Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение изменчивости среди растений, регенерированных из протопластов мезофилла листа картофеля

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение изменчивости среди растений, регенерированных из протопластов мезофилла листа картофеля"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи

ПЕТЮХ Григорий Павлович

[ЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ СРЕДИ РАСТЕНИЙ, РЕГЕНЕРИРОВАННЫХ ИЗ ПРОТОПЛАСТОВ МЕЗОФИЛЛА ЛИСТА КАРТОФЕЛЯ

Специальность 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1991

Работа выполнена в Украинском научно-исследовательском институте картофельного хозяйства Украинской Академии Аграрных Наук

Научные руководители: академик АН УССР, доктор биологических наук, профессор Ю. Ю. Глеба

кандидат биологических наук А. А. Кучко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Палилова А. Н.

доктор биологических наук Кунах В. А.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии „

с*о

Защита состоится «А-«? ъНШОрА 1991 г. в / / часов на заседании специализированного / совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте генетики и цитологии АН Республики Беларусь по адресу: 220734, г. Минск, ул. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа. ^

Автореферат разослан » 1991 г,

/

Ученый секретарь специализированного совета К 006.02.01, кандидат биологических наук (У $ (

Е. В. Лобанок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Методы культуры клеток растений in Vitro используются с различными целями и в разных направлениях экспериментальной, биологии, включая решение некоторых фундаментальных вопросов физиологии и генетики растений, а. там© прикладные направления, нацеленные на улучшение сушэствувдсс или создание новых сортов сельскохозяйственнных культур. .-. • Явление сомаклональной изменчивости наблвдается во всех случаях культивирования клеток или эксплантатов н культуре Чп vitro. Появление изменённых форм отмечаиг все исследователи, работающие в этом направлении биотехнологии (Larkin, Scowcroft, 1981).

Большой цикл работ досвялфн изучению факта появления изменённых форы растений или клеточных клонов после различных этапов культуры in. vitro. Различные исследователи изучали изменчивость морфологических признаков число и характер поведения хромосом, об-дее содержание ДНК, белковый полиморфизм и изменчивость митохснд-риадьной ДНК у клеточных клонов и регенерированных, растений (ifeins, 1983; Orton, 1984; Thomas et al.', 1982; Сидоров, Сидорова, 1987; Ranilu et al., 1988).

Однако вопрос природы явления.сомаклональной изменчивости, до настоящего времени ' остается , открытым (Pijnacker,. Sree Ramulu, 1930; Phillips et. al., 1990),; несмотря на то, что собственно явление сомаклональной изменчивости используется в настоящее время в генетико-селекцконных исследованиях; сельскохозяйственных культур. Некоторые авторы считает, что сомаклональныэ изменения имеют эпигенетическую природу и поэтому не заслуживают внимания, поскольку даннш изменения не ш^рут быть унаследованы и, соответственно, не могут быть.:- использованы в селекционной работе (Sanford st al., 1984). Шэтому определение причин сомаклональной изменчивости имеет не только теоретический, но и практический аспект.

Дедь ц задачи' исследования. Цедь'р настоя®го исследования явилось получение..растений-регенерантов та протопластов мэгсфиллэ листа картофеля и всестороннее их изучение. Для реализации поставленных' целей было предусмотрено решение следупщвс задач :

1. Шлучение, растений-регенерантов из протопластов мезофилла листа у разных генотипов картофеля.:

2. Проведение морфологического анализа среди регенерантов;

3. Цитологический и белковый, анализы растений.

4. Изучение степени полиморфизма длин рестргасгных фрагментов ДНК

у сортов и регенератов из протопластов.

5. Предварительное испытание растений в полевых условиях.

Научная новизна. В проведенных исследованиях были оптимизированы условия получения к культивирования протопластов из мэзофшиа листа, получении клеточных линий и индукции морфогенеза для генотипов картофеля, ранее не использованных в экспериментальной работе другими исследователями, а такж .был проведен комплексный анализ полученных ргстеяий-регеЕерантов. ••

В ревультате проведения работы впервые показано, что при регенерации растений из культуры протопластов меаофияла листа картофеля появляются растения, имеющие нормальный фенотип, во, измененные, как по белковым спектрам, так и по структуре повторов генов рибосомальных РНК, являющихся высоко консервативной частью генома.

Практическая ценность. Проведенная работа позволяет получать растения из протопластов для всех использовавшихся генотипов картофеля. Результаты исследований расширят представление о соыакло-нальной изменчивости - и позволяет утверждать,, что такая изменчивость имеет генетическую природу и, следовательно, может быть использована при составлении селекционных программ Предложен способ первичной оценки растений-регенерантов на скороспелость.

Апробация работа Результаты исследований представлены на ' Б съезде ЕОГИС С Москва, 1987), Шждународной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1888), Взесо-юзном совещании ЮФР "Регуляция роста и развития картофеля in vivo и in vitro", Республиканской конференции "Частная генетика растений" (Киев,1989), Международном совепрнии по биотехнологии картой фэля (Нэмэшаево, Киевская обл. ,1989), Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток (Звенигород, Московская обл., 1839), VII 122вдународном конгрессе по культуре клеток и тканей растений (Амстердам, 1990), на Всесоюзном совещании по, программе КП НГП СЭВ 5.1.1. (Краснодар, 1991), Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград,1991), а также, на научных семинарах и Ученом Совете Украинского ШИНХ. •

Публикации результатов исследования. Ш материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. ..■■-'.••■

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Ь&териады и методы исследований", "Результаты и обсуждение", выводов, и списка использованной литературы, вмшчгщрго 211 названий, из которых - 138 иностранные..

S

Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 5 ёабхщ, иллюстрирована 9 рисунками.

. . ШЕРИШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ■

Исходный материал. В экспериментах по выделению и культивировании протопластов из кеэофилла листа использовали сорта Лорх, Свитанок киевский, ■ Украинский розовый я . гибрида Pg-438 и 81.595/22.

Для оценки изменчивости рДНК среди сортов картофеля использовали сорта Гатчинский, Гарт, Искра, Луговской, ЛЬрх, Ыавка, Прке-кульский ранний. Украинский розовый, гибрид Pg-439 и дигаллоид сорта Гатчинский (2п»24).

. Выделение, культивирование протопластов и регенерация растений. ■ Работу по выделению и культивированию протопластов картофеля проводили согласно методической разработки В, А. Сидорова с сотр. (Сидоров и др., 1986а,б). При культивировании протопластов образовались многоклеточные колонии. Через 1-2 мес. полученные колоши 8ал лавляли в среду ST-1 для позеленения. Через З-б недель поэеле-■ невшие клеточные линий переносили поочередно на поверхность среды ST-1, а затем - на среды для регенерации растений. Образовавшиеся ростки: высотой 4-10 мм отделяли от клеточных линий и укореняли на безгоршнальной среде ЫР.

Анализ'изменчивости числа хромосом у протоклонов картофеля. }1а учение проводили по слэдупцэй методике. Корешки пробирочных растений длиной до 1-2 см отрезали и помещали в раствор колхицина СО. 01-0.057.) на 1-6 часов. Затем корешки отмывали и фиксировали в уксусном алкоголе - смеси этиловый спирт : ледяная уксусная кислота (3:1). Фиксаций проводил» в течение 24-48 час..

: Зафиксированные корешки помещали в 12-яый раствор ацетоорсеи-ва на 24-27 часов при комнатной температуре. Шсле окрашивания корешки анализировали на давленых препаратах.

. Изучение изменчивости шозгестветшх молекулярных фор« эстера-зы Z. протоклонов. Для выделения белков использовали пробирочную я горшечную культуру линий растений-регенерантов с. Лэрх. Листья растений растирали в фарфоровой ступке в жидкои азоте. Шсле полной гомогенизации добавляли экстракционный буфер в соотношении 1:1 (вес/объем). Гоиогенат цетрифугировали в пробегах зппендорф при 15000? в течение 15 мин.. "Супернатаят использовали для нанесения

lM6G8S.

3

на полкзкрллзишдный гель для электрофореза.

Для определения множественных молекулярных форм эетераэы элеетрофорез проводили в вероналовой системе. Для обшивания специфических полос белков с эстеразной. активностью ■ готовили краси- , тель с использованием раствора нафтшацетата всмэси ацетон-вода и раствора соли прочного синего в фосфатной буфере.

Окрашивание гелей , проводили при тешературе +37вС до лоявле-ния полос активности фермента. :: : С

Изучение изменчивости рДЗК у картофеля. ДНК выделяли из листьев пробирочных растений картофеля по. модифицированной наш методике к по М. (Shure et al.,1983). • ,.

После выделения и очистки необходимое количество ДНК (2-Быкг) помечали в пробирку, добавляли соответствующий для давной рестрик-тааы буфер (Шзниатис и др. ,1984), добавляли 5 единич на 1мкг ДНК рестрикцконной эндонуклеазы EcoRl, EcoRV, BamHl, Mbai и помещали в термостат при +37-"С на.4-6 часов.

После гидролиза фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 0.75Х-НОМ агарозном геле ("Siena", USA). Электрофорез проводили при напряжении 2.5 в/cu в течение 16-20 часов. При/электрофорезе использовали трисацетатный (ТАЕ) буфер, содержащий 0.04М трис-аце-тат и ЭДГА. -.v.V.:.'. '■.:,'",'' Y'.V ' ''

После электрофореза ДНК на агарозного геля переносили на нит-роцеллюлозный.фкльтр по, методу Е. Саузерна iSouthern, 1975) и вале-кали при ВО" С в течение 4-6 часов.

Для выявления фрагментов рДНК на фильтрах использовали плаз-мнду pUL222, содержащую фрагмент 3*-концевой последовательности гена 26S рДНК лимона длиной . 500 пн < Нолоша,1986). ДНК. метили мэго-дои шх-траясляции (Манниатис и др. ,1984) с использованием ДНН-по-лкмеразы Е. соИ.или набора для ник-трансляции и дЦТО с\ радиоактивным фосфором. • Меченную ДНК отделяли от не: вклвчявшегося . дЦГФ хроматографией на сефадексе G5Q. Удельная активность составляла 1СГ6-1СГ7' имп/мин на 1 ккг ДЕК. ' ■ '-v Д^;--'-

Срагмекты ДНК, кодирущие рибосомальные белки выявляли методом гибрздазацки. по Е. Саузерну (Southern, 1975) с мечеными ДНК-зон-дзма. Китроцелаалззный фильтр с затепленными фрагментами ДНК за-цачлнали в растворе 4*SET, содержащего 0.1М NaClj 0. ОЗМ трис; 2Ш ЗДТЛ), лросуаивали .. на воздухе и помещали в полиэтиленовый пакет, содержаний 3-5 ил рзствора для предгибридизации : 4*SET; 0. 2Х ДОН. Паяэг запаивали и инкубировали 2-3 часа при +в5гС. Шслв оредгиб-

ридизации в пакет добавляли денатурированнуп кипячением в 0.2М NaOH.B течение 5-7 иин., а затем нейтрализованную уксусной кислотой ДНК зонда, меченую дЦТФ (5*ltr5-líT8 имп/мин на фильтр). Шкет вновь запаивали и инкубировали при +85°С 14-1S часов. После гибридизации фильтр извлекали из пакета и промывали 10-15 мин. в растворе 2*5ЕТ и 0.2% ДОН на встряхивателе или при помешивании при +65" С в течение 30 мин. .. Затем продолжали отмывку в буфере (1*5ЕТ; 0.2Х ДСН в течение 20 мин. и O.S*SET; 0.2% ДСП в течение 20 мин. при +65СС). Ш окончании отмывки фильтр споласкивзли в 2*S£T, сушили на воздух»! и закладывали, на экспозицию с рентгеновской пленкой FJf-B в низкотемпературный морозильник.на 1-7 суток. Радиоавтограф проявляли и научали полученные материалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И 0БСУДЦЕЕИ2

•Щдучение растений-регенарантов га - протопластоз мезофилла листа. Протопласты выделяли из листьев пробирочных растений сортов Jbpx, Свкганок киевский, Украинский розовый, гибридов Pg-428 и 81.593/22.

v. Первым этапом а этой работе быа подбор оптимальных условий выделения протопласгов^. Основным условием для успешного выделения является состав ферментной смеси для мацерации клеток и растворения клеточной оболочки. 1 Наиболее оптимальными смесями для используемых генотипов были следующие : •

Ceílulysin - 1- ОХ + Macerase - 0.5Х - для с. Свитанок киевский И Pff-438.

Ceílulysin - 0.5Х +Macerase - 0.5% - для сортов Лорх и Украинский розовый.

-.- Ceílulysin - 1.5& + Macerase - 0.5Х - для 81.598/22.

- Шсле отмьсвки. от ферментного раствора суспензию протопластов помещали на питательные среды для культивирования. Анализ подученных данных показал," что различия между генотипами проявляются уяе на первых этапах культивирования, а с увеличением времени культивирования эти различия все более увеличивается. . Так, протопласты с.Лорх и с. Свитанок киевский способны быстро регенерировать и на 1-2 недели опережает в скорости регенерационяых процессов другие генотипы. " "

' Полученные микроколонии затем подращгвали на твердых питательных средах, а затем, индуцировали побегообразование. В период

2-16686

культивирования клеточных ланий мы наблаэдали значительную гетерогенность: одни.линии темнели и некратизировались, другие - сохраняли интенсивно-зеленую окраску, у одних линий наблюдали морфогенез, у других - морфогенез отсутствовал. Ш способности к морфогенезу генотипы также существенно различались. ,.; .Регенерированные растения размножали и подвергали всестороннем? изучению. ; . "

Одновременно, часть . регенерированных . растений была' передана' для предварительных испытаний в полевых условиях, фи отборе мате--, риала для полевых испытаний возник вопрос, какие из регенерантоа передать для дальнейших испытаний. • Для этого мы разработали,способ отбора форм по признаку скороспелости как. один ' из методов экспресс-оценки и отбора среди большого числа, регенерантов. В основу разработанного способа были положены наши.наблюдения о различном поведении эксплантатов разных генотипов на.питательных средах, содержащих в качестве добавки бенэимидазольную соль 2-хлорз-тилфосфоновой кислоты. Эксплантаты (междоузлия) на таких, средах образовывали корешки с интенсивностью, которая коррелировала со скороспелостью при сравнении с генотипами с известной скороспелостью. ■....'''..■•'"•" ;-V .

Шлевые растения отличались от исходного сорта по. способности к цветению. и по морфологии. ' Клубни, полученные при выращивании пробирочных растений также имели различную морфологию. 7 / :

Мэрфологическая оценка регенерантов. При регенерации в культуре протопластов наблэдади очень широкий диапазон изменчивости : по морфологии, раетелия-регенераяты с. Украинский розовый, не имели форм с фенотипом исходного . сорта. . Третья:, часть растений имела серьезные морфологические аномалии: уроды и карлики, нарушение нормального синтеза хлорофилла. Кроме гого, наблюдали тага» растения с удлиненными междоузлиями и редуцированными листьями и, наоборот - с укороченными междоузлиями. При микрочеренковании . подученных растений часть из них погибла (в основном, это уроды и хло-рофиллдефектные формы), другие же выщепляли формы с новыми типами морфологического статуса. Среди таких растений наблюдали хлоро-филлдэфекгные и сильно опушенные формы, а также формы с укороченными мэядоузлиями и с редуцированными листьями."

У регенерантов Рё~438 также наблюдали растения с морфологическими отклонениями от исходного сорта Появлялись растения с учащенным расположением листьев и укороченными .междоузлиями," растения с очень компактной формой и значительно ниже исходного

фенотипа, растения с редким расположением листьев и со скрученными листьями.. Уродов не набладали. Около половины растений тили фенотип исходного генотипа шш более мощые стебли и широкие дгатья.

Наибольпее разнообразие по морфологии среди ргстений-рэгенэ-рантов наблюдали у с. Лэрх (табл.1.). У с. ЛЪрх было получено около 500 протсклонов. Таксе количество растений было регенерировано более чем из 70 морфогенных клеточных линий. Типы морфологических проявлений у регенерантов для простоты изложения в дальнейшем будем называть "мэрфотипами"

Таблица 1.

Типы морфологических изменений у раетений-регенерантов ' е.Лэрх

; Типы Морфологические изменения Частота, %

О.

1\-2 3

4.

6 б

7

8

9 10

Растения, идентичные исходному ■ фенотипу

: Растения, идентичные исходному фенотипу, но с измененной актовой пластинкой ' Растения с короткими междоузлиями •и учаленным расположением листьев . Растения .с редуцированными листьяш и нитчатыми стеблями АлтоцизноЕые растения Растения-карлики

Растения с нарушением,апикального

доминирования

Опушенные растения

"Кусты" (растеши, не имекзие главного .стебля, а растущие подобно густой траве) 1&огостебельчатые растения Растения с хлорофимдефектньши секторами

38.6

55.0

1.4 0.4

1.6

0.2

0.6 2.0 0.2

Как видим из таблицы, 1-3 типы встречались с частотой 55. ОХ. Указанные три морфотипа объединяет изменчивость признаков стебля и листьев, ййыми словами, наиболее частш изменениям у с. Лорх подвержены признаки стебля (длина и количество междоузлий, толщина стебля) и листьев (размеры листовой пластинки, размещение щистъ&в на стебле).

2*-1668б

7

Анализ изменчивости числа хромосом у протоклонов' картофеля. Цитологический анализ растений по оценкекариотипа проводили у 31 протоклона с. Лорх, б регенерантов с. Украинский розовый и 13.ре-генэрантов гибрида - Pg-438. Для . цитологического анализа отбирали нормальные по фенотипу, образующие корни, растения. .

у протокдонов с. Украинский розовый не наблюдали изменчивости в уровне плоидности по сравнению с исходным генотипом (2п-4х«48), но выход нормальных по фенотипу регенерантов был у данного сорта очень низким (2QZ).: ; Л- •./•-- :„•'

У протокдонов Pg-438 выход нормальных растений был несколько выше, чем у с. Украинский розовый (ЕБХ) . Т5рп этом наблюдали,; что'из 13 регенерантов данного генотипа 12. демонстрировали: плоидность . исходного гибрида (2n=2x*=24), . a l протоклон показал тетраплоидный набор (2п-4х»48). \-.'.-:v' ; -7 ■

Более яркую изменчивость демонстрировали регенеранты с. Лорх. Данные свидетельствуют о разнообразии среди протоклонов. по частоте встречаемости различных наборов чисел хромосом. Чаар других ветре-, чзлись растения с' тетраплоидным набором хроыосом(48,6Х), реже - с тркплоидным набором (22.7Х). Остальные .типы плоидности встречались не чаще, чем в З-6% случаев каждый. Проведенное наш изучение изменчивости у с.' Яцвс показало,'. .что ' 48,61 ■■ раствний-рёгенврантон имели тетрашшидный набор хромосом (2п»4х»48). Такой факт, южно объяснить, учитывая, что;с. Лорх - "старый" сорт (возделывается более 60 лет) и является вутривидовым гибридом, а такяе имеет-высокую экологическую пластичность,, что предполагает стабилизацию генома.- - ...; л ';- V/

■ с другой стороны, достаточно трудно объяснитьпоявление такого больного числа регенерантов с числом хромосом близким или равным . тришюидному набору (2n-3x-S8) - 82,7%, несмотрЯна то.что подобный аффект наблвдага у с.Зарево (Хила я др. , 1987).

Изучение изменчивости множественных молекулярных формэстера-зы. К настоящему времени опубликовано достаточно много докладов хю морфологической и кариотипической изменчивости растений, рёгенери-рованных из культуры in vitro. В то ж время существует очень малое число сообщений по исследованию таких растений по;; биохимическим маркерам. Б частности, исследования ш изучению белкового полиморфизма среди регенерантов иэ культуры протопластов картофеля были проведет Д. Cvoitom (Sraith, 1986) ■ - и X. Стигеманол (Matern, Strcbel, 1337). в ларвой; работе были исследованы спектры общего

белкгС .клубней протоклонов трех сортов а найдены изменения у двух сортов (Smith,1986). Дри изучении спектров ИШ ферментов с. Рассет Бербанк обнаружили некоторые изменения 1Ш малатдегидрогеназы и не обнаружили изменений по эстеразе . (Matem,Strobel, 1987). Другие исследования по белковому полиморфизму среди протоклонов картофеля • нам не, известна, ; Дээтому.на нал взгляд, проведение подобного изучения ..позволило бы расширить представление об изменчивости среди раетений-регенерантов из культуры протопластов у картофеля.

для.исследований была взята гаоферментная система эстеразы (EST), поскольку в более ранни* сообщениях злектрофорезные спектры эстераэы демонстрировали стабильность у калликлонов (Allicohio et al. ,1987) и у протоклонов (Matern, Strobel, 1987), что свидетельствует. об . относительной стабильности данного фермента. Ш ставили своей "целью оценить степень изменчивости работы генов эстеразы у ' растений, регенерированных из культуры протоплзстов.

12 3 4 СГ 5 6 7 а 9 Рис.1. Спектры эстерааы у РРОТОКДОНОВ С. Дзрх: С?-,: исходный, с. Лорх; 1-9 г, клоны.

На рис. 1. -2. ' показана изменчивость 1Ш эстеразы. КЗ 18 проа-нализарованньа клонов 7 клонов демонстрируют появление новых полос .в.: центральной и нижней части спектров и отсутствие двух полос а нижней частя. Следует отметить,: что,. : практически, все клоны варьировали однотипно,за. исключением клона 1. Этот клав имеет трек, в - котором отсутствует ;.. всего одна полоса, однако, эта полоса присутствует у всех, даже измененных, клонов и является видоспеци-фичной, ее отсутствие свидетельствует р глубине изменений в работе

10 и а 13 Cf 1t 15 16 17 18

■Рис. 2. Спектры эстеразы у протоклонов С.Лэрх: СТ-исходяый с. Jbpx; 10-18 - клоны.

генов белков астерагы. Крот качественных изменений, изоферментные спектры эстераэы у протокловов демонстрируют также изменения в интенсивности экспрессии данных генов и/илиих амплификации.

Использованные для анализа клоны были отобраны, в первую очередь, по фенотипическим признакам, т.е. отбирались растения■ не только нормальные по морфологии, но и аномальные формы. Кроме того, для проведения окончательного фореза, представленного на рис. 1.-2., была проведена предварительная проверка 75 регенеран-тов. Общее число растений, показавших измененный белковый статус по эстеразэ составляет 18,7%. Если сравнить морфогипы использованных клонов, становится ясно; "что проявление того или иного ыорфо-. типа, дззке существенно отличающегося от исходного сорта, далеко не всегда сопровождается изменением белкового фенотипа. Так, клоны 5, 7,10, 16 характеризуются усиленным синтезом ангоциана по всему растении, однако, изменения по IШ эстераэы наблюдается - лишь :,у клона 7, в то время как клоны 5, ;1Q и 16 не имеет, изменений в бел-; новых спектрах.' Растения, на- листьях которых встречаются : хлоро-. филлдефэктнке участки (клон 4) не Имеют изменений.во зстеразе. ; И, наоборот, . нормальный фенотип иногда сопровождался.' изменениями в спектрах йстерззы ( клоны 8, 12, 13, 18, ).

Изменчивость рДНК £ картофеля. Научение изменений генотипа после прохождения через культуру in vitro не ограничивается только цитологическим, биохимическим и морфологическим анализами.В последнее время была проведена работа по изучению структуры мтДШ и хлДНК у регенерантов га протопластов у картофеля {Kemble, Shepard, 1384). ^■•С';- -

Анализ изменчивости яДНК- сопряжен с определенными методическими трудностями. Высшие растения имеют очень большой ядерный геном, составлящяй 10~9г10~10 пар оснований. Больщую часть ядерного генома составляет повторяпциеся последовательности (60-90%), которые образуют семейства. . ■ "'■-.' ■ \

Одним ш наиболее изученных является, семейство повторяющихся последовательностей, кодирукцих 18S, 5.8S, 26S рибоеомальныэ РНК, которые входят в состав цитоплаэматических рибосом и составляет около 90S оСкэклеточной.РНК. ••<

Ко Бремени начала проведения работ по анализу рДНК имелось одно осознание о наСлвдаеюй изменчивости генов ррш среди растений картофеля, регенерированных из культуры In vitro (Landsmann, Ufcrig, 19S£), в котором авторы обнаружили ,редукцию числа генов у

Ю

одного семейства.повторяющихся последовательностей у растений, ре. генерированных из протопластов. Это семейство повторяющихся последовательностей авторы отнесли к семейству генов рРНК. Более глубоких изменений, как-то, перестройки структуры ДНК, не было обнаружено.;:.

ИЬследования по анализу рДНК целесообразно было провести так-жб, поскольку рДНК - очень консервативна в пределах одного вида и имеет достаточно большое число'повторов на геном.

Изменчивости генов рРНК у сортов. Рэред проведением анализа по изучению структуры рДНК у протокдонов, . мы решили оценить степень изменчивости рДНК среди разных сортов. Для получения более объективной оценки мы вклотиди в эксперимент гибриды различной степени сложости и филогенетического родства.

• Среди приведенных геногшюв были'как шжаидозыэ гибриды, з создании которых принимали.участие один-два вида картофеля (Гатчинский, Искра, Швка), так.й мелшидовые гибриды, в создании которых принимали участие 5-В видов картофеля (Рг-433, Украинский розовый, ЛугоЕской), а также - внутривидовые гибриды (ЛЬрх, Пряе-кульский ранний).

1Л Р9 УР ДагПр Гт И М • и Р9 УР AyrПр Гт И М

Fnc.3. Струга ура повторов ; Рис.4. - Структура повторов рДНК у сортов при исподь- РДНК у сортов при «спо-ть-

аозаниа EcoRl. ' . '"'■''.' зовании BairHl.

Нарис. 3.-4. показана структура рибосоыалышх повторов сортов Лзрх, Украинский розовый, Луговской, . Цриекульский ранний, Гатчинский, Искра, ,. Мзлка и гибрида Pg-4-38 при гидролизе ДНК EcoRl и BamHl. Результаты блот-гибридизации с данным зондом свидетзльству-

ш о том, что разнш генотипы имеютразную конструкций: повторов рибосомальных генов и тип этой конструкции не зависит от происхождения, т.е. от наличия в геноме наследственного материаладругих, видов картофеля. 1Ь . характеру появления полос габридазацаи мы условно разбили все исследованные генотипы, на три- группы : ■ 1 ..-. с. с. Лорх, Гатчинский, ■ Искра и Швка; 2 - Рв-438; з - с.с.'ЛУ" говской, Украинский розовый и Цриекульский ранний (рис. б). ч ..,-. .

ВатН1 Есо Расположение сайтов узнаваний

' ЕсоИ может свидетельствовать о том, 3 2 1 1*2 3 что генотипы, относящиеся к первой и

• третьей группе имеют два типа повто-

__■^тш, Р°в РДНК с одним сайтом узнавания;

Щ *—* ___ЕсоИ. в каждом повторе : и двумя сай-

ПГмм , тами ВашН1, а Ре-438 (вторая группа) — ' имеет три типа рибосомадьшдг - довто-

. ров с одним сайтом ЕсоЮ. и двумя; ~~~ сайтами ВазН1 в каждом повторе. : 1а-

. кой логический вывод позволяет предположить о том, что все товтйры рДНК УР Рд ХЛ М Рд УР у сортов картофеля имеют одинаковой

Рис. 5. Типы повторов число сайтов узнавания ЕсоИ. и Ваяй! рДНК. и различаются лишь длинами повторов.

Такая консервативность в изменчивости рДНК подтверждается исследо-1 ваниями Хвырлевой с сотр., которые показали, что различия в говто* рах рДНК среди сортов ячменя определялись длиной нетранскрибируе-мого спейсера (Хвырлева и др., 1987).

Изучение изменчивости генов рРНК £ регенерантов из протоп-. ластов. Ддя нроведенняоценки изменчивости рДНК: среди нескольких десятков растений . при выделении ДНК использовали модифицированную нами методику выделения (см."Материалы-и методы"). .

После оптимизации выделения ■ ДНК была освоена методика блат-гибридизации, т. е. переноса рестриктных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизации с радиоактивно меченными зондами (в данном случае плазмида рШ222, содержащая фрагмент 3'-концевой последовательности 263 рДНК лишна длиной 500пн). ■

Результаты гибридизации данного.зонда с рестриктными фрагментам! ДНК регенерантов . из протопластов свидетельствуют о наличии внсоксй степени изменчивости по сравнению с исходным сортом (рис. е.).

CI 1 2 3 4 5 6 7 S "9 10 11 12 13 1<t 1S

; Eco Ri pU L 222

Рис.. 6.- Изменчивость рДНК среди протоклонов картофеля с. Jbpz.

СХ - исходный сорт; 1 - 15,- линии протоклонов.

Как видно на рисунке, сразу четыре клона демонстрируют существенные различия в характере организации рибосомальных позто^ ров, . по сравнению с контролем (исходный с. Jtopx). Так, верхний фрагмент значительно деамплифицирован у клонов 4, б, 12, а нижний : Фрагмент несколько деамплифицирован у клона 12 и существенно - у . клона 6.

■ ; Однако,.не только изменения в уровне амплификации рДНК демонстрирует ■ проанализированные растения. Мы обнаружит новый тип изменчивости изменчивость структуры повторов. Такую изменчивость : демонстрируют клоны 4 и 6. - фи этом, как -видим, "появляется совершенно новый фрагмент, :не характерный для исходного сорта.

После проведения анализа изменчивости рДНК у протоклонов и сортов мы обратили внимание на тот факт;, что изменение . структуры : рибосомальнрго повтора у клонов 4 и в (рис. 6. ) происходит, вероятно, не произвольным образом, т. к. структура повторов данных клонов аналогична таковой , наблюдаемой у некоторых сортов картофеля, .представляющих.третью группу сортов. . Поэтому, ш решили провести сравнительный "анализ . представителей обеих групп сортов и клонов с. Лэрх, демонстрирующих измененную структуру повторов. Для более яркой демонстрации характера изменчивости были _ использованы в эксперименте сочетания разных фердонтов рестрикции (рис. 7.).

/[:;"_ Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что изменения структуры рибосомального повтора у рег.енерантов из протопластов имеют определенную квантованное«. Иными словами, повторы рДНК изменяются на* определенную величину. Более того, измененные повторы подобны повторам второй группы сортов, т.е. сор-гам Украинский розовый, Дуговской, Дриекульский ранний. Таким образом, происходит нэ произвольное изменение повторов рДНК, а наблю-

дается „.обсааднашш„сдногр.. лд^трех jjaroe обнаруженных типов повторов. ; BamHl Xba 1 EcoRV'BamHlEcoTa^XbäT l

4P >л • 6'-.V w Г ;У . "и (, ц зр

Рис. 7. Структура повторов у разных генотипов картофеля при использовании различных сочетаний рестрикгаз: УР-с. Украинский розовый, Х5-с. Лорх, 4 и б - протоклоны с. Jbpx. ..

Естественно, что может возникнуть вопрос,. •почему изменения происходят именно таким образом, изменяясь лишь на строго определенную величину? Ш считаем, что окончательный ответ дать еще. преждевременно, однако, можно предположить, что подобный феномен возможен при изменении длины межгенного спейсера,. или нетранскри-бируэмого спейсера (HFC). Результаты секвенирования последователь-^ ности кодирующей и некодирующей зон повторов рДНК; показали, что HIC состоят из многократно повторягщихся последовательностей субповторов, длиной от 115пн до 400пн й различия в длине НГС обусловлены разным числом этих субповторов. (Saghai-Maroof et al-, 1984; Yakura et al., 1984; Jorgensen.et al., 1987; Choumane, Heizmann, 1383). Ероке того, Хвырлевой о сотр. было показано, что различия между сортами ячменя в структуре рДНК определяется длиной межгенного спейсера ( Хвцрлева и др. ,1987). А изменения в повторах рДНК у регенерантов в наших опытах подобны изменениям между сортами. : ГЬэтоцу, было бы логично объяснять варьирование длины повторов рДНК. у картой ля за счет делеций/вставок субповторов НГС при шпотической рекомбинации между хромосомами в соматических клетках при культивировании клеток и регенерации растений

Шхаяизмы подобных изменений епэ не. изучены, однако, считается, что одним из механизмов, . приводящим к изменению структуры повторов рДНК, itüхат быть неравный кроссинговер (Smith, / 1976;' ■ Petes, lSSO) кли конверсия генов (Baitljnore, 1981). ^

Возможно, такой процесс изменчивости,- как. делеция/вставка

субповторов ЯГС позволяет варьировать структурой повторов рДНН, яэ внося изменений в кодирупщэй части повторов, т.к. последнее, несомненно, привело бы к изменениям в процесс биосинтеза белка в клетке и, в конечном итоге, могло бы привести клетку к гибели.

Следует отметить также тот факт, что клоны с измененной структурой повторов рДНК (4,8,12) имели совершенно нормальный фенотип. В то же время мы изучали изменчивость рДНК и среди растений с другими типами морфологического статуса, включая и глубоко аномальные формы, и, к Еашеиу удивлению, ни один другой тип не обнаружил изменчивости в структуре повторов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что растения, регенерированные из культуры протопластов' у картофеля демонстрирует глубинные генетические изменения, выражающиеся как в изменении числа копий повторов, так и в изменении структуры повторов рибосомальной ДНК, что представляет совершенно новый аспект в изучении влияния культуры in vitro на растительные геном*

. 2. Проведена оптимизация выделения и культивирования протопластов из мезофилла листа, а также получены растения у пяти ранее не использовавшихся генотипов, картофеля, имеющих различное генетическое происхождение.

3. Сравнение ростовых процессов в культуре in vitro как на клеточном уровне, так и на уровне пробирочных растений, свидетельствует о специфической реакции каждого генотипа на условия m Vitro. ._:•'.•.'

• 4. Проведенный морфологический, биохимический и цитологический ■ анализы продемонстрировали широкую изменчивость среди растений-регенератов не только по фенотипу и по числу хрожсом, но и по спектрам изоферыентов.

б. Оптимизирована методика выделения и очистки ДНК из разных генотипов картофеля, что позволило успешно провести блот-гибриди-зационный анализ сортов и растений-регеиераятов.

в.- Разработанный способ отбора пробирочных: растений по признаку скороспелости позволяет, проводить быстрый скрининг по указанному признаку» Это ускоряет процесс отборами оценки форм по хозяйственно-ценным признакам для практической селекции.

Список работ, опубликованных но теме диссертации :

1. Пэтюх Г. EL Изолированные протопласты картофеля и их использование в генетико-селекционной работе // Тез. докл. 5 съеэ-

да ВОГиС им. Е И. Вавилова. - Москва. - 1987.

2. ■ Штюх Г.Е,. Оценка in vitro изменчивости растений-регенерантов из протопластов-у картофеля // Тез. докл. междунар. 'конф. "Биология культивируемых клеток -и биотехнология".- Новосибирск.• - 1988. - : ,'■

3. Пегих Р. П., Кравец о. "А. Влияние "питательной среды на популяции изолированных протопластов картофеля // Тез. докл. всес. науч.- техн. конф. "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине".- .йэнинград-Шскаа.-,198а . "/-.'; .■••/'. Л -:V ■

4. Кучко А.А., ЕредкоЕЕ, Кононученко А. А., Коваль Е Д., Штих Г. tt Изменчивость популяций протоклонов картофеля по устой-. чиеости к фитофторе при искусственном заражении -// Тез. ' докл. респ. конф. "Частная генетика растений". - Киев.- 1989.

5. Кучко A.A., Дредко М.Н., Кононученкр А. А., Маруневко И.И., Петхзх Г. П. изменчивость признака устойчивости исходного материала картофеля, полученного методами клеточной инженерии к мокрой гнили // Тез. докл. науч. -произв. совев;. "Селекционно-генетические, фи-знолого-биохимические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля".- Уфа.- 1989.

6. Кучко А.А., Пэтпх Г.П. Изменчивость среди сомаклональных вариантов из протопластов у различных.генотипов картофеля // Тез.-: докл. всес. конф. по генетике * соматических клеток в культуре, поев. пам. ЕИ. Шапиро.- Звенигород-Москва.- 1989. •

7. Петюх Г.Е, 1йгчко А. А. Различия ростовых процессов в культуре in vitro у разных генотипов картофеля// Регуляция роста и развития картофеля. - ЬЬсква: Наука. - 1990.

8. Еорисос ЕЕ, Штюх Г. Е , Кучко А. А., Глеба В. й. Изменчивость генов рибосомальных РНК у растений-регенерантов из протопластов картофеля // Тез. докл. 2 съезда ВОФР. - Мэсква. - 1990.

9. Способ оценки скороспелости селекционных фэрм картофеля //a.c. n 1578191, КучкоА-а., Штех Г.Е, шщко ЕЕ

10. Petyuoh а Р., N. V. ; Borisyuk, A. A. Kuchko, Y. Y. ; Gleba Variability of ribosoraal . RNA genes amongst . potato protoplasts-derived plants // Abstr. VII-th Intern. . Congr. on Plait Tissue and Cell Culture, Amsterdam, 1990. : J^ . • . .

Подписано ж печати I5.I0.9I. Формат 60x84 I/I6. Офсетная.печать. Усл.печ.л. 0,93. Учета.-изд.л. 0,8. Tiipax КО экз. Зак. 16686.

ШШ УкрНЖШТИ, 252I7I, Киев, ул. Горького, 180.