Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана

Лазебная, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана"

а*

PK"

• i-jJ На правах рукописи

УДК 575.113:595.773.4

ЛАЗЕБНАЯ Ирина Викторовна'

АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ СТРУКТУРЫ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ РЫЖЕГО ТАРАКАНА (Blattella germanica L.)

03.00.15 - генетика

I /

/ !

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000 год

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Д.В. Муха

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Г.Е. Сулимова

доктор биологических наук А.И. Ким

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится _ 2000 года в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 117809, Москва, ул. Губкина, д 3; факс (095) 135-12-89

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан_2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

£ 640М) о

Г^.ЗЗ, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рРНК в биосинтезе белка, связью структуры рДНК со скоростью развития (Cluster et al., 1987), а также особенностями строения рДНК, позволяющими использовать ее при решении вопросов популяционной генетики, селекции, систематики, эволюции и экологии.

В настоящее время накоплена обширная информация о структуре ядерной рДНК насекомых (Beckingham, 1975; Jakubczak et al., 1990; Алешин и др., 1995), которая :видетельствует о существовании общих черт в макроструктуре рДНК различных видов и индивидуальных особенностей их микроструктуры. Однако, большинство исследователей в ;воих работах ограничиваются изучением небольших участков кластера рДНК, размером от нескольких сот до полутора тысяч пар нуклеотидов (Harmsen et al., 1995; Cormean et al., 1992; Kambhampati, 1995, 1996), что осложняет получение целостной картины структурной организации рДНК конкретного вида, а тем более ее внутри- и межвидовой изменчивости. При этом, вне шля зрения часто остаются не только виды, но семейства и даже отряды тасекомых, среди которых отряд Blattoptera является одним из древнейших (около 350 млн. ier).

Рыжий таракан - Blattella germanica L. (отряд Blattoptera, семейство Blattellidae) -;амый распространенный в России вид таракана. Он является генетически наиболее сученным по сравнению с другими представителями отряда Blattoptera, однако о его рДНК ивестно крайне мало, а именно, что местом локализации ядрышкового организатора шляется Х-хромосома (Cave, 1976). Последнее позволяет исследовать структуру рДНК «щивидуальных Х-хромосом при анализе отдельных самцов, поскольку, в отличие от самок, ;амцы В. germanica несут только одну Х-хромосому. Эти генетические особенности данного >ида имели существенное значение при выборе объекта исследования. Кроме того, древность троисхождения и высокий генетический консерватизм В. germanica (мутационный груз у (энного вида составляет 0,02- 0,04% на особь, для примера, у дрозофил - 0,5-1,5% (van de Jey, 1969), а у москитов - 0,5-3,0% (Craig, Hickey, 1967)), позволяют рассматривать труюуру его рДНК в качестве предковой для класса Insecta.

Очевидно, что для выявления специфических особенностей структуры рДНК ?. germanica необходимо оценить внутривидовую изменчивость кластера рибосомных генов ' исследуемого вида и межвидовую изменчивость в пределах отряда Blattoptera.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структурной организации и полиморфизма кластера ядерных рибосомных генов самцов В. germanica из естественных и искусственных популяций, а также определение степени родства исследуемого вида с другими представителями отряда Blattoptera на основе анализа их ядерной рДНК.

Перед нами стояли следующие задачи:

1) амплификация и секвенирование протяженного фрагмента ядерной рДНК В. germanica с целью получения первичной информации о структуре кластера рибосомных генов исследуемого вида, а также оценка возможности применения данного фрагмента в составе зонда для исследования полиморфизма структуры рДНК В. germanica,

2) выявление характера наследования различных типов структуры кластера рДНК рыжего таракана в индивидуальном скрещивании;

3) анализ внутри- и межпопуляционной изменчивости кластера рибосомных генов в выборках из лабораторных линий и природных популяций В. germanica;

4) оценка межвидовой изменчивости кластера генов рРНК б видов из отряда Blattoptera и определение возможности применения ядерной рДНК в качестве маркера филогенетических связей В. germanica с представителями данного отряда.

Научная новизна и практическая ценность работы. В процессе данного исследования нами впервые определена последовательность нуклеотидов протяженного фрагмента кластера ядерной рДНК В. germanica, содержащего внутренние транскрибируемые спейсеры, 5,8S рРНК ген и фрагменты генов рРНК, гомологичные 18S и 28S рРНК генам насекомых. Нами впервые методом ПДРФ в результате анализа индивидуального скрещивания получено подтверждение локализации рДНК на Х-хромосоме у В. germanica, и установлен сцепленный с полом характер наследования различных вариантов структуры рДНК. Впервые проведен молекулярно-генетический анализ внутривидовой изменчивости рДНК В. germanica. Впервые описана изменчивость ядерной рДНК нескольких видов из отряда Blattoptera и продемонстрирована возможность ее использования в установлении филогенетического родства В. germanica с представителями данного отряда.

Апробированный нами анализ рДНК В. germanica с применением сконструированного зонда может быть предложен для проведения масштабных популяционных экспериментов. Примененный в данном исследовании маркер межвидовой

изменчивости расширяет спектр молекулярных характеристик, используемых для уточнения родственных связей в пределах отряда Blattoptera.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференции "Экология и генетика популяций" (Йошкар-Ола, 1998), на Ш Республиканской конференции молодых ученых "Генетика и селекция на рубеже XXI века" (Минск, Беларусь, 1999) и на межлабораторном семинаре "Генетика животных" (ИОГен РАН, Москва, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах и состоит из следующих стандартных разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и приложения. Список литературы включает в себя 213 источников. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе использованы следующие стандартные молекулярные методы: ПЦР, клонирование и секвенирование, блот-гибридизация по Саузерну. Выделение тотальной ДНК тараканов и ее ПДРФ анализ проводили как описано ранее (Муха и др., 1995, 2000), с использованием трех зондов, представляющих собой плазмиду pUC19 с различными вставками. В зонде №1 вставкой является клонированный по EcoRl сайтам амплифицированный нами участок рДНК В. germanica, который был получен методом ПЦР с использованием Тац-полимеразы ("Promega") и праймеров: DAMS-18 -5'gtccctgccgtttgtacaca3' (последовательность 17S рДНК простейшего Tetrahymena pyriformis с 1587 по 1606 нуклеотид); DAMS-28 - 5'ctactagatggttcgattagtc3' (последовательность 25S рДНК Т. pyriformis с 948 по 926 нуклеотид) (Муха и др., 1999). В зонде №2 вставка представляет собой клонированный по сайтам HindlR-Bglil фрагмент (1752 н.п.) гена 17S рРНК Т. pyriformis (зонд №2) (Муха, Сидоренко, 1996; Сидоренко и др., 1997), а в зонде №3 -фрагмент (1212 н.п.) гена 25S рРНК (зонд №3) (Муха, Сидоренко, 1995) этого же вида, клонированный по Hindlll сайтам. Вставки в зонды №2 и №3 получали как описано ранее (Муха и др., 1994; Муха и др., 1995).

Внутривидовую изменчивость рДНК В. germanica исследовали у самцов из лабораторных линий "Black", "Prestage Р-6", "Jacksonville", предоставленных кафедрой энтомологии Государственного Университета штата Северная Каролина (США), и природных популяций городов Москвы (Россия), 'Ашхабада (Туркменистан) и Киева

(Украина). Анализировали по 27 самцов из лабораторных линий и 20-25 самцов из природных популяций. Сбор насекомых из природных популяций проводили в пяти - шести жилых помещениях, расположенных в значительно удаленных друг от друга районах каждого города. Отдельную выборку составили особи из одного помещения г. Москвы (московская колония).

Для выявления внутривидового полиморфизма рДНК В. germánico методом блот-гибридизации Я/лДП-рестрикты тотальной ДНК особей из природных выборок и лабораторных линий визуализировали зондами №1 и №3.

На основании полученных радиоавтографов для каждой выборки, а также суммарно для нескольких выборок, была составлена бинарная матрица признаков, где наличие или отсутствие гибридизационного фрагмента определенного размера обозначали соответственно "1" и "0". На основании этих матриц для каждой выборки рассчитывали следующие показатели: среднее число фрагментов на особь (N), среднее внугригрупповое сходство (S) (Nei, Li, 1979), среднее генетическое разнообразие или гетерозиготность (Hs) (Stephens et al., 1992; Li, Chakraborty, 1993), долю полиморфных локусов (P).

Генетическое сходство выборок оценивали на основе стандартного генетического расстояния Нея (Nei, 1972). Достоверность различий по значениям N, S и Hs рассчитывали с помощью пермутационного теста (Good, 1993). Генетическая однородность природных популяций и лабораторных линий по распределению частот фрагментов различного типа проверялась с помощью теста однородности выборок, основанного на распределении у2 (Глотов и др., 1982).

Для выявления межвидового полиморфизма рДНК представителей 6 видов отряда Blattoptera, относящихся к следующим семействам: Blaberidae - Gromphadorhina portentosa, Nauphoeta cinerea, Blaberus giganteas; Blattidae - Blatía orienialis, Periplaneta americana; Blattellidae - Blattella germánico, была охарактеризована с помощью двух гибридизационных зондов (№2 и №3) и отдельно трех рестриктаз (EcoRL, Psll, HinAW). Анализировали суммарные паттерны 3-4 особей каждого вида.

По результатам радиоавтографии составляли бинарную матрицу признаков. На ее основе рассчитывали коэффициенты попарного сходства между видами и составляли матрицы коэффициентов сходства (S), которые подвергали многомерному кластерному анализу.

Компьютерную обработку данных осуществляли с помощью пакетов программ NTSYS (Rohlf, 1997), GELSTATS (Rogstad, Pelikan, 1996), STATISTICA (StatSoft, 1996) и

POPGENE (Yeh et al., 1999). Анализ первичной последовательности клонированного фрагмента рДНК В. germanica был выполнен с использованием программ FASTA и BLAST (Wilbur, Lipman, 1983; Pearson, 1990; Altschul, 1990, 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование внутривидовой изменчивости структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана (Д germanica L.).

1.1. Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента рДНК В. germanica.

В рамках данного исследования был амплифицирован фрагмент кластера рибосомных генов В. germanica с использованием метода полимеразной цепной реакции и набора ранее описанных универсальных праймеров (Муха, Сидоренко, 1995; 1996; патент №2113481, Захаров и др., 1998), представляющих собой фрагменты последовательностей 25S и 17S рДНК T. pyriformis. Размер амплифицированного фрагмента, а также его нуклеотидная последовательность были установлены секвенированием (рис.1).

Идентификация границ структурных элементов кластера генов рРНК в амплифицированной последовательности рДНК В. germanica была осуществлена с использованием программ FASTA и BLAST путем детального сравнения отдельных участков этого фрагмента с нуклеотидными последовательностями баз данных EMBL и GeneBank. Установлено, что в состав данного фрагмента рДНК рыжего таракана входят: 3'-конец гена 18S рРНК (188 п.н.), ITS1 (661 п.н.), ген 5,8S рРНК (142 п.н.), ITS2 (464 п.н.), начало гена 28S рРНК (1282 п.н.). Полная длина амплифицированного фрагмента составляет 2737 п.н.

Было выявлено, что фрагмент 188-подобного рРНК гена В. germanica обладает максимальным сходством (97-100% на протяжении 135 н.) с 18S рРНК генами насекомых Nicrophorus orbicollis и N. americanas (Insecta, Coleóptera), а фрагмент 288-подобного гена рыжего таракана - с 28S рРНК геном насекомого Vespa crabro (Insecta, Hymenoptera) (сходство 88-100% на протяжении 350 н ).

1.2. Анализ структурной организации кластера рибосомных генов В. germanica.

На рис. 2 приведены результаты блот-гибридизации тотальной ДНК отдельных самцов В. germanica, обработанной зндонуклеазой HitidUI, с зондами №1 и №2. Зонд №2 выявил у всех особей только один фрагмент, размером около 2 т.п.о. (рис. 26). Зонд Xsl выявил у всех особей два фрагмента, длиной около 1 и 2 т.п.о., и полиморфную зону,

ITS1

1-60 CTACTAGATGOTTCGATTAGTCTTTCGCCCCTATACCCAGCTCTGACGArCGATTTGCAC

61-120 CTCGCTGCGGACCTCCATCAGG3TTTCCCCTGACTTCGTCCTGACCAGGCATAGTTCACC

121-180 ATCTTTCGGGTCCCAACGTGTACGCTCTGGGTGCGCCTGCGGCCGAGGCCGAGGCGCCCC

181-240 GGGJlGTGCGGGCCCGGACACTC3CCGCGGAGQ3Ct3AGGCCAGACGGCCATCCTCCCAACA

241-300 AACATCGGCAACGCCACGAGTGACGCGCCrTTGCCATGCTTTCACTGCGCCTTTGGGTTT

301-360 AGACAGCCCAATOACTCGCGCACATGTTAGACrCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCG

361-420 GGAAAGAGACCGAAGCTTTAAGCGCCGCCGACGGGAGACTGCTACCGTCCGAGGAATCCO

421-480 AGOACCAACAGCCGACGGGGGCCGGGGGCGTGGCGTTCGCCACGGACCACCCAGACACAA

481-540 CCCGAAGAGCTTGCCCTCGGTCCGGACGCTCACTCGCAGTTAAGGAGCGGGCCTTCTCCG

541-600 CCATGCTATACCGTCGGGCTCCGGCCAGGCATaOAACOGGTTCCCGGCGACCTTTGGCCC

601-660 GAGCCAAACCGGCTTCGGAGGTCGACTAAQOACAATTCCCAGAGCCCTTACAGACCGGTG

661-720 CCCAACGAGTCGCGACaTCCTACTCGGGGAAGAAGTGCACCTCGCCAGCACCAGAGACTT

721-780 TGTGCTTCCGGGCCAAGGGTGACTCCGGACCGACACGGAGCGCGCCTTGCGGCGCGACCG

7B1-840 CTGGCCGGGGCCATCCCCAAGGCAACTTCGGGCGCCCTGCGTGGACAAGAATGAGTCTCC

841-900 CCCTTTCGCCTATTCGGATCTGTCCCGTTTACCCTTGAACGGTTTCACGTACTGTTGAAC

901-960 TCTCTCXTCAAAGTTO'lT'ri'CAACTTTCCCTCACGGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCGTG

961-1020 GTCATATTTAGCCTTAGATGGAGTTTACCACCCACTTAGTGCTCCACTCTCAAGGAACAC

1021-1080 GACTGTGAGGAGAGCTCCTCTCGGGCACGGXGCCGGTCACTACGGGCCTGGCACCCTCTA

1081-1140 CGGGATGTAGCCCCGTTCAAGGGAGACTTGAACTCGGCACCGACGCCCGAGAATGCGGAA

1141-1200 CCTCCCACACACGACATCTCCCTGCGCGTTGCCACGCGGGATTCCGTGCTGGGCTCTTCC

1201-1260 CTGTTCGCTCGCCGGTACTTGGGGAATCCTTGTTAGTTTCTXTTCCTCCGCCTATTAATA

1261-1320 TGCTTAAATTCAGCGGGTAGTCTCGCCTGATCTGGGGTCGGAAACAATTAAGACTGCCAA

1321-1380 GAGCCTTGCCAGAAGCTTTTGCGTCGAGCAGACGAACACCGGGGGTCGGTCACAAGGCTT

1381-1440 TTTCTGTTACAAAGCAGCCAGAACCGCGCGCGCAGCGGATGTTCTTTGTCCGATCGACCC

1441-1500 CTATCGGCTTTGCAGCCTCACGCGGGACCGACCATATAGCGGACGAGACAGAACCTTTTC

1501-1560 CACACACGCATTGCCCCGTTCAGCATAAGCTGCCGACAGCTTCACGAGAGACTTAAAGAG

1561-1620 CGACGGGCTCGCAAAAGAAAGAAAAACAAATTTTTTTCCTTTTTCGCAAGGCACCGGTGC

1621-1680 CCCCAAAGCGGACAAGCGACGGGCCTCTCATTCCCACAGCAAGCGACACACAGTGTGTCG

1681-1740 AGTCAGTGGAGAGAAAACGCCGACGATGCCACAGGAATTGTTTGCAAGCCGACCCTCAGC

1741-1800 GAGGCGtggtcagggattggaaatccaaggaccgcaatgtgcgttcgaaatgtcgatgtt

1801-18 60 catgtgfccctgcagttcacatgtcgacgcgcaatttgctgcg'ttcttcatcgacccacga

1861-1920 gccgagtgatccaccgttcagggttgtaATGATAGTTCÄTATAAATCCÄAAACGACGCGC

1921-1980 AAGGCGCCGAGAAGGAAATATAGAAAAAATTTGCCAGACAAGGTATAAGTTTCGCCCCTC

1981-2040 CGCGAGGAGGGGCTCCTTCGCATCCGCCACCAAGAGCCCTAACCCCTCACACCACACAAC

2041-2100 GACTTCTCGAGCGATCGAGAGCGATGCGATGTACAGAGAGAGTAAGAGACAAGCGAGACA

2101-2160 GCGGACGAAAGGGGTCTTTGCCGAGGGCGAAGCCTAAAGCTGGCTCCTTTAAACCGCGCA

2161-2220 TTTTGCAGTGCCCAAAGCATTCGACAGTAAAAAAAAAGGGCGAGTTAGGTCAGACGCAGC

2221-2280 ACGCGAAGCATGCAGGACAACCGCCGCGCCACAAGGCGGTTACCAGACGCAGCACGTGAA

2281-2340 GCATGCAGACCCTTACTACAAACCCTTTGGGCGAAGACTGTTAGAGTCAGTCTTCTTTCA

2341-2400 ACGGCGCACACAAAAGCGCCGTACCCATAAAAAGGGCAACCTTCTCCGCCGAAACGGACG

2401-2460 AAAGAGTTGCCTAAGTAAAAAACAATGTGCTCAAAAGCCCTTCCAGTAAAAACAGAATTC

2461-2520 GCCCGCGCGCGCGCGTCCACCAACGAACGACACACACGGGGAATCTCTCTCTCCTCCACA

2521-2580 AAACTTCCATAGTGGCAACGATAAATTCCACCrrAA.T£MrCCrTCCGCACGrrCACCrAC

2581-2640 GGAAACCTTeTTACGACTTTTAGTTCCTCTAAJLTAÄTCAAGTTTGGGCATCTTCCCGGTG 2641-2700

2701-2737 GTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTA£AAACGGCAGGGGC

Рисунок 1. Последовательность нуклеотидов в амплифицированном фрагменте рДНК В. germanica.

Различные структурные элементы в последовательности обозначены на рисунке следующими шрифтами: участок 28S рДНК - заглавным полужирным; фрагмент 18S рДНК - заглавным полужирным курсивом; 5,8 S рРНК ген - строчным полужирным; ITS1 и ITS2 участки - указаны прописными буквами; последовательности, соответствующие праймерам, использованным для амплификации фрагмента рДНК В. germanica, подчеркнуты одной чертой; последовательности, соответствующие сайту рестрикции HindtB. фермента, выделены двойной чертой.

ITS2

18S rei

6,5 5,0

2,0

зо

1.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 а

1 2 3 4 5 б

6 7 8

Рисунок 2. Результат блот-гибридизации тотальной ДНК самцов В. germanica, обработанной Hindlll эндонуклеазой, с зондом №1 (а) и с зондом №2 (б).

фрагменты которой находятся в интервале от 5 до 6,5 т.п.о. (рис. 2а). Паттерны особей различаются числом фрагментов в этой зоне (от 1 до 3) и интенсивностью гибридизации. Таким образом, рДНК различных особей В. germanica не является идентичной.

Для выявления районов кластера рДНК В. germanica, обеспечивающих обнаруженную изменчивость, мы идентифицировали границы структурных элементов в амплифицированной последовательности, используемой в составе зонда, и локализовали сайты узнавания рестриктазы HindiII в ней (рис. 1, 3). Hindlll сайты находятся в 5' районе 28Б-подобного рибосомного гена {Hindill №1) и во втором внутреннем транскрибируемом спейсере (Hindlll №2). Расстояние между ними составляет 960 п.о. На рис. 2а этому фрагменту соответствует зона гибридизации с длиной около 1 т.п.о.

Чтобы определить положение третьего Hindlll сайта (№3) на схеме (рис. 3), необходимо принять во внимание, что размер фрагмента, выявленного обоими зондами составляет около 2 т.п.о. Из них, как показала идентификация структурных границ секвенированной последовательности рДНК В. germanica, входящей в состав зонда №1, 1216 п.о. приходятся: на ITS1; 5,8S-reH рРНК и часть ITS2, расположенную левее второго HindU.1

зонд 2

зонд 1

1Гз,ЗОНд3,

18S

около 2тпа

960 по

около 5-6,5 тпо

Н(МаЗ)

Н(№2) Н(№1}

H(Na4) Н(№3)

Рисунок 3. Схема строения кластера рибосомных генов В. germanica.

А - Н(№1) и Н(№2) - локализация сайтов узнавания рестриктазы HindiП, выявленных на основе анализа первичной последовательности амплифицированного фрагмента; Н(№3) и Н(№4) - предпологаемое положение других Hindill сайтов. Б - варианты структуры кластера рДНК, различающиеся длиной NTS. Условные обозначения: 18S; 5,8S; 28S - гены рРНК В. germanica гомологичные рРНК генам других эукариот; ITS1 и ITS2 - внутренние транскрибируемые спейсеры; NTS -нетранскрибируемый спейсер.

сайта (№2), остальные - около 800 и.о., принадлежат 188-подобному рРНК гену. Поскольку в среднем размер этого гена у эукариот составляет около 1,7-1,8 т.п.о. (Алешин и др., 1995), и не известно организмов с длиной 18S гена равной или менее 800 нуклеотидов, мы полагаем, что третий Hindlll сайт (№3) расположен в 1 SS-подобном гене. Тогда фрагменты вариабельной длины (рис. За) могут располагаться в повторах рДНК между Hindlll сайтами Xsl и №3 в направлении от 5'- к 3'- концу последовательности. Нельзя исключить и того, что между сайтами №1 и №3 находятся дополнительные Hindlll сайты (Н№4 и др.). В этом случае, фрагменты вариабельной длины располагаются между Hindlll сайтом №1 и ближайшим к нему сайтом, расположенным правее (№4 или др.). Однако, независимо от того, какой из названных сайтов определяет З'-границу фрагментов вариабельной зоны, ясно, что каждый тип фрагмента в паттерне особи отражает факт существования опредслеыногс типа структуры повтора рДНК.

Согласно представленной нами схеме структуры рДНК В. germanica (рис.3), зонды №1 и №3 должны выявлять одни и те же фрагменты вариабельной длины, что было подтверждено результатами радиоавтографии. Таким образом, любой из названных выше зондов может быть использован для выявления Hindill полиморфизма у В. germanica.

Для выявления причин вариабельности рДНК у исследуемого вида имеет значение положение Hindill сайта, определяющего 3' границу фрагментов вариабельной зоны. Если предположить, что Hindlïï сайт №4/или др. существует, то он не должен находиться в 28S-подобном рРНК гене, так как тогда длина этого гена составила бы около 6,5-7,5 т.п.о. (909 п.о. с5'-конца 288-подобного гена, согласно секвенированной последовательности, плюс длина фрагментов вариабельной зоны от 5 до 6,5 т.п.о.). Это не согласуется с размером 28S-подобного гена у эукариот, который у насекомых составляет 3,5-4,5 т.п.о. (Beckingham, 1982). Положение Hindlll сайта №4 в пределах 288-подобного гена рыжего таракана возможно только при наличии инсерций в этих генах, что представляется маловероятным. Поскольку, если принять нашу точку зрения о соответствии каждого фрагмента вариабельной зоны определенному типу повтора рДНК, то фрагменты этой зоны, имеющие минимальную длину, не содержат инсерций в 285-подобном рРНК гене. Но нами было показано, что у ряда исследованных особей В. germanica фрагменты минимальной длины в вариабельной зоне отсутствуют (рис. 2а, дорожки 2,3, 5-13). Если интеграция инсерций у рыжего таракана, как и у D. melanogaster, вызывает инактивацию 28S гена рРНК (Long et al., 1981), то существование особей с неактивными копиями является маловероятным.

Таким образом, нами впервые получены данные о структуре рДНК рыжего таракана и ее внутривидовой изменчивости, наиболее вероятной причиной которой, по нашему мнению, может являться вариабельность типа и/или числа субповторов в нетранскрибируемом спейсере.

1.3 Анализ наследования вариантов структуры кластера рибосомных генов В. germanica в индивидуальном скрещивании.

На рис. 4 представлен результат блот-гибридизации Hindlll ресгриктов тотальной ДНК родительских особей В. germanica и их потомства с зондом №3, а в табл. 1 схематично изображены типы паттернов членов анализируемой семьи. Родительские особи имеют неодинаковые типы паттернов при совпадении одного фрагмента (Б). Самка имеет два индивидуальных фрагмента (В и Г), самец - один (А), который наследуется всеми самками первого поколения. У потомков Fl каждого пола выявлено по два типа паттернов (у самцов типы 3 и 4, у самок - 5 и 6), соотношение частот встречаемости которых у каждого пола

Т.П.!

fcyr-.V.

т~т р

f » Ш*

3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рисунок 4. Блот-гибризационный анализ наследования различных типов повторов рДНК в индивидуальном скрещивании В. germanica. Тотальную ДНК обрабатывали ферментом Hindill и гибридизовали с зондом №3. Образцы ДНК наносили в следующей последовательности: ДНК родителей (дорожка 2 - самец, дорожка J - самка), ДНК потомства (дорожки 3-11,13-15 - самцн, дорожки 12,16-25 - самки).

соответствует расщеплению 1:1 (самцы: х2=0.333 р>0.05; самки: р>0.05).

Отметим, что нами не было выявлено особей с рекомбинантными типами структуры рДНК.

Поскольку ядрышковый организатор у В. germanica расположен на Х-хромосоме, а самцы имеют одну Х-хромосому (Cochian, Ross, 1976b; Cohen, Roth, 1970), то по паттернам самцов первого поколения можно судить о структуре рДНК обеих материнских Х-хромосом. Как видно из табл. 1, они имеют неодинаковые тины структуры.

Таблица 1. Типы паттернов рДНК родителей и их потомства в анализируемом скрещивании.

Паттерны родителей Паттерны потомства

самка самец самцы самки

1 2 3(7) 4(5) 5(5) 6(6)

А Б В Г — — — — — —

В скобках указано число исследованных особей.

Таким образом, у В. germanica выявлено сцепленное с полом наследование вариантов структуры рДНК и показано, что гомологичные Х-хромосомы могут различаться структурой повторов рДНК.

1.4. Анализ вариабельности структуры кластера генов рибосомных РНК в лабораторных линиях и природных популяциях рыжего таракана.

Внутривидовая изменчивость рДНК была проанализирована в трех лабораторных линиях и четырех природных популяциях В. germanica. На рис. 5-6 представлены результаты блот-гибридизационного анализа Hindlll фрагментов тотальной рДНК отдельных самцов названных выше выборок. Рис. 56 отражает типы паттернов, обнаруженные в линиях.

Особи в каждой выборке различаются числом и размером фрагментов в вариабельной зоне, а также интенсивностью их гибридизации. Последнее, вероятно, связано с неодинаковой копийностью повторов рДНК, но в популяционном анализе нами не учитывалось.

Размер выявленных фрагментов составил для линий и популяций 5,0-6,5 т.п.о. и

т.п.о 6,5 5,0

1 2 3 4 5 6 7 Jacksonville

9123456789 123456789 ' Prestage Р-6 ' Black

Фрагменты рДНК Ji h Ja Pi P2 Рз P4 в, в2

А -

Б - -

В - - - - - -

д — -

Е - -

Ж - — — -

3 -

Fp 0,78 0,11 0,11 0,56 0,22 0,11 0,11 0,89 0,11

Рисунок 5. Результат блот-гибридизации тотальной ДНК самцов В. germanica из линий "Jacksonville", "Prestage Р-6" и "Black", рестрицированной HindRl ферментом, с зондом №3 (а). Паттерны представлены в соответствии с их частотой встречаемости при исследовании 27 особей в каждой линии. Схема распределения различных фрагментов рДНК в линиях (б). Условные обозначения: заглавными русскими буквами обозначены различные фрагменты рДНК, латинскими буквами с индексом - типы сочетаний фрагментов рДНК у отдельных самцов; Fp - частота встречаемости каждого типа сочетания.

««* I* Ш .w Ш ш, Щ» • — Ш О&Щк >»- "

гп, т«* щт ш ■ -

т.п.о. — 6,5

— 4,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

•Ж 3

к ■л

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

ффФ* -

* • *

w» «§ ш — ^

> Ф «* а» •» шщш &

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 1718 19 2021 2223 24 25

4,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рисунок 6. Результат блот-гибридизации тотальной ДНК рыжих тараканов из г. Ашхабада (а, б) и г. Киева (в, г), рестрицированной Hind HI ферментом, с зондом №3 (рис. 6, а, в -радиоавтограф, б, г - схема).

4,5-6,5 т.п.о., соответсвенно. Число выявленных фрагментов разного типа для отдельных линий и отдельных популяций составляет 3-5 и 8, 10, соответственно. Отметим, что линия "Black" характеризуется минимальным, а линия "Prestage Р-6" - максимальным числом выявленых фрагментов. В выборках из природных популяций наибольшее число фрагментов обнаружено в московской колонии (10), тогда как в других популяциях это число одинаково и составляет 8.

Анализ типов фрагментов в линиях показывает, что линии "Prestage Р-6" и "Jacksonville" имеют три общих типа (В, Е, Ж) и только один из них является общим для всех трех выборок (В). Частоты этих фрагментов в линиях различаются. Обращает на себя внимание тот факт, что в каждой линии только один тип фрагмента имеет максимальную частоту и для каждой линии он специфичен. Это наиболее ярко демонстрирует график распределения частот фрагментов разного типа в линиях (рис. 7). Так, в линии "Black" наибольшую частоту имеет Б тип (1,00), в линии "Prestage Р-6" - В тип (1,00), а в линии "Jacksonville" - Ж тип (0,89). Стоит отметить довольно значительную частоту встречаемости фрагмента Е (0,67) в линии "Prestage Р-6".

Спектр выявленных Hind Ш фрагментов рДНК в природных популяциях шире, чем в линиях, больше и число одинаковых для нескольких популяций фрагментов. Так, все природные выборки имеют фрагменты В, Ж, 3, К, JI. Фрагменты Б, Г, Д и Е встречаются в различных комбинациях в трех из четырех исследованных выборок. Специфичными только для московской колонии являются фрагменты А, И. В отличие от линий, в природных популяциях, за небольшим исключением, максимальной частотой обладают одни и те же два типа фрагментов. Это фрагменты В (0,72-0,92) и Ж (0,32-0,73). На рис 7 хорошо видны два пика. Необходимо отметить особенности киевской выборки. Ее отличает неярко выраженный второй пик, а также практически одинаковые частоты встречаемости фрагментов К и JI (0,40 и 0,48, соответственно). Распределение частот различных фрагментов в выборке из московской колонии не отличается от такового в природных популяциях. Учитывая высокое сходство распределений частот встречаемости 11 типов фрагментов в исследованных природных популяциях, мы провели проверку однородности выборок по данному показателю методом %2. Результат проверки показал, что все европейские выборки (Москва, московская колония, Киев) не отличаются между собой, а московская популяция к тому же и от среднеазиатской популяции. Отсутствие значимых отличий московской популяции от популяции г. Ашхабада может быть связано либо со случайной географической изменчивостью данного признака (учитывая синантропность В. germanica), либо со значительным притоком мигрантов в Москву из Средней Азии,

О . 95

а р

1,1

О, 9 0,7 0,5 О, 3 0, 1 -0,1

В Д

Фрагмент»)

-О-

—Л—

Моск. колония Москва Киев Ашхабад

Г Д Е Ж Фрагменты

Рисунок 7. Частота всречаемости различных фрагментов в исследованных лабораторных линиях и природных популяциях.

который носит неравномерный характер. Сравнение групп выборок, линий и популяций, по типам выявленных фрагментов показывает, что четыре фрагмента (Г, И, К, и Л), присутствующие в паттернах особей из природных популяций, не обнаружены в лабораторных линиях.

Кроме того, в лабораторных линиях мы провели учет типов сочетаний фрагментов в паттернах и частот их встречаемости. Он показывает, что каждая линия имеет специфичный набор типов паттернов и их количество ограничено (2, 4). Только один тип паттерна в каждой линии встречается наиболее часто (рис. 56): в линии "Black" - это Bi тип (89%), в линии "Jacksonville" - Ji (78%), в линии "Prestage Р-6" - Pi (56%). В природных популяциях выявлено значительное число типов паттернов (более 10) и из-за сложности анализа они не были нами учтены.

Для характеристики внутривидовой изменчивости рДНК мы использовали рад

о . V о

0.45

0.20

— О . О 5

статистических параметров, которые приведены в табл. 2. По среднему числу выявленных фрагментов на особь (N) линия "Prestage Р-б" достоверно отличается от двух других линий (р<0,05). По значению средней гетерозиготносги (Н) все три линии достоверно отличаются друг от друга. При этом максимальной средней гетерозиготностью (Н) обладает линия "Jacksonville", а минимальное значение этого параметра наблюдается в линии "Black". Аналогичная картина наблюдается и по значениям доли полиморфных локусов (Р). Внугрилинейное среднее сходство особей (S) по изученному признаку является наибольшим в линии "Black", тогда как в линии "Prestage Р-б" оно минимально. Таким образом, наиболее полиморфными линиями являются линии "Prestage Р-6" и "Jacksonville", а наименее гетерогенной - линия "Black".

Сравнение выборок из природных популяций показало (табл. 2), что они не отличаются достоверно друг от друга по среднему числу детектируемых фрагментов (N) и внутрипопуляционному сходству (S). Как видно из табл. 2, максимальной гетерозиготностью обладает популяция города Москвы, которая достоверно отличается по значению этого параметра от популяций города Киева и московской колонии. Популяция города Ашхабада занимает промежуточное положение по уровню гетерозиготносги и достоверно не отличается ни от одной из названных выше выборок. По значению внутрипопуляционного среднего сходства, так же как и по доле полиморфных локусов, достоверных различий между исследованными популяциями и московской колонией не выявлено.

Таблица 2. Параметры внутривидового полиморфизма рДНК у В. germanica.

Среднее число фрагментов на особь, N±SE Внугрилинейное среднее сходство, S Средняя гетерозиготносгь, Н Доля полиморфных локусов, р

lacksonville (n=27) 1,111±0,320 0,73 5Ю,019 0,454 1,000

Prestage P-6 (n=27) 2,778±0,424 0,67310,085 0,366 0,514

Black (n=27) 1,44410,847 0,82110,058 0,176 0,191

Московская колоши [n=22) 2,90911,509 0,543Ю,036 0,627 1,000

Москва (n=25) 2,520±1,194 0,45210,037 0,709 1,000

Киев (n=25) 2,480±1,327 0,51010,032 0,619 1,000

Ашхабад (n=20) 2,350+0,671 0,49710,051 0,679 1,000

Популяции (п=92) 2,5911,132 0,481Ю,043 0,660 1,000

Линии (n=81) 1,78±0,922 0,317Ю,081 0,825 1,000

Таким образом, выборка из популяции города Москвы характеризуется максимальным полиморфизмом рДНК. Это, скорее всего, является следствием притока мигрантов. Что касается московской колонии, то она составляет незначительную часть московской популяции и обладает минимальным значением генетического разнообразия.

Дендрограмма, изображенная на рис. 8 отражает генетические различия между лабораторными линиями и природными популяциями, рассчитанные на основе стандартного генетического расстояния Нея (DN). Из трех лабораторных линий, линии "Prestage Р-б" и

г— Мое. кол. Москва

_ _ Ашхабад

--- Киев

--- Prestage Р—f

Jacksonville

- Black

1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0,0

Генетическое расстояние

Рисунок 8. Дендрограмма генетических различий исследованных лабораторных линий и природных популяций, построенная на основании меры сходства Dn.

"Jacksonville" оказались гораздо ближе к природным популяциям, чем линия "Black". Расстояния между природными популяциями довольно незначительные, причем наиболее близкими друг к другу оказались московская колония и московская популяция, формирующие кластер первого уровня. Несколько обособлена от них ашхабадская популяция и еще более - киевская. Интересно отметить, несмотря на принадлежность московской и киевской популяций к одной климатической зоне, а ашхабадской популяции -к другой, именно последняя кластеризовалась с московской популяцией.

Как уже было показано выше, исследуемые линии отличаются по степени генетического разнообразия структуры кластера генов рРНК. Это может быть связано с различными сроками их содержания в лабораторных условиях и эффектом основателя. Так, линия "Black" искусственно поддерживалась в условиях ограниченной численности в течение 30 лет. Этого времени достаточно для того, чтобы данная линия потеряла большую часть исходной изменчивости. Вероятно, при создании линии имел место эффект

,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 О,

Генетическое расстояние

"основателя", поскольку частота мутации black, которой маркирована данная линия, в природных популяциях крайне низка. Линии "Prestage Р-6" и "Jacksonville" до исследования содержались в лабораторных условиях 2 года и были основаны особями из двух различных природных популяций. Это и определило более высокую степень изменчивости структуры рДНК в названных выше линиях по сравнению с линией "Black". Существующее различие по уровню полиморфизма между линиями "Prestage Р-6" и "Jacksonville" может быть связано с разницей в степени изменчивости рДНК исходных природных популяций, а также с эффектом основателя.

Полученные результаты свидетельствуют о сходном уровне полиморфизма рДНК в исследованных выборках самцов из природных популяций. Хотя часть статистических тестов и параметров позволили различить отдельные популяции, в целом не получено четкой картины их дифференциации. По нашему мнению, это может быть связано с высокой степенью синантропности В. germanica, а также с активной миграцией особей между исследованными городами.

Сравнительное исследование полиморфизма рДНК в лабораторных линиях и природных популяциях рыжего таракана свидетельствует о том, что по изученному признаку между ними существуют различия. Они касаются как числа выявленных фрагментов рДНК, так и распределения частот встречаемости фрагментов разной длины. Почти во всех природных популяциях наибольшей частотой встречаемости характеризуются два фрагмента (В и Ж), а в линиях - только один фрагмент, причем для каждой линии он специфичен. Отметим, что лабораторные линии имеют и индивидуальные варианты сочетаний фрагментов. Возможно, преобладание частот встречаемости двух фрагментов (В и Ж) в природных популяциях является отражением более высоких адаптивных характеристик типов структуры рДНК, соответствующих этим фрагментам.

Отдельные природные популяции и отдельные лабораторные линии отличаются друг от друга по изученным популяционным параметрам (табл. 2). Так, в среднем особи в популяциях можно охарактеризовать как более полиморфные по сравнению с особями в лабораторных линиях, поскольку первые несут большее число фрагментов рДНК. Особи внутри отдельных популяций обладают меньшим сходством по сравнению с особями внутри отдельных линий, и наоборот, изменчивость по структуре рДНК в природных популяциях выше, чем в отдельных линиях. Об этом свидетельствуют такие показатели, как доля полиморфных локусов (Р) и средняя гегерозиготность (Н).

Кроме того, сравниваемые группы отличаются по оценкам внутригруппового сходства (S) и по среднему генетическому разнообразию (Н) (табл. 2). Из данных,

представленных в табл. 2, следует, что гетерозиготность (Н) в совокупности популяций ниже, чем в совокупности линий, а сходство особей в группе популяций (S) выше аналогичного параметра в группе линий. Это является отражением того факта, что каждая линия обладает индивидуальным набором типов паттерна, которые при объединении линий в одну выборку увеличивают ее изменчивость.

Представленные нами результаты анализа структуры рДНК В. germánico методом ПДРФ показали слабую дифференциацию природных популяций и четкую дифференциацию лабораторных линий между собой.

2. Изменчивость рДНК в отряде Blattoptera и возможность ее использования для выявления филогенетических связей Д germanica с представителями данного таксона.

В рамках данной работы мы провели анализ изменчивости рДНК в отряде Blattoptera и оценили возможность применения полиморфизма длин рестрикгных фрагментов для изучения филогенетических связей между шестью видами, принадлежащими к трем семействам названного отряда.

На рис. 9 представлены результаты блот-гибридизационного анализа Hindñl, ЕсоМ, Pstl рестриктов тотальной ДНК зондами №2 и №3. Анализ радиоавтографов показывает, что в основном по большинству рестриктаз паттерны гибридизации различных видов, выявляемые одним и тем же зондом, могут значительно различаться как по числу фрагментов, так и по их длине. Наиболее ярко это видно на примере выявленных зондом №2 EcoRl паттернов, где число фрагментов у разных видов колеблется от 1 до 5 (рис. 9а, дорожки 1-6). Однако, стоит отметить существование общих фрагментов у двух, иногда трех видов. Интересным является тот факт, что ряд видов по отдельным рестриктазам демонстрирует полное совпадение типов паттернов. Так, зонд №3 выявил идентичные EcoRl паттерны у трех видов - Р. americana, N. cinerea и G. portentosa (присутствует только один фрагмент, рис. 96, дорожки 1, 2, 3), а зонд №2 - одинаковые Pstl паттерны у двух из названных выше видов - N. cinerea и G. portentosa (также присутствует только один фрагмент, рис. 9а, дорожки 14, 15). Обратим внимание на сходство HineñR паттернов, идентифицируемых обоими зондами у каждого из пяти видов, за исключением В. germanica (рис. 9: дорожки 7-11), хотя у Р. americana и G. portentosa и появляются по одному дополнительному легкому мажорному фрагменту (рис. 9: дорожки 7 и 9, соответственно). Наличие в ШпЛП паттернах отдельных видов одинаковых фрагментов, выявляемых обоими зондами, свидетельстует о наличии в составе этих фрагментов участков,

2,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

13 14 15 16 17 18

Рисунок 9. Результат блот-гибридизации тотальной ДНК 6 видов тараканов, обработанной тремя различными эндонуклеазами рестрикции, с зондом №2 (а) с зондом №3 (б). Виды тараканов:

1. Periplaneta americana (дорожки 1, 6 и 13).

2. Nauphoeta sinerea (дорожки 2, 7 и 14).

3. 'Gromphadorhinaportentosa (дорожки 3, 8 и 15).

4. Blaberus giganteus (дорожки 4, 9 и 16).

5. Blatta orientalis (дорожки 5,10 и 17).

6. Blattella germanica (дорожки 6,11 и 18).

Р. americana Blatta orlentalis Nauphoeta cinérea G. portentosa Blaberus gjganteus Blattella germánica

семеис Blattida

семеис; Blaberii

семеис Blattelli

0,2 0,3 0,4

Коэффициент сходства

Рисунок 10. Дендрограмма генетического сходства исследованных видов, построенная н основе обобщенной матрицы коэффициентов сходства по методу UPGMA. Сокращения: G. portentosa - Gromphadorhina portentosa, Р. americana - Periplanet< americana.

гомологичных зондам №2 и №3, то есть 18S- и 288-подобным рРНК генам эукариот.

Как видно из дендрограммы генетического сходства, изображенной на рис. 10, видь относящиеся к одному семейству, кластеризуются вместе, а единственный представител семейства Blattellidae - рыжий таракан, выделяется в резко обособленную группу. Наш результаты согласуются с данными классической систематики, основанной на комплекс морфолого-экологических, физиологических и цитогенетических критериев.

Полученные данные свидетельствуют о наличии довольно значительной межвидово изменчивости рДНК в отряде Blattoptera. Использование нескольких рестриктаз в сочетани с зондами, гомологичными различным генам рибосомного кластера, повышае разрешающую способность метода ПДРФ, и нам удалось оценить возможность применени рДНК маркеров для установления филогенетических связей между видами отря^ Blattoptera. Полученные результаты представляют собой первые сведения об изменчивост ядерной рДНК в отряде Blattoptera.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе нам удалось получить первую информацию о структуре ядерной }ДНК представителя одного из древнейших отрядов класса Insecta, В. germanica. Кроме того, «ми получены оценки внутривидовой изменчивости кластера рибосомных генов у шванного вида и межвидовой вариабельности ядерной рДНК в отряде Blattoptera.

Нами впервые клонирован и секвенирован протяженный (2737 п.о.) фрагмент кластера рДНК В. germanica. Было установлено, что он содержит ITS1, ITS2, 5,8S рРНК ген, !'-район ISS-подобного рРНК гена и 5'-конец 283-подобного рРНК гена.

Нам удалось локализовать район, обуславливающий вариабельность повторяющихся гдиниц кластера рибосомных генов. Он довольно обширен и охватывает 5' участок 18S рРНК ■ена, ограниченный HindüI сайтом, межгенный спейсер (IGS) и 3' район 28S рРНК гена до 4indïïl сайта. Поскольку последовательности, кодирующие рРНК, обладают значительным сонсерватизмом в пределах вида, полагаем, что выявленная нами изменчивость может быть 5ызвана вариабельностью нетранскрибируемого спейсера По числу и/или типу юследовательности субповторов. Для получения однозначного ответа на вопрос о сонкретной причине изменчивости повторяющихся единиц рДНК по длине у рыжего таракана необходимо провести в будущем дополнительные исследования.

Нами впервые методом ПДРФ получено подтверждение локализации рДНК на X-сромосоме у В. germanica, что ранее было показано методом гибридизаци in situ (Cave, 1976). Анализ индивидуального скрещивания не выявил в первом поколении особей с )екомбинантными типами структуры рДНК. Возможно, этот факт является отражением 1изкой частоты рекомбинации между ядрышковыми организаторами гомологичных X-сромосом.

Анализ внутривидовой изменчивости рДНК В. germanica показал, что лабораторные шнии находятся друг от друга на большом генетическом расстоянии и значительно >бособлены от группы, состоящей из выборок природных популяций. По сравнению с 1риродными популяциями, лабораторные линии обладают меньшим генетическим >азнообразием рДНК, проявляющемся как в спектре выявленных фрагментов, так и в [астотах одинаковых типов фрагментов. Во всех природных популяциях максимальные гастоть: распространения имеют одни и те же два типа кластера, а для каждой лабораторной шнии эти типы специфичны. Это может свидетельствовать о различной адаптивной (ениости упомянутых типов кластера рДНК, а также о различиях в действии генетико-втоматических процессов в естественных и лабораторных условиях.

Характер выявленного в природных популяциях полиморфизма рДНК не позволяет четко их дифференцировать, несмотря на географическую удаленность исследованных популяций (от 700 до 2900 км) и принадлежность к разным климатическим зонам. Полученный результат может быть связан с высокой степенью синантропности и значительным уровнем миграции В. germanica. О слабой дифференциации природных популяций В. germanica свидетельствуют результаты других исследователей, использовавших методы RAPD анализа и полиморфизма белков (Cioarec et al., 1999; Jobet et al., 2000). Полагаем, что эти данные вместе с результатами наших исследований отражают присущую В. germanica неярко выраженную популяционную дифференциацию. Тем не менее, для однозначной трактовки всех имеющихся на данный момент результатов, считаем необходимым проведение более масштабных исследований самцов и самок рыжего таракана из популяций, расположенных на значительно более удаленных друг от друга территориях.

В проведенном нами исследовании оценена межвидовая изменчивость рДНК в отряде Blattoptera на примере шести видов, включая В. germanica. Полученные данные представляют собой первые сведения об изменчивости ядерной рДНК в названном отряде. Как свидетельствуют результаты, межвидовая изменчивость рДНК в отряде Blattoptera, оцененная методом ПДРФ с использованием набора из трех рестриктаз и двух зондов, довольно значительная. По отдельным рестриктазам между видами наблюдаются различные уровни сходства: полное совпадение паттернов рестрикции, наличие одного или нескольких общих фрагментов, либо полное отсутствие сходства. Филогенетическое дерево, построенное на основе полученных результатов, совпадает с классическими классификациями, основанными на морфо-анатомических и физиологических признаках (McKittrick, 1964), а также с результатами сравнительного анализа первичной последовательности фрагментов рибосомных генов митохондрий тараканов (Kambhampati, 1995). Отметим, что в отличие от других исследователей, мы впервые применили маркер ядерной ДНК (рДНК) для описания филогенетических связей в отряде Blattoptera. Полагаем, что привлечение молекулярных маркеров, в том числе и апробированного в данной работе, в сочетании с традиционными морфологическими признаками, позволит уточнить существующие классификации тараканов. Это является актуальным для данного таксона, включающего около 4000 видов, особенно учитывая противоречивость современных классификаций отряда Blattoptera (McKittrick, 1964; Rehn, 1951; Princis, 1960; Huber, 1974).

Таким образом, данная работа явилась первым этапом в исследовании структуры рДНК В. germanica, се внутривидовой изменчивости, а также в определении перспектив использования полиморфизма структуры рДНК в филогенетических исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Определена последовательность нуклеотидов фрагмента рДНК В. germanica размером 2737 н.п., содержащего внутренние транскрибируемые спейсеры (1TS1 и ITS2), 5,8S рРНК ген, а также фрагменты 18S- (188 п.н.) и 28S- (1282 п.н.) подобных генов рРНК.

2. Выявлен внутривидовой полиморфизм структурной организации кластера рибосомных генов В. germanica. Показано, что:

1) полиморфизм кластера рРНК генов в отдельных исследованных природных популяциях выше, чем в отдельных лабораторных линиях;

2) максимальной частотой встречаемости во всех популяциях обладают два одинаковых типа фрагментов кластера рРНК генов, тогда как в линиях -только один тип, причем для каждой линни он специфичен; специфичными для линий являются и типы паттернов;

3) генетические расстояния между популяциями значительно меньше, чем между лабораторными линиями;

4) структурная вариабельность кластера рибосомных генов В. germanica, исследованная методом ПДРФ, позволяет четко дифференцировать две группы: лабораторные линии и природные популяции;

5) стандартные статистические методы (метод 'fj, средняя гетерозитотность, генетическое расстояние Нея) не позволяют четко дифференцировать исследованные природные популяции по структуре рДНК.

3. Определен сцепленный с полом характер наследования вариантов структуры рДНК. Показано, что гомологичные Х-хромосомы могут иметь неодинаковые типы структуры кластера рибосомных генов.

4. Оценена межвидовая изменчивость кластера генов рРНК б видов из отряда Blattoptera и показана возможность применения ядерной рДНК в качестве маркера филогенетических связей В. germanica с представителями данного отряда.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Муха Д.В., Сидоренко А.П., Лазебная И.В., Захаров И.А. Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов в пределах класса Insecta // Генетика. 1995. Т. 31.С. 63-67.

2. Муха Д.В., Лазебная И.В., Сидоренко А.П. HindUl полиморфизм рибосомальной ДНК рыжего таракана (Blattella germanica) II Цитология и генетика. 1997. Т. 31. С. 88-90.

3. Лазебная И.В., Муха Д.В., Захаров И.А. Анализ структуры кластера рибосомальных генов у представителей класса Insecta. // Тезисы конференции "Экология и генетика популяций". Йошкар-Ола. 1998. С. 263-265.

4. Лазебная И.В., Хмелев A.B., Муха Д.В. Анализ внутривидовой изменчивости рибосомной ДНК Blattella germanica // Тезисы III Республиканской конференции молодых ученых «Генетика и селекция на рубеже XXI века», Институт генетики и цитологии HAH Беларуси, 1999.

5. Муха Д.В., Лазебная И.В., Сидоренко А.П. Внутривидовой полиморфизм структурной организации кластера рибосомных генов у Blattella germanica // Генетика. 2000. Т. 36.

6. Mukha D.V., Sidorenko A.P., Lazebaya I.V., Wiegmann B.M., Schal C. Analysis of intraspecies polymorphism in the ribosomal DNA cluster of the cockroach Blattella germanica // Insect Mol. Biol. 2000. V. 9. P. 217-222.

С. 17-22.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лазебная, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация кластера генов рибосомных РНК эукариот.

1.1.1. Общая характеристика организации кластера генов рибосомных РНК эукариот.

1.1.2. Сравнительный анализ структуры рДНК наиболее изученных видов насекомых.

1.2. Рибосомная ДНК - биологический хронометр эволюционного процесса.

1.2.1. Макроэволюция кластера рибосомных генов.

1.2.2. Микроэволюция кластера рибосомных генов.

1.3. Характеристика объекта исследований.

1.3.1. Биология Blattella germanica.

1.3.2. Обзор данных по генетике В. germanica.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Перечень видов тараканов, использованных в данном исследовании.

2.2. Выборки В. germanica из природных популяций.

2.3. Условия содержания В. germanica в инсектарии.

2.4. Постановка скрещиваний.

2.5. Анализ тотальной ДНК тараканов.

2.6. Получение зондов и их характеристика.

2.7. Методы статистической обработки.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование внутривидовой изменчивости структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана (В. germanica L.).

3.1.1. Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента рДНК В. germanica.

3.1.2 Анализ структурной организации кластера рибосомных генов

В. germanica.

3.1.3. Анализ наследования вариантов структуры кластера рибосомных генов В. germanica в индивидуальном скрещивании.

3.1.4. Анализ вариабельности структуры кластера генов рибосомных РНК в лабораторных линиях и природных популяциях рыжего таракана.

3.2. Изменчивость рДНК в отряде Blattoptera и возможность ее использования для выявления филогенетических связей В. germanica с представителями данного таксона.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана"

Интерес к структурно-функциональной организации кластера рибосомных генов обусловлен центральной ролью рРНК в биосинтезе белка, связью структуры рДНК со скоростью развития (Cluster et al., 1987), а также особенностями строения рДНК, отличающими ее не только от уникальных генов, но и от кластеров других многокопийных генов. Характеризуя гены рРНК, важно отметить, что они расположены в геноме в виде тандемного кластера, в каждой единице которого присутствуют высококонсервативные участки, кодирующие рРНК гены, и вариабельные спейсерные последовательности.

Вышеперечисленное, а также наличие механизмов, обеспечивающих согласованную эволюцию рибосомных повторов внутри тандемного кластера (Dover, 1982; Arnheim, 1983; Williams et al., 1989), позволяют использовать рДНК при решении многих вопросов популяционной генетики (Cluster, Allard, 1995; Crease, 1995; Demerida et al., 1995; Suzuki et al., 1994), селекции (Kavanagh, Timmis, 1986; Brown, 1990; Polanco, Perez de la Vega, 1997), систематики, эволюции (Cormean et al., 1992; Schlotterer et al., 1994; Nickrent et al., 1994; Titus, Larson, 1995; Halanych, 1996) и экологии. Кроме того, кластер генов рибосомных РНК является модельной системой для выявления закономерностей эволюции мультигенных семейств (Arnheim et al., 1980а; Long,

Dawid, 1980; Coen etal., 1982; Dover, 1982; Coen, Dover, 1983).

Специфичность вариантов рДНК широко используют для паспортизации сортов растений, пород животных и для идентификации видов в сложных сообществах при симбиозе и паразитизме (Appels, Dvorak, 1982; Ellis et al., 1984; Thomas et al., 1993; Lee et al., 1993; Rehner, Uecker, 1994; Beck, Ligon, 1995; Сидоренко и др., 1997).

Вариабельность рДНК в природных популяциях обеспечивает дополнительные генетические маркеры, которые наряду с белковым полиморфизмом и морфологическими признаками используются для мониторинга окружающей среды, а также решения проблем микро- и макроэволюции (Kavanagh, Timmis, 1986; Brown, 1990; Polanco et al., 1997).

В настоящее время накоплена обширная информация о структуре рДНК насекомых (Beckingham, 1975; Jakubczak et al., 1990; Алешин и др., 1995), которая свидетельствует о существовании общих черт в макроструктуре рДНК различных видов (последовательность расположения генов, чередование их со спейсерными последовательностями в повторах тандемного кластера рДНК) и индивидуальных особенностей их микроструктуры (тонкое строение генов, высоковариабельных районов нетранскрибируемого и транскрибиремых спейсеров, степень внутривидовой изменчивости последних). Однако, большинство исследователей в своих работах ограничиваются изучением небольших участков кластера рДНК, размером от нескольких сот до полутора тысяч пар нуклеотидов (Harmsen et al., 1995; Cormean et al., 1992; Kambhampati, 1995, 1996), что осложняет получение целостной картины структурной организации рДНК конкретного вида, а тем более ее внутри- и межвидовой изменчивости. При этом, вне поля зрения исследователей часто остаются не только виды, но семейства и даже отряды насекомых, среди которых отряд Blattoptera является одним из древнейших.

Представители его многочисленны (около 4000 видов) и сильно различаются по морфологическим и поведенческим признакам. Тараканы занимают различные экологические ниши (всеядные синантропные виды; лесные виды, перерабатывающие древесину) и характеризуются неодинаковыми адаптивными способностями.

Самый распространенный в России вид таракана, Blattella germanica (отряд Blattoptera, семейство Blattellidae), является генетически наиболее изученным по сравнению с другими представителями отряда Blattoptera. В отличие от Drosophila melanogaster - классического объекта генетических исследований, с детально изученной во всех отношениях структурой рДНК (Cluster et al., 1987; Terracol, Prud'homme, 1986; Tartof, 1973; Tartof, 1974; Jakubczak, 1990; Long et al., 1981; Williams et al., 1990), B. germanica обладает некоторыми преимуществами, имеющими существенное значение при генетическом анализе рДНК. Так, у D. melanogaster ядрышковый организатор расположен на обеих половых хромосомах, в то время как у рыжего таракана -на Х-хромосоме. С учетом типа определения пола у В. germanica (самки - XX, самцы - ХО), это позволяет исследовать структуру и описывать изменчивость рибосомной ДНК индивидуальных Х-хромосом при анализе отдельных самцов популяции.

В. germanica является представителем одного из наиболее древних отрядов класса Insecta (Ross, Cochran, 1975; Wootton, 1981), обладает высоким уровнем морфологического и генетического консерватизма. Так, мутационный груз у исследуемого вида составляет 0,02 - 0,04% на особь, для примера, у дрозофил - 0,5 - 1,5% (van de Hey, 1969), а у москитов - 0,5 - 3,0% (Craig, Hickey, 1967). Это позволяет рассматривать структуру рДНК В. germanica в качестве предковой для класса Insecta и ее исследование является важным для понимания процесса эволюции кластера рибосомных генов в пределах данного таксона.

Интерес к генетической структуре популяций В. germanica обусловлен широким распространением вида на всех континентах, его синантропностью, устойчивостью к инсектицидам. Кроме того, В. germanica является источником аллергенов и механическим переносчиком многих серьезных заболеваний человека.

Очевидно, что для проведения сравнительного анализа структуры рДНК В. germanica с насекомыми других отрядов, важно предварительно оценить внутривидовую изменчивость кластера рибосомных генов у этого вида и межвидовую изменчивость в пределах отряда Blattoptera. Отметим отсутствие каких-либо данных на эту тему.

Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации и полиморфизма кластера ядерных рибосомных генов В. germanica из естественных и искусственных популяций, а также определение степени родства исследуемого вида с другими представителями отряда Blattoptera на основе анализа их ядерной рДНК.

Перед нами стояли следующие задачи:

3) анализ внутри- и межпопуляционной изменчивости кластера рибосомных генов в выборках из лабораторных линий и природных популяций В. germanica', 4) оценка межвидовой изменчивости кластера генов рРНК 6 видов из отряда Blattoptera и определение возможности применения ядерной рДНК в качестве маркера филогенетических связей В. germanica с представителями данного отряда.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В настоящем обзоре описана структура кластера рибосомных генов, присущая большинству эукариотических организмов, и существующие отклонения от нее у низших эукариот, а также показано функциональное значение различных элементов кластера генов рРНК. Поскольку кластер рибосомных генов D. melanogaster исследован наиболее подробно, это нашло отражение и в обзоре. На примере ряда видов высших эукариот продемонстрированы существующие у них особенности микроструктуры, определяющие видоспецифичные характеристики последовательности кластера рДНК и особенности регуляции транскрипции. Эта информация представляется актуальной в связи с впервые проведенным нами исследованием структуры кластера рибосомных генов В. germanica, являющегося одним из наиболее древних видов насекомых, что позволяет рассматривать структуру его рДНК как предковую по отношению к большинству таксонов высших эукариот. В обзоре приводится также фактический материал по использованию кластера рибосомных генов как маркера микро- и макроэволюционных событий. Существует множество литературы на эту тему, однако, большинство результатов оказались несопоставимыми и трудно поддавались систематизации из-за фрагментарного характера исследований. Тем не менее, изложение этого материала отражает существующую в науке тенденцию по исследованию небольших участков рДНК для проведения популяционных и филогенетических сравнений.

Раздел по биологии исследованных видов был включен в обзор литературы в связи с тем, что тараканы в целом, и даже наиболее изученный из них вид В. germanica, не являются традиционными объектами молекулярно-генетических исследований.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лазебная, Ирина Викторовна

114 ВЫВОДЫ

1. Определена последовательность нуклеотидов фрагмента рДНК В. germanica, размером 2737 п.н., содержащего внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2), 5,8S рРНК ген, а также фрагменты 18S- (188 п.н.) и 28S- (1282 п.н.) подобных генов рРНК.

2) максимальной частотой встречаемости во всех популяциях обладают два одинаковых типа фрагментов кластера рРНК генов, тогда как в линиях - только один тип, причем для каждой линии он специфичен; специфичными для линий являются и типы паттернов;

3) генетические расстояния между популяциями значительно меньше, чем между лабораторными линиями;

5) стандартные статистические методы (метод %, средняя гетерозитотность, генетическое расстояние Нея) не позволяют четко дифференцировать исследованные природные популяции по структуре рДНК.

4. Оценена межвидовая изменчивость кластера генов рРНК 6 видов из отряда Blattoptera и показана возможность применения ядерной рДНК в качестве маркера филогенетических связей В. germanica с представителями данного отряда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Кластер генов рибосомных РНК предоставляет большие возможности для исследования микро- и макроэволюционных процессов, происходящих в природе.

Известно, что последовательности генов рРНК в пределах вида практически не отличаются. Однако, хотя между видами, семействами, классами и даже царствами существует сквозная гомология названных последовательностей, в их составе присутствуют как высококонсервативные области, не изменяющиеся в пределах больших таксономических групп, так и более вариабельные, поэтому анализ нуклеотидных последовательностей генов рибосомных РНК малой и большой субъединиц широко используют для установления или уточнения систематического положения организмов различных таксонов, а также выявления филогенетических связей между ними (Алешин, 1995).

Сравнение быстро эволюционирующих спейсерных последовательностей, позволяет исследовать систематические связи между близкородственными видами и популяционную изменчивость (Beebe, Saul, 1995; Suzuki et al., 1994; Brauner et al., 1992).

Анализ повтора кластера рибосомных генов довольно трудоемкий процесс, но только он способен дать полную картину эволюции рДНК, отражающую как процессы изменчивости, так и процессы стабилизации (консерватизма) данного участка генома конкретного вида.

В настоящей работе нам удалось получить первую информацию о структуре рДНК представителя одного из древнейших отрядов класса Insecta, В. germanica. Кроме того, нами получены оценки внутривидовой изменчивости кластера рибосомных генов у названного вида и межвидовой вариабельности в отряде Blattoptera.

В процессе данного исследования нами впервые амплифицирован протяженный фрагмент кластера рДНК В. germanica, размером 2737 п.о. Анализ нукпеотидной последовательности амплифицированного фрагмента, проведенный путем сравнения ее с последовательностями, помещенными в базы данных EMBL и GENBANK, позволил определить структурные элементы кластера рДНК, входящие в состав исследуемой последовательности. Было установлено, что она содержит внутренний транскрибируемый спейсер (ITS1 - 661 п.н., ITS2 - 464 п.н.), 5,8S рРНК ген (142 п.н.), фрагменты генов рРНК, гомологичные 18S и 28S рРНК генам насекомых (3-район 188-подобного рРНК гена размером 188 п.н. и 5'-конец 28Б-подобного рРНК гена размером 1282 п.н.). Таким образом, амплифицированная последовательность включает в себя сложный по структуре центральный район кластера рибосомных генов исследуемого вида.

Проведенный дальнейший анализ рДНК рыжего таракана методом ПДРФ позволил установить, что амплифицированный фрагмент входит в состав еще более протяженного в районе 18S рРНК гена высококонсервативного участка кластера. Нам удалось локализовать район, обуславливающий вариабельность повторяющихся единиц кластера рибосомных генов. Он довольно обширен и охватывает 5' участок 18S рРНК гена, ограниченный Hindlll сайтом, межгенный спейсер (IGS) и, возможно, 3' район 28S рРНК гена до Hindlll сайта. Поскольку, как уже отмечалось, последовательности, кодирующие рРНК, обладают значительным консерватизмом в пределах вида, полагаем, что выявленная нами изменчивость может быть вызвана вариабельностью нетранскрибируемого спейсера по числу и/или типу последовательности субповторов. Для получения однозначного ответа на вопрос о конкретной причине изменчивости повторяющихся единиц рДНК по длине у рыжего таракана необходимо провести в будущем дополнительные исследования.

Нами впервые методом ПДРФ получено подтверждение локализации рДНК на Х-хромосоме у В. germanica, что ранее было показано методом гибридизаци in situ (Cave, 1976). Анализ индивидуального скрещивания не выявил в первом поколении особей с рекомбинантными типами структуры рДНК. Возможно, этот факт является отражением низкой частоты рекомбинации между ядрышковыми организаторами гомологичных Ххромосом. Анализ большего числа индивидуальных скрещиваний в дальнейшем может позволить определить частоту кроссинговера в этом районе у В. germanica.

Анализ внутривидовой изменчивости района рДНК рыжего таракана, ограниченного Hindlll сайтами в 18S- и 28S- подобных генах, показал, что лабораторные линии находятся друг от друга на большом генетическом расстоянии и значительно обособлены от группы, состоящей из выборок природных популяций. По сравнению с природными популяциями лабораторные линии обладают меньшим генетическим разнообразием рДНК, проявляющемся как в спектре выявленных фрагментов, так и в частотах одинаковых типов фрагментов. Во всех природных популяциях максимальные частоты распространения имеют одни и те же два типа кластера, а для каждой лабораторной линии эти типы индивидуальны. Это может свидетельствовать о различной адаптивной ценности упомянутых типов кластера рДНК, а также о различиях в действии генетико-автоматических процессов в естественных и лабораторных условиях.

Нами показано, что характер выявленного в природных популяциях полиморфизма рДНК не позволяет четко их дифференцировать, несмотря на географическую удаленность исследованных популяций (от 700 до 2900 км) и принадлежность к разным климатическим зонам. Полученный результат может быть связан с высокой степенью синантропности В. germanica и высоким уровнем миграции между исследованными популяциями, а также с низким мутационным грузом, характерным для данного вида. О слабой дифференциации природных популяций В. germanica свидетельствуют результаты других исследователей, использовавших методы RAPD анализа и полиморфизма белков. Так, единственные на данный момент времени исследования популяционно-генетической структуры по комплексу признаков двух городских популяций В. germanica из Франции, показали, что из 41 белкового локуса и 60 RAPD-маркеров, только 8 локусов и 10 маркеров обнаруживают полиморфизм, причем он не позволяет дифференцировать популяции (Cloarec et al., 1999; Jobet et al., 2000). Полагаем, что эти данные вместе с результатами наших исследований отражают присущую исследуемому виду неярко выраженную популяционную дифференциацию. Тем не менее, для однозначной трактовки всех имеющихся на данный момент результатов, считаем необходимым проведение более масштабных популяционных исследований, охватывающих разные континенты.

В проведенном нами исследовании оценена межвидовая изменчивость рДНК в отряде Blattoptera на примере шести видов, включая В. germanica. Полученные данные представляют собой первые сведения об изменчивости ядерной рДНК в названном отряде. Как свидетельствуют результаты, межвидовая изменчивость рДНК в отряде Blattoptera, оцененная методом ПДРФ с использованием набора из трех рестриктаз и двух зондов, довольно значительная. По отдельным рестриктазам между видами наблюдаются различные уровни связи: полное совпадение паттернов рестрикции, наличие одного или нескольких общих фрагментов, либо полное отсутствие сходства. Филогенетическое дерево, построенное на основе полученных результатов, совпадает с традиционными классификациями, основанными на морфо-анатомических и физиологических признаках (McKittrick, 1964), а также с результатами сравнительного анализа первичной последовательности фрагментов рибосомных генов митохондрий тараканов (Kambhampati, 1995). Отметим, что в отличие от других исследователей, мы впервые применили маркер ядерной ДНК (рДНК) для описания филогенетических связей в отряде Blattoptera. Полагаем, что привлечение молекулярных маркеров, в том числе и апробированного в данной работе, в сочетании с традиционными морфологическими признаками, позволит уточнить существующие классификации тараканов. Это является актуальным для данного таксона, включающего около 4000 видов, особенно учитывая неоднозначность современных классификаций отряда Blattoptera (McKittrick, 1964; Rehn, 1951; Princis, 1960; Huber, 1974).

Таким образом, данная работа явилась первым этапом в исследовании структуры рДНК В. germanica, ее внутривидовой изменчивости, а также в определении перспектив использования полиморфизма структуры рДНК в филогенетических исследованиях.

Дополнение списка насекомых, чья рДНК исследована или исследуется, еще одним видом - В. germanica, расширит представления об изменчивости рДНК в пределах одного из наиболее многочисленных классов животных. Кроме того, высокие адаптивные способности рыжего таракана могут быть связаны в том числе и с особенностями строения и функционирования кластера рибосомных генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лазебная, Ирина Викторовна, Москва

1. Алешин В.В., Владыченская Н.С., Кедрова О.С., Милютина И.Л., Петров Н.Б. Сравнение генов 18S рибосомной РНК в филогении беспозвоночных//Мол. Биология. 1995. Т. 29. №6. С. 1408-1426.

2. Алешо Н.А. Биологическое обоснование разработки и использования пищевых токсических приманок в системе интегрированной борьбы с синантропными тараканами: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1992.

3. Бей-Биенко Г.Г. Низшие, древнекрылые, с неполным превращением // Определитель насекомых европейской части СССР. 1964. Т.1. М.-Л.: Наука.

4. Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В., Баранова В.А. Популяционный анализ активности ядрышкового организатора у растений Vicia cracca // Генетика. 1987. Т. 33. №2. С. 317-324.

5. Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В. Цитогенетический анализ популяций Vicia cracca в зоне действия линии высокого напряжения // Экология. 1988. №6. С. 20-24.

6. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. Биометрия // Ред. Тихомирова М.М. Л.: Изд. Ленинград. Универ. 1982. 264 с.

7. Захаров И.А., Муха Д.В., Сидоренко А.П., Созинов А.А. Патент2113481 на изобретение "Способ исследования структурно-функциональной организации ДНК рибосомного кластера эукариот" // Российское агенство по патентам и товарным знакам. 1998.

8. Кусакин О.Г., Дроздов A.JI. Филема органического мира. Ч. 1. Пролегомены к построению филемы II 1994. С.-П.: Наука. 282 с.

9. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные, цитологические и климатические аспекты // Цитология. 1992. Т. 34. №10. С. 3-25.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // 1984. М.: Мир. 479 с.

11. Мирошниченко Г.П., Партии В.А. Использование полинуклеотидных последовательностей ДНК для изучения внутривидовой изменчивости у высших эукариот//Успехи совр. биологии. 1991. Т. 111. С. 323-338.

12. Муха Д.В., Сидоренко А.П., Хомякова Е.Б., Петрова Н.В., Марченко Г.Н. Оптимизация методов выделения высокомолекулярной ДНК Tetrahymena // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. №1. С. 172-174.

13. Муха Д.В., Сидоренко А.П. Выявление и анализ доменов последовательности 26S рибосомной ДНК Tetrahimena pyriformis, различающихся по степени эволюционного консерватизма // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. №3. С. 529-537.

14. Муха Д.В., Сидоренко А.П., Марченко Г.Н. Клонирование протяженной палиндромной последовательности рибосомной ДНК Tetrahymenapyriformis // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. №4. С. 824-829.

15. Муха Д.В., Сидоренко А.П. Выявление высококонсервативных доменов в последовательности 17S рибосомной ДНК Tetrahimena pyriformis II Генетика. 1996. Т. 32. №11. С. 1494-1497.

16. Муха Д.В., Вигманн Б.М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомных генов в процессе эволюции тараканов рода Blattella//Докл. РАН. 1999. Т. 364. С. 134-139.

17. Сидоренко А.П., Муха Д.В., Королев A.JI., Созинов А.А. Анализ внутривидовой вариабельности структуры кластера рибосомальных генов гороха посевного (.Pisum sativum L.) II Генетика. 1997. Т. 33. №6. С. 826-831.

18. Сидоренко А.П., Муха Д.В., Королев А.Л., Созинов А.А. Структурный полиморфизм кластера рибосомальных генов растений и перспектива его использования // Цитология и генетика. 1998. Т. 32. №4. С. 97-104.

19. Фролов С.В. Ядрышкообразующие районы хромосом как маркер популяций симы Oncorhynchus masou (Brevoort) II Генетика. 1995. Т. 31. №6. С. 833-838.

20. Abe Н., Aoyama М. In vitro culture of Gregarina blattarum II Bull. Fac. Educ., Yamaguchi Univ. 1979. V. 29. P. 1-9.

21. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

22. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searchingmolecular sequence databases // Nature Genetics. 1994. V. 6. P. 119-129.

23. Appels R., Dvorak J. The wheat ribosomal DNA spacer region: its structure and variation in populations and among species // Theor. Appl. Genet. 1982. V. 63. P. 337-348.

24. Archbold E.F., Rust M.K., Reierson D.A., Atkinson K.D. Characterization of a yeast infection in the german cockroach {Dictyoptera: Blattellidae) H Environ. Entomol. 1986. V. 15. P. 221-226.

25. Archbold E.F. Rust M.K., Reierson D.A. Comparative life histories of fungus infected and uninfected German cockroaches, Blattella germanica (L.) {Dictyoptera: Blattellidae) I I Asm. Ent. S.A. 1987. V. 80. P. 571-577.

26. Arnheim N. Concerted evolution of multigene femilies // In: Evolution of Genes and Proteins / Ed. Nei M., Koehn R.K. 1983. Sinauer, Boston.

27. Arnheim N., Krystal M., Schmickel R., Wilson G., Ryder O., Zimmer E. Molecular evidence for genetic exchenges among ribosomal genes on non gomologous chromosomes in man and apes // Proc. Natl. Sci. USA. 1980a. V. 77. N. 12. P. 7323-7327.

28. Beck J.J., Ligon J.M. Polymerase chain reaction assays for the detection of Stagonospora nodorum and Septoria tritici in wheat 11 Phytopathology. 1995. V. 85. P. 319-324.

29. Beckingham K. The ribosomal DNA of Calliphora erythrocephala. The cistron classes of total genomic DNA // J. Mol. Biol. 1981. V. 149. P. 141169.

30. Beckingham К. Insect rDNA // In: The Cell Nucleus. V. X. / Ed. Busch H., Kethblum L. 1975. P. 205-269.

31. Beebe N.W., Saul A. Descrimination of all members of the Anopheles punctulatus complex by polymerase chain reactin fragment length polimorphism // Am. J. Tropic. Medic. Hygiene. 1995. V. 53. P. 478-481.

32. Besse P., Lebrun P., Seguin M., Lanaud C. Ribosomal DNA variations in wild and cultivated rubber tree (Hevea brasiliensis) // Genome. 1993. V. 36. P. 1049-1057.

33. Birnstiel M.L., Wallace H., Sirlin J.L., Fischberg M. Localization of the ribosomal DNA complements in the nucleolar organizer region of Xenopus laevis //Natl. Cancer Inst. Monogr. 1966. V. 23. P. 431-447.

34. Botstein D, White R.L. Skolmick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lengh polymorphism.// Am. J. Hum. Genet. 1980. V. 32. P. 314-331.

35. Boudreaux H.B. Artropod phylogeny with special reference to insects. // NY: John Wiley and Sons. 1979.

36. Brauner S., Crawford D.J., Stuessy T.F. Ribosomal DNA and RAPD variation in the rare plant family Lactoridaceae // American. J. Botany. 1992. V. 79. P. 1436-1439.

37. Brown A.H.D. Genetic characterization of plant mating systems // In: Plant population genetics, breeding and genetic resources / Ed. Brown A.H.D., Clegg M.T., Kahler A.L., Weir B.S. 1990. Sunderland: Sinauer Associares. P.145.162.

38. Bret B.L., Ross M.H. Insecticide-induced dispersal in the German cockroach, Blattella germanica (L.) (Ortoptera: Blattellidae) // J. Econ. Ent. 1985. V. 78. P. 1293-1298.

39. Bret B.L., Ross M.H. Behavioral responses of German cockroach, Blattella germanica (L.) (Ortoptera: Blattellidae), to propoxur formulation // J. Econ. Ent. 1986. V. 79. P. 426-430.

40. Bross K., Krone W. On the number of ribosomal RNA genes in man // Humangenetik. 1972. V. 14. P. 137-141.

41. Carlson D.A., Brenner R.J. Hydrocarbon-based discrimination of three North American Blattella cockroach species (Orthoptera: Blattellidae) using gas chromatography//Ann. Ent. SA. 1988. V. 81. P. 711-723.

42. Cave M.D. Absence of rDNA amplification in the uninucleolate oocyte of the cockroach Blattella germanica (Oorthoptera: Blattidae) // J. Cell Biol. 1976. V. 71. P. 49-58.

43. Chattopadhyay S.K., Kohne D.E., Dutta S.K. Ribosomal RNA genes of Neurospora: isolation and characterization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 3256-3259.

44. Cloarec A., Rivault C., Cariou M.L. Genetic popualtion structure of the german cockroach, Blattella germanica-. Absence of geographical variation // Entomologia Experimentalis et Applicata. 1999. V. 92. P. 311-319.

45. Coen E.S., Dover G.A. Unequal exchanges and the coevolution of X and YrDNA arrays in Drosophila melanogaster // Cell. 1983. V. 33. P. 849-855.

46. Coen E.S., Thoday J.M., Dover G.A. Rate of turnover of the structural variants in the rDNA gene family of Drosophila melanogaster II Nature. 1982. V. 295. P. 564-568.

47. Cluster P.D., Marinkovic D., Allard R.W., Ayala F.J. Correlation between developmental rates, enzyme activities, ribosomal DNA spacer-length phenotypes and adaptation in Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84, P. 610-614.

48. Cluster P.D., Allard R.W. Evolution of ribosomal DNA (rDNA). Genetic structure in colonial Californian populations of Avena barbata // Genetics. 1995. V. 139. P. 941-954.

49. Cochran D.G., Ross M.H. Cockroach genetics // In: Genetics of insect: vectores of disease / Ed. Wright J.W., Pol R. Amsterdam: Elsevier. 1967a. P. 403-415.

50. Cochran D.G., Ross M.H. Preliminary studies of the chromosomes of twelve cockroach species (Blattaria: Blattidae, Blatellidae, Blaberidae) // Ann. Entomol. Am. 19676. V. 60. P. 1265-1272.

51. Cochran D.G., Ross M.H. Chromosome identification in the German cockroach // J. Hered. 1969. V. 60. P. 87-92.

52. Cochran D. G., Ross M.H. Preliminary studies of the chromosomes of twelve cockroach species (Blattaria: Blattidae, Blatellidae, Blaberidae) // Ann. Entomol. Soc. Am. 1976. V.60. P. 1265-1272.

53. Cockburn A.F., Newkirk M.J., Firtel R.A. Organization of the ribosomal RNA genes of Dictyostelium discoideum: mapping of the nontranscribed spacer regions // Cell. 1976. V. 9. P. 605-613.

54. Cockburn A.F.; Taylor W.C.; Firtel R.A. Dictyostelium rDNA consists of nonchromosomal palindromic dimers containing 5S and 36S coding regions // Chromosoma. 1978. V. 70. P. 19-29.

55. Cohen S., Roth L.M. Chromosome numbers of the Blattaria // Ann. Entomol. Soc. Am. 1970. V. 63. P. 1520-1547.

56. Cormean D., Kimsey L.S., Berbee M.L. 18S rDNA sequences and the homometabolous insects // Molec. Phylog. Evol. 1992. V. 1. P. 270-278.

57. Cornwell P.B. The cockroach. Vol. I. A laboratory insect and an industrial pest // 1968. London: Hutchinson and Co.

58. Craig G.B., Hickey W.A. Genetics of Aedes aegypti И In: Genetics of Insect Vectors of Disease / Ed. Wrihht J.W., Pal R. 1967. Amsterdam: Elsevier. P. 67-131.

59. Crease T.J. Ribosomal DNA evolution at the population level nucleotide variation in intergenic spacer arrays of Daphnia pulex H Genetics. 1995. V. 141. P. 1327-1337.

60. Cullis C.A. Quantitative variation ribosomal RNA gene sin flax genotrophs // Heredity. 1979. V. 42. P. 237-246.

61. Cutler M.G., Bartlett S.E., Hartley S.E., Davidson W.S. A polimorphism in the ribosomal RNA genes distinguishes Atlantic salmos (Salmo salar) from

62. North America and Europe I I Can. J. Fish. Aquat. Sci.Vol. 1991. V. 48. P. 1655-1661.

63. Degelmann A., Royer H.D., Hollenberg C.P. The organization of the ribosomal RNA genes of Chironomus tentans and some closely related species // Chromosoma. 1979. V. 71. P. 263-281.

64. Demerida M.M.P., Demata M.P., Molina E., Porter C.H., Black W.C. Variation in ribosomal DNA intergenic spacers among populations of Anopheles albimanus in South and Central America // Am. J. Tropic. Medicin Hygiene. 1995. V. 53. P. 469-477.

65. Denzer D.J., Fuchs M.E.A., Stein G. Zum Verhalten von Blattella germanica L.: Aktionsradius und Refugientreue. Behavioural studies on Blattella germanica L.: radius of action and loyality to the refuge. // J. Appl. Ent. 19886. V. 105. P. 330-334.

66. Doerschung E.B., Miksche J.P., Palmer K.G. DNA content, ribosomal RNA gene number and protein content in soybeans // Can. J. Genet, and Cytol. 1978. V. 20. P. 531-538.

67. Dover G. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. 1982. V. 9. P. 111-117.

68. Doyle J.J., Beachy R.N. Ribosomal gene variation in soybean (Glycine) and its relatives // Theor. Appl. Genet. 1985. V. 70. P. 369-376.

69. Ellis T.H.N., Davies D.R., Castleton J.A., Bedford I.D. The organization and genetics of rDNA length variants in peas // Chromosoma (Berl.). 1984. V. 91. P. 74-81.

70. Engberg J., Andersson P., Leick V., Collins J. Free ribosomal DNA molecules from Tetrahymena pyriformis GL are giant palindromes // J. Mol. Biol. 1976. V. 104. P. 455-470.

71. Fan H., Yakura K., Miyanishi M., Sugita M., Sugiura M. In vitro transcription of plant RNA polymerase I dependent ribosomal RNA genes is species specific // Plant J. 1995. V. 8. P. 295-298.

72. Findly R.C.; Gall J.G. Free ribosomal RNA genes in Paramecium are tandemly repeated // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 3312-3316.

73. Gall L.G., Yao M.C., Blackburn E., Findly R.C., Wild M. The extrachromosomal ribosomal DNA of Tetrahymena and Paramecium // In: Specific eukariotic genes / Ed. Engberg J., et al. 1979. Copenhagen: Munksgaard. P. 299-305.

74. Gasser R.B., Chilton N.B. Characterization of Taeniid cestode species by PCR-RFLP of ITS 2 ribosomal DNA // Acta Tropica. 1995. V. 59. P. 31-40.

75. Gerbi S.A. Evolution of ribosomal DNA // Molecular evolutionary genetics / Ed. Maclntyre R.J. New York: Plenum Press. 1985. P.419-517.

76. Good P. Permutation tests // 1993. Springer Verlag, New York.

77. Gosden J., Lawrie S., Seuanez H. Ribosomal and human-homologous repeated DNA distribution in the orangutan (Pondo pygmaeus). Comparison with distribution of these DNAs in the other species of the Hominidae // Cell Genet. 1978. V. 21. P. 1-10.

78. Gould G.E., Deay H.O. The biology of six species of cockroaches which inhabit buildings //Purdue Univ. Agr. Exp. Stat. Bull. 1940. V. 451. P. 31.

79. Gubler U., Wyler Т., Braun R. The gene for the 26 S rRNA in Physarum contains two insertions // FEBS Lett. 1979. V. 100. P. 347-350.

80. Guiyoule A., Grimont F., Iteman I., Grimont P.A.D., Lefevre M., Carniel E. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains // J. Clinic. Microbiol. 1994. V. 32. P. 634-641.

81. Guthrie D.M., Tindall A.R. The biology of the cockroach // 1968. London: Edward Arnold (Publishers) Ltd., NY: St. Martin's Press.

82. Halanych K.M. Testing hypotheses of Chaetognath: long branches revealed by 18 ribosomal DNA // Systematic Biology. 1996. V. 45. P. 223-246.

83. Harmon J. D., Ross M.H. Effects of propoxur exposure on females of the German cockroach, Blattella germanica, and their oothecae // Ent. Exp. App. 1987. V. 44 P. 269-275.

84. Harmon J. D., Ross M.H. Effects of malathion and diazinon exposure on female German cockroach (Dictyotera: Blattellidae) and their oothecae // Рос. Ent. Soc. Wash. 1988. V. 90 P. 248-255.

85. Hilliker A.J., Appels R., Schalet A. The genetic analisis of Drosophila melanogaster heterochromatin // Gene. 1980. V. 21. P. 607-619.

86. Hillis D.M., Davis S.K. Evolution of ribosomal DNA: fifty million years of recorded history in the frog genus Rana // Evolution. 1986. V. 40. P. 12751288.

87. Hollenberg C.P. Proportionate representation of rDNA and Balbiani ring DNA in polytene chromosomes of Chironomus tentans I I Chromosoma. 1976. V. 57. P. 185-197.

88. Huber I. Taxonomic and ontogenic studies of cockroaches (Blattaria) // Univ. Kansas Sci. Bull. 1974. V. 50. P. 233-332.

89. Izutsu M., Veda S., Ishii S. Aggregation effects on the growth of the German cockroach, Blattella germanica (L.) (Ortoptera: Blattellidae) // Appl. Ent. Zo. 1970. V. 5. P. 159-171.

90. Jakubczak J.L., Xiong Y., Eickbush Т.Н. Type I (RI) and Type II (R2) ribosomal DNA insertions of Drosophila melanogaster are retrotransposable elements closely related to those of Bombyx mori 11 J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 37-52.

91. Kambhampati S. A phylogeny of cockroaches and related insects based on

92. DNA sequence of mitochondrial ribosomal RNA genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 2017-2020.

93. Kambhampati S. Phylogenetic relationship among cockroach families inferred from mitochondrial 12S rRNA gene sequence // Syst. Ent. 1996. V. 21. P. 8998.

94. Kano Y., Maeda S., Sugiyama T. The location of ribosomal cistrons (rDNA) in chromosomes of the rat // Chromosoma. 1976. V. 55. P. 37-42.

95. Karvonen P., Karjalainen M., Savolainen O. Ribosomal RNA genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.): chromosomal organization and structure // Genetica. 1993. V. 88. P. 59-68.

96. Kavanagh T.A., Timmis J.N. Heterogeneity in cucumber ribosomal DNA // Theor. Appl. Genet. 1986. V. 72, P. 337-345.

97. Keil C.B., Ross M.H. An analysis of embryonic trapping in the German cockroach // Ent. Exp. App. 1977. V. 22. P. 220-226.

98. Kiefer B.I. Dosage regulation of ribosomal DNA in Drosophila melanogaster //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 61. P. 85-89.

99. Kim S.C., Crawford D.J., Francisco-Ortega J., Santos-Querra A. A common origin for woody Sonchus and five related genera in the Macaronesian islands: molecular evidence for extensive radiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7743-7748.

100. Komiyama M., Ogata K. Observations of density effects on the German cockroaches, Blattella germanica (L.) // Jpn. J. Sanit. Zool. 1977. V. 28. P.409.415.

101. Kunz W., Petersen G., Renkawitz-Pohl R., Glatzer K.H., Schafer M. Distribution of spacer length classes and the intervening sequence among different nucleolus organizers in Drosophila hydei // Chromosoma. 1981. V. 83. P. 145-158.

102. Lathe W.C., Eickbush Т.Н. A single lineage of R2 retrotransposable elements is an active, evolutionarily stable component of the Drosophila rDNA locus // Molec. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 1232-1241.

103. Lee I.M., Hammond R.W., Davis R.E., Gundersen D.E. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms //Phytopathology. 1993. V. 83. P. 834-842.

104. Lin D.M., Wu L.C., Rinald M.Q., Lehmann P.E. 3 distinct genotypes within Candida parapsilosis from clinical sources. // J. Clinic. Microbiol. 1995. V. 33. P. 1815-1821.

105. Li J., Chakraborty R., A bias-corrected estimate of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. P. 11121114.

106. Long E.O., Dawid I.B. Repeated genes in eukariotes // Annu. Rev. Biochem.1980. V. 49. P.727-764.

107. Long E.O., Collins M., Kiefer B.I., David I.B. Expression of ribosomal insertions in bobbed mutants of Drosophila melanogaster II Mol. Gen. Genet.1981. V. 182. P. 377-384.

108. Macgregor H., Sherwood S. The nucleolus organizers of Plethodon and Aneides located by in situ nucleic acid hubridization with Xenopus 3H-ribosomal RNA// Chromosoma. 1979. V. 72. P. 271-80.

109. McKittrick F.A. Evolutionary studies of cockroaches // Cornell Univ. Agricult. Experiment Station Memoir. 1964. V. 389. P. 1-197.

110. Mandal R.K., Dawid I.B. The nucleotide sequence at the transcription termination site of ribosomal RNA in Drosophila melanogaster // Nucleic. Acids. Res. 1981. V. 9. P. 1801-1811.

111. Manning R.F., Samols D.R., Gage L.P. The genes for 18S, 5.8S and 28S ribosomal RNA of Bombyx mori are organized into tandem repeats of uniform length// Gene. 1978. V. 4. P. 153-166.

112. Metzger R., Trier K.-H. Zur Bedeutung der Aggregationspheromone von

113. Blattella germanica und Blatta orientalis // Z. Angew. Parasit. 1975. V. 16. P. 16-27.

114. Miller L., Brown D.D. Variation in the activity of nucleolar organizers and their ribosomal gene content // Chromosoma. 1969. V. 28. P. 430-444.

115. Miller L., Gurdon J.B. Mutations affecting the size of the nucleolus in Xenopus laevis //Nature. 1970. V. 227. P. 1108-1110.

116. Molgaard H.V., Matthews H.R., Bradbury EM Organisation of genes for ribosomal RNA in Physarum polycephalum // Eur. J. Biochem. 1976. V. 68 P. 541-549.

117. Musters W., Boon K., van der Sande C.A.F.M., van Heerikhuizen H., Planta R.J. Functional analysis of transcribed spacers of yeast ribosomal DNA // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3989-3996.

118. Nei M. Genetic distance between populations // Am. Nat. 1972. V. 106. P. 283-292.

119. Nei M., Li V. Mathematical model for studing genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 52695273.

120. Nevo E., Beiles A. Ribosomal DNA non-transcribed spacer polymorphism in subterranean mole rats: genetic differentiation, environmental correlates and phylogenetic relationships//Evolut. Ecol. 1988. V. 2. P. 139-156.

121. Nickrent D.L., Schuette K.P., Starr E.M. A molecular phylogeny of Arceuthobium (Viscaceae) based on nuclear ribosomal DNA internaltranscribed spacer sequences // American Journal of Botany. 1994. V. 81. P. 1149-1160.

122. Di Nocera P.P., Graziani F., Lavorgna G. Genomic and structural organization of Drosophila melanogaster G elements I I Nucl. Acids Res., 1986. V. 14. P. 675-691.

123. Pardue M.L., Gall J.G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 64. P. 600-604.

124. Pearson W.R. Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA // Meth. Enzymol. 1990. V. 183. P. 63-98.

125. Petes T.D. Meiotic mapping of yeast ribosomal deoxyribonucleic acid on chromosome XII // J. Bacteriol. 1979a. V. 138. P. 185-192.

126. Petes T.D. Yeast ribosomal DNA genes are located on chromosome XII // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 19796. V. 76. P. 410-414.

127. Phillips R.B., Hartley S.E. Fluorescent banding patterns in the chromosomesof the genus Salmo // Genom. 1988. V. 30. P. 193-197.

128. Phillips R.B., Kapuscinski A.R. High frequency of translocation heterozygotes in odd stocks of salmon {Oncorhynchus gorbucha) // Cytogenet. Cell Genet. 1988. V. 48. P. 178-182.

129. Phillips R.B., Pleyte K.A., Hartley S.E. Stock-specific differences in the number and chromosome position of the nucleolar organizer regions in arctic char (Salvelinus alpinus) II Cytogenet. Cell Genet. 1988. V. 48. P. 9-12.

130. Phillips R.B., Zajicek K.D., Ihssen P.E. Population differences in chromosome-banding polymorphism in lake trout // Trans. Am. Fish. Soc. 1989. V. 118. P. 64-73.

131. Pleyte K.A., Phillips R.B., Hartley S.E. A band chromosomal polimorphisms in Arctic char (Salvelinus alpinus) II Genom. 1989. V. 32. P. 129-133.

132. Polanco C., Perez de la Vega M. Intergenic ribosomal spacer variability in hexaploid oat cultivars and landraces // Heredity. 1997. V. 78. P. 115-123.

133. Princis K. Zur Systematik der Blattarien // Eos. 1960. V. 36. P. 427-449.

134. Princis K. Orthopterorum catalogus // In: Blattariae / Ed. Beier M. Gravenhage: Junk (Germ.). 1969. P. 6-8.

135. Rae P.M., Steele R.E. Absence of cytosine methylation at C-C-G-G and G-C-G-C sites in the rDNA coding regions and intervening sequences of Drosophila and the rDNA of other insects // Nucleic. Acids. Res. 1979. V. 6. P. 2987-2995.

136. Rae P.M., Barnett Т., Murtif V.L. Nontranscribed spacers in Drosophilaribosomal DNA// Chromosoma. 1981. V. 82. P. 637-655.

137. Raina S.N., Ogihara Y. Ribosomal DNA repeat unit polymorphism in 49 Vicia species // Theor. Appl. Genet. 1995. V. 90. P. 477-486.

138. Rehn J.A.G. Man's uninvited fellow traveller the cockroach // Sci. Monthly. 1945. V. 61. P. 265-276.

139. Rehn J.W.H. Classification of the Blattaria as indicated by their wings (Orthoptera) // Am. Ent. Soc. Mem. 1951. V. 14. P. 1-134.

140. Rehner S.A., Uecker F.A. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer phylogeny and host diversity in the Coelomycete phomopsis II Can. J. Botany. 1994. V. 72. P. 1666-1674.

141. Renkawitz-Pohl R., Gerbi S.A., Glatzer K.H. Ribosomal DNA of fly Sciara coprophila has a very small and homogeneous repeat unit 11 Mol. Gen. Genet. 1979. V. 173. P. 1-13.

142. Renkawitz-Pohl R., Glatzer K.H., Kunz W. Characterization of cloned ribosomal DNA from Drosophila hydei II Nucleic. Acids. Res. 1980. V. 8. P. 4593-4611.

143. Ritossa F.M., Scala G. Equilibrium variations in the redundancy of rDNA in Drosophila melamogaster II Genetics. 1969. V. 61. P. 305-317.

144. Rogstad S.H., Pelikan S. GELSTATS: a computer program for population genetics analyses using VNTR multilocus probe data // Biotechniques. 1996. V. 21. P. 1128-1131.

145. Roiha H., Glover D.M. Duplicated rDNA sequences of variable lengthsflanking the short tipe I insertions in the rDNA of Drosophila melanogaster II Nucl. Acids Res. 1981. V. 9. P. 5521-5532.

146. Rohlf F.J. Numerical taxonomy and multivariate analysis system (NTSYS-pc) // 1997. Ver. 1.80. Applied Biostatistics Inc. NY.

147. Ross M.H. Three-point data for linkage group VI of the German cockroach // Ann. Entomol. Soc. Am. 1971. V. 64. P. 1178-1180.

148. Ross M.H. Genetic variability in the German cockroach. VIII. Studies of deformed-leg and broad-banded pronotum // J. Hered. 1972. V. 63. P. 26-32.

149. Ross M.H. Additional data for linkage group X of the German cockroach // J. Hered. 1973. V. 64. P. 44-45.

150. Ross M.H. Laboratory population studies of the German cockroach using a two-chromosome and a three-chromosome reciprocal translocation // Ann. Ent. S.A. 1976. V. 69. P. 1073-1081.

151. Ross M.H. A strain difference and ablation experiments involving a dispersal pheromone in the German cockroaches: Blattella germanica (Dictyotera: Blattellidae) // J. Entom. Sci. 1989. V. 24. P. 101-106.

152. Ross M.H. Differencis in the response of the German cockroach (Dictyotera: Blattellidae) fieldstrains to vapors of pyrethroid formulations // J. Econ. Ent. 1992. V. 85. P. 123-129.

153. Ross M.H., Cochran D.G. A body color mutation in the German cockroach // Nature (Lond.). 1962. V. 195. P. 518-519.

154. Ross M.H., Cochran D.G. A preliminary report on genetic variability in the

155. German cockroach, Blattella germanica II Ann. Entomol. Soc. Am. 1965. V. 58. P. 468-375.

156. Ross M.H., Cochran D.G. Genetic variability in the German cockroach. I. Additional genetic data and the establishment of tentative linkage groups // J. Hered. 1966. V. 57. P. 221-226.

157. Ross M.H., Cochran D.G. Genetic variability in the cockroach. VI. Studies of fused-antennae, crossveinless and downturned-wing // J. Hered. 1970. V. 61. P. 123-128.

158. Ross M.H., Cochran D.G. German cockroach genetics and its possible use in control measures // Patna J. Med. 1973. V. 47. P. 325-337.

159. Ross M.H., Cochran D.G. The German cockroaches, Blattella germanica // In Handbook of Genetics /. Ed. King R.C. NY: Plenum Press. 1975. V. 3. P. 3562.

160. Ross M.H., Cochran D.G. Strain differences in the response of German cockroach (Dictyotera: Blattellidae) to emulsifiable concentrates // J.Econ. Ent. 1992. V. 85. P. 1201-1208.

161. Ross M.H., Liu H. Hybridization studies on Blattella germanica and B. asahinai (Dictyoptera: Blattellidae): chiasma frequency and distribution // Ann. Entomol. Am. 1995. V. 88. P. 215-219.

162. Ross M.H., Mullins D.E. Biology // In: Understanding and Controlling the German Cockroach / Eds. Rust M.K., Owens J.M., Reierson D.A. 1995. Oxford Univ. Press. P. 21-47.

163. Ross M.H., Bret B.L., Keil C.B. Population growth and behavior of Blattella germanica (L.) in experimentally established shipboard infestations // Ann. Ent. S.A. 1984. V. 77. P. 740-752.

164. Roth L.M. Evolution and taxonomic significance of reproduction in Blattaria // Ann. R. Entom. 1970. V. 15. P. 75-96.

165. Roth L.M. A taxonomic revision of the genus Blattella Caudell (Dictyoptera, Blattaria: Blattellidae) //Entomol. Scand. Suppl. 1985. V. 22. P. 1-221.

166. Roth L.M., Willis E.R. The biotic associations of cockroaches // Smith. Inst. Misc. Coll. 1960. V. 141. P. 1-470.

167. Sakuma M., Fukami H. The aggregation pheromone of the German cockroach, Blattella germanica (L.) (Dictyotera: Blattellidae): isolation and identification of the attractant components of the pheromone. // Appl. Ent. Zo. 1990. V. 25. P. 355-368.

168. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual // N.Y.: Cold Spring Harbor Univ. Press. 1989. V. 1-3. 1626 p.

169. Schafer M., Wyman A.R., White R. Length variation in the non-transcribed spacer of Calliphora erythrocephala ribosomal DNA is due to a 350 base-pair repeat // J. Mol. Biol. 1981. V. 146. P. 179-199.

170. Schlotterer C., Hauser M.T., von Haeseler A., Tautz D. Comparative evolutionary analysis of rDNA ITS region in Drosophila // Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 513-522.

171. Schmidtke J., Zenzes M.T., Weiler C., Bross K., Engel W. Gene action in fish of tetraploid origin. IV. Ribosomal DNA amount in clupeoid and salmonoid fish//Biochem. Genet. 1976. V. 14. P. 293-297.

172. Schwarzacher H.C., Wachrler F. Nucleolus organizer regions and nucleoli // Hum. Genet. 1983. V. 63. P. 89-99.

173. Schweizer E, MacKechnie C, Halvorson H.O. The redundancy of ribosomal and transfer RNA genes in Saccharomyces cerevisiae II J. Mol. Biol. 1969. V. 40. P. 261-277.

174. Scudder S.H. Paleosoic cockroaches: A complete revision of the species of both worlds, with an essay toward their classification // Mem. Boston Soc. Nat. Hist. 1879. V. 3.P. 23-134.

175. Silverman J., Bieman D.N. Glucose aversion in the German cockroach, Blattella germanica II J. Insect Phy. 1993. V. 39. P. 925-933.

176. Sinclair J.H., Carroll C.R., Humphrey R.R. Variation in rDNA redundancy level and nucleolar organizer length in normal and variant lines of the Mexican axolotl // J. Cell Sci. 1974. V. 15. P. 239-257.

177. Sollner-Webb В., Туе К., Steitz J. In: Ribosomal RNA: Structure, Evolution, Processing and Function in Protein Synthesis / Ed. Zimmerman R., Dahlberg A. 1995. New York: CRC Press.

178. Sozansky O.A., Zakharov A.F., Terekhov S.M. Intercellular NOR-Ag-variability in man. Search for determining factors, clonal analisis // Hum. Genet. 1985. V. 69. P. 151-156.

179. Spear B.B., Gall J.G. Independent control of ribosomal gene replication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 1359-1363.

180. Stahl G. Genetic population structure of Atlantic salmon // In: Population Genetics and Its Application to Fisheries Management / Eds. Ruman N., Utter F. Seattle: University of Washington Press. WA. 1987. P. 121-140.

181. StatSoft. STATISTIC A for Windows (computer program manual) / 1996. StatSoft, Inc., Tulsa, OK.

182. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O'Brien S. J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 729-743.

183. Stothard J.R., Hughes S., Rollinson D. Variation within the internaltranscribed spacer (ITS) of ribosomal DNA genes of intermediate snail hosts within the genus Bulinus (Gastropoda: Planorbidae) // J. Acta Tropica. 1996. V. 61. P. 19-29.

184. Sturmbauer C., Levinton J.S., Christy J. Molecular philogeny analisis of fiddler crabs: jest of the hypothesis of increasing behavioral complexity in evolution //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 10855-10857.

185. Suzuki H., Tsuchiya K., Sakaizumi M., Wakana S., Sakura S. Evolution of restriction sites of ribosomal DNA in natural populations of the field mouse, Apodemus speciosus II J. Mol. Evol. 1994. V. 38. P. 107-112.

186. Tartof K.D. Regulation of ribosomal RNA genes in Drosophila melanogaster II Genetics. 1971 V. 73. P. 57-71.

187. Tartof K.D. Unequal mitotic sister chromatid exchange as the mechanism of ribosomal RNA gene magnification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 1272-1276.

188. Terracol R., Prud'homme N. Differential elimination of rRNA genes in bobbed mutations of Drosophila melanogaster II Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 1023-1031.

189. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P., Scott N.S. repetitive DNA of grapevine classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 173-180.

190. Thweatt R., Lee. Yeast precursor ribosomal RNA. Molecular cloning and probing the higher-order structure of the internal transcribed spacer I by r/kethoxal and dimethylsulfate modification // J. Mol. Biol. 1990. V. 211. P. 305-320.

191. Tillyard R.J. Kansas Permian insects Pt. 20. The cockroaches, or order Blattaria // Am. J. Sci. 1937. V.34. P. 169-202, 249-276.

192. Titus T.A., Larson A. A molecular philogenetic perspective on the evolutionary radiation of the salamander family Salamandriae // Systematic Biology. 1995. V. 44. P. 125-151.

193. Tsai Y.H. and Cahill, Kevin M. Parasites of the German cockroach (Blattella germanica L.) in New York city // The Journal of Parasitology. 1970. V. 56. P. 375-377.

194. Ueda Т., Ojima Y. Geographic and chromosomal polymorphisms in the iwana (Salvelinus leucomaenis) // Proc. Jpn. Acad. 1983. V. 59B. P. 259-262.

195. Warburton D., Henderson A.S., Atwood K.C. Localization of rDNA and

196. Giemsa-banded chromosome complement of white-hsnded gibbon, Hylobate larll Chromosoma. 1975. V. 51. P. 35-40.

197. Wilbur W.J., Lipman D.J. Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 726-730.

198. Williams S.M., DeSalle R., Strobeck C., 1985. Homogenization of geographical variants at the nontranscribed spacer of rDNA in Drosophila mercatorum II Mol. Biol. Evol. 1985. V. 2. P. 338-346.

199. Williams S.M., Kennison J. A., Robbins L.G., Strobeck C. Reciprocal recombination and evolution of the ribosomal gene family of Drosophila melanogaster 11 Genetics. 1989. V. 122. P. 617-624.

200. Williams S.M., Robbins L.G., Cluster P.D., Allard R.W., Strobeck C. Superstructure of the Drosophila melanogaster ribosomal gene family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 3156-3160.

201. Williams I.G.K., Kubelik A.R., Livar K.I. et al. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl.Acid. Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

202. Willis E.R., Riser G.R., Roth L.M. Observations on reproduction and development in cockroaches // Ann. Ent. S.A. 1958. V. 51. P. 53-69.

203. Wooster M.T., Ross M.H. Subletal responses of the German cockroach to vapors of commercial pesticide formulations // Ent. Exp. App. 1989. V. 52. P. 49-55.

204. Wootton R.J. Paleozoic insects //Ann. R. Entom. 1981. V. 26. P. 319-344.

205. Xiong Y., Eickbush Т.Н. Functoinal expression of a sequence-specific endonuclease encoded by the retrotransposon R2Bm // Cell. 1988. V. 55. P. 235246.

206. Yeh F.C., Yang R.-C. Boyle T. POPGENE VERSION 1.21 // 1997.

Информация о работе

Лазебная, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.15

Диссертация

Анализ вариабельности структуры кластера рибосомных генов рыжего таракана - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно