs И. Nuclear gone tica of sonatie coll hybrids // Abstracts of the XXV International Botanical congreas. Bor) in (West), Germany, 24 July to 1 August, 1 987• Barlin (Weat)<-"'"' 1987. - p. 154.