АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ

Муха, Дмитрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ"

На правах рукописи

Муха

Дмитрий Владимирович

Анализ структурно-функциональной организации и эволюционной

ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ НАСЕКОМЫХ

03.00.15-генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва • 2004 год

■г

Работа выполнена в Группе генетической инженерии животных Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Научный доктор биологических наук, профессор,

консультант: академик РАН

Юрий Петрович Алтухов

Официальные доктор биологических наук, профессор

оппоненты: Николай Казимироеич Янковский

доктор биологических наук Александр Иннокентьевич Ким

доктор биологических наук, профессор Вячеслав Залманович Тарантул

Ведущая организация: Институт биологии развития

им, Н. К. Кольцова РАН

Защита состоится_февраля 2004 года 8_часов

на заседании Диссертационного совета Д002.214.01 при Институте общей генетик» им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 116991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан_января 2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г. Н. Полухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Геном эукариот представляет собой сложноорганизованную систему генов, регуляторных и структурных элементов. Неотъемлемой частью генома любого (за исключением рада простейших (Yao, 19S2]) эукариотического организма является кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой тандемно повторенные гены рибосомных РНК, разделенные рядом спей серных последовательностей [Gerbi, 1985).

Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время каждый еид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного участка генома. С нашей точки зрения, для комплексного понимания всего разнообразия генетических процессов, лежащих в основе функциональной активности и эволюционной изменчивости живых организмов, принципиально важным является молекуля рно-генетическое исследование новых, ранее не исследованных видов, то есть традиционно не являющихся "модельными".

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рДНК эукариот может рассматриваться как эффективный подход к изучению закономерностей эволюционного процесса [Hillis & Dixon, 1991]. Характерной особенностью рДНК является то, что различные структурные элементы данного участка генома эволюционируют с разной скоростью. Наиболее ээолюционно консервативны гены рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) - их сравнительный анализ эффективен при исследовании генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами. Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, 1TS1 и VTS2) эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными видами. Нетранскрибируемый спейсер (NTS) является наиболее изменчивой частью рДНК - в пределах одного генома может содержаться несколько типов NTS - анализ изменчивости данного района рДНК, с нашей точки зрения, позволит проследить первые этапы эволюционного процесса, то есть возникновение индивидуальных, вкутрипопуляционных и межпопуляционных генетических различий, предшествующих возникновению нового вида.

1 ^ * : 1 yj-'b^jLo

Кроме тога, кластер рДНК является классическим примером мультигенного семейства и. следовательно, представляет собой удобную модель для анализа механизмов изогениэации ("согласованной" эволюции) членов мультмгенного семейства. Основные генетические процессы, лежащие в основе изогенизации, были описаны на примере рДНК различных эукариот [Dover, 1982].

Промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК (промотор РНК полимераэы I), в отличие от промоторов РНК полимераэы II, обусловливающих транскрипцию большинства генов, кодирующих информацию о белках, и РНК полимераэы III обладает рядом уникальных особенностей. Во-первых, данный промотор обусловливает гиперэкспрессию РНК. Клетки эукариотических организмов синтезируют около 10000 различных типов РНК, при этом около половины транскрипционной активности направлено иа синтез только одного типа РНК, а именно рибосом ной РНК (Paule & Lofquist, 1996]. Во-вторых, данный промотор не обладает тканеспецифичностью и активно работает во все типах клеток на всех стадиях развития организма. В-третьих, он является вцдоспецифичным [Soliner-Webb & Tower, 1986]. С нашей точки зрения, вышеперечисленные особенности позволяют предположить, что промотор, обусловливающий экспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии. В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК {то есть транскрипции соответствующей палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы I.

Отметим, что методы генетической инженерии, получившие в последние десятилетия большое развитие, позволяют не только генетически модифицировать живые организмы, но и, что с нашей точки зрения особенно важно, изучать биологическую роль конкретных генов посредством специфического подавления функциональной активности соответствующих РНК, В этой связи особенно актуальными представляются исследования, направленные на разработку новых векторных систем, позволяющих переносить чужеродный генетический материал в геном исследуемого объекта. Для получения трансгенных насекомых одним из подходов является использование денсовирусов [Carlson et al., 2000].

Цели и задачи исследования

Сравнительный анализ молекулярно-генетической организации рДНК различных видов организмов необычайно важен для понимания механизмов функционирования и эволюции живых организмов. В этой связи одной из целей данного исследования была разработка "универсальных" методических подходов, позволяющих исследовать структуру рДНК любых эукариотических организмов вне зависимости от видовой принадлежности.

Второй целью данного исследования являлось описание и выявление особенностей структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК нескольких вцдов насекомых {на примере отряда Blattodea).

Третья цель - характеристика открытого нами нового вида денсовирусов -ßgDNV - потенциальной векторной системы, позволяющей экспрессировать чужеродную генетическую информацию в клетках насекомых под контролем мощного промотора генов рибосомных РНК.

В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования.

1) Посредством анализа In srtico рДНК эукариот выявить универсальные праймеры и молекулярные зонды, позволяющие исследовать методами ПЦР и блот-гибридизации рДНК любых эукариотических организмов, привести экспериментальные доказательства "универсальности" предложенных методических подходов.

2) Клонировать и секвенировать полноразмерный повтор рДНК рыжего таракана Blattella germanica, описать структурно-функциональные элементы данного участка генома.

3) Описать внутривидовой полиморфизм различных структурных элементов рДНК рыжего таракана. На основе выявленного полиморфизма исследовать генетическую структуру природных популяций этого вида.

4) На основе анализа изменчивости нуклеотидоа 28S генов рРНК определить генетические дистанции между представителями различных родов отряда Blattodea, Провести анализ эволюционной

изменчивости внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров у близкородственных видов родов B/atteJJa и Periplaneta.

5) Клонировать, секвенировать и описать структуру ДНК обнаруженного нами деноовируса рыжего таракана ßgDNV.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые разработан новый методический подход исследования структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов эукариот. основанный на использовании универсальных праймеров и зондов. На примере нескольких таксономических групп эукариот (насекомых и растений) продемонстрирована эффективность данного подхода, позволяющего клонировать нативные повторы рДНК любых эукариотических организмов, первичная структура рДНК которых не определена, а также исследовать полиморфизм длин рестриктных фрагментов рДНК на популяционном и видовом уровнях. Впервые дано полное описание структурно-функциональной организации нативного повтора рДНК рыжего таракана.

Впервые проведен комплексный анализ различий структурных элементов рДНК (генов 26S- и 5.8S рРНК, внутренних и внешних транскрибируемых спейсеров) у различных видов отряда Тараканы, - как близкородственных, так и эволюционно удаленных друг от друга. Показано, что степень эволюционной изменчивости описанных структурных элементов рДНК сильно различается, что отражает двойственную природу эукариотического генома [Алтухов, 2003]. Сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов тараканов двух родов - Blatteila и Periplaneta - выявил внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.

В связи с активным использованием антибиотиков на животноводческих фермах особую озабоченность вызывает способность тараканов переносить микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, которые используют как для ветеринарных целей, так и в медицинской практике [Schal & Hamilton, 1990]. Нами впервые разработаны молекулярно-генетические маркеры ДНК, позволяющие дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции и

уровень миграции между ними. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов из животноводческих ферм в населенные пункты и, соответственно, сфокусировать санэпидемиологический надзор в правильном направлении.

Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана Blattella germanica (B3DNV). Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Parvoviridae, род Densovirus, Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.

Результаты, полученные в настоящем исследовании, были использованы для разработки методологии и оригинальных экспериментов лри изучении различных видов насекомых на Кафедре энтомологии Государственного университета Северной Каролины (США). Полученные данные и обобщения следует учитывать при проведении работ в области популяционной генетики, молекулярной эволюции и структурно-функциональной организации генома, а также использовать при чтении соответствующих курсов лекций в ВУЗах.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. М. И. Вавилова (Саратов, 1994); Евроазиатском симпозиуме "Текущие тенденции в биотехнологии* (Анкара, 1995); на международной конференции "Генетические манипуляции с насекомыми" (США, 1999); на международной конференции "Биология насекомых" (Москва, 2002); на второй конференции Московского общества генетиков и селекционеров им, Н, И. Вавилова (Москва, 2003); на научных семинарах Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН; на научных семинарах кафедры генетики Государственного университета Миннесоты (США, 1999), кафедры генетики и кафедры энтомологии Государственного университета Северной Каролины (1997,1999,2000),

Объем и структура работы. Публикации

Диссертация, изложенная на 253 страницах, включает стандартные разделы и иллюстрирована 19 таблицами и 52 рисунками.

Ряд данных, представленных в диссертации, был получен в результате плодотворного сотрудничества с А. П, Сидоренко, А. Л. Королёвым, О, Е, Лазебным и Л. Е Андреевой, работавшими под руководством автора аспирантами - А В. Ильичевым, И. В, Лазебной, А. Г. Чумаченко, М. В. Паленко, В. А. Мьгоиной, а также К. Шалом и Б. Вигманном (Университет Северной Каролины, США), которым автор приносит глубокую и искреннюю благодарность.

По теме диссертации опубликовано 19 работ в российских и международных рецензируемых журналах и зарегистрирован патент на изобретение в Государственном реестре изобретений Российской Федерации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1, Анализ in siuco генов рибосомных РНК эукариот

С целью выявления высококонсервативных доменов в пределах генов рибосомных РНК эукариот ранее опубликованные последовательности 26S и 17S генов рибосомных РНК Tetrahymena pyriformis - представителя эукариот из типа простейших - условно наиболее примитивного живого существа, сравнивали с последовательностями рДНК других эукариотических организмов, представленными в EMBL базе данных, посредством компьютерной программы ImaGene {QueryLogic Inc.), Принцип действия программы заключается в следующем. Сублоследовательность, состоящая из N первых нуклеотидов изучаемой ДНК, сравнивается с базой данных, состоящей из нуклеотидных последовательностей определенного типа. Количество последовательностей, представленных в базе данных, обладающих заданной степенью сходства с анализируемой субпоследовательностью, отмечается по оси ординат в качестве определенной абсолютной величины. По оси абсцисс обозначается полное количество нуклеотидных пар изучаемой последовательности. В очередном цикле работы программы сравнению подвергается сублоследовательность, состоящая из следующих N нуклеотидов анализируемой ДНК. Длина субпоследоеательности, тестируемая в единичном цикле работы программы, равнялась 40 нуклеотидам.

1.1 285- подобные гены рибосомных РНК

Для анализа 288-подобных генов рРНК эукариот использовали базу данных, состоящую из всех последовательностей рднК эукариот, содержавшихся в EMBL банке генов к моменту начала работы (19ЭЗ год). Общая длина 26S рДНК Т. pyriformis равняется 3341 л.н. [Engberg, 19&4J. На рисунке 1 представлены результаты, полученные при использовании различных степеней сходства: 40/40 (100%) - рис. 1а; 40/33 (95%) - рис, 16: 40/35 (37,5%) - рис, 1в; 40/30 (75%) -рис. 1г; 40/28 (70%) - рис. 1д.

Как видно на рисунках 1а, б, в, г, д общий характер изменений при увеличении значений задаваемых степеней сходства заключается в сужении областей последовательности 26S рДНК Т. pyriformis и уменьшении количества последовательностей, содержащихся е базе данных, удовлетворяющих данному критерию. Однако даже при столь высокой степени сходства как 87,5% (рис. 1в), в анализируемой последовательности рДНК можно выявить до 7 доменов, протяженностью 200 - 400 нуклеотидов, степень эволюционной консервативности которых соответствует заданному параметру. Наиболее протяженные высоко консервативные домены 26S рДНК Т. pyriformis локализованы ближе к 3' концу изучаемой последовательности.

На рисунке 1а представлен результат сравнения субпоследовательностей 26S рДНК Г. pyriformis с банком генов рДНК посредством компьютерной программы ImaGene при заданной 100% степени сходства (40/40), Обнаружено три субпоследователькости 26S рДНК Т. pyriformis, которые проявляли 100% сходство с определенным числом (от 40 до 70) последовательностей рДНК, представленных в EMBL базе данных. Более тонкий анализ проводился посредством программы FASTA. Результаты проведенной работы представлены в таблице 1. Как видно на таблице, три субпоследовательности рДНК Т. pyriformis, протяженностью от 41 до 61 п.н., имеют 100% сходство с соответствующими последовательностями рДНК таких различных организмов, как Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (растения), Saccharamyces cerevisiae (грибы), Caenorbabditis elegans (круглые черви), Xenopus leavis (земноводные), Homo sapiens (человек). Описанные субпоследовательности 263 рДНК Т. pyriformis могут быть рекомендованы для создания праймеров для

исследования методом ПЦР рДНК организмов различных таксонов, в том числе и тех организмов, первичная структура рДНК которых еще не определена.

1.2 18S- подобные гены рибосомных РНК

Аналогично анализу 285-псдобных генов рРНК (описано выше) исследовали гены ISS-подобных рРНК эукариот. Отличительной особенностью данных последовательностей является тот факт, что эволюционно консервативные домены со степенью сходства 80% и выше - 200-300 п. н. - равномерно распределены вдоль длины 18S геное рРНК.

Данные сублоследовательности имеют следующую примерную локализацию на последовательности 17S рДНК T. pyrtformts (указаны первый и последний нукпеотид): 310-410; 550-650; 900-1010; 1200-1320; 1550-1650. Внутри данных доменов были выявлены более короткие субпоспедовательности, протяженностью в несколько десятков нукпеотидных пар, имеющие степень сходства около 100% с рДНК таких эволюционно удаленных от простейших такооноа, как растения, грибы, млекопитающие и человек. Описанные субпоспедовательности 17S рДНК Т. pyiifomis могут быть рекомендованы в качестве основы для исследования методом ПЦР рДНК организмов различных таксонов, в том числе и тех организмов, первичная структура рДНК которых еще не определена.

2. Создание универсальных праймеров и зондов, позволяющих методами ПЦР и

блот-гибридизации анализировать структуру рибосомной ДНК эукариот

2.1 Создание универсальных праймеров, позволяющих методом ПЦР анализировать структуру рДНК эукариот

На основе проведенного сравнительного анализа степени эволюционного консерватизма различных субпоспедовательностей генов рРНК и выявленных сверхконсереатианых доменов были предложены две пары праймеров DAMS_18 - 5' gtccctgccctttgtacaca 3'; DAMS_28 - 5' ctactagatggttcgattagtc 3' и NTS J 8 - 5' tccaccaactaagaacggcc 3'; NTS_28 - 5' aactatgactctcttaaggt 3', обладающие 100%-ным сходством с соответствующими доменами генов рРНК почти всех эукариотических организмов, нуклеотидная последовательность рДНК которых описана к настоящему времени. Отметим, что данная работа была проведена в

начале 90-х годов прошлого века. На современном этапе развития биоинформатики и компьютерной

»»И 3101

Рисунок I. Выявление и последовательности 265 рДНК Т. руп/огтЬ домекоэ, облагающих различной степенью эволюционной консервативности (пояснения в тексте). Данные получены совместно с Сидоренко А. П.

Таблвиа1

Характеристика субпоследовательностей гена 26S рРНК Т. pyriformis, которые имеют !00%-ное сходство с рДНК организмов - представителей различных таксонов.

Последовательность нуклеотидов Протяженность и локализация на последовательности гена 26S рРНК Т. pyríformls Названия организмов, рДНК которых имеет 100% сходство с указанными субпоследовательностями ¡

taggggcgaaagactaatcga accatetagtagctggttcc 41 нукпеотид, с 916 по 956 п.н. Растения: Arabldopsis ШНапв, Oryza sativa; Грибы: | Saccftaromyces cerews/ae; Круглые черви: Caenorhabditis , e/egans: Земноводные: Xenopus leavis] Человек: Horno sapiens !

aagcgcgggtaaacggcggga gtaactatgactctcttaagg tagccaaatgcctegteat 61 нукпеотид, с 2214 по 2274 п.н.

tgagctgggtttagaccgtcg tgagacaggttagttttaccct aetg 47 нуклеотидов, с 2920 по 2966

Данные получены совместно с Сидоренко А. II.

техники стали общедоступными сверхмощные серверы, содержащие на порядок большее количество последовательностей рДНК, и разработаны соответствующие компьютерные программы, позволяющие проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнение последовательностей нуклеотидов предложенных праймероа (DAMS_18, DAMS_28, NTS_1S и NTS_28) С последовательностями нуклеотидов рДНК эукариот, представленными в EMBL и GenBank базах данных (февраль 2003 года - мш/www.rcbt.ni m. ning ov ). посредством компьютерных программ BLAST и FASTA не выявило соответствующих субпоследовательностей, которые имели бы более одной нуклеотцдной замены, причем вариабельные нуклеотиды не затрагивали 3' фланга лраймера, важного для инициации полимеразной цепной реакции. Таким образом можно заключить, что данные праймеры являются универсальными для амплификации методом ПЦР соответствующих фрагментов рДНК эукариотических организмов.

На рисунке 2 приведена схема структурной организации кластера рибосомных генов эукариот и обозначены ориентация и примерная локализация универсальных лраймеров. Суть предложенного нами подхода, позволяющего амплифицировать перекрывающиеся фрагменты полнораэмерного, то есть содержащего все структурные элементы, повтора кластера рибосомных генов любого эукариотического организма, проста и заключается в следующем. С использованием

пар универсальных лраймероэ DAMS_18/DAMS_28 и NTS_18/NTS_28 амплифицируют, клонируют и определяют последовательность нуклеотидоа соответствующих фрагментов рДНК (смотрите рисунок 2). На основе определенной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов создаются дополнительные две пары видоспецифичных праймеров, обозначенные на рисунке 2 как а/Ь и с/с), которые позволяют амллифицировать дополнительные два фрагмента рДНК, необходимые для полного перекрывания нативного повтора кластера рибосомных генов.

В рамках данной диссертационной работы описанный подход был реализован при анализе структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов рыжего таракана, Blattella germanica.

Рисунок 2. Схема строения кластера рибосом ной ДНК эукариот. DAMS_18, DAMS28, NTSJS н NTS_28 - универсальные праймеры; а, Ь, с и d - вилослсцифичные праймеры (пояснения в тексте). ISS, 5.SS, 28S - последовательности генов рибосомных РНК; ITS1 и ITS2 - внутренние транскрибируемые спейсеры; NTS - нетрансярибируемый спейсер,

2.2 Клонирование высококонсервативных фрагментов рДНК

Tetraftymene pyriformis

На рисунках 1 а, б видно, что наиболее протяженные высококонсервативные домены 26S рДНК 7, pyriformis локализованы ближе к 3' концу изучаемой последовательности а районе между 2000 и 3000 нуклеотидами. Эта область была выбрана для создания зонда, позволяющего выявлять последовательности рДНК различных таксономических групп методом блот-гибридиэации, В пределах последовательности 17S рДНК Г. pyriformis характер распределения высококонсервативных последовательностей иной - относительно короткие домены равномерно распределены по всей длине гена. Поэтому, а также учитывая

а Ъ

с d

относительно небольшой размер этого гена (1752 п.н.), для создания зонда, гомологичного 18S- подобным рДНК, клонировали фрагмент рДНК, содержащий полнораэмерный ген 17S рРНК T. pyriformis.

Как известно, а процессе созревания макронуклеуса инфузорий происходит амплификация локализованной в хромосоме копии рДНК, причем а макрокуклеусе кластер рибосомальных генов представлен в виде палиндромной последовательности длинной около 20 т.п.н. (рисунок 3). В зрелом вегетативном ядре Tetrahymena содержится около 1 х 104 копий таких палиндромных последовательностей [Engberg, 1985].

Подход, используемый нами для выделения амплифицированных копий рДНК T. pyrifotmis, был основан на методе пульс-электрофореза, при этом тотальную ДНК предварительно экстрагировали в особо мягких условиях для сохранения нативных размеров и лучшего фракционирования мультикопийных линейных молекул - рДНК и митохондриальной ДНК, Результат пульс-электрофореза тотальной ДИК T. pyriformis представлен на рисунке 4.

Рибосомапьная ДНК Т. pyriformis являлась предметом изучения многих авторов, и к настоящему времени составлена подробная рестриктная карта этих молекул, определена полная последовательность нуилеотидов 17S, 5.8S и 26S рДНК [Engberg, 1985]. На рисунке 3 представлена схема, иллюстрирующая расположение сайтов узнавания рестриктаз Hindill и Bgill на палиндромной молекуле рДНК Т. pyriformis. Отметим, что при обработке рДНК T. pyriformis рестриктаэой Hind III в числе прочих образуется фрагмент ДНК (1212 л.н.), соответствующий последовательность 26S рДНК с 1989 -го по 3201 -й нуклеотид, то есть фрагмент, содержащий вьюскоконсераативную зону 26S рДНК Г, pyriformis (смотрите рисунки 1 и 3), а при последовательной обработке рестриктазами Hindill и ВдМ - фрагмент, содержащий полноразмерный ген 17S рРНК Т. pyriformis (смотрите рисунок 3).

Очищенную ДНК полноразмерных амплифицированных молекул рДНК Т, pyriformis обрабатывали рестриктаэой Hind III или последовательно рестриктазами Hinä III vi Bgl II. Полученный препарат ислользоаали для создания миниклонотек на основе вектора pUC19. Анализ полученных рекомбинантных молекул позволил отобрать искомые клоны, то есть плазмидные молекулы, содержащие последовательность 26S рДНК 7. pyriformis с 1989 -го по 3201 -й нуклеотид (плазмида названа pFF(H-H)1212) и полноразмерный ген 17S рРНК (плазмида

названа р175{Н-В)1752). Фланги клонированных фрагментов были частично секвенированы в составе описанных плазм ид и показана полная идентичность ранее описанным последовательностям.

Центр симметрии

к н н

1 I 1

1 Г

ттг

в вв

нн 5

11 »и

175(Н-Б'|<752

нн

н н

тп 1—Т

в в в

Рисунок 3. Схема структурной организации автономно решшцируемых молекул рДНК Т. р)п/сггп!!. Стрелками указано расположение сайтов узнавания ресгрнктэз /Лл<И1Г (Н) н В§!\1 (В). Коротким» продольными полосами обозначены соответствующие фрагменты рДНК, входящие в состав рекомбннантных плазм ид р ПЭ (Н-В) 1752 и рРНН-Н) 1212.

ТПН Старт

150

Рисунок 4. Пульс-электрофорез тотальной ДНК Те!гаЬутепо руН/огт'к. Стрелкой указана фракция автономно реплицирующихся линейных молекул рибосомной Д1!К; звездочкой обозначена фракция линейных молекул митохондриальной ДНК.

2.3 Демонстрация применимости полученных универсальных зондов для анализа структуры рДНК животных и растений.

К сожалению, нельзя теоретически однозначно определить степень сходства двух последовательностей ДНК, необходимую для того, чтобы одна из них могла бы быть использована в качестве зонда для выявления гомологичных

последовательностей е других видах организмов методом блот- гибридизации. "Адекватность" зонда всегда следует проверять экспериментально.

В рамках диссертационной работы было проведено несколько оерий экспериментов, направленных на анализ структурной организации и эволюционной изменчивости рДНК представителей различных таксонов - главным образом, насекомых и растений, в ходе которых были использованы "универсальные" зонды sFF(H-H}1212 и p17S(H-B)1752. В автореферате диссертации я ограничусь описанием исследования внутривидового полиморфизма рДНК гороха посевного.

Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного fPisum sativum)

В работе использовали 21 сорт гороха P. sativum, полученный из коллекций Института земледелия УААН и Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Пераой задачей данного исследования было выявление ферментов рестрикции, позволяющих детектировать внутривидовой полиморфизм длин реетриктных фрагментов рДНК P. sativum, обусловленный ее гетерогенностью. На рисунке 5 показан результат блот-гибридиэации р17$(Н-В)1752 с тотальной ДНК двух произвольно взятых сортов гороха после рестрикции эндонуклеазами BemHI, EcoRI и Hind III. В результате гибридизации с тотальной ДНК, гидролизовакной ферментами ВэтН! и Hind III, полиморфизм рДНК между двумя исследованными сортами не выявляется (рисунок 5, сравните дорожки 1, 2 и б, 6). После рестрикции тотальной ДНК гороха ферментом EcoRI, зонд pl7S(H-B)1752 выявляет у каждого сорта по два варианта фрагментов размерами от 2 до 5 т.п.н. (рисунок 5, дорожки 3, 4). Один из них, имеющий размер около 3.7 т.п.н., обнаруживается у каждого из двух сортов, два других являются характерными для данного сорта.

На рисунке 6 представлены типичные для 21 исследованного сорта P. sativum варианты блот-гибридизационных характеристик рестрицированной £coRI тотальной ДНК с клонированной последовательностью 17S рДНК Т. pyriformis. Гибридиэационный зонд выявляет два типа полос. Одна из полос в положении, соответствующем фрагментам длиной около 3.7 т.п.н. (с-полоса), обнаруживается у всех тестированных сортов; остальные гибридиэационные полосы (a, b, d) выявляются на элекгрофореграмме в различных положениях, соответствующих размерам от 2.0 до 5.0 т.п.н.

0 F ¿ Ь tí tt

ТПН 1t

Рисунок 5. Результат блот-гибриднзааии р178(Н-В}1752 с тотальной ДНК двух произвольно вздтых сортов гороха (1-й сорт -1,3,5; 2-й сорт - 2,4, 6), ресгрицирошнноЙ: В - ВатН I Е-ЕсоК I Я - Нтй ¿1 Данные получены совместно с Сидоренко А. П. и Королевым А. Л.

'ВШ1

¡í'í^í'ÍS!

.[.."-«üK

Рисунок 6. Результат блот-гибриднэаиии рестрицированной эцдонуклеазой EcoR ! тотальной ДНК гороха copra: 1 - Неручь, 2 - Напарник, 3 -Арендатор. Зонд р175(Н-В)П51.

а, Ь, с, d - условное обозначение выявленных фрагментов рДНК, имеющих различную алектрофорегическую подвижность. Данные получены совместно с Сидоренко А. П. н Королевым А, Л,

Рисунок 7. Результат блот-гибриднзааии тотальной ДИК, выделенной из индивидуальных проростков (1-8) гороха сорта Чешский богатырь и рестряинрованной эндонуслеаэой ЕсоМ. Зонд р17(Н-В)1752, Ь, с - фрагменты рДНК, соответственно обозначенные на рисунке б. Данные получены совместно с Сидоренко А. П. и Королевым А. Л.

Специфические характеристики ПДРФ рДНК стабильно воспроизводятся у растений одного сорта, что показано на примере сорта Чешский богатырь {рисунок 7), Отсутствие индивидуальной вариабельности тестируемого признака внутри сорта и наличие сортоспецифических отличий позволяет использовать выявляемый описанным способом полиморфизм рДНК гороха посевного для анализа сортовой принадлежности.

3. Клонирование, секвенирование и описание структуры полноразмерного повтора рДНК рыжего таракана ВШТТЕиА в£Р)МАН1СА

Методические подходы, описанные в первых двух главах, позволяющие с использованием "универсальных" праймеров амплифицировать, клонировать и

определять последовательность нуклеотидов перекрывающихся фрагментов полиораэмерного повтора рДНК зукариот, были применены для анализа структурной организации кластера рДНК рыжего таракана Blattella germanica.

На рисунке 8а (дорожка 1) приведен результат амплификации фрагмента рДНК рыжего таракана с использованием "универсальных' праймарое DAMS_18/DAMS_28, Амплифицироэанный участок генома включает фрагменты генов 183 и 285 рРНК, ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 (смотрите рисунок 2). Известно, что гены рибооомных РНК и транскрибируемые спейсеры являются наиболее эволюционно консервативными частями кластера рДНК зукариот. Нетранскрибируемый сгтейсер (NTS) является наиболее вариабельной частью рДНК зукариот, известно, что в пределах кластера генов рРНК может содержаться несколько вариантов NTS [Gerbi, 1985]. На рисунке 86 (дорожки 1, 2) представлен результат ПЦР ДНК различных особей рыжего таракана с использованием "универсальных" праймеров NTS_18/NTS_28, то есть участков рДНК, содержащих фрагменты генов 16S и 28S рРНК и нетранскрибируемый спейсвр (смотрите рисунок 2). Как видно на рисунке 86, электрофоретическая подвижность сравниваемых фрагментов резко различается.

Описанные выше амплифицированные фрагменты рДНК рыжего таракана были клонированы (результат клонирования двух вариантов фрагмент», содержащих NTS, представлен на рисунке 86, дорожки 3 и 4) и секвенированы (больший по размеру фрагмент, содержащий NTS, секвенирован частично). На основе определенной последовательности нуклеотидов описанных фрагментов рДНК рыжего таракана были созданы две дополнительные пары видослецифичных праймеров а/Ь и c/d, позволяющие амплифицировать, клонировать и секвенировать фрагменты 28S и 18S генов рРНК соответственно, последовательность нуклеотидов которых оставалась неопределена (смотрите рисунок 2 ).

Полная последовательность нуклеотидов полноразмерного повтора рДНК рыжего таракана (901S л.н.}, содержащая один из вариантов нетранскрибируемого спейсера, зарегистрирована a Gen Ban k #AF321244.

Определение границ генов рРНК (18S, 5.8S и 28S) и соответственно границ внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) проводили посредством сравнения различных участков рДНК рыжего таракана с соответствующими

тпо

.. а

.'•p'k-i-,. -ir

1 м

Ml 2 3 4 М

Рнсупок S. Результат ПЦР амплификации рДНК В, germonica с использованием прайм tpoe А - DAMS_18 / DAMS„28 (дорожка 1); Б - NTS_!8 / NTSJ28 (дорожки 1 и 2); дорожки 3 и 4 -результат электрофореза рестряцироьанных ферментом Not I (уникальный сайт рестрикции) пяазмнл рСЕМ-Т, содержащих клонировал и ые фрагменты, представленные на дорожках 2 и 1 (соответственно), М - маркеры размеров фрагментов ДНК.

последовательностями, представленными в EMBL и GenBank базах данных. За начало (конец) генов рРНК принимались наиболее протяженны© области рДНК, дающие 100% сходство с соответствующими последовательностями других эукариот, представленных в настоящее время в базах данных.

Для определения старта транскрипции рДНК, т. е. области локализации промотора, был применен следующий стандартный подход. Радиоактивно меченный лраймер, локализованный в непосредственной близости от начала 18S гена отжигали с тотальной РНК, изолированной из рыжего таракана и посредством обратной транскриптазы синтезировали комплементарную цепь ДНК (кДНК). Размер кДНК определяли методом фракционирования в 6%-ном по л иакри лам идном геле е денатурирующих условиях {рисунок 9, дорожка 1), используя для определения размера синтезируемой кДНК фХ174 ONA/Hinf I маркеры фирмы "Promega". Отметим, что выбранный нами метод не позволяет с точностью до одного нуклеотида определить старт транскрипции, но выявляет область локализации промотора с точностью, зависящей от типа используемых маркеров. На рисунке 10 область старта транскрипции выделена курсивом и жирным шрифтом.

Как видно на рисунке 10, в пределах ETS В. germaroca находятся три типа субповторов, каждый из которых представлен несколькими копиями. Сравнительный анализ с EMBL и GenBank базами данных не выявил значимого сходства описанных субпоеторое ни с одной из известных последовательностей ДНК, В то же время

сравнение субповторов с известными регуляторными элементами, основанное на алгоритме Вайбела (Waibel) и соавторов (http;//www. fruit-fly.org/seq_tools/promoter.html), выявило значительное сходство последовательности íctagcltgtctcggcatatctgtccgtataggattgtgtgtgtgtgaga (на рис. 10 выделено строчными буквами и жирным шрифтом) с промоторами генов прокариот.

Рисунок 9. Результат авторадиографии кДНК после электрофореза в 6% полиакриламндном геле в денатурирующих условиях. Дм синтеза кДНК использовали радиоактивно меченый праймер и тотальную РНК, экстрагированную ютараканов: i -В.germanica:2-В. tifuricotis; 3 ~В. asahinai.

Известно, что в отличие от эукариотических организмов, использующих для транскрипции различных генов три типа РНК пелимераз, прокариоты используют только один фермент, в том числе и для транскрипции генов рибосомных РНК. Остается неясной эволюционная преемственность данных типов регуляторных элементов, однако, с нашей точки зрения, это является важным указанием на функциональную значимость описанных субповторов и их возможную роль е регуляции активности промотора РНК пояимеразы I S. germanica. Отметим, что описанный факт не является первым случаем обнаружения прокариотических регуляторных элементов в геноме эукариот. Ранее в составе эукариотических геномов мной в соавторстве с Ильичевым А. 8. и Авдреевой Л. Е, был описан БАК-домен лактозного оперона £. coli и методами генетической инженерии показана его роль в регуляции активности эукариотических промоторов (описано в Приложение к диссертации).

Известно, что NTS рибосомных генов эукариот содержат субповторы, играющие важную роль в регуляции транскрипционной активности данных генов. Причем различные типы NTS могут отличаться между собой как по типу субповторов, так и по их количеству. На рисунке 10 кластер, состоящий из четырех одинаковых субповторов, обозначен темным фоном и подчеркиванием. Анализ функциональной

28S

CGTÇTGGT

CGATGCAACGATGAGATCGGGA3ÎCС GGTGGG TCGAÂÂGGCTTTAAAСAAG GTGATTTÏCT T С С T AG GG G GGGA CT CTTT G GA GCAGÎT AAGG С GG GAAGCCGAGTG TC GCTGAAAT GTTCA ACTATCGTA AT CAGA AACGG TGG AAGTGG TCT TAG T CCG AGCAG T AGGGCGGACTG ACC A ï G TT AGG AAG GGTGGGA TTGCCGG лСТ TA AG GCGGG A AGCGGAGT G T CGCTG AAATGTT AAAC T AT С GTAAT CAG AAAC GGT GGAAGT G GTC TT AGT С С G AG CA GTAGGGCGGACTGAÇ С AT GT T AGG AAG 3C TGGG ATTGCCGG .¿TT AAG GC GGG AAGCG GAGTG T CG CTG А AAT G АТС AACT A TGGTAATС AG AAAC GG TGGAAGTGG TCTTAG TCCGAGCAGTTGGGC GGAC TG АССAT GTTA GG AAC G CAGGGATTGCCGG ¿¿TT A AGGCGGGA AGCGGAGTG TCGC TG AA ATGTTC AACT AT G GTAAtCAGAA ACGSTGG AAG Tt ST CTG AG T CC G AG С ATT AGG GCSGACT GACCAT A T TAAG GT С GA С С TCATCG GC CGG TAAАТС GT AC G CAGAT G T GC GG AAT GG GT TG TGT T GGAAAT T T TC TAAG T С С AGAC CTCT TC AAG AC ATAC A CGTGCAGCC GAACCCAAAAT GC AG G GGAG T ï G AAAAAG T AG CCCC TC GG GA G T TGATGGG TGAACGA TGC GGTTT TT GAC GT G AT TTAGG GAG

gc gacag atc t ac ag actcgg с a at g t с a aac с atat at gt aga gggg ag tcgt ca g gac a gatc tgtaa tgg aastgttc t gg cg с t tg gt с gggt tcg atgccgg ag gtat gtct с gtcc t ctcgcc tcccttgatgtgcat t gac tcg gc ca с tc acggt aggaattttg gt t tccg gac

С AGÎT TC TG АТС CG GT GCA С AG С ACC ТС С GCG GGC ACT AG G CCCT CC AT AGCC TT TGT GT G

îcttatgcggagaccctttttatgtcgtatc гла тел та тлтлстстсттасстссоеаса

CSлес T ATGTCTCG АС Г Т ГС ТСА TG AG GG TTCTGG T TGCGCC TTTGCGCGCTCCGGGCATT С GT AGAG A T ÎG ТС AG GTGT GAGAC TG ААСС ААGTGTGÏGCCTT CGGGCATGAATGAGTT G G GGC3TACGGÎtot»gott9totoege*t*tet«tee9t«t*OT«ttvt0tet9tgte*g»C G T SG CC T gTGA С CGAC CC СACAAA G AG T G TftCTCT ^TG CGCCTTCG g G ÇA TG -

fcëeg t»U.M»ttflW^ttftffte«g»cSTGGCCrGTGAC£:GSC С CCA CAAAGAGT G ï " ÇTCTGTGCQCC7TÇGGGCATGAATGAGTTGGGGt"-'"' — -

ÇGTgS^ôféîçccaçccçàcs^ gtgc gcg At СТЛСТСТС ГССРСААв

¿¿cc T ttc ccgtct CGAGX'tG t ATI tctigI gt CCG gggtctflt ag gt TT T с TT gt cg gc t g t cgg act ttt t ct gt cgcag ag тattaat gactaggttgcc at g cg gggc тт тт gt ac cc g t ggc gcctgt tcggagcî

Рисунок 10. Фрагмент последовательности нуклеотчдов гтолноразмерного повтора рДНК В. germanica, содержащего один из вариантов NTS. Праймер, использованный для определения старта транскрипции выделен жирным шрифтом к одиночным подчеркиванием. Фрагменты последовательностей генов 1SS- к 2SS рРНК выделены белым шрифтом на темном фоне. Область старта транскрипции выделена курсивом н жирным шрифтом. Субповторы NTS обозначены темным фон«« л подчеркиванием. Последовательности, проявляющие значительное сходство с промоторами генов прокариот выделены строчными буквами и жирным шрифтом, Субповтсры ETS выделены темным фоном.

значимости данных субповторов может быть проведен известными методами генетической инженерии, что будет являться предметом нашей дальнейшей работы.

4. Внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера рДНК Bla ttella

GE/Ждаисл.

4.1 Выявление и описание ПДРФ рДНК

Нетранскрибируемый спейсер рДНК эукариот является важным структурно-функциональным элементом генома, ответственным за регуляцию активности промотора РНК-полимеразы I и, в конечном итоге, за количество синтезируемой рибооомной РНК, то есть за количество рибосом в клетках организма. Можно предположить, что различным экологическим условиям, в которых данный вид может находиться в силу особенностей своей биологии, соответствуют определенные наиболее адекватные уровни интенсивности обмена веществ, которые коррелируют с интенсивностью белкового синтеза и, следовательно, требуют оптимального количества рибооом, зависимого от транскрипционной активности рДНК. В сипу этого обстоятельства наличие в геноме нескольких типов NTS, избирательная активность которых в соматических клетках может корректировать количество формируемых рибосом, и способность клеткок полового пути формировать новые типы NTS представляется крайне адаптивным эволюционным приобретением эукариот.

В рамках данной работы выявлен полиморфизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) рДНК рыжего таракана, определен характер наследования различных структурных вариантов NTS, с помощью созданных ПДРФ рДНК маркеров проведен анализ генетической структуры лабораторных линий и природных популяций данного вида наоекомых.

Рибосомная ДНК эукариот является уникальным структурно-функциональным образованием генома, в котором собраны воедино генетические элементы, обладающие резко различающейся степенью эволюционной консервативности. Наиболее консервативными являются гены рРНК - в пределах вида в этих последовательностях выявляют лишь единичные нуклеотидные замены либо полное отсутствие вариабельных сайтов. Наиболее вариабельной областью рДНК эукариот является нетранскрибируемый спейсер - несколько структурных вариантов которого может содержаться в составе одного генома. Исходя из описанных особенностей структуры рДНК эукариот, становится ясным, что после рестрикции тотальной ДНК

эукариотического организма эндонуклеазой, один сайт узнавания которой локализован в пределах 28S гена, а второй в пределах вариабельной области NTS, и блот-гибридизации с зондом, гомологичным 3' концу 28S гена, у разных представителей данного вида или даже в пределах одного генома, будет выявлено несколько фрагментов, имеющих различную длину (смотрите рисунок 11). ПДРО рДНК, обусловленный вариабельностью структуры NTS. методом б лот-гибридизации может быть выявлен у любого эукариотического организма. На практике задача сводится к поиску соответствующих рестриктзз, имеющих вышеописанные особенности локализации сайтов узнавания ДНК. Отметим, что для успешного проведения данного анализа необходимо иметь зонд, гомологичный 3' концу 28S гена. Если известна последовательность нукпеотидов рДНК исследуемого организма, можно амплифицировать методом ПЦР соответствующую область 28S гена и клонированный фрагмент использовать в качестве зонда. Альтернативным подходом является использование *универсального" зонда sFF(H-H)1212, описанного во второй главе данной работы, который, как было нами показано, содержит высококоноервативные домены, гомологичные 3' концу 28S генов всех эукариот.

Для анализа внутривидового ПДРФ рДНК рыжего таракана методом блот гибридизации по Саузерну в качестве зонда использовали клонированный фрагмент рДНК Blattella germanica, полученный в результате ПЦР с праймерами DAMS_18 ! DAMS__28 (смотрите рисунок 11; зонд №1). Как видно на рисунке, этот зонд содержит большую часть 28S гена, имеющую главное значение для выявления данного типа полиморфизма.

Очевидно, что для выявления ПДРФ рДНК, обусловленного вариабельностью в пределах NTS, один сайт рестрикции должен находиться в 28S гене ближе к его 3' концу так, чтобы последовательность от сайта узнавания до конца 28S гена была достаточной для выявления методом блот гибридизации. Поскольку 3' конец 28S гена эволюционно консервативен, данный сайт рестрикции не будет полиморфным в пределах виде. Второй сайт рестрикции должен быть локализован в высоковариабельной области NTS. Поскольку последовательность

Зонд 2

Зонд 1

18S ITS1 5.8S ITS2

28S

NTS

18S

| 966 no |

1934 no J 966по T -5-6.5ТПО Hindill Hind lit Hind III Hind It!

Рисуиок И. Схема строения рДНК рыжего таракана. А - I8S, 5.8S, 28S - последовательное™ генов рибосомкых РНК; ITSI и ITS2 -внутренние транскрибируемые слейсеры; NTS - нетрикмернбируемый спейсер. Тонкими стрелками указаны сайты узнавания рестрнктазы Hint.ЛИ в эволюциоино консервативной области рДНК, толстыми стрелками - &ариабельный сайт(ы). Зонд 1 я Зонд 2 - обозначение областей гомологии фрагментов ДНК, использованных в качестве радиоактивно меченных проб для блот-гибрвдизашш. Б и В - два гипотетических варианта структуры рДНК.

t«

тпо

Рисунок 12. Результат блот-гибридиззции S5 рестрицировавноЭ i/wdIII тотальной ¿IHK 61 индивидуальных тараканов из лабораторных 50 линий; в качестве зондов нслольэовальсь клонированные фрагменты А - рДНК В. germanica, Б - 18£-подобный фрагмент 3 0 рДНК Т. pyrifortnis. ДНК использованная на дорожках 1 - 5 (Б) соответствует дорожкам

2 О

1, 2,3, 8 и 10 (А), соответственно,

1.0

1 2 3 4 S в 7 в 9 1СП1 1213 1 2 S Л 5

нуклеотидое 28S гена рДНК рыжего таракана была определена нами ранее, с помощью соответствующих компьютерных программ можно было олределелить сайты локализации всех известных эндонуклеаз, из которых несколько (BgliI, Oral, Psft, PviA, Hind 111) были выделены нами в качестве кандидатных, Понятно, что выполнение второго условия - локализация дополнительного сайта рестрикции (ближайшего к 3' концу 28S гена) в вариабельной области NTS - может быть определена только экспериментально. В результате проведенной работы из всех кандидатных рестриктаэ была отобрана одна - H/ndlll, выявляющая ярковыраженный внутривидовой полиморфизм рДНК рыжего таракана.

На рисунке 12а представлен результат блот-гибридиэации тотальной ДНК рыжего таракана, обработанной ферментом рестрикции H/ndlll, с зондом №1 (смотрите рисунок 11). На каждой дорожке представлен результат блот-гмбридизации с ДНК. выделенной из индивидуальной оооби, В работе использовали только самцов - представителей различных лабораторных линий. В результате эксперимента были выявлены три зоны гибридизации: две из них (в районе около 1 т.п.н. и 2 т.п.н ) являются мономорфиыми и одна зона (в районе 5.0 - 6.5 т.п.н.) содержит вариабельные фрагменты ДНК. Как видно на рисунке 12а {сравните

дорожки 1-13), в вариабельной зоне фрагменты ДНК. выявляемые используемым зондом, у исследованных особей имеют различную длину и представлены различным числом вариантов. Кроме того, в раде случаев интенсивность гибридизации различных НАк11Н-фрагментов, принадлежащих ДНК одной особи, значительно различались. Данный результат показывает, что особи в пределах популяции не являются идентичными, а содержат различные типы повторов рДНК.

Для характеристики внутривидового полиморфизма рДНК В. germanica анализировали только самцов (XX - самки; ХО - самцы), следовательно, все описанные у одной особи варианты повторов рДНК локализованы в пределах одной Х-хромосомы. Исходя из вышеизложенных экспериментальных данных, можно предположить два варианта структурной организации рДНК В. germanica, Согласно первому варианту повторы определенного типа рибосомной ДНК локализуются в геноме кластерами - "островной" тип организации (рис. 116). Согласно второму варианту, различные типы повторов расположены случайным образом (рис. 11 в). Выбор между этими вариантами может быть еделан на основе анализа рекомбинации между гомологичными Х-хромосомами, несущими различные повторы РДНК,

4.2 Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК

Для анализа наследования различных структурных вариантов рДНК было поставлено несколько индивидуальных скрещиваний. На рисунке 13 представлен результат блот-гибридизации тотальной ДНК индивидуальных особей рыжего таракана (родителей и потомков F1), обработанной ферментом рестрикции Hind III, с зондом №1 (смотрите рисунок 11), Известно, что кластер рибосомных генов у В. germanica локализован в Х-хромосоме; самки содержат в геноме две Х-хромооомы, самцы - одну [Ross, 1992]. Как видно на рисунке, обе хромосомы Рсшт содержат кластеры рДНК, у которых после рестрикции H/ndlll и блот-гибридизации с соответствующим зондом выявляются фрагменты одинаковой длины. X хромосома самца (Рс*мш) содержит кластер рДНК, отличный от такового самки; после рестрикции H/ftdtll и блот-гибридизации выявляется один фрагмент большего размера, чем у Ршмм. Очевидно, что все самцы первого поколения должны

содержать одну из хромосом Рим», а самки первого поколения одну из хромосом Рикш и одну от самца Роит., что и наблюдалось в эксперименте (рисунок 13).

тпо

I 6S

6,0

1 2 3 4 5 6 7 8. ij^ll 23 4 5 6789 10

с/

Рисунок 13. Анализ наследования различных структурных вариантов рДНК В. germanica у потомков Fi в индивидуальном скрещивании. Р - ДНК родителей (самки и самца, соответственво).

Анализ наследования описанных структурных вариантов в поколениях F2 показал, что самцы F2 содержат одну из родительских X хромосом, а самки F2 две хромосомы в разных сочетаниях. Отметим, что вое исследованные самцы F2 не содержали рекомбинактных X хромосом, то есть X хромосом, образованных в результате рекомбинации между хромосомами Роит и Реши* в районе кластера рибосомных генов. Аналогичный результат fein получен при анализе 100 самцов F9 - ре комбинатов также не было выявлено. Таким образом, X хромосомы, содержащие различные типы NTS, стабильно поддерживаются в ряду поколений.

4.3 Анализ генетической структуры природных популяций рыжего таракана

Рыжий таракан в. germanica является синантропным видом. На протяжении долгой истории человечества это насекомое обитает в жилых помещениях, а с развитием сельскохозяйственной индустрии в качестве среды обитания использует и животноводческие фермы. К сожалению, совместная жизнь с этим видом насекомых далеко не безопасна. Недавние исследования показали, что тараканы являются этиологическими агентами многих аллергических заболеваний челоеека, в частности,

детской бронхиальной астмы и старческого ринита [Rosenslreich et al. 1997]. Известно также, что тараканы способны переносить многие микроорганизмы, потенциально патогенные для человека. Однако в последнее время, в связи с активным использованием антибиотиков на животноводческих фермах, особую озабоченность вызывает способность тараканов переносить микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, которые используют как для ветеринарных целей, так и в медицинской практике.

В этой связи, с нашей точки зрения, является актуальной разработка молекулярно-генетических маркеров, позволяющих дифференцировать популяции тараканов и определять пути их миграции. Успешное развитие исследований в данном направлении позволит установить основные пути переноса тараканов из животноводческих ферм в населенные пункты и, соответственно, сфокусировать сан эпидемиологический надзор в правильном направлении.

Нами было предложено в качестве такого маркера использовать ПДРФ рДНК, основанный на вариабельности нукпеотидных последовательностей нетранскрибируемого спейсера.

В таблице 2 схематично представлены рестрикций иные спектры, полученные в результате б лот-гибридизации Windlli-рестриктов тотальной ДНК самцов В. germanica из трех американских популяций (свиноферм). Длины выявленных фрагментов находятся в интервале 5.0-6.5 т.п.н. Суммарно в исследованных популяциях выявлено 8 типов фрагментов. В популяциях "Britt* и "Riverfront" выявлено 7 и 6 типов фрагментов, соответственно, в популяции "Hairr" - 3, Фрагменты 3, 4, 5 являются общими для всех популяций. Популяции "Riverfront" и "Britt" кроме названных выше типов фрагментов характеризуются еще двумя общими типами: 1 и 7. Достоверность различий по частотам типов фрагментов между парами популяций оценивали no GJ-статистике. Достоверные (р<0,01) различия получены между парами популяций "Riverfront" и "Hairr' по двум локусам (1 и 7), "Hairr" и "Britt" - по трем локусам (1, 6 и 8), "Riverfront" и "Britt" - по четырем локусам (2,3,6,8). Таким образом, анализ частот различных типов фрагментов может быть использован для дифференцировки отдельных пар популяций.

Нами были даны оценки генетического полиморфизма рДНК в исследованных американских популяциях, рассчитанные на основе анализа типов фрагментов: среднее число фрагментов на особь (N), доля полиморфных локусов (Р), среднее

внутригрупповое сходство (APS - Average Pairwise Similarity), а также степень генного разнообразия, или гетерозиготности (Н). Определены уровни достоверности различий перечисленных параметров. Так, по среднему числу фрагментов на особь вое популяции достоверно отличаются друг от друга (р<0.01). При этом наиболее богатыми рестрикционными спектрами характеризуется популяция "Sritt" (N=3.00Q±0.166), значительно беднее спектры в популяции "Hairr" (N=1.476±0.131), промежуточное положение занимает популяция "Riverfront" (N=2,150+0,209). Популяции "Riverfront" и "Britt" характеризуются высоким уровнем полиморфизма выявленных локусов (Pr=0,875 и Ра=0,750), который как минимум в два раза выше, чем в популяции "Britt" (Р=0,375). Значение индекса внутригруппового среднего сходства (APS) указывает на меньшую однородность популяций "Riverfront" (APSr=0,431) по сравнению с двумя другими исследованными популяциями (APSh~0,645, APSe=0,534); отличие популяции 'Riverfront" от популяций "Hairr" и "Britt" является достоверным. Сравнение индексов генетического разнообразия (М) также указывает на высоко достоверные отличия (р«0,001) популяции "Riverfront* от двух других. Отметим, что во всех популяциях уровень гетерозиготности является высоким и уменьшается в ряду: "Riverfront", "Britt", "Hairr" (HR=Q,750, Ha=0,602, Нн=0,540).

Уровень межлолуляционной изменчивости по типам фрагментов оценивали с использованием коэффициента фиксации (F,t). Показано, что межпопупяционная изменчивость, рассчитанная по всем выборкам, составляет 25,81% {Fsir-h^O.2581 ). Эта доля межлолуляционной изменчивости свидетельствует о дифференциации популяций. Наиболее четко дифференцированы популяции "Hairr" и "Britt" (F,tn-в=0,314), наименее -"Riverfront" и "Hain' (F«r*=0,172).

Генетические расстояния между популяциями оценивали с использованием алгоритма Cavalli-Sforza [Cavalli-Sfofza et al„ 1967] на основе различий частот встречаемости различных структурных вариантов рДНК. На рисунке 14 изображены исследованные популяции в пространстве первых двух главных компонент. Как видно на рисунке, наиболее близко друг к другу расположены популяции "Riverfront" и "Hairr". На значительном расстоянии от них находится популяция "Britt*, причем вклад обеих двух главных компонент в дистанцирование данной популяции от двух других примерно одинаков.

Полученный результат многомерного анализа методом главных компонент, как и проведенный выше анализ изменчивости локусов, свидетельствует о существовании различий между исследованными популяциями.

Доминирование рестрикгных фрагментов рДНК определенного типа в различных популяциях было также показано при анализе тотальной ДНК, выделенной из 50 оотек, взятых от самок, обитающих в каждом из свинарников. Поскольку каждая оотека содержит около 30 зародышей (то есть -45 X - хромосом), это соответствует тотальной ДНК из более 2000 самцов. На рисунке 156 представлен результат блот гибридизации с такой "суммарной" ДНК. Отчетливо видно доминирование определенных фрагментов в различных популяциях. Данный тип экспериментов может быть рекомендован в качестве "экспресс анализа" подразделенности популяций рыжего таракана.

Представленный выше полокусный анализ применительно к кластеру рибосомных генов рыжего таракана является формальным, поскольку различные по структуре повторы рРНК генов расположены в районе одного ядрыцжового организатора Х-хромосомы и наследование этих фрагментов, как нами было показано выше, происходит сцеплено. Исходя из этого, нами был проведен также анализ изменчивости структуры рДНК отдельных Х-хромосом (гаплотипов). Была определена достоверность различий между популяциями по частотам хромосом каждого типа, оцененная с помощью Ог-теста. Достоверные различия между парами популяций "Riverfront"-"Hairr* и "Riverfront"-" В ritt" получены по двум типам хромосом (типы В, Е и типы А, Н, соответственно), а между популяциями "Hairr" и "Britt" - по четырем типам (А, В, С. Н).

5. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда Всаттооеа

В рамках данной работы предметом анализа являлась эволюционная изменчивость различных структурно-функциональных элементов рДНК представителей отряда Blattodea с цепями 1) изучения филогенетических

Таблица 2

Схематическое изображение выявленных в результате блот-гибридизацин структурных вариантов рДНК В. germanica.

ffiverfreot

О сов* Фмгн«иг " М R2 FOIfUiM fH ft7 Rt «fttfc KlIBtl.ftlMMi'RH.ftH «IT ' • i [ ? ■ 1 ' ' mi к» ■ I

1 » 4 • !*;: .',: ! i ; , ; .; ! ♦ г + * ] | +1 • ♦ 1 * , > L * 1 I ; * ■¡■т ■] * * ■ \ *" i*": '

Я в it;:), ui:________ Г "f "М 1 ♦!»! I i + 1 : 1 V ' > vi т 4 4 1 * , + | * ... ^

1ип а»»* CFCt.AAE^ee я e A etc A i a A A

Hair

„ ^ 0«6b iwtrttn" rt1:HJ Hl'tM Hi» HI pi A HIB НИ Hfl Hl» HU Hit Hit H1JM1I MI» Hlf Hit : ' I i ; и : i ; 1 : ■ , : ; ! j ; L

1 Г ........ - | , I

1 —.} ™ ' " 4 » I * r . : -."T--' : = ; ^ , * L + , t I + * ! ■ + ^ + i * j + I + [

( 7 ft i !

А В ВС А С С С A B'G.t'A С 1 С ' В , О : t

Britt

___ OrtCn ЗфШМКГ BliBiW W'B* BII17 B*'B» t1»LB«11П»« »Н B« evt B1fiB1l «1» )Й ШЮ№ MMij.ü t и , M ! ; I И :

% '"г а 4 «

i ! ' "; i':-: i : .; j i T f i : *' = !;♦ .i- + .t-| ¡Ф*!»! | + i j

7 " » Глшшны *: +|+;* : t t * ' * ! * i + ^ » ^ + ■91 J < H J H H К L » ' i ' »i M H WO* К L H N H E

взаимоотношений между представителями данного отрада (на примере генов 28Й рРНК) и 2) анализа закономерностей эволюционной изменчивости рДНК данной группы организмов (на примере ЕТ5, )ТЭ1 и 1Т52).

Мы амллифицировали, клонировали и сехвенировали протяженные (более 2500 л.н.) фрагменты рДНК, локализованные между "универсальными" праймерами ОАМ5_18 / ОАМ8_28, то есть участки рДНК, содержащие 1Т51, 1Т32, 5.85 и протяженный фрагмент (-1200 л.н.) гена 28в рРНК, у

Рисунок 14. Генетические расстояния между выборками в пространстве первых двух главных компонент. Данные получены совместно с Лаэебным О. Е. и Лазебной И. В.

R В Н

Рисунок IS. Результат блот-гибр иди задай рестрицнрованнон Hinfill тотальной ДИК 50 оотек, изолированных от самок из различных популяций: R - Rtverside, Н • Hair, В - Briet. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент DAMS_18/DAMS_I8 рДНКЯ germanica.

следующих представителей отряда Blattodea: Blattelle germanica (GenBank # AF321244), Blattella asahinai (GenBank # AF321253), Blattella lituricollis (GenBank # AF321245), Blattella vaga (GenBank # AF321246), Periptaneta amricana (GenBank # AF321248), Periptaneta brunnee (GenBank # AF321249), Periplaneta fuliginosa (GenBank # AF321250), Parcoblatta lata (GenBank # AF321247), Bieberns atropos (GenBank # AF321252), Bieberns giganteus (GenBank #AF321254), Diploptera punctata (GenBank # AF321251) и фрагменты рДНК, содержащие ETS, трех близкородственных видов тараканов рода Blattella: В. germanica, В. asahinai, В. töuricollis,

5.1 Построение филогенетического древа отряда В1айойеа на основе нуклеотидных последовательностей генов 288 рРНК

Известно, что тараканы являются одним из наиболее древних отрядов насекомых - различия во времени становления между различными родами могут составлять 75 - 100 миллионов лет. Филогенетические взаимоотношения между различными таксонами отряда Тараканы являются предметом интенсивных дебатов в мировой литературе, посвященной систематике несекомых, Несмотря на использование различных подходов, то есть попытки построить совершенное филогенетическое древо на основе сравнения морфологических, физиологических и молекулярных различий, в настоящее время нет полного согласия относительно филогении данной группы насекомых. Нами было сделано предположение, что для анализа филогении такой древней группы насекомых, как тараканы, наиболее адекватным будет использование медленно эволюционирующих районов ядерной рибосомной ДНК- генов 285 рРНК.

Для построения филогенетического древа отрада В1аПобеа были использованы фрагменты 283 рДНК, локализованные в пределах амплифицироеанных с использованием праймеров 0АМ5_18 / ОАМ5_28 участков рДНК 11 названных видов тараканов.

Попарное сравнение фрагментов 285 генов рРНК показало, что в пределах родов (например, рода ВШеНа) расхождение (дивергенция) варьирует от 0.1 до 8%; а между между родами и семействами достигает 11 - 19%, Максимальное расхождение наблюдалось между родами 0>р!ор1ега и ВШНеНа, Средние частоты оснований в анализируемом фрагменте рДНК у исследованных видов равны: А=16.10, С=34.07. 0=29.29 и Т=20.06%. Достоверных различий по частотам встречаемости нуклеотидов межцу таксонами не наблюдалось (х!=19.26, й^ЗО, р=0.93).

Для определения степени насыщенности исследованных фрагментов рДНК различных таксонов вариабельными нукпеотидзми было проанализировано соотношение между числом транзиций и трансверсий, с одной стороны, и попарными различиями между таксонами, вычисленными на основе модели НКУ [Наведаша е1 а!., 1985}, с другой. Показано, что число обоих типов замен постепенно

аккумулировалось по мере роста дивергенции (смотрите рисунок 16), что свидетельствует о том, что насыщение не было достигнуто.

Попарный анализ исследованных фрагментов рДНК методом "максимальной экономии" привел к построению наиболее вероятного филогенетического древа, изображенного на рисунке 17. Топология древа была подтверждена высокими бутстреп (bootstrap) значениями (около 89%), подтверждающими все внутренние узлы (структуру филогенетического древа). Допопнительный анализ методом "максимального сходства" привел к аналогичному филогенетическому древу, со сходными генетическими расстояниями между таксонами.

н х

:«0

TS-

а 25"

3 5 С

• .Транэнцнц 0 ; Трансверсян ! 0« 0°

•• 5;%

••egg

8 ¡1 «в«* Л" gt • *

•

1°

Рисунок 16. Общее количество транзиций и тралсверснй в 883 пн 283 рДНК, использованных для построения филогенетического древа отряда Тараканы методом "максимальной экономии", как фу1гкмия "НКУ - коррелировалиой" дивергенции для каждой пары сравниваемых видов.

СМ

<ыв

0.10

0.1 Б

020

ojs

Попарная дивергенция (HKY- корреляция)

Тот факт, что дзумя различными методами

("максимальной экономии" и 'максимального сходства") были построены сходные филогенетические деревья с высокой достоверностью расхождений между ветвями деревьев, а также полученные оценки степени насыщенности вариабельными муклеотидами убедительно демонстрируют высокую информативность исследованных фрагментов рДНК для филогенетических построений в пределах отряда Тараканы.

5.2 Анализ эволюционной изменчивости транскрибируемых спвйсеров у близкородственных видов родов Blattella и Periplaneta

Эволюционная изменчивость внутренних транскрибируемых

спвйсеров

Нами был проведен сравнительный анализ последовательностей ДНК ITS1 и ITS2 трех близкородственных видов тараканов рода Blattetle: В. germanica, В. lituricollis и В. vaga и трех близкородственных видов рода Periplaneta: Р, americana. Р. fuliginosa и Р. brunea; а также сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента ITS1 11 особей из трех различных популяций 6. germanica.

Рисунок 17. Филогенетическое дерево отряда Тараканы, постросное на основе двух методов: "максимальной экономии" и "максимального сходства" (оба использован них алгоритма выявили идентичные генетические расстояния между видами). Цифрами обозначены достоверности (в процентах) расхождения ветвей, выявленные бутстреп (bootstrap) анализом - первая цифра соответствует методу "максимальной экономии", вторая - "максимального сходства".

Для выявления внутри- и межпопуляционных различий структуры ITS1 Б. germanica сравнивали последовательности нукпеотидов амплифицированных

фрагментов рДНК протяженностью около 630 п.н. В работе использовали тараканов, выловленных из трех различных популяций: Jacksonville (США) - 5 особей, Prestage (США) - 5 особей и Москва (Россия) - 1 особь. Сравнение последовательности нуклеотидов проводили посредством компьютерной программы ClustalW. Вьшо показано, что в пределах анализируемых фрагментов рДНК наблюдаются лишь единичные замены нуклеотидов. Известно, что тараканы являются одним из наиболее древних таксонов насекомых. Согласно теории нейтральной эволюции в функционально инертных последовательностях ДНК должно происходить быстрое накопление нейтральных мутаций, которые, в свою очередь, в пределах мультигенного семейства рибосомных генов фиксируются согласно описанным механизмам молекулярного драйва [Dover, 1982]. Обнаружение высокой степени внутривидового консерватизма ITS1 свидетельствует, с нашей точки зрения, о функциональной значимости этого района в регуляции активности кластера рибосомных генов тараканов.

Для попарных сравнений нукпеотидных последовательностей ITS1 и ITS2 трех видов тараканов каждого из выбранных для изучения родов (Btatiella и Реф/алеГа) использовали компьютерную программу FASTA. На рисунке 18 приведен фрагмент нукпеотидных выравниваний 1TS1 двух представителей рода Biattelia (В. germanice и S. liturícollis). Видно, что сравниваемые последовательности нуклеотидов сильно различаются: выявлены инсерции / делеции, в том числе протяженные (выделено темным шрифтом) и большое количество точечных замен. Сходство между ITS1 В. germanica и В, fíturicollis и В. germanica и В. vaga составляет 67,2% и 30,0%, соответственно, а между ITS2 - 81,1% и 55,8%, Таким образом, показано, что эволюция исследованных видов тараканов сопровождалась сильными качественными изменениями структуры ITS1 и ITS2.

Общий характер эволюционной изменчивости ITS1 тараканов рода Períplaneta сходен с таковым, описанным выше для тараканов рода б/affe/fa. Сходство между последовательностями ITS 1 Р. americana и Р. fuliginosa и Р. americana и Р. Ьгипва составляет 59.5 и 55.4%, соответственно. Размер последовательности ITS1 исследованных видов также значительно различается и составляет 388, 343 и 354 п.н. для видов Р. americana, Р. fuliginosa и Р. Ьгипва, соответственно. Множественное выравнивание ITS1 данных виде® демонстрирует

зоо 5io зао ззо 340 350

9® г CCTTCTGGCGCGaCGSITGTCCTGCiTGCTTCSCGrGCISCGTCTGbCCTAACTCGCCCT

lit CCTT5TGGCGC3KGGTTCTCATi3CATGCTTCGCTTGCTÜCGTCTGäCCTACCTCGCCCT 230 290 300 310 320 330

360

ger ТТТГТТТ—----ТА С--------------------------------------------

; 1 i : i : i :

340 350 360 370 360 390

у r----------------■—■——-------------------------------------

üt слыммяггосаеаимьдонФсмсмесгасксотжтет«^

400 410 420 430 440 450

460 470 4Э0 490 500 510

370 3S0 390 400 ¿10 420

ger —TGTCGMTtX:TirG(^ACtMUiAATGMCÄtrtTTAAÄ№AGcaGCTITAG£CrrC

1 i t TATGTCGAAGGCTTTGGGCACTGCAAAATGCGCGCiTTTAAACSGAiiCCAGCTTTAGGTTTC 520 530 540 550 560 570

Рнсунок lg. Фрагмент попарного сравнения нуклеотидиых последовательностей 1TSI А germanica (ger) и В. litericollis (lit). Протяженная ннсершя (деления) выделена жирным шрифтом.

большое количество нуклеотидных замен и инсерций / делеций, возникших в процессе эволюции данных видов. Сранительный анализ ITS2 тараканов рода Periplaneta демонстрирует больший эволюционный консерватизм данных последовательностей по сравнению с ITS1. Сходство между последовательностями ITS2 Р. атепсапа и Р. fullginosa и Р. атепсапа и Р. Ьшпва составляет 71,1 и 64,0%, соответственно.

Таким образом, сравнение ITS1 и ITS2 трех близкородственных видов тараканов внутри каждого из исследованных родов выявляет сальтационный характер изменчивости анализируемых последовательностей ДНК в процессе эволюции описываемых в wob. При сравнении ITS тараканов одного вида выявляется генетический мономорфизм данного признака.

Эволюционная изменчивость внешних транскрибируемых спейсеров

6 рамках данной работы был проведен сравнительный анализ последовательностей ДНК ETS трех близкородственных видов тараканов рода

Blatteila: В. germanica, В. asahinai (виды близнецы) и В. lituricoilis, а также сравнительный анализ длины ETS 50 особей из 10 различных популяций В. germanica.

Структура ETS трех близкородственных видов - S. germanica, В. asahinai и S. lituricotlis - представлена на рисунке 19. Для амплификации ETS использовали праймеры catcatcftggttagactgtc / gtgagactgaaccaagtgtg, один из которых локализован в пределах 5' области 18S гена, а второй за потенциальным промотором РНК полимеразы I.

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидое ETS S. germanica и вида близнеца В. asahinai выявляет депецию двух субповторов (123 п,н.) у последнего (рисунок 19а, б, в), В пределах ETS 8. lituricoilis выявлен лишь один из субповторов, описанных у двух других эволюционно родственных видов {рисунок 19г).

В рамках данной работы мы не проводили секвенирования полноразмерных повторов рДНК В. asahinai и S. lituricoilis, поэтому старт транскрипции рДНК у этих видов остается неопределенным. Однако сравнение величины фрагмента транскрипта пре-рРНК от начала до последовательности, обозначенной на рисунке 19 одиночным подчеркиванием (праймер, использованный для определения старта транскрипции) показывает, что изменение длины первичного транскрипта пропорционально изменениям длины ETS этих видов (рисунок 9).

Таким образом, показано, что в процессе эволюции тараканов рода Btattella происходят салътационные изменения в структуре функционально значимого района генома - внешнего транскрибируемого спейсера рДНК,

Для выявления внутри- и межпопуляционных различий структуры ETS В, germanica сравнивали размер соответствующих амллифицированных фрагментов рДНК протяженностью 767 п.к. В работе анализировали по 5 тараканов, выловленных из десяти различных популяций: США - 4 популяции, Фракция - 2 популяции и Россия - 4 популяции. На рисунке 20 приведен результат электрофоретического разделения соответствующих фрагментов, амллифицированных из ДНК тараканов 10 описанных популяций. Как видно на рисунке, вариации длины анализируемых фрагментов не наблюдается, другими словами, ETS В. germanica является видоспецифичным высококонсервативным участком генома.

С нашей точки зрения, характер изменчивости транскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК исследованных видов тараканов не может быть объяснен с позиций теории нейтральной эволюции [Кимура, 1985). Более адекватной представляется интерпретация полученных результатов с позиции теории генетического мономорфизма [Алтухов, 1969, 1989, 2003; Алтухов и Рысков, 1972], согласно которой, как известно, видообразование трактуется не как постепенный вероятностный процесс, протекающий на популяционном уровне, а как следствие качественных реорганизаций генома.

Как уже было отмечено, интенсивность синтеза рРНК коррелирует с общим уровнем метаболизма, который, в свою очередь, является важной адаптивной составляющей, определяющей приспособительные способности особи к данным условиям окружающей среды. Можно предположить, что эволюция тараканов сопровождалась освоением новых экологических ниш, для которых более адаптивными являлись разные уровни интенсивности метаболизма и, следовательно, различная интенсивность синтеза рРНК, которая, в свою очередь, определяется, в частности, структурой транскрибируемых спейсеров.

В настоящее время остается открытым вопрос о конкретных механизмах, лежащих в основе качественной смены структуры рибосомной ДНК в процессе эволюции видов. В тоже время показано, что меж- и / или внутрихромосомная генная конверсия лежат в основе изогенизации членов мультигенного семейства и их

> Б. 9вшав1с*

САСабСАОТССТСАСеАСАеАТСТСТАДТСОАМТСТТСТСССССТТбСТСССетТСЙАТСССССАСБТАТСТСТСОТСС ТС ТССССТСССТТСАТСТССАТТСАС ТСЙССС АСТСАСбСТМО ААТТТТСаТТТССМ АССАСТТТСТ ЕАТССССТССА

сасс АССТСССС5СССАСГА65СССТССАТ дгссттютстстс ттатсс бсдедссстттттатстсс гд тстаа тса г АГАгдсгсгсггассгссеессесслсстАтстстсаАСТттстсАтаАССсттстссттссбсстттоссссстссасе САтте£ТАСАСАТтетсдостетоАеАстсААссААс№т6¥оот

cttgtctcgэcatвt<;tgtocgtвt*9gsttgt^^gtgtga9»CGTGGCCTGIOACCSЬCCCCACAAAGAвTCTACTC

да^гдодоьодадгагажсстстедс^^

вААААС ААТСССАСАсаТЬСйСТЪсгадсЪ-М^Ьсддсдга Ъс^^св

тетаАТСбхсоссьдуамаатсаАстстатесБссатст Астстстссбсд АГ^АСС ТТТССССТСТССАСАТСТАТТТ сттЕтстссесостстАТАССттгтсттстссосгстсссАСтттттстстсесАбАСТдттААтсАСТАесттссСАТС есСЕСсттттстАсссстсосссстсттсссАССАСТзгеии^ААСААсасдс^

> 8. isablBxi

GTGAG ACTG AACCAAGTGTGrcrreGGGeATGÄATGAGTTGgGSC aatgcgt ggaaggttc GTCCGAqATAf^g tcgatc CCGCTTGAGGCCGCAGAGCCGATGGACGGGGGTAGATCGGGaAATGMTCCGACACGrJLCGGTte tajottgtctcggc» tatctgtcc^tata^»ttgtgtgtgtgtgag«ceTI^CTGTeACCGACCCCaCAAA0AOTGTACTCTGTGCGCCITO5 GGCTTG AATGAGTTGGGGCA atgcgtggaaggttcgtccgagatatggtcgatcccccttgaggctgcagagccga^^ cgggggtag atcgggaaaaga^tccg acftcct*eÖättct«<K;ttatctga<ieat>tetatet:gta tum t tg tgt^tg tgt-gagaCGTGGCCTGTGACCQACCCCACAAAGAgTOTACTCTGTGCGCGATCTAGTCTCTCCGCftAGGACCTTTCC cgt CTCGAGATGTATTrCTIGIGTCCGGGGTCrATAGSTTTTCTTGTCGGCTGTCGGACTTTTTCTGTCGCAGAGTATTAArG

ATCCTOCCA<HAGTC*TAT<XTTGTCrCAAA&TTAAGCCATGCGT<H^

Деления (В. germanica/ В. astäiiinai) -123 п.н,

WT&T«CI,i<i^C®£№|^gT^<5G0GMTACGGTtctBgcttg tctc^gcata tctgtccgtataggattgtgtgt gtg4»g»CST<^CTGTa*CCaACCCcKcAAAiiAeT<;TACTC

> В. lifcurleollia

етсАСАСтСААССААотдт^ф.^^с^^урКчттзвЕассАттссетбйААбетттбтссбстАТАТбЕтссйт cccgctlgaggctgcagagccgctggacgggrcgalcgggäatätaatccgacacgcacggttctügcttgtcgcatatc tgtccgtcgctgtcgggaggatigtgtctgtgacatggcctgtgacggaccccagtgtactctigigcgtctagtctctc cgcaaggaccticcccgaccggatgtatttcttgtttggggtcta5gttttcttgtcggctgtcggacttgtactcgcag agtaiga atg actaggttgcc atgcggggctttgcacccgtggcgcc tgttcggagcacgtctaacacaacgcacgactr CCCTGGTTGATCC TGCCAG TAöiCA ТА TGCTTGTCTCAAA GA TTAAGCCA TGCA TG TCTCAG TCCAAGCTA ТЛСТАААй Г

Рисунок 19. Область ETS трех близкородственных видов тараканов А - В. germanica, Б - В. asahinai, Г ■ В. UtitricoUis. Жирным курсивом выделено начало 18S гена; курсивом и одиночным подчеркиванием - область локализации промотора; одиночным подчеркиванием последовательность нуклеотидов, соответствующая праймеру, используемому для определения старта транскрипции; темным фоном, жирным шрифтом и двойным подчеркиванием выделено три типа субповторов; строчными буквами и жирным шрифтом выделена последовательность, имеющая высокую гомологию с промоторами генов прокариот. В - последовательность нуклеотидов, делегированная из генома В, asahinai (при сравнении с В. germanica).

Рисунок 20. Результат амплификации фрагмента

рибосоиной ДНК В. germanieo, содержащего внешний

транскрибируемый спенсер. В качестве матрицы использовали ДНК тараканов 10 различных популяций.

согласованной, концертной эволюции [Dover, 1982; Slatkin, 1986]. Можно предположить, что процесс иэогенизации происходит неравномерно по воей длинне мультигенного семейства и фланга кластера вовлечены в этот процесс в меньшей степени, В этом случае именно фланкирующие члены кластера рибосомных генов представляют собой материал для дальнейшей эволюции. В этих районах без существенного влияния на фенотип особи может происходить формирование новых структурных вариантов, которые могут оказаться селективно выгодными в новых

1.02

О.Я

123456 78 9 10

условиях окружающей среды. Избирательная матификация генов рРНК, описанная в экспериментах на D. rnelanogaster [Hawley et al., 1985], и направленная ("полярная") генная конверсия [Dover, 19821 - Два механизма, благодаря которым новый структурный вариант может стать основным членом мультигенного семейства.

Подчеркнем, что в описанной гипотетической схеме эволюции тараканов рода Blattella, особое внимание уделяется генетическим событиям, происходящим иа уровне особи. Именно определенный структурный вариант рибосом ной ДНК, матифицированный в клетках полового пути конкретной особи, является основой для формирования кластера рибосомных генов другого вида. Этот подход, с нашей точки зрения, хорошо согласуется с постулатами теории генетического мономорфизма, согласно которой, в частности, "любой вид по генетически мономорфной части генома предстает перед нами как отдельная особь* [Алтухов, 2003].

6. Денсовирус рыжего таракана Blattella gerkawga: обнаружение,

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ И ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА

Как уже было отмечено, промотор, обусловливающий гиперэкспрессию генов рибосомных РНК, может быть использован как уникальный инструмент для решения многих экспериментальных задач методами генетической инженерии- В частности, для исследования функциональной значимости конкретных генов методом "нокаута", посредством экспрессии двунитивой РНК (то есть транскрипции соответствующей палиндромной последовательности ДНК), комплементарной изучаемому гену, под контролем промотора РНК полимеразы 1. Вторым направлением может являться разработка биологических методов борьбы с вредными для человека животными, посредством использования генетически модифицированных вирусов. В этом случае необычайно важно, чтобы не только вирус являлся видоспецифичным, но и экспрессия токсина, или двунитевой РНК. комплементарной функционально важному гену хозяина, контролировалась видоспецифичным промотором (каковым является промотор РНК полимеразы I).

В данной главе дается описание открытия и общая характеристика деноовируса рыжего таракана Blattella genrtanica (SgDNV). Денсовирусы были описаны у многих насекомых и было показано, что они являются эффективным инструментом для переноса генетической информации в клетки хозяина [Carlson et

а1„ 2000]. Можно надеяться, что конструирование векторных конструкций на основе ВдООТ с использованием промотора генов рибосомных РНК позволит на новом уровне изучать молекулярно-генетическую организацию данного вида насекомых и разработать новые экологически чистые методы регуляции численности этого синантропного паразита.

Обнаружение вируса, общая характеристика и клонирование вирусной ДНК

При исследовании живых объектов молекулярно-биологическими методами часто является необходимым экстрагировать тотальную ДНК из объекта исследований. Мы анализировали тотальную ДНК, экстрагированную из индивидуальных тараканов В1аПвНа дегтатса, выловленных в различных свинарниках, расположенных на территории США. Было показано, что после электрофореза 8 0,7% агароэном геле часть образцов тотальной ДНК, экстрагированной из тараканов, собранных в одном из свинарников (Р6) и поддерживаемых в лабораторных условиях в течение 5 лет, содержала дополнительную фракцию ДНК размером примерно 5 т.п.н. {Рис. 216). Обнаруженная дополнительная фракция была экстрагирована из геля, очищена (Рис. 21в) и использована для электронно-микроскопического анализа, который показал, что исследуемая ДНК представлена линейной формой длиной около 1,2 мкм (Рис. 22).

Рисунок 21. Выделение ДНК вируса рыжего таракана.

А Б В

Т.П.Н.

Результат электрофореза в 0.7% агароэном геле тотальной ДНК, экстрагированной из А - неннфицированного, Б - инфицированного вирусом таракана В. germanica. В - очищенная ДНК вируса, вырезанная из геля. Стрелка указывает на фракцию вирусной ДНК.

Рисунок 22. Электронная микроскопия вирусной ДНК,

линейна» ДНК вируса

маркерная кольцевая ДНК плазмиды pUC19. "^ '.*"".

Посредством обработки рядом ферментов рестрикции (Bg/ll, EcoRI и Paíl) было показано, что данная фракция является двуце л очечной ДНК, и была построена частичная рестриктная карта. В ходе дальнейшего исследования тараканов Р6 было показано, что все тараканы, тотальная ДНК которых содержала дополнительную фракцию, проявляли явные признаки болезни: вялость, неекоординированность движений, полный или частичный паралич задних конечностей. Сходные признаки заболевания были описаны для других насекомых, инфицированных денсовирусами, - тараканов Peñplaneta fuliginosa и сверчков Acheta domesííca [Meynadier et al„ 1977; Hu. 1994).

Электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов тканей больных тараканов показало, что клетки пищеварительной системы, жирового тела и эпидермиса инфицированы вирусом, который вызывает зачительные ультраструктурные изменения. Основные цитопатологические эффекты сходны е клетках различных тканей и заключаются в необычной структуризации хроматина, при этом большая часть нукпеоплазмы занята вирусными частицами. Показано, что вирусные частицы имеют диаметр примерно 20 нм и могут локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме.

Для клонирования вирусной ДНК в плазмидном векторе pUC119 был использован метод, основанный на добавлении гомополимерных фрагментов ДНК (примерно по 20 нуклеотидов на каждый фланг) с последующим отжигом векторной и клонируемой ДНК. Было проанализировано несколько сотен рекомбинантных плазмид, и только одна из них (pVir-8) содержала инсерцию, соответствующую полноразмерной копии исследуемого вируса (BgDNV). Данная плазмида была использована для секвенирования вирусной ДНК.

Последовательность нуклеотидов и организация генома вируса

Полная последовательность генома BgDNV представлена 5335 нуклеотидами (фрагмент последовательности изображен на рисунке 23а). Последовательность нуклеотидов BgDNV содержит концевые инвертированные повторы (КИП) протяженностью 216 и 217 нуклеотидов на правом и левом концах, соответственно. Показано, что КИП BgDNV содержат несовершенные палиндромные последовательности длиной 192 нуклеотида, которые могут формировать вторичные структуры.

В пределах генома BgDNV было обнаружено 5 ОРС. Две из них (1 и 2) локализуются на одной цели, три другие (3,4 и 5) - на комплементарной (Рис. 236).

Описанные ОРС потенциально могут кодировать следующие белки. ОРС1 локализуется между 922-2808 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 628 аминокислот (69,7 (Да). ОРС2 локализуется между 243-932 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 229 аминокислот (24,8 кДа). ОРСЗ локализуется между 44042811 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 530 аминокислот (60.2 кДа). ОРС4 локализуется между 4397-3608 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 262 аминокислот (30.3 кДа). ОРС5 локализуется между 50554404 нуклеотидами и кодирует белок, состоящий из 216 аминокислот (25.9 кДа).

Для сравнения белков SgDNV с белками других описанных денсовирусов использовали программу BLAST, специально адаптированную для сравнения аминокислотных последовательностей. Показано, что все описанные белки вируса BgDNV обладают очень низким сходством с соответствующими белками других денсовирусов. В то же время, мы выявили относительно короткие аминокислотные мотивы, которые обладают высоким уровнем эволюционного консерватизма и проявляют значительную степень сходства в пределах денсовирусов, паразитирующих на насекомых различных таксонов: SgDNV, PfDNV, JcDNV, GmDNV, DsDNV.

Предсказание промоторных последовательностей было основано на алгоритме П. Бушера (P. Bûcher) (Bûcher, 1989J. В результате проведенного компьютерного анализа были выявлены два потенциальных промотора: Р1 (локализован между 200250 нуклеотидами) и Р2 (локализован между 5136-5086 нуклеотидами), Р1 может быть ответствен за транскрипцию ОРС1 и ОРС2, Р2 - за транскрипцию ОРСЗ, ОРС4 и ОРС5.

Были обнаружены сигналы полиаденилирования на цепи ДНК, содержащей ОРС1 и ОРС2 в позициях 937-942 и 2818-2823. Дополнительный сигнал полиаденилирования был обнаружен на комплементарной цепи, содержащей ОРСЗ,ОРС4 и ОРС5, в позиции 2810-2815.

С нашей точки зрения, клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии (в частности, функциональной значимости регуляторных

элементов рДНК) и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.

:ео

СЙТС СТТ АТТТАС АТТТААТСАААТС ААСССО-ПСАТ йСТГВААСТС ААССТСОАСС АСТСССС ССТС С АССГ,С,СА5СТ5

Р1 240

ССССДасССГ;ТеСАА5СТСТС6ССТТС6СЙСМОСАССЛЙ5ЙТСАЛССТТААААЛСдССе(:5ЛЛЛСАС5ТСа*СТССТТА Стар» ОРС1 Ь

-► 320

СТИвГСТАССТСССОСТТАСАЯСАСТгССТТТСГТАССЛЙ'ГСААТАСТССААСАаТССААТАтегТССААТАеАСССА

5040

тстссААтетТАСТоетьАААсстстотстттттссААТТССАГстАТААТАстттААСАСтссстетттАСАСАААтст Старт ОРСЗ

п иго

Т Т ТААА£АТ£ ССАГТАС С Т А С СIА ССТС Т ОС Т С Т С С ТС С ААС ТТ С ААС Т ГАСААСТААА ТС СССТССААС А Т(>С ТССС ТС

5200

ОРС1

ОРСЗ

ОРС1

оРсг

}

Белки капсидьг

ОРСЗЧ

ОРС4 > Регуляторныс белки ОРС5 у

Рисунок 23 Основные струкурные элементы В^ОМУ, А - Фрагмент последовательности нуклеотидов вирусном гекома. Комплементарные последовательности концевых инвертированных повторов (палиндромов) а (выделено двойным подчеркиванием) и Ь (выделено одиночным подчеркиванием) обозначены как а' и Ь' соответственно. Кодоны инициации трансляции открытых рамок считывания выделены жирным шрифтом к обозначены как Старт ОРС% где N - номер соответствующей открытой рамки счнтыавния. Предполагаемые районы локализации промоторов (Р1 и Р2) обозначены темным фоном; иукпеотид, соответствующий началу транскрипции обозначен увеличенным размером. Б - Схема расположения открытых рамок считывания.

выводы

1) Выявлены ir> sllico высококонсервативные домены рибосом ной ДНК (рДНК) эукариот. Впервые подобраны универсальные праймеры, позволяющие методом ПЦР амплифицироеать полноразмерные копии повторов рДНК различных эукариот. Клонированы выоококонсервативные районы рДНК простейших и созданы универсальные зонды, позволяющие методом блот-гибридизации изучать ПДРФ рДНК различных эукариот. Применимость полученных универсальных праймеров и зондов показана на примере анапиза структуры рДНК эволюционно отдаленных таксонов: простейших, животных и растений.

2) Клонирован и секвенирован полноразмерный повтор (9015 п.н.) рДНК рыжего таракана ВШвНа дегтаЫса. Впервые для этого вида насекомых описана структура изучаемого района генома (нетранскрибируемый спей сер, внешний и внутренние транскрибируемые слейсеры, гены 18S, 5,8S и 28S рибосомных РНК) и охарактеризованы функционально значимые регуляторные элементы.

3) Впервые обнаружен и охарактеризован внутривидовой полиморфизм нетранскрибируемого спейсера рДНК Btattatla gemianica. С помощью созданных ГЩРФ маркеров проведен анализ генетической структуры лабораторных линий и природных популяций данного вида насекомых. Показано, что маркеры ПДРФ рДНК позволяют дифференцировать популяции тараканов и определять генетические дистанции между ними.

4) Проведен анализ эволюционной изменчивости 5.8S рДНК, двух транскрибируемых спейсеров и протяженного фрагмента 28S рДНК у 11 видов отряда Тараканы, Показано, что генетическая изменчивость фрагмента (-1200 п.н.) 285 рДНК, в отличие от других исследованных участков генома, отражает филогенетические дистанции между видами отряда Тараканы.

Проведен сравнительный анализ структуры двух внутренних транскрибируемых и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК у близкородственных видов на примере тараканов двух родов - ВШеИз и Рвг/р/але?а. Выявлен внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.

Открыт, клонирован и описан новый вирус рыжего таракана ВШеИэ деттаЫса (ВдОЫУ), Показано, что исследованный вирус принадлежит семейству Раг\гоу[гйае, род Оепьомгив. Проведен электронно-микроскопический анализ ДНК вируса и ультратонких срезов тканей рыжего таракана, инфицированных еируоом. Проведены определение полной последовательности нукпеотидов (5335 п.н.) и компьютерный анализ ДНК исследованного вируса. Выявлены и описаны структурно-функциональные элементы исследованного вируса: пять открытых рамок считывания, промоторы и концевые инвертированные повторы.

Клонированный денсовирус представляет собой многообещающий инструмент для исследования рыжего таракана методами генетической инженерии и разработки новаторских экологически чистых способов регуляции численности данного вида насекомых.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Муха Д. В. Исследование динамики роста массовой культуры Teirahymena pynformis на различных питательных средах //Цитология, 1991, Т. 33. С. 106-109. 2} Муха Д. В., Сидоренко А. П., Хомякова Е. В., Петрова Н. В.. Марченко Г. Н. Оптимизация методов вьщеления высокомолекулярной ДНК Tetrahymena pyiiformis It Молекулярная биология. 1994, Т. 28, С, 172-174.

3) Муха Д, В., Сидоренко А, П. Выявление и анализ доменов последовательности 26S рибосом ной ДНК Tetrahymena pynformis, различающихся по степени эволюционного консерватизма // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 529-537.

4) Муха Д. В., Сидоренко А, П., Марченко Г. Н. Клонирование протяженной палиндромной последовательности рибосомной ДНК Tetrahymena pynformis II Молекулярная биология. 1995, Т. 29, С. 824-829.

5) Муха Д. В., Сидоренко А. П., Лаэебная И. В., Захаров И. А. Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов в пределах класса Insecta IS Генетика. 1995. Т. 31. С. 63-67.

6) Муха Д. В., Андреева Л. Е., Ильичев А. В. Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна {Misqunus fassilis) II Генетика. 1996. T. 32. С. 1387-1391.

7) Муха Д. В., Сидоренко А. П. Выявление высококонсерватиэных доменов в последовательности 17S рибосомальной ДНК Tetrahymena pyriformis I) Генетика. 1996. T. 32. С. 1494-1497.

8) Сидоренко А. П., Муха Д. В., Королев А. Я., Созинов А. А, II Анализ внутривидовой вариабельности кластера рибосомных генов гороха посевного (P/sum sativum) It Генетика. 1997. T. 33. С. 676-680.

9) Mukha D. V., Sidorenko A. P., Siblryak M. I. A simple method for isolation of amplified copies of ribosoma! DNA of Tetrahymena pynformis by pulse-field gel electrophoresis // Цитология и генетика. 1997, T. 31. С, 46-48.

10) Муха Д. В., Лазебная И. В., Сидоренко А. П. Hind III полиморфизм рибосомальной ДНК рыжего таракана {Blatteila germanica) il Цитология и генетика. 1997. Т. 31. С, 8890.

11) Муха Д. В., Вигманн Б. М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомных генов в процессе эволюции тараканов рода Blattella И Доклады Российской Академии наук, 1999, Т, 364. С. 134-139.

12) Муха Д. В., Лазебный О. Е., Лазебная И. В, Анализ различий структуры кластера рибосомных генов двух видов близнецов: : Drosophila melanogaster and Drosophila simulansl! Генетика. 1999. T. 35. С. 1394-1397.

13) Сидоренко A. П., Муха Д. В. Выявление внутривидового внутреннего полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомной ДНК кукурузы II Молекулярная биология, 2000. Т. 34, С. 308-310.

14) Муха Д. В.. Лазебная И, В., Сидоренко А, П. Внутривидовая структурная вариабельность рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanteа II Генетика. 2000. Т.36. С. 11-15.

15) Mukha D. V., Sidorenko А, P., Lazebnaya I. V., Wiegmann В. M., and Schal С. Analysis of Intraspecies polymorphism In the ribosomal DNA cluster of the cockroach Blattella germanica II Insect Molecular Btology, 2000, V. 9. P. 217-222.

16) Муха Д. В., Вигманн Б. и Шал К. Сапьтационные изменения структуры внешнего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК в процессе эволюции тараканов рода Blattella II Доклады Российской Академии Наук. 2002. Т. 387. С. 1-5.

17) Mukha D. V., Wiegmann В. M,, Schal С. Evolution and phytogenetlc information content of the ribosomal DNA repeat unit in the Blattoidea ftnsecta) Il Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2002, V. 32. P. 951-960.

18) Лазебная И. В., Муха Д. В. Генетическая изменчивость ядерной рибосомной ДНК насекомых отряда тараканы (Blattaria): филогенетический анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов II Генетика. 2003. Т. 39. С. 474-477.

19) Муха Д. В. и Шал К. Денсовирус рыжего таракана: обнаружение, последовательность нуклеотидов и организация генома II Молекулярная биология. 2003. Т. 37, С. 607-618.

20) Изобретение: "Способ исследования структурно-функциональной организации ДНК рибооомного кластера эукариот." Патент № 2113481 Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 июня 1998 года

Авторы: Захаров И. А„ Муха Д. В., Сидоренко А. П., Соэинов А. А.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 21.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 120 экз. Заказ 033. Тел, 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В, Ломоносова, 2-Й учебный корпус, 627 к.

í¡4r

Информация о работе

Муха, Дмитрий Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы