Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных

Загоскин, Максим Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных"

Загоскин Максим Владимирович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛАСТЕРА РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ РАКООБРАЗНЫХ

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степепи кандидата биологических наук

Москва - 2009

003481485

Диссертационная работа выполнена в Лаборатории генетических основ биоразнообразия Учреждения Российской академии Наук Института Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Муха Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Сулимова Галина Ефимовна

кандидат биологических наук Генинг Леонид Владимирович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук

Институт Биологин Развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится « 26 » ноября 2009 г. в «/v » часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институте Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-1, ул. Губкина, д.З. Факс (499) 132-8962, электронная почта iogen@vigg.ru. адрес в Интернете: www.vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институте Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан «£2. » октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.А. Синелыцякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Ракообразные (Crustacea), в частности планктонные формы, составляющие основную массу зоопланктона, играют чрезвычайно важную роль в морских и пресноводных экологических системах [Монаков, 1976]. Известно, что веслоногие ракообразные (подкласс Copepoda) имеют морское происхождение - представители морской фауны преобладают почти во всех 10 отрядах этого подкласса [Монченко, 2001]. Исключением является отряд циклопообразных копепод (Cyclopoida), преобладающее большинство представителей которого - пресноводные виды. Из трех свободноживущих семейств этого отряда семейство циклопы (Cyclopidae) самое многочисленное -насчитывает 650-670 видов, на его долю приходиться большая часть всех пресноводных видов. Другие два свободноживущих семейства (Oithonidae и Cyclopinidae) представлены исключительно морскими видами [Монченко, 2001].

Таксономия циклопообразных копепод достаточно подробно разработана на основе сравнения морфологических признаков [Gurney, 1933; Рылов, 1948; Dussart, 1969; Монченко, 1974], в тоже время исследователи часто сталкиваются с трудностями систематики циклопообразных вследствие высокого уровня полиморфизма видов пресноводных копепод. Зоологи и гидробиологи отмечают насущную необходимость использования новых методов для таксономических исследований, которые позволят дифференцировать виды-двойники и понять экологическое значение близкородственных видов циклопов [Wyngaard, Chinnappa, 1982, Banaresque, 1974]. Таким образом, становится очевидной актуальность привлечения современных методов молекулярной генетики для оценки филогенетического родства различных видов пресноводных копепод, а также для оценки скорости микроэволюционных процессов у географически изолированных популяций циклопов.

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рибосомной ДНК (рДНК) эукариот может рассматриваться как эффективный подход к определению генетических дистанций между видами и изучению эволюционного процесса [Hwang, Kim, 1999]. Характерной особенностью рДНК является то, что различные структурные элементы данного участка генома эволюционируют с различной скоростью. Наиболее эволюционно консервативны гены рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) - их сравнительный анализ эффективен при сравнении генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами. Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, ITS1 и ITS2) эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при исследовании

филогенетических взаимоотношений между близкородственными видами. К началу наших исследований, относительно мало видов циклопообразных копепод было представлено в базе данных GeneBank, еще меньше оказалось видов, для которых были представлены последовательности рДНК.

Одним из типов генетических маркеров основанных на ПЦР являются ISSR-маркеры (inter simple sequence repeat) [Zietkiewicz et al., 1994]. Однако информация о нуклеотидном составе данного типа последовательностей отсутствует в базе данных GenBank для подавляющего большинства видов. В связи с этим, с нашей точки зрения, актуальный является определение нуклеотидного состава и изучение структуры ISSR последовательностей.

Диминуция хроматина (ДХ) представляет собой процесс программированного удаления части генома из презумптивных соматических клеток в ходе раннего эмбриогенеза некоторых видов животных. В общей сложности насчитывается около 20 видов пресноводных копепод, у которых в онтогенезе встречается ДХ [Beermann, 1959; Einsle, 1962; Beermann, 1959, 1977; Einsle, 1964; Акифьев, 1974; Emsle, 1993; Einsle, 1993, 1996; Chinnappa, 1980; Dorward and Wyngaard, 1997].

Молекулярные механизмы, обеспечивающие процесс диминуции и тип элиминируемой ДНК в настоящее время остаются во многом неизученными, В частности, до начала наших исследований отсутствовали данпые об изменениях в структуре кластера рДНК циклопообразных копепод вызванных диминуцией хроматина.

Очевидно, что для изучения преобразований структуры кластера рДНК в процессе ДХ необходим молекулярный маркер не связанный с рДНК, свидетельствующий о прохождении диминуции хроматина. Для циклопообразпых копепод рапее были выявлены повторяющиеся последовательности, частично удаляющиеся из генома в ходе диминуции хроматина [Degtyarev et al., 2004; Зоткевич и др., 2008; Drouin, 2006], однако удаления последовательностей, которые могли бы служить молекулярным маркером диминуции хроматина, не было показано.

Дели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение структурной организации и эволюционной изменчивости кластера рибосомной ДНК ракообразных семейства Cyclopidae.

В соответствии с целью были обозначены следующие задачи исследования:

1) Определить степень эволюционной изменчивости протяженных фрагментов (-1000 п.н.) 28S гена и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2)

рибосомной РНК 11 видов отряда Cyclopoida. На основании полученных данных построить филогенетические деревья и определить генетические дистанции между представителями изучаемого отряда.

2) Посредством сравнительного анализа полноразмерных копий 5.8S-, 18S- и 28S генов рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) определить степень изменчивости рДНК двух обитающих в сходных экологических нишах близкородственных видов циклопов рода Cyclops (С. insignis и С. kolensis).

3) Для изучения изменений структуры кластера рДНК в процессе диминуции хроматина С. kolensis, на основе сравнительной характеристики межмикросателлитных последовательностей (ISSR), получить молекулярный маркер прохождения диминуции хроматина, не связанный с рДНК.

4) Методом ПЦР в реальном времени (real-time PCR) определить число копий рДНК в геноме С. kolensis до и после диминуции хроматина.

Научная новизна и практическая цеппость работы

Впервые определены последовательности нуклеотидов полноразмерных генов (18S, 5.8S, 28S) и спейсерных последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК двух представителей отряда Cyclopoida: С. kolensis и С. insignis.

Проведен сравнительный анализ эволюционной изменчивости протяженного фрагмента 1 ООО п.н.) 28S гена и спейсерных последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК 11 видов и двух популяций одного вида циклопообразных копепод. Показано, что полученные в ходе исследования данные могут быть использованы для молекулярной систематики отряда Cyclopoida и определения видов циклопов.

Определен нуклеотидный состав 58 межмикросателлитных последовательностей С. kolensis. Впервые показано, что сравнительный структурный анализ межмикросателлитных последовательностей позволяет делать заключения относительно молекулярных механизмов формирования этого типа структурных элементов генома эукариот. В частности, анализ сходства описанных последовательностей позволил выявить группы схожих последовательностей, которые, вероятно, образовались в результате магнификации исходной уникальной геномной последовательности с последующей дивергенцией образовавшихся копий.

Показано, что большая часть из исследуемых межмикросателлитных последовательностей сохраняется в геноме С. kolensis после прохождения процесса диминуции, то есть после удаления -94% геномной ДНК, что может свидетельствовать об их важной структурно-функциональной роли.

Разработан молекулярный маркер диминуции хроматина С. kolensis. Подход, использованный при разработке маркера, может быть применен при изучении других объектов, в онтогенезе которых встречается ДХ.

Впервые показано значительное изменение числа копий рДНК в ходе диминуции хроматина у циклопообразных копепод.

Апробация работы

Результаты диссертации представлены на конференции "Вычислительная филогенетика и геносистематика" МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 16-19 ноября 2007; ХХ-м международном генетическом конгрессе "Генетика—понимание живых систем", Берлин, 2008; IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения B.C. Кирпичникова, «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб», Санкт-Петербург, 2008; Пятом съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва, 2009; Международной научной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объём и структура работы

Диссертация изложена на 145 страницах и включает стандартные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение. Работа иллюстрирована 30 рисунками, содержит 7 таблиц и 2 формулы. Библиография - 249 источников зарубежной литературы и отечественных авторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда Cyclopoida

(Crustacea)

На рисунке 1 приведена схема строения кластера рибосомных генов эукариот и обозначены праймеры, используемые в работе.

Рисунок 1. Схема строения кластера рибосомной ДНК эукариот. DAMS 18, DAMS 28, NTS 18 и NTS 28 -универсальные праймерьг; a, b, с и d — видоспецифичные праймеры (пояснения в тексте). 18S, 5.8S, 28S -последовательности генов рибосомных РНК; 1TS1 и ITS2 - внутренние транскрибируемые спейсеры; NTS -нетранскрибируемый спейсер.

С помощью "универсальных" праймеров DAMS18 / DAMS_28 [Муха и Сидоренко, 1995, 1996; Муха и др. 2000] были амплифицированы протяженные (около 2000 п.н.) фрагменты рДНК исследуемых видов циклопов. Амплифицированные участки рДНК, включающие в себя: ITS1, ITS2, 5.8S, протяженный фрагмент гена 28S рРНК (-1000 п.н.) и короткий фрагмент (-200 п.п.) 18S гена, были клонированы и секвенированы. Кроме того, для двух близкородственных видов Cyclops kolensis и Cyclops tnsignis с помощью универсальных праймеров NTS 18 / NTS 28 [Муха, Сидоренко, 1995, 1996; Муха и др. 2000] и дополнительных пар видоспецифичных праймеров (a-28SrevDAMS-5'GCGATTCTGACGTGCAAATCG3' / b-ÎSSrevOTS-S'CTGTCTCACGACGGTCTAAACS', c-18SrevNTS-5'GTAATTCCAGCTCCAATAGC3' / d-18SrevDAMS-5'CGTTCAATCGGTAGTAGCG3'X Созданных на OCHOBe определенной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов, получены полноразмерные последовательности 18S (соответственно - 1817 и 1529 п.н.) и 28S (соответственно - 3517 и 3543 п.н.) генов (смотрите рисунок 1).

Исследуемые виды включали: 9 пресноводных видов - Mesocyclops leucarli, Termocyclops oitinoides, Termocyclops crassus, Macrocyclops distinctus, Macrocyclops albidus, Diacyclops bicuspidatus, Megacyclops viridis, Cyclops kolensis (популяции озера Байкал и Малого Андреевского пруда г. Москвы), Cyclops insignis и 2 морских вида, выловленных в Норвежском море - Опсаеа spp., Oithona similis. В анализируемую группу последовательностей были добавлены последовательности 28 S генов рДНК из базы данных GenBank: Paracyclopina nana (GenBank #FJ214952), Oithona nana (GenBank #FM991727), Lamproglena orientalis (GenBank #DQ107543).

1.1 Исследование филогенетических взаимоотношений между

представителями отряда Cyclopoida (Crustacea) на основе последовательностей 28S гена рРНК

Протяженность фрагментов 28S гена рРНК, полученных для 11 исследуемых видов, составила в среднем 1050 п.н. Попарное сравнение фрагментов 28S генов рРНК показало, что в пределах родов Cyclops, Thermocyclops и Macroçyclops расхождение (дивергенция) составило 2.8%, 6.9%, и 10.3%, соответственно; а между родами достигает 7 - 11.9 %; при попарном сравнении исследуемых видов семейства Cyclopidae с представителем другого семейства (Oithonidae, Oithona similis) расхождение варьировало от 15.8 - 17.7 %, с представителями другого отряда (Poecilostomatoida, Oncaea spp.) - от 17.4 - 20.2%. Средние частоты оснований в анализируемом фрагменте рДНК у исследуемых видов семейства Cyclopidae равны: А=22.77, С=24.65, G=32.69, Т=19.88%. Достоверные различия по частотам встречаемости четырех оснований между таксонами не наблюдалось (X2=18.36,i^30,p=0.95).

Для оценки степени насыщения исследованных фрагментов рДНК различных таксонов вариабельными нуклеотидами было проанализировано соотношение между числом транзиций и трансверсий, с одной стороны, и попарными различиями между таксонами, вычисленными на основе модели HKY [Hasegawa et al., 1985], с другой. Для описанного соотношения был построен график, который указывает на отсутствие насыщения в исследованных последовательностях, так, по мере роста дивергенции число обоих типов замен (транзиций и трансверсий) постепенно растет (рисунок 2). Полученные результаты указывают на возможность построения достоверного филогенетического дерева на основе исследованных фрагментов 28S гена рРНК.

Сравнительный анализ исследованных фрагментов рДНК методом «максимальной экономии» привел к построению наиболее вероятного филогенетического древа, изображенного на рисунке 3. Топология дерева подтверждена высокими значениями (>50%) бутстреп (bootstrap), подтверждающими все внутренние узлы (структуру филогенетического древа). Схожая топология древа получена при использовании метода «максимального правдоподобия».

На основе последовательности 28S гена рРНК была проведена оценка эволюционного расхождения представителей отряда Cyclopoida (таблица 1).

Соотношение количества замен к степени дивергенции (рисунок 2), а также общая топологий древ построенных различными методами («максимальной экономии» и «максимального сходства») указывает на высокую информативность исследованных

IT Ô! 02 03 0.4

Попаркмдяксрггнция (HKY-roppejMiixj^

* • * * TpMtHfm

* * * * Трямщм

Рисунок 2. Общее количество транзиций и трансверсий в 656 пн 28S рДНК, использованных для построения филогенетического древа отряда Циклопообразные (Cyclopoida) методом "максимальной экономии", как функция "HKY - коррелированной" дивергенции для каждой пары сравниваемых видов.

фрагментов 28S рДНК при установлении филогенетических взаимоотношений в пределах отряда Cyclopoida.

1.2 Исследование филогенетических взаимоотношений между

представителями семейства Cyclopidae (Crustacea) на основе внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК - ITS1 и ITS2

Анализ макроэволюционных событий на примере 28S гена показал, что семейство Cyclopidae со значением бутсреп 88% отделяется в отдельный клад (рисунок 3). Для детального анализа филогенетических взаимоотношений и подтверждения топологии внутри семейства, мы использовали последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2, обладающих в сравнении с последовательностями 28S гена рРНК, большей эволюционной изменчивостью.

Средняя протяженность ITS1 и ITS2 составила 304 п.н. и 197 п.н. соответственно. Выравнивание последовательностей ITS 1 и ITS2 было произведено в составе фрагментов, ограниченных последовательностями праймеров DAMS 18 и DAMS 28 (смотрите рисунок 1). Анализ проводился методом «максимальной экономии» и «максимального правдоподобия». В обоих случаях были получены деревья со схожей топологией (рисунок 4).

Onceaspp

- Lamproglena orientals

* Paracyclopina nana

- Oíacydops bícuspklalus

- Megacyciops viridis

- Cyclops tosignis

- Cyclops kolensis ox Байкал

- Cyclops Mensis пруд г. Моема

- Termocyciops ofllnokles

- Termocyciops crassus

- Mesocyclops leucaili

— Macrocyclops dlstindus и

Macrocyclops albidus

Рисунок 3. Филогенетическое дерево отряда Циклопообразные (Cyclopoida), построенное на основе метода "максимальной экономии". Цифрами

обозначены достоверности (в процентах) расхождения ветвей, выявленные бутстреп (bootstrap) анализом.

Показано, что филогенетическое дерево, построенное на основе последовательностей ITS1 и ITS2 подтверждает топологию дерева, построенного на основе 28S гена, а также позволило уточнить положение видов Diacyclops bicuspidatus и Mesocyclops leucarti. Кроме того, значения бутстреп, то есть степень достоверности филогенетического древа, значительно повысились.

Анализ, проведенный на основе последовательностей ITS1 и ITS2, позволил с большей достоверностью выделить на филогенетическом древе отдельные рода - Cyclops (С. kolensis, С. insignis), Thermocyclops (Т. oitinoides, Т. crassus) и Macrocyclops (М. distinctus и М. albidus) (смотрите рисунок 4). С целью изучения эволюционной изменчивости внутри отдельных родов, нами был проведен сравнительный анализ последовательностей ДНК ITS1 и ITS2 у представителей каждого из родов.

Степень сходства транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) двух близкородственных видов С. kolensis и С. insignis составляет 92.7% и 96.4%,

соответственно, что в свою очередь подтверждает близкое родство между данными видами, установленное на основе морфологических признаков [Монченко, 1974].

............. I Мвдасусйрв У1ГШВ

ОйеуОор» bicti«wieuii

i'JfrW — Cycfcpf kale г» (j пруд г. Мзсвва

- Cyclops Wiflsu 51 Safcraя

Рисунок 4. Филогенетическое дерево семейства Цихлопы (Cyclopidae), построенное на основе методов "максимальной экономии" и "максимального сходства". Цифрами обозначены достоверности (в процентах) расхождения ветвей, выявленные бутстреп (bootstrap) анализом -первая цифра соответствует методу "максимальной

экономии", вторая -

"максимального сходства".

Сходство между ITS1 и ITS2 видов Thermocyclops oitinoides и Thermocyclops crassus составляет соответственно 83.0% и 82.0%. Очевидно, что эволюция данных видов сопровождалась определенными изменениями в структуре ITS1 и ITS2, при этом в сходной степени для обоих спейсеров. Иной характер эволюционной изменчивости обнаружен при сравнении ITS1 и ITS2 видов Macrocyclops distinctus и Macrocyclops albidus - 58.0% и 68.1%, соответственно. В данном случае ITS2 демонстрирует больший эволюционный консерватизм по сравнению с ITS1. Уровень гомологии между видами рода Macrocyclops оказался близким к межродовому уровню гомологии среди исследованных

— Termocycicps oitinoides ам

1 Teimotyctops crassus ' — MacrocyOops »IbkJus

Macrucycfups del iitctua

Таблица I. Оценка эволюционного расхождения представителей отряда Cyclopoida на основе последовательности 28S гена рРКК. Указано число нуклеотидных замен на сайт при попарном сравнении 15 нуклеотидных последовательностей методом «максимального правдоподобия» в программе MEGA 4 [Tamura, Kumar, 2004; Tamura et al., 2007].

Названия видов 1 « O. similis e § с Ö о S с а; t а 1 О « и ■а 1 2 и ■3 .6 1 U Э ■8 1 ci Т. oitinoides T. crassus ! J M. distinctus M albidus M. viridis ,««1 f § •J

Oncea spp.

Oilhona similis 0.2892

Oithona nana 0.3038 0.1817

Paracyclopirta nana 0.2878 0.1662 0.2212

Cyclops kolensis (M*) 0.2599 0.2352 0.3132 0.2815

Cyclops kolensis (B**) 0.2605 0.2359 0.3189 0.2885 0.0107

Cyclops ins ignis 0.2723 0.2470 0.3171 0.2791 0.0359 0.0439

Diacyclops bicuspidalus 0.2267 0.2167 02783 0.2425 0.0946 0.1000 0.1013

Termocyclops oitinoides 0.2780 0.2313 0.2719 0.2469 0.1385 0.1443 0.1313 0.1048

Termocyclops crass us 0.2774 0.2276 0.2710 0.2446 0.1382 0.1440 0.1400 0.0998 0.0919

Mesocyclops leiicarli 0.2518 0.2139 0.2694 0.2187 0.1486 0.1545 0.1394 0.1011 0.0976 0.0893

Macrocyclops distinctus 0.2900 0.2410 0.2771 0.2683 0.1696 0.1756 0.1606 0.1226 0.1434 0.1608 0.1465 — — — —

Macrocyclops albidus 0.2822 0.2443 0.2676 0.2490 0.1532 0.1609 0.1539 0.1005 0.1424 0.1224 0.1152 0.1383 — — —

Megacyclops viridis 0.2777 0.2420 0.3058 0.2619 0.1649 0.1746 0.1612 0.1265 0.1373 0.1433 0.1371 0.1706 0.1613 — —

Lantproglena oriental is 0.4128 0.3754 0.4340 0.4303 0.3547 0.3630 0.3645 0.3450 0.3498 0.3717 0.3550 0.3651 0.3678 0.3540 —

* - популяция С. ко1егим Малого Андреевского пруда, г. Москва. ** - популяция С. ко!ею1з оз. Байкал.

видов семейства Сус1орИае - 61.7 % для 1ТЭ1 и 56.5 % для 1Т82. Высокая степень расхождения между представителями рода \iacrocyclops, по сравнению с другими исследованными родами, очевидно, указывает на относительно более давнее расхождение видов М. ¿Ытс1и$ и М. а1Ы(1ш (см. таблицу 2).

Таблица 2. Степень сходства между различными участками рДНК представителей трех родов семейства Сус1ор1<Зае, а также между географически отдаленными популяциями С. ¿у/тш.

Представители семейства Cyclopidae ITS1 ITS2 28S

Cyclops kolensis (M*) 98.9% 92.7% 98.5% 96.4% 99.2% 97.6%

Cyclops kolensis (Б**)

Cyclops insignis

Thermocyclops oitinoides 83.0% 82.0% 94.5%

Thermocyclops crassus

Macrocyclops distinctus 58.0% 68.1% 89.4%

Macrocyclops albidus

* — популяция С. kolensis Малого Андреевского пруда, г. Москва.

** — популяция С. kolensis оз. Байкал.

1.3 Исследование изменчивости рДНК двух близкородственных видов

циклопов рода Cyclops: С. insignis и С kolensis Филогенетический анализ семейства Cyclopidae (глава 1.1 и 1.2) позволил выявить два наиболее близких вида - С. kolensis и С. insignis, обитающих в схожих условиях среды. Для этих видов были определены полные последовательности рибосомных генов 18S, 5.8S, 28S и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и 1TS2). На основе полученных данных был проведен более детальных анализ эволюционной изменчивости этого района генома двух представителей рода Cyclops.

Сравнительный анализ фрагментов генов 28S рРНК (-1000 п.н.) двух обитающих в сходных экологических нишах близкородственных видов рода Cyclops позволил разделить их со значением бутсреп 100% (смотрите рисунок 3). На основе сравнения полноразмерных последовательностей 28S гена С. kolensis и С. insignis было показано 98.7% сходство (47 замен на 3555 п.н.), и 99.5% сходство (8 замен на 1534 п.н.) полноразмерных последовательностей 18S гена этих же видов.

Известно, что при формировании зрелой рибосомной РНК немаловажную роль играют правильная укладка молекулы-предшественника рибосомной РНК, включающей рибосомные гены и межгенные спейсеры. Можно предположить, что более существенные

различия в структуре рДНК С. kolensis и С. insignis заключаются во вторичной структуре внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2.

Вторичная структура последовательности ITS2 обоих видов имела схожую форму в диапазоне температур от +4 до +16 °С (рисунок 5, в, г). Напротив, анализ вторичной структуры последовательностей ITS1 выявил сильные различия между исследованными видами (рисунок 5, а, б). Мы проследили динамику в изменениях вторичной структуры ITS 1 и ITS2 С. Mensis и С. insignis с изменением температуры. Оказалось, что с ростом температуры происходят изменения во вторичной структуре 1TS1 и ITS2. ITS1 С. insignis сохраняет устойчивую конформацию в диапазоне от 4 до 19 °С (рисунок 5, а), начиная с +20 °С наблюдаются незначительные изменения в структуре ITS 1, при температуре +22 °С наблюдаются сильные изменения во вторичной структуре. Вторичная структура ITS1 С. kolensis устойчива в пределах от +4 до +28 °С (рисунок 5, б), после чего также наступают сильные конформационные изменения структуры ITS 1. Несмотря на схожесть вторичной структуры ITS2 С. kolensis и С. insignis (рисунок 5, в, г) изменения в конформации ITS2 этих видов наблюдаются при разных температурах - при +17 °С в ITS2 С. insignis и при +37 °С в ITS2 С. kolensis (рисунок 5, д, е).

Таким образом, наблюдается большая устойчивость вторичной структуры С. kolensis к повышению температуры, по сравнению с вторичной структурой предшественника рРНК С. insignis. Эти результаты хорошо согласуются с нашими наблюдениями, указывающими на большую устойчивость С. kolensis к высоким температурам среды обитания. Оба этих вида обитают в схожих условиях (в нашем случае — популяции обоих видов обитают в одном пруду), однако репродуктивный период С. insignis проходит в диапазоне более низких температур +3 - +7 °С [Frisch 2001], чем репродуктивный период С. kolensis, максимум которого ограничивается температурой +12 - +14 °С [Rivier 1996]. Полученный результат может свидетельствовать о наличии связи между особенностями укладки вторичной структуры предшественника рибосомной РНК и экологической пластичностью вида.

1.4 Характеристика степени эволюционной изменчивости

транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) и участка 28S гена рРНК двух географически отдаленных популяции Cyclops kolensis

В ходе исследования двух популяции С. kolensis - Малого Андреевского пруда г. Москва и популяции обитающей в озере Байкал, проведенного группой А.П. Акифьева (ИОГен РАН) и лаб. И.Ф. Жимулева (ИЦИГ СО РАН), установлено, что помимо общей

морфологии и схожих условий обитания, обе популяции обладают схожей картиной ДХ -в результате ДХ, протекающей во время 4-го деления дробления в пресоматических клетках зародыша С. кокти, происходит удаление 94-96% геномной ДНК [Гришанин и др., 2006].

о.

.' \ ' е

их-. ■ ' ' '" ~

Рисунок 5. Вторичные структуры последовательностей ITS1 и ITS2 С. insignis и С. kolensis. а - ITS1 С. insignis в диапазоне от +4 до +19 "С; б - ITS1 С. kolensis в диапазоне от +4 до +28 °С; в - ITS2 С. insignis и г - ITS2 С. kolensis в диапазоне от +4 до +16 "С; д - ITS2 С. insignis и е - ITS2 С. kolensis при +17 °С.

В результате анализа изменчивости внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК была выявлена высокая степень консерватизма ITS 1 и ITS2 между московской и байкальской популяциями С. kolensis (таблица 2). Учитывая значительную географическую (4500 км) и временную (не менее 25 млн. поколений) разобщенности данных популяций [Гришанин и др., 2006], данный факт является весьма необычным.

Высокий внутривидовой консерватизм ITS1 и ITS2 С. kolensis может быть обусловлен, по нашему мнению, функциональной ролью последовательностей ITS1 и ITS2 в регуляции активности кластера рибосомных генов.

Анализ участка 28S гена московской и байкальской популяций также показал наличие высокого уровня гомологии близкого к уровню гомологии, выявляемому при сравнительном анализе последовательностей нуклеотидов ITS1 и по ITS2 (таблица 2).

2 Исследование изменепий структуры кластера рДНК в процессе

диминуцпи хроматина С kolensis

Диминуция хроматина описана у относительно небольшого числа видов различных групп организмов (аскарид, миксин, двукрылых насекомых, циклопов, простейших и ряда других) [Гришанин и др., 1996; Гришанин и др., 2006; Beermann, 1977; Dorward et. al., 1997; Goday et. al., 1993; Nakai et. al., 1991; Prescott, 1992].

Доля геномной ДНК, удаляемой в ходе диминуции хроматина, различна у разных видов - от 25% у Ascaris suum [Muller,Tobler, 2000] до 94% у С. kolensis [Гришанин и др., 1996], следует отметить, что С. kolensis обладает рекордной среди описанных эукариот долей элиминируемой ДНК.

Известно, что кластер рибосомных генов эукариот представляет собой мулыигенное семейство. У разных групп организмов насчитывается от нескольких десятков до десятков тысяч копий рибосомных генов [Prokopowich, 2003]. Одной из задач данного исследования являлось определение числа копий повторов рДНК и изучение влияния ДХ на структуру кластера рибосомных генов С. kolensis.

Очевидно, что для качественной оценки материала, используемого в данном исследовании, необходим молекулярный маркер, свидетельствующий о прохождении диминуции хроматина, при этом он не должен быть связан с рДНК.

2.1 Разработка маркера диминуции хроматина на основе

межмикросателитиых последовательностей (ISSR - inter simple sequence repeats)

2.1.1 Характеристика ISSR-последователыюстей геномной ДНК бластомеров С kolensis до диминуции хроматина

Последовательности ДНК, которые могут быть использованы в качестве молекулярного маркера диминуции хроматина, должны удовлетворять следующим критериям: независимо от числа представленных копий полностью удаляться из генома

соматических клеток в ходе ДХ, не иметь отношения к рДНК, легко детектироваться с помощью ПЦР. Ранее было показано, что в состав элиминируемой ДНК С. kolensis входят некодирующие последовательности, обладающие сложной мозаичной структурой повторов [Degtyarev et al., 2004, Зоткевич и др., 2008]. Кроме того, известно, что другой представитель семейства Cyclopidae Mesocyclops edax в ходе ДХ теряет значительную часть последовательностей сателлитной ДНК [Drouin, 2006]. К сагеллитной ДНК относят и так называемые микросателлитные последовательности.

Микросателлиты, или короткие тандемные повторы (simple sequence repeats -SSRs), — характерный компонент генома эухариот. В настоящее время накоплено много данных относительно структуры этого компонента генома, механизмов, обеспечивающих вариабельность длины и увеличение числа их копий [Li et al., 2002]. Исследована закономерность распределения микросателлитов по геному; показана их преимущественная концентрация в некодирующей части генома [Hancock, 1995]. Показано, что среднее расстояние между микросателлитами в гетерохроматиновых районах генома эукариот составляет от нескольких сотен до нескольких тысяч пар нуклеотидов [Katti et al., 2001], что позволяет амплифицировать фрагменты ДНК, локализованные между микросателлитами (inter-simple sequence repeats, или ISSR-последовательности), методом ПЦР. В ходе диминуции хроматина у ряда видов большая часть гетерохроматиновых участков хромосом удаляется из генома клеток соматической липии [Goday et al., 1993; Nakai et al., 1991]. Можно предположить, что в ходе диминуции хроматина у С. kolensis также удаляется значительная часть гетерохроматина, в том числе микросателитные последовательности.

В рамках данной работы были амплифицированы, клонированы и секвенированы 58 последовательностей ДНК С. kolensis, локализованных между микросателитиыми последовательностями типа (GA)n. Амплификацию проводили с использованием праймера (GA^C; в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из бластомеров С. kolensis на стадии 4 деления дробления, то есть до прохождения диминуции хроматина у этого вида циклопов. Амплифицированные последовательности были клонированы в плазмидном векторе и секвенированы. Длина клонированных фрагментов варьировала от 104 до 812 п.н. Сравнительный компьютерный анализ посредством программы BLAST (httn://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi1 не выявил значимой степени сходства исследованных последовательностей ни с одной из последовательностей ДНК, представленных в базе данных GenBank. С целью выявления возможного сходства между нуклеотидными последовательностями 58 исследуемых ISSR-фрагментов, нами были

использованы два подхода: филогенетический, с построением дерева, отражающего степени родства последовательностей, и подход, основанный на поиске непротяженных повторов в анализируемых последовательностях. На основе исследуемых ISSR-фрагментов, в программе MEGA версия 4 [Tamura, et al., 2007] методом невзвепгенного попарного среднего (UPGMA - Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Averages) [Sneath, Sokal, 1973], было построено филогенетическое дерево. Второй подход был реализован по средствам программы MEME version 4.1.1 [Bailey, Elkan, 1998] (http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html). позволяющей выявлять повторяющиеся мотивы различной степени сходства в протяженных последовательностях ДНК (рисунок 6). В результате анализа было выявлено три клада lSSR-фрагментов с высоким уровнем гомологии (рисунок 6). Остальные последовательности, не вошедшие ни в один из кладов, содержали в различных комбинациях «уникальные» мотивы - #9 (зеленый), #10 (светло-серый), а также мотивы, встречающиеся во всех трех кладах, - #3 (красный), #8 (серый), #1 (голубой), #2 (синий), #6 (светло-зеленый), #7 (бирюзовый) (смотрите рисунок 6). Следует отметить, что каждый мотив представляет собой консенсусную последовательность слабо вырожденных повторов, обнаруживающихся в составе различных последовательностей (рисунок 7).

Первый клад включал в себя двадцать последовательностей размером от 252 до 584 п.н. В этом кладе были представлены семь мотивов: #1 (голубой), #2 (синий), #3 (красный), #4 (фиолетовый), #5 (желтый), #8 (серый), #10 (светло-серый) (смотрите рисунок 6). Все lSSR-фрагменты первого клада можно было разделить на две подгруппы. Одна из них содержала мотивы #1 и #2, другая подгруппа в дополнение к мотивам #1 и #2 содержала мотивы #4 и #5.

Второй клад объединял собой четыре фрагмента. Протяженность каждого из них составляла около 200 п.н. и все они демонстрировали высокий уровень гомологии, несмотря на то, что посредством программы MEME было выделено только два общих мотива - #6 (светло-зеленый) и #7 (бирюзовый). Все четыре последовательности второго клада различались по небольшому числу нуклеотидпых замен.

Последовательности третьего клада содержали мотив #3, в состав которого входили микросателлиты (CTTT)n (GT)n, и мотив #8 представляющий собой вырожденную последовательность микросателлита (GAAA)„.

ISSRs-фрагменть я р- значение

1 -M -i; -- VU - -¡.,

1 -зьт -sCT¿ 1

II vol-м С—— --

»L-эм ------^сг» -^cz" —г V ;........=........-........-.....--....... .... = =

-ïtn:, -Л 1

Рисунок 6. Сравнительный структурный анализ клонированных lSSR-фрагментов, представленный в виде филогенетического дерева, совмещенного с результатами анализа мотивов, выявляемых посредством программы MEME version 4.1.1 [Bailey T. L. and Elkan C.,1998] (http: meme.sdsc.edu meine intro.html). Зелеными метками («галочками») обозначены, ISSR-фрагменты характерные для генома соматических клеток С. kolensis, красными - ISSR-фрагменты, удаляемые из генома соматических клеток С. kolensis в результате ДХ (объяснения в главе 2.1.2). Клады с высоким уровнем гомологии выделены цветом и обозначены римскими цифрами.

консенсусная ret ЛТТТЛЛЛТТГТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ Т CACA TT СТАЛ С ТСААСАТТА ТТСТАСАТТСАТ CÎATTTAТТААААА т

последовательность

• ISSR [>v»4» Сайты

7-* <«8с-<0 ААТГГТЛСГГ ТСТ АТТТАЛАТТТТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ V CACA TT СТАА С ТСААСАТТА ТТСТАСАТТСАТ С 7А ТТТ А ТТААААА Т ТГГГПСПА

SM 1.02e-." лдттгм.ггт ТСТ АТГГАААТТТТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ Т CACA ГТ СТАЛА С ТСААСАТТА ТТСТАСА ТТ7А Т С7Л ТТТЛ ТТААААА t ТТТ-ГГКТГг:

ААТТСАЛСТТ ТСТ ЛТТТАЛАТТТТ СТСТСТТААТАА CACA TT СТАЛА С ТСААСАТТА' ТТСТЛСАТТТАТ СТА ТТТЛ ТТААААА

3M Î.Ofc-S? AATTTTAGTÏ ТСТ АТТГ*ЛА:гТТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ X CACA TT СТАА САТСААСАТТА ТТСТАСАТТСАТ СТА ТТТЛ ТТААААА Т Г.ТГ. !'•• 1 ТА

ЛЛ.ГГСАА^ТТ ТСТ АТТТАААГГТТ СТСТСТТЛЛ-АЛ CACA TT СТАА С ТС АСА ТТЛ ТТСТАСАТТСАТ СТА ТТТ А TT АЛЛА

4* 7.0.V.S7 AATTCAAGT? ТСТ АТТТААА . ТТТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ т CACA TT СТАЛА С ТСААСАТТА ТТСТАСА ТТТАТ С ТА ТТТ А ТТААААА » тттсттстк:

AATTTÎACTT ТСТ АГГГГААТТТТТСТСТСТТААТАА ТА ТСТТ Т CA A TT СТАА С ТСААСАТТА ТТСТАСАТТСАТ CÎATTTA ТТААААА

2-1 6.Í2C-52 ЙЛТТСЛЛСТГ ТСТ АТТТАЛАТТТТ СТСТСТТААТАА ТА ТСТТ т CACA TT СТАА С ТСААСАТТА ТТСТАСАТТСАТ CT AATTA TT АЛЛА Т АГТГСПЧЛТ

Рисунок 7. Характеристика степени вырожденности мотивов, выявленных в исследованных ISSR последовательностях, посредством программы MEME version 4.1.1 [Bailey T. L. and Elkan C.,1998] (http: meme.sdsc.edu me me intro.htinD. В первом столбце указаны название ISSR-фрагментов, содержащих мотив #4 (на рисунке 6 обозначен розовым цветом); p-value - степень достоверности родства между последовательностями выявленного мотива; вверху приведена консенсусная последовательность мотива.

Анализ сходства описанных ВЗЯ-фрагментов позволил выявить группы схожих последовательностей, которые вероятно образовались в результате магнификации исходной уникальной геномной последовательности с последующей дивергенцией образовавшихся копий. Можно предположить, что при образовании новых ВЗЯ-фрагментов, помимо точковых мутаций, важную роль играет процесс рекомбинации. Наличие внутри ряда ВЗЯ-фрагментов микросателлитных последовательностей свидетельствует в пользу локализации этих последовательностей в гетерохроматиновой области генома С. ко1еш1.^.

2.1.2 Характеристика описанных 18811-фрагментов в геноме соматических клеток С. Ло/е/ш«

Для 11 из 58 клонированных последовательностей были подобраны «внутренние» уникальные пары праймеров, позволяющие методом ПЦР амплифицировать соответствующие фрагменты ДНК, исходно локализованные между микросателлитами (ОА)п. Пары праймеров, использованных в эксперименте: - тстосотсаатаггоаоаао4_гсу -

СООТСААООАСАОАаТАОСА; 15_/ог - СТСААТСТАССОАОТСТААСС/15_гсу - ТАТООАОТОТАСГСТААСГС; 3_Сзг -А(ЮСАТСАТСАСТСГГСААС/3_геу - ОТАОТОТОТТСОТОАОТОТО; 11_«зг - АОАаАОАОАОАСТТААСТОО/11_гет -ТАТСОТТаТСТСТСГТАТАС; г - АСАОАС1ТАООТСТОТТСТС/9_геу - ОАСАТААОАОСТСОААСТАС; 2-7_йг -АСТААСТСТСААТОТСССАА/2-7_гет - ООТТОААООТОТТАТГООТАС; 4-6_&г - СТСТГАОААААСАТАТСНХО/4-6_геу -(ЗСТСАААТАПТААТТСАСАСОО; 5-7_(ог - ССАААОТАААТААААТСОСО/5-7_геу - ААТОТТОТТСАООТООСАТГ; 14-7_Гог -ОАТСТТАССАТАТОТАСАСС/14-7_геу - ОААОАОСОАОАТАСТАОСТ; 19-1_6>г - ОАОСТОАТССАТОТССАТАО/19-1_геу -ТАСаЗТТААСКЖ5АОТАТСХ;; 3-7_йг - ОАТАОААССААААСЮСААТО/3-7.геу - АСАОАГГССАТСОААОСАТТ. На

рисунке 6 эти 11 исследуемых ^БЯ-фрагментов обозначены «галочками». Сравнительный анализ продуктов амплификации этих последовательностей до и после диминуции хроматина показал, что восемь из одиннадцати исследованных в этом отношении межмикросателлитных локусов остаются в геноме соматических клеток после прохождения ДХ, в то время как три из них элиминируется в процессе диминуции хроматина (на рисунке 8 приведен пример электрофореграммы четырех ВЗК-фрагментов). Во всех экспериментах для проведения ПЦР использовали определенное количество тотальной ДНК (50 нг). Тот факт, что некоторые, по всей видимости, некодирующие последовательности сохраняются в геноме соматических клеток С. Ыети в ходе диминуции, является весьма необычным, если учесть, что в ходе ДХ у этого вида циклопов в геноме соматических клеток сохраняется лишь 6% от общего размера генома. Можно предположить, что сохраняющиеся в ходе ДХ ВЗЯ-фрагменты, играют важную роль в геноме соматических клеток С. ко1ею м, например, в поддержании пространственной структуры хроматина.

В дальнейшей работе ISSR-фрагмент #9 был использован в качестве маркера ДХ С. kolensis.

ПН

750

500

250

J L

8 M

#11

Рисунок 8. Результат электрофоретического разделения в 1% агарозном геле продуктов ПЦР-амплификации тотальной ДНК С. ко\еп:;1г, со специфичными праймерами, фланкирующими соответствующие ^БЯ-фрагменты. Дорожки: 1 и 2 - фрагмент #3, 3 и 4 - фрагмент #4, 5 и 6 - фрагмент #9, 7 и 8 - фрагмент #11. В реакциях ПЦР использовали ДНК. выделенную из эмбрионов циклопа до (дорожки обозначены нечетными номерами) и после (дорожки обозначены четными номерами) стадии прохождения диминуции хроматина.

2.2 Определение уровня внутригеномной изменчивости рДНК С.

kolensis посредством сравнения последовательностей нуклеотидов рДНК соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина

Протяженный участок рДНК, содержащийся в геноме соматических клеток и

бластомеров до ДХ С. kolensis, был амплифицирован с помощью праймеров DAMS 18 и

DAMS 28 (смотрите рисунок 1), клонирован и секвенирован. Оба полученных фрагмента

рДНК имели протяженность 1872 п.н. и содержали последовательности 5.8S гена,

фрагментов 18S и 28S генов рРНК, а также транскрибируемых спейсеров - ITS1 и ITS2.

Уровень сходства между транскрибируемыми спейсерами ITS1, ITS2 и 28S геном рРНК

Таблица 3. Степень сходства между различными участками рДНК, клонированными из бластомеров до диминуции хроматина и соматических клеток С. kolensis, в сравнении с таковой, выявленной при исследовании межпопуляционных различий (смотрите главу 1.4).

Представители семейства Cyclopidae ITS1 ITS2 28S

Cyclops kolensis (М*) (бластомеры до ДХ) 100% 99.5% 99.9%

Cyclops kolensis (М*) (клетки соматического пути) 98.9% 98.5% 99.2%

Cyclops kolensis (Б**)

* — популяция С. Малого Андреевского пруда, г. Москва.

** — популяция С. ко/епяи оз. Байкал

составил, соответственно, 100%, 99.5% и 99.9% (таблица 3). Таким образом, внутригеномные различия соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина С. kolensis не превосходят популяционные различия, и соответствуют уровню ошибки секвенирования.

2.3 Определение числа копий рДНК в геноме соматических клеток и

бластомеров до диминуции хроматина С kolensis

Метод ПЦР «в реальном времени» (real-time PCR) предназначен для количественного определения исходного числа матриц, введенных в реакцию [Higuchi et al., 1992]. Различают два метода измерения исходного количества матриц -относительный и абсолютный. При относительном методе количество матрицы изучаемого гена оценивается в процентах от количества матрицы другого, референсного, гена. Абсолютное измерение подразумевает использование внешнего образца с известным числом копий матрицы (как правило, это плазмидная ДНК, содержащая клон интересующего гена), относительно серии таких стандартных образцов (с построением стандартной калибровочной кривой) производится измерение исследуемого образца. Абсолютный метод позволяет определить число копий интересующего гена относительно плазмидной ДНК с известным количеством «плазмидных копий» интересующего гена.

Для определения числа копий рДНК в геноме С. kolensis до и после ДХ мы использовали «абсолютный» методом измерения количества матрицы в образце. Для визуализации накопления продукта амплификации при проведении ПЦР «в реальном времени» использовался интеркалирующий краситель — EVA Green. Для нормализации сигнала флуоресценции красителя реакция проводилась в присутствии пассивного референсного красителя ROX.

В качестве стандартного образца была использована ранее полученная нами плазмида, содержащая клонированный участок 28S гена С. kolensis протяженностью 2199 п.н. Размер плазмиды со вставкой составил 5216 п.н. Исходя из нуклеотидного состава полученной плазмиды в программе OligoII Mass Calculator v.1.0 была определена молярная масса плазмиды в двухцепочечной форме - М=3,23 * 106 г/моль.

* =iV,-M0-15=6,02-10".1.10-^ 18б

р М 3,23-106

Формула 1. Формула расчета количества молекул плазмидной ДНК (Np), приходящееся на 1 фг пДНК, где Na - число Авагадро; М - молярная масса плазмиды.

По формуле 1 рассчитано количество молекул плазмидной ДНК, приходящееся на 1 фг ДНК - оно составляет 186 молекул плазмидной ДНК.

Нами были сконструированы специфические праймеры, позволяющие амщшфицировать фрагмент 183 п.н., локализованный внутри клонированного участка. В реакцию были взяты образцы анализируемой ДНК - бластомеров до диминуции хроматина и соматических клеток (после диминуции хроматина) С. kolensis, а также ДНК соматических клеток С. insignis в количестве 200 пг каждый. Для построения калибровочной кривой использовались следующие разведения плазмидной ДНК - 1 пг, 10 пг и 1 нг. Исходное количество матрицы 28S гена (яри пороговой величине

накопленного продукта

амплификации Nt=30,10), взятое в реакцию на 200 пг до и после диминуционных образцов ДНК по результатам реакции составило 1120 и 102 фг (Nra), соответственно, и С. insignis -1730 фг (рисунок 9).

Рисунок 9. Среднее значение стартового количества матрицы взятой в ПЦР, представленное в десятичном логарифме. Ось абсцисс - изучаемые образцы (Cyclops kolensis-. бластомеры до ДХ. соматические клетки - после ДХ, Cyclops insignis соматические клетки); Стд - стандарты, с указанием соответствующего количества плазмидной ДНК в трех разведениях; отрицательный контроль - образец без ДНК матрицы; ось ординат - среднее значение стартового количества матрицы (указано над столбцами в фемтограммах) в десятичном логарифме.

Ранее в эксперименте с Фёльген-окрашиванием ядер клеток С. kolensis и С. insignis [Гришанин и др. 1996] было показано, что диплоидный геном бластомеров С. kolensis до диминуции содержит 4,6 пг ДНК, а диплоидный геном соматических клеток С. kolensis -0,28 пг ДНК, геном соматических клеток С. insignis - 4,2 пг. Исходя из этого, можно определить количество клеток, приходящееся на 200 пг до и после диминуционной ДНК С. kolensis и на 200 пг ДНК соматических клеток С. insignis.

Учитывая выявленные различия в количестве матрицы и различия в размере генома до и после диминуции хроматина, по формуле 2 было рассчитано количество копий рДНК приходящееся на диплоидный геном.

J 10000000 т-

100000-

X/c//>V>

N -N -2 С

Формула 2. Формула расчета количество копий рДНК (Ыг), приходящихся на диплоидный геном, где -исходное количество матрицы 28Б гена, определенное в ходе эксперимента; ^ - количество молекул плазмидной ДНК, приходящееся на 1 фг пДНК, взятой в реакцию (смотрите формулу 1); к - количество анализируемой ДНК, взятой в реакцию (для всех образцов - 200 пг), 2С - размер диплоидного генома (клеток зародыша до ДХ С. ко/епз/з - 4,6 пг, соматических клеток С. Шетгз - 0,28 пг, соматических клеток С. insignis - 4,2 пг, [Гришанин и др. 1996])

В результате вычислений было показано, что бластомеры до ДХ С. £о/еяда содержат в своем диплоидном геноме 4844 копии рДНК, а диплоидный геном соматических клеток (после ДХ) С. Ао/е/мю содержит 26 копий рДНК, соматический диплоидный геном С. ши^тш - 6846 копий рДНК. Показано, что С. ¡>ш'цш'£, у которого

отсутствует ДХ, содержит больше копий рДНК, чем геном соматических клеток и бластомеров до ДХ С. ко1ет!й, в онтогенезе которого проходит ДХ (рисунок 10).

Соотношение между числом копий рДНК до и после прохождения ДХ составляет 186:1. Это соотношение согласуется с наблюдаемой положительной корреляцией между размером генома и количеством копий рДНК, описанной ранее [Ргокоро\У1с11 е! а1. 2003]. В ходе диминуции хроматина геном С. кокт^в уменьшается в

а 2000

i 1800

в.

I 1600 s

8 1400 X

§ 1200

S 1000 ■ S

1 600 S

I 600 I

I 400

£ 200 I о

шш |

ь fJZi

Г ~ '

- У

'*'-'•

v-'-'.-v v

г- "... У-V

"'-л '¿С: h

доДХ после ДХ C.kolensis C.kolensis

C.insignis

Рисунок 10. Среднее значение стартового количества матрицы в ПЦР (в фемтограммах) относительно плазмидной ДНК. Ось абсцисс - изучаемые образцы (Cyclops kolensis: бластомеры до ДХ, соматические клетки -после ДХ: Cyclops insignis соматические клетки); ось ординат - среднее значение стартового количества матрицы.

16 раз, а число копий рДНК уменьшается примерно в 200 раз. Возможно, существует прямая зависимость между размером генома и количеством активных копий рДНК.

Если учесть, что после ДХ остается всего несколько десятков копий рДНК, что в почти в 200 раз меньше исходного количества, логично предположить, что в ходе ДХ сохраняются преимущественно функциональные копий рДНК. Известно, что значительная часть копий рДНК дрозофилы и других организмов [ДакиЬсгак е! а1., 1992, Каграманова и др., 2007] поражена специфическими мобильными элементами (Ш, Я2), которые при встраивании приводят к инактивации копий рДНК. Возможно, именно такие копии подвергаются удалению в ходе ДХ у С. ¿о/ети.

выводы

1. Проведен анализ эволюционной изменчивости фрагментов рДНК протяженностью около 2000 п.н. каждый, содержащих в своем составе внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2), ген 5.8S рРНК и часть генов 18S и 28S рРНК, 11 видов отряда Cyclopoida.

Показано, что генетическая изменчивость фрагмента гена 28S рРНК, отражает филогенетические дистанции между эволюционно удаленными видами изучаемого отряда, в то время как изменчивость ITS1 и ITS2 с высокой достоверностью отражает филогенетические дистанции между видами в пределах отдельных семейств. На основании полученных данных построены филогенетические деревья и определены генетические дистанции между представителями изучаемого отряда.

2. Проведен сравнительный анализ структуры клонированных и секвенированных 58 межмикросателитных последовательностей [(GA)<jC] С. kolensis общей протяженностью -22000 п.н. Показано, что исследуемые фрагменты ДНК содержат в своем составе вырождепные субповторы, отражающие эволюционную преемственность между различными группами межмикросателитных последовательностей этого вида циклопа.

3. Для 21 межмикросателитных последовательностей созданы пары праймеров, позволяющие амплифицировать индивидуальные фрагменты этого типа геномной ДНК. Показано, 8 из исследуемых 11 межмикросателитных последовательностей сохраняются в геноме С. kolensis после завершения диминуции хроматина, что может свидетельствовать об их важной функциональной роли. На основе межмикросателлитной последовательности, удаляемой в ходе диминуции хроматина, получен молекулярный маркер, позволяющий методом ПЦР идентифицировать до- и после- диминуциониые геномы С. kolensis.

4. Определено количество копий генов рРНК, содержащихся в геномах клеток С. kolensis до и после прохождения диминуции хроматина (4844 и 26 копий на диплоидный геном, соответственно) и в геноме С. insignis, у которого диминуция хроматина отсутствует (6846 копий на диплоидный геном).

Впервые показано, что в ходе диминуции хроматина у С. kolensis происходит умепьшение количества копий генов рРНК примерно в 190 раз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Загоскин М. В. Гришапин А. К., Муха Д. В. Диминуции хроматина у Cyclops kolensis: изучение структуры межмикросателлитных локусов. Международная конференция «Вычислительная филогенетика и геносистематика», МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 2007,16-19 ноября, с. 87-92.

2) Загоскин М. В., Гришанин А. К., Королев А. Л., Паленко М. В., Муха Д. В. Характеристика межмикросателлитных последовательностей ДНК до и после диминуции хроматина у Cyclops kolensis // Доклады Академии Наук, 2008, Т. 423, №4, с. 551-555.

3) Zagoskin М. V., Grishanin А. К., Palenko М. V., Mukha D. V. Chromatin diminution in Cyclops kolensis: is "junk" DNA left? ХХ-й международный генетический конгресс "Генетика—понимание живых систем", Берлин, 2008,12-17 июля, с.120-121.

4) Загоскин М. В., Гришанин А. К., Паленко М. В., Муха Д. В. Межмикросателлитные последовательности в геноме Cyclops kolensis. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, 11-15 мая, с. 137.

5) Загоскин М. В., Гришанин А. К., Муха Д. В. Молекулярно-филогенетический анализ некоторых видов циклопообразных копепод (Cyclopoida, Crustacea). Международная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения B.C. Кирпичникова, «Генетика, селекция, гибридизация, племенное дело и воспроизводство рыб», Санкт-Петербург, 2008,10 -12 сентября, с. 13-14.

6) Загоскин М. В., Гришанин А. К., Муха Д. В. Судьба некодируклцих последовательностей в ходе диминуции хроматина у Cyclops kolensis на примере межмикросателлитных последовательностей. Пятый съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва, 2009, 21 - 27 июня, ч.2, с.17.

7) Гришанин А. К., Загоскин М. В. Необычные свойства хромосом пресноводных циклопов (Crustacea): структурные и эволюционные аспекты. Международная научная конференция «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009, 31 августа - 6 сентября, с. 18-19.

Работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ - гранты №06-04-48474-а и №08-04-09220-моб_з, и Программы фундаментальных исследований РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

Подписано в печать:

19.10.2009

Заказ № 2765 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Загоскин, Максим Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Организация кластера рибосомных генов эукариот.

1.1. Структурные и функциональные особенности организации рДНК

1.2. Явление ядрышкового доминирования.

1.3. Избыточность числа копий рДНК в геноме эукариот.

1.4. Направленные изменения количества копий рибосомной ДНК в геноме эукариот.

1.5. Молекулярная эволюция рДНК и ее использование в филогенетических исследованиях.

2. Краткая характеристика микросателлитных (SSR) и межмикросателлитных (1SSR) последовательностей.

3. Феномен диминуции хроматина.

3.1. Диминуция хроматина у нематод (Nematodes).

3.2. Элиминация хромосом (на примере двукрылых).

3.3. Диминуция хроматина при созревании вегетативных ядер (макронуклеусов) у инфузорий.

3.4. Диминуции хроматина у пресноводных копепод (Cyclopoida, Copepoda, Crustacea).

3.5. Диминуция хроматина у Cyclops kolensis.

4. Состав элиминируемой ДНК и молекулярные механизмы диминуции хроматина.

4.1. «Молекулярная свалка» в геноме Ми представителей отряда

Hypotricha.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Сбор материала.

Выделение тотальной ДНК циклопов.

Полимеразная цепная реакция.

Электрофорез.

Получение очищенных продуктов ПЦР.

Лигирование фрагментов ДНК.

Трансформация клеток Е. coli и селекция колоний.

Приготовление компетентных клеток E.coli.

Трансформация компетентных клеток E.coli.

Выделение плазмидной ДНК методом быстрого лизиса для идентификации истинных рекомбинантов.

Выделение плазмидной ДНК для секвенирования.

Скрининг клонов со вставкой и определение размеров клонированного фрагмента с помощью ПЦР.

Секвенирование.

Real-time PCR.

Измерение концентрации нуклеиновых кислот.

Методы биоинформатического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда

Cyclopoida (Crustacea).

1.1. Исследование филогенетических взаимоотношений между представителями отряда Cyclopoida (Crustacea) на основе последовательностей 28S гена рРНК.

1.2. Исследование филогенетических взаимоотношений между представителями семейства Cyclopidae (Crustacea) на основе внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК- ITS1 и 1TS2.

1.3. Исследование изменчивости рДНК двух близкородственных видов циклопов рода Cyclops: С. insignis и С. kolensis.

1.4. Характеристика степени эволюционной изменчивости внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) и участка 28S гена рРНК двух географически отдаленных популяций Cyclops kolensis.

2. Исследование изменений структуры кластера рДНК в процессе диминуции хроматина С. kolensis.

2.1. Разработка маркера диминуции хроматина на основе межмикросателитных последовательностей (ISSR- inter simple sequence repeats).

2.1.1. Характеристика ISSR-последовательностей геномной ДНК бластомеров С. kolensis до диминуции хроматина.

2.1.2. Характеристика описанных ISSR-фрагментов в геноме соматических клеток С. kolensis.

2.2. Определение уровня внутригеномной изменчивости рДНК С. kolensis посредствомсравнения последовательностей нуклеотидов рДНК соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина.

2.3. Определение числа копий,рДНК в геноме соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина С. kolensis.9Ф

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных"

Ракообразные (Crustacea), в частности планктонные формы, составляющие основную массу зоопланктона, играют чрезвычайно важную роль в морских и пресноводных экологических системах [Монаков, 1976]. Известно, что веслоногие ракообразные (подкласс Copepoda) имеют морское происхождение представители морской фауны преобладают почти во всех 10 отрядах этого подкласса [Монченко, 2001]. Исключением является отряд циклопообразных копепод (Cyclopoida), преобладающее большинство представителей которого -пресноводные виды. Из трех свободноживущих семейств этого отряда семейство циклопы (Cyclopidae) самое многочисленное - насчитывает 650-670 видов, на его долю приходится большая часть всех пресноводных видов. Другие два свободноживущих семейства (Oithonidae' и Cyclopinidae) представлены исключительно морскими видами [Монченко, 2001].

Таксономия циклопообразных копепод достаточно подробно разработана на основе сравнения морфологических признаков [Gurney, 1933; Рылов, 1948; Dussart, 1969; Монченко, 1974], в то же время исследователи часто сталкиваются с трудностями систематики циклопообразных вследствие высокого уровня полиморфизма видов пресноводных копепод. Зоологи и гидробиологи отмечают острую потребность в использовании новых методов для таксономических исследований, которые позволят дифференцировать виды-двойники и понять экологическое значение близких видов циклопов [Wyngaard, Chinnappa, 1982]. Таким образом, становится очевидной актуальность привлечения современных методов молекулярной генетики для оценки филогенетического родства различных видов пресноводных копепод, а также для оценки скорости микроэволюционных процессов у географически изолированных популяций циклопов.

Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов рибосомной ДНК (рДНК) эукариот может рассматриваться как эффективный подход к определению генетических дистанций между видами и изучению эволюционного процесса [Hwang, Kim, 1999]. Характерной особенностью рДНК является то, что различные структурные, элементы данного участка генома эволюционируют с различной; скоростью. Наиболее эволюционно консервативны гены рибосомных РНК (18S, 5.8S и 28S) — их сравнительный анализ эффективен при сравнении генетических дистанций между эволюционно отдаленными таксонами: Внешний и внутренние транскрибируемые спейсеры (ETS, ITS1 и ITS2) эволюционируют более активно - их сравнительный анализ эффективен при исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными видами. К>" началу наших исследований, относительно мало видов циклопообразных копепод было представлено в базе данных GenBank, еще меньше'оказалось видов, для которых были представлены последовательности рДНК.

Для некоторых родов семейства Gyclopidae, в частности рода Cyclops, представители которого исследовались в данной работе, сведения о рибосомной; ДНК в GenBank отсутствовали. К настоящему времени, в GenBank представлены сведения только для четырех: видов циклопообразных копепод - Acanthocyclops vernalis [Grishanin et al., 2005], Acanthocyclops robustus [Silva, Matsumura-Tundisi, 2005], Mesocyclops edax [Allan, Unpublished] и Cyclops kolensis [Degtyarev et al., 2004] (сведения о последовательностях рДНК отсутствовали), в. онтогенезе которых встречается явление диминуции хроматина (ДХ). Однако, в работе [Grishanin et al., 2005] изучалась популяция A. vernalis, у которой ДХ отс^ггствует [Dorward; Wyngaard, 1997], а имеющиеся в GenBank последовательности рДНК А robustus и M. edax представлены разными участками и не пригодны для сравнения. В общей сложности насчитывается около 20 видов пресноводных копепод, у которых в онтогенезе встречается ДХ [Einsle, 1962; Beermann, 1959, 1977; Einsle, 1964; Акифьев, 1974; Einsle, 1993, 1996; Chinnappa, 1980; Dorward, Wyngaard, 1997; Гришанин, Акифьев, 1993; Гришанин A.K. и др., 1996].

Одним- из типов генетических маркеров, основанных на ПЦР, являются ISSR-маркеры (inter simple sequence repeat) [Zietkiewicz et al., 1994]. Однако информация о нуклеотидном составе данного типа последовательностей отсутствует в базе данных GenBank для подавляющего большинства видов. В связи с этим, с нашей точки зрения, актуальным является определение нуклеотидного состава и изучение структуры ISSR последовательностей.

Диминуция хроматина (ДХ) представляет собой ' процесс программированного удаления части генома из презумптивных соматических клеток в ходе раннего эмбриогенеза некоторых видов животных. Молекулярные механизмы, обеспечивающие процесс диминуции и тип элиминируемой ДНК в настоящее время остаются во многом неизученными. В частности, до начала наших исследований отсутствовали данные об изменениях в структуре кластера рДНК циклопообразных копепод вызванных диминуцией хроматина.

Очевидно, что для изучения преобразований структуры кластера рДНК в процессе ДХ необходим молекулярный маркер, не связанный с рДНК, свидетельствующий о прохождении диминуции хроматина. Для циклопообразных копепод ранее были выявлены повторяющиеся последовательности, частично удаляющиеся из генома в ходе диминуции хроматина [Degtyarev et al., 2004; Зоткевич и др., 2008; Drouin, 2006], однако удаления последовательностей, которые могли бы служить молекулярным маркером диминуции хроматина, не было показано.

Цели и задачи исследования

В соответствии с целью были обозначены следующие задачи исследования:

1) Определить степень эволюционной' изменчивости протяженных фрагментов (-ЮООп.н.) 28S гена и внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1 и ITS2) рибосомной РНК 11 видов отряда Cyclopoida. На основании полученных данных построить филогенетические деревья и' определить генетические дистанции между представителями изучаемого отряда.

2) Посредством сравнительного анализаполноразмерных копий 5.8S-, 18S-и 28S генов рРНК и* внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1' и ITS2) определить степень изменчивости рДНК двух, обитающих в сходных экологических нишах, близкородственных видов циклопов рода Cyclops (С. insignis и С. kolensis).

4) Методом «ПЦР в реальном времени» (real-time PCR) определить число i копий рДНК в геноме С. kolensis до и после диминуции хроматина.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые определены последовательности нуклеотидов полноразмерных генов (18S, 5.8S, 28S) и.спейсерных последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК двух представителей отряда Cyclopoida: С. kolensis и С. insignis.

Проведен сравнительный анализ эволюционной изменчивости I протяженного фрагмента (~1000 п.н.) 28S гена и спейсерных последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК 11 видов и двух популяций одного вида циклопообразных копепод. Показано, что полученные в ходе исследования данные могут быть использованы для молекулярной систематики отряда Cyclopoida и определения видов циклопов.

Определен нукпеотидный состав 58 межмикросателлитных последовательностей С. kolensis. Впервые показано, что сравнительный структурный анализ межмикросателлитных последовательностей позволяет делать заключения относительно молекулярных механизмов формирования этого типа структурных элементов генома эукариот. В частности, анализ сходства описанных последовательностей позволил выявить группы схожих последовательностей, которые, вероятно, образовались в результате магнификации исходной уникальной геномной, последовательности с последующей дивергенцией образовавшихся копий.

Показано, что большая часть из исследуемых межмикросателлитных последовательностей сохраняется в геноме С. kolensis после прохождения процесса диминуции, то есть после удаления ~94% геномной ДНК, что может свидетельствовать об их важной структурно-функциональной роли.

Разработан молекулярный маркер диминуции хроматина С. kolensis. Подход, использованный при разработке маркера, может быть использован при изучении других объектов, в онтогенезе которых встречается ДХ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Загоскин, Максим Владимирович

выводы

1. Проведен анализ эволюционной изменчивости фрагментов рДНК протяженностью около 2000 п.н. каждый, содержащих в своем составе внутренние транскрибируемые спейсеры (ITSTh ITS2), ген 5.8S рРНК и.часть генов 18S и 28S рРНК, 11 видов отряда Cyclopoida:

Показано, что генетическая изменчивость фрагмента гена 28S рРНК, отражает филогенетические дистанции между эволюционно удаленными видами изучаемого отряда, в то время как изменчивость ITS1 и. ITS2' с высокой достоверностью отражает филогенетические дистанции между видами в пределах отдельных семейств. На основании полученных данных построены филогенетические деревья и< определены генетические дистанции между представителями изучаемого отряда. I

2. Проведен сравнительный анализ структуры клонированных и секвенированных 58 межмикросателитных последовательностей [(GA)gC] С. kolensis общей протяженностью ~22000 п.н. Показано, что исследуемые фрагменты ДНК содержат в своем составе вырожденные субповторы, отражающие эволюционную преемственность между различными группами межмикросателитных последовательностей этого вида циклопа.

3. Для 11 межмикросателитных последовательностей созданы пары праймеров, позволяющие амплифицировать индивидуальные фрагменты этого типа геномной ДНК. Показано, 8 из исследуемых 11 межмикросателитных последовательностей сохраняются в геноме С. kolensis после завершения диминуции хроматина, что может свидетельствовать об их важной функциональной роли. На основе межмикросателлитной последовательности, удаляемой в ходе диминуции хроматина, впервые получен специфический молекулярный маркер, позволяющий методом ПЦР идентифицировать до- и после- диминуционные геномы С. kolensis.

4. Определено количество копий генов рРНК, содержащихся в геномах клеток С. kolensis до и после прохождения диминуции хроматина (4844 и 26 копий на диплоидный геном, соответственно) и в геноме С. insignia у которого диминуция хроматина отсутствует (6846 копий на диплоидный геном).

Впервые показано, что в ходе диминуции хроматина у С. kolensis происходит уменьшение количества копий генов рРНК примерно в 190 раз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение филогенетических взаимоотношений между представителями циклопообразных копепод с использованием молекулярно-генетических методов начато относительно недавно и охватывает пока малое число видов. Однако интерес к данному направлению исследований растет.

Проведенные нами исследования^ позволили расширить список видов циклопообразных копепод, изучение филогенетических взаимоотношений между которыми проводится на основе последовательностей' рибосомной ДНК. Нами были-определены и проанализированы протяженные (~2000 п.н.) участки рДНК 11 видов'циклопообразных копепод. Кроме того, нами, впервые были определены последовательности нуклеотидов полноразмерных генов (18S, 5.8S, 28S) и спейсерных последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК двух видов рода Cyclops.

Сравнительный анализ эволюционной изменчивости' протяженного фрагмента-28S гена и. спейсерных-последовательностей (ITS1 и ITS2) рДНК 11 видов циклопообразных копепод позволил дать научное обоснование выбора спейсерных последовательностей ITS1 и ITS2 для проведения филогенетического анализа циклопообразных копепод на уровне семейства и последовательностей 28S гена для филогенетического анализа на уровне отряда. Полученные данные имеют практическое значение в молекулярной систематике отряда Cyclopoida и в определении видов циклопов.

В' результате сравнительного анализа двух географически отдаленных популяций Cyclops kolensis - озера Байкал и пруда г. Москва по исследуемому участку рДНК была: выявлена высокая степень сходства, нуклеотидных последовательностей (ITS1 - 98.9%, ITS2 - 98.5%, 28S - 99.2%). Эти данные могут свидетельствовать либо о недавнем образовании одной из популяций, либо о поддержании? высокого уровня консервативности данного участка генома. С. kolensis.

Сравнительный анализ полноразмерных .последовательностей; генов рДНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 Cyclops kolensis и Cyclops /ns/gn/s позволил выявить высокий уровень сходства (ITS1 - 92.7%; ITS2 - 96.4%, 28S - 98.7%, 18S - 99.5%), подтверждающий статус близкородственных, видов, определенный по морфологическим признакам.

Проведенный нами анализ динамики изменения вторичной структуры ITS1 и ITS2 С. kolensis и С. insignis с ростом температуры указывает на наличие связи, между особенностями^укладкишторичной структуры предшественника рибосомной РНК и экологической, пластичностью вида: Так, нарушения;вторичной структуры: ITS1 и- ITS2 С. insignis;. обитающего при. более низкой, чемг С. kolensis температуре; с ростом^температурывозникают раньше; чем;у С. kolensis; Более: существенно эти .близкородственные^ виды; отличаются? по наличию диминуции хроматина. У С. /со/ens/'s в ходе диминуции хроматина:удаляется-~ 94% геномной ДНК соматических клеток, в то: время как; у С. insignis диминуция хроматина отсутствует. В ходе; работы было- определено, что: диплоидный геном С. insignis содержит около 7000 копий рДНК, а диплоидный геном бластомеров до диминуции хроматина С. /со/ens/s около,5000 копий. Также было:установлено, что в результате диминуции хроматина? в: геноме соматических клеток С: kolensis сохраняется лишь около 30 копий, рДНК. Таким образом, впервые показано уменьшение числа копий генов рРНК в результате диминуции хроматина почти в 190 раз. Сравнительный анализ исследуемого участка рДНК С. kolensis до и после диминуции хроматина указывает на то, что изменений в первичной структуре рДНК в ходе диминуции хроматина, по всей видимости, не происходит.

Чистота материала используемого в экспериментах, касающихся диминуции хроматина, была проверена с помощью специфического молекулярного маркера, свидетельствующего о прохождении диминуции хроматина. Этот маркер был разработан нами на основе последовательностей, локализованных между*микросателлитами, - ISSR- фрагментов.

При разработке маркера была определена^ последовательность нуклеотидов 58 ISSR-фрагментов генома бластомеров до диминуции хроматина С. kolensis, сравнительный анализ которых позволил выявить эволюционную преемственность между различными- группами межмикросателитных последовательностей этого вида циклопа. Среди исследованных ISSR- -фрагментов^ выявлены группы- последовательностей, которые содержали определенный, набор схожих субповторов. Можно предполагать, что. образование ISSR-фрагментов, имеющих схожую структуру, произошло в результате магнификации^ исходной уникальной* геномной последовательности с последующей дивергенцией образовавшихся копий.

Кроме того, 11 из 58 ISSR-последовательностей было^ проверено на присутствие4 в геноме соматических клеток С. kolensis. Выяснилось, что большая часть (8 из 11) ISSR-последовательностей сохраняется в геноме соматических клеток С. kolensis после прохождения диминуции хроматина. Учитывая размер доли, удаляемой ДНК (~94%), можно предположить, что данные ISSR-последовательности играют важную роль в геноме соматических клеток С. kolensis, что представляет интерес для дальнейшего исследования этих последовательностей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Загоскин, Максим Владимирович, Москва

1. Акифьев А.П. "Молчащая" ДНК и ее роль в эволюции // Природа. 1974. Т.9. С. 49-54.

2. Акифьев А.П., Гришанин А.К. Некоторые биологические аспекты диминуции хроматина //Журн. общей биол. 1993. Т. 54. С. 5—15.

3. Алешин В.В., Владыческая Н.С., Кедрова О.С., Милютина И.А., Петров Н.Б. Сравнение генов 18S рРНК в филогении бесповоночных // Молекуляр. Биология. 1995. Т. 29. С. 1408-1426.

4. Банникова А.А. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих //Журнал Общей биологии. 2004. Т. 65. №4. С. 278-305.

5. Башкиров В.Н. Регуляция числа генов рибосомных РНК у дрозофила // Генетика. 1980. Т. 16. С. 7-29.

6. Гришанин А.К. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение хромосом и интерфазных ядер в клетках зародыша Cyclops kolensis (Copepoda, Crustacea) до и после диминуции хроматина // Онтогенез. 1995. Т. 26. С. 188—195.

7. Гришанин А.К., Акифьев А.П. Диминуция хроматина и организация хромосом у Cyclops strenuus strenuus // Генетика. 1993. Т. 29(7). С. 1099 -1107.

8. Гришанин А.К., Бойкова Т.В., Маршак Т.Л., Акифьев А.П., Жимулев И.Ф. Сравнительный анализ размера генома и особенностей диминуции хроматина у байкальской и московской популяций Cyclops kolensis // Докл. РАН. 2006. Т. 408. Н. 5. С. 684-687.

9. Гришанин А.К., Бродский В.Я., Акифьев А.П. Соматические клетки Cyclops strenuus (Copepoda, Crustacea) теряют при диминуции хроматина более 90% генома//Докл. РАН. 1994. Т. 338. С. 708—710.

10. Дегтярев С.В., Гришанин А.К., Белякин С.Н., Рубцов Н.Б., Жимулев И.Ф., Акифьев А.П. Нуклеотидные последовательности ДНК, элиминируемые в процессе диминуции хроматина их хромосом соматических клеток С. kolensis//Цокл. РАН. 2002. Т. 384. С. 255—258.

11. Жарская О.О., Зацепина О.В. Динамика и механизмы реорганизации ядрышка в митозе // Цитология. 2007. Т. 49. Н. 5. С. 355 369.

12. Зоткевич Е.А., Бойкова Т.В., Акифьев А.П., Тереза Е.П., Помазкова Г.И., Мельник Н.Г., Тимошкин О.А., академик Жимулёв И.Ф. Консерватизм в структуре повторенной избыточной ДНК у двух видов рода Cyclops II ДАН. 2008. Т. 420. Н. 5. С. 691-694:

13. Монаков А.В. Питание и пищевые взаимоотношения пресноводных копепод II. Л., Наука. 1976. С. 170.

14. Монченко В.И. Челюстноротые циклопообразные. Циклопы // (Фауна Украины; Т. 27, вып. 3). Киев, «Наукова думка». 1974. -450 с.

15. Монченко В.И. О дифференциальной галопатии семейств свободноживущих CopepodaCyclopoida// Vestnik zoologii; 2001. Т. 35. Н. 5 С. 3—7.

16. Муха Д.В., Лазебная И:В., Сидоренко А.П. Внутривидовая структурная вариабельность рибосомной ДНК рыжего таракана Blattella germanica И Генетика. 2000. Т. 36. С. 11-15.

17. Муха^ Д.В., Сидоренко А.П. Выявление и анализ доменов последовательности 26S рибосомной ДНК Tetrahymena pyriformis, различающихся по степени эволюционного консерватизма // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 529-537.

18. Муха Д.В., Сидоренко А.П. Выявление высококонсервативных доменов в последовательности 17S рибосомальной ДНК Tetrahymena pyriformis II Генетика. 1996. Т. 32. С. 1494-1497.

19. Рылов В.М. Cyclopoida пресных вод. Фауна СССР. Ракообразные // Т. 3., вып. 3. М.; Л.: Изд-во АН СССР. 1948. — 318 с.

20. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. Н. 3. С. 260.

21. Хемлебен В., Беридзе Т.Г., Бахман Л., Коварик Я., Торрес Р. Сателлитные ДНК//Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 267—306.

22. Adoutte A., Balavoine G., Lartillot N., deRosa R. The end of intermedia taxa? // Animal Evol. 1999. V. 15. P. 104-108.

23. Aeby P., Spicher A., de Chastonay Y., MGIIer F., Tobler H. Structure and genomic organization of proretrovirus-like elements partially eliminated from the somatic genome of Ascaris lumbricoides // EMBO J. 1986. V. 5. P. 3353-3360.

24. Albertson D., Nwaorgu O.C., Sulstons J.E. Chromatin diminution and chromosomal mechanism of sexual differentiation in Strongyloides papillosus // Chromosoma. 1979. V. 75. P. 75-87.

25. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. Nucleolar proteome dynamics // Nature. 2005. V. 433 P. 77—83.

26. Arnheim N. Concerted evolution of multigene families. In: Evolution of Genes and Proteins (Eds. Nei M. and Koehn R. K.) // Sinauer, Sunderland. 1983. P. 38-61.

27. Arnheim N.M., Krystal M., Schmickel R., Wilson G., Ryder O., Zimmer E. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and ape // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 7323-7327.

28. Arnheim N., Treco D., Taylor В., Eicher E. Distribution of ribosomal gene length variants among mouse chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 4677-4680.

29. Ashley C.T., and Warren S.T. Trinucleotide repeat expansion and' human disease //Annu. Rev. Genet. 1995. V. 29. P. 703-728.

30. Atwood K.C. Some aspects of the bobbed problem in Drosophila II Genetics.-1969. V. 61. P. 319-324.

31. Baird S.E., Fino G.M., Tausta S.L., Klobutcher L.A. Micronuclear genome organization is Euplotes crassus: a transposonlike element is removed during macronuclear development// Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. Pi 3793—3807.36.

Информация о работе

Загоскин, Максим Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы