Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культура тканей, протпластов и генетическая трансформация голубиного гороха (Cajanus cajan (L,) Millsp.)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Культура тканей, протпластов и генетическая трансформация голубиного гороха (Cajanus cajan (L,) Millsp.)"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

САРАВДЖЙ Биджайя Кетая

КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ, ПРОТОПЛАСТОВ-И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ГОЛУБИНОГО ГОРОХА С Cajanus cajan (L.) Mi lisp.].

Специальность 03. 00.12 - Физиология растений 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена в отделе патофизиологии к клеточной инженерии Института клеточной биология и генетической инженерии АН Укра-шы.

Научный руководитель - академик АН Украины, доктор биологических наук, профессор ГЛЕБА ¡0. Ю. ■

Официальные оппоненты - Доктор биологических наук,

ьедувдай научный сот рудник, Левенко Б. А.

Доктор биологических наук- , »едущий научный сотрудник, Сарнацкая Б. В.

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии и

генетики, АН Украины ■

Завита диссертации состоится"^ п ^ОМз^^Ц. 992г. в часов на заседании специализированного совета Д. 016. 5?. 01 по заздгае диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте Физиологии Растений и Генетики АН Украины.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Автореферат разослан "

1992.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук В. А. Трухансз.

Г ЯТ»..„ J

j Mbi v" [

окцдя xapainmiciim работы

Актуальность темье За провадпдае 10 с небольшим лет генетическая и клеточная инженерия растений достигли впечатляющих успехов в расшифровке механизмов организация, функционирования к регуляция растительного генома, а также в конструировании ковьк форм расте-31 Кй, ОиЛВДа!Си5*Х ЦсЛЫМ РЯДОМ ХОЗЯЙСТЗЭНКО- ценных признаков. Развитие зтого направления вывело пауку на новые ступени з познании живой природы. Более того,- применение методов биотехнологии растений уже в настоящее время существенно изменяет и ускоряет селекционный

jjpu-цсиu JJU .0 сиз стлали ¿¿¡iuwrwj'^wvna^^etA. JU уи^им^ло.; /> .nct-v.ici.A uiip/i^i

ним факторам среды сортов сельскохозяйственных растений.

В то же-время подавляющее большинство экспериментов по клеточкой к генетической инженерии растений проведены на видах из семейств пасленовых и, в меньвей степени, крестоцветных. Значительно хуже изучены в этом отношении важные. для сельскохозяйственного

ПрСИЗЕОДСТЗЗ ВИДЫ ЙЗ С£)>'8ЙСТЗ ЗЛоКОЗЫл JJ uCuOBKX«

Ео многом зто положение сложиось из-за проблем, связанных с культивированием этих видов растений в условиях ¿л vitro, регенерации растений из неорганизованных клеточных линий (каллуса), оптимизации условий культивирования протопластов.

Попытки решения этих задач, опубликованные в работах, вышедшие к моменту начала навих исследований (1989 г.), имели ограниченный успех. Только у таких видов как лицерна или. клевер белый из семейства бобовых были получены положительные результаты по культивированию протопластов и регенерация растений, позволяющие более оптимистично смотреть ка возможность получения трансгенных растений и соматических гибридов у этих видов. Хотя о' регенерации растений из протопластов гороха сообщалось, процент' регенерации полных растений был очень низким и воспроизводимость результатов вызывала сомнение.

Цели и задачи ксслалрвамия: Е связи с вышеизложенным, целью настояЕ^й работы была разработка приемов и методов генетической и клеточной инженерии для голубиного гороха (Cajanus cajsn, семейство Fsbaceae), и получение при помоща этих способов трансгенных клеточных линий и растений, а также соматических гибридов. Кроме того, предполагалось изучить возможность использования мутантов "shooty" Agrobactenum tunsfaciem для улучшения регенерационкого потенциала Cajanus cajsn. ■

Согласно поставленной цели з задачи экспериментальной работы входило:

- г -

1. Разработать пркег-щ и методы выделения и культизирозакия протопластов у голубиного гороха [Cajsr.;js cajsn (L.) Mi lisp. ].

2. Выяснить возможность регенерации растений из протопластов и стандартизации системы: растение - протопласты - растение.

• 3. Установить возможность регенерация растений ;:з каллусов, полученных кз разных частей растения.

Л Лггплтгд wmii ri «ч г>/-\ nrvrr^s

■»> VAi^c^cj-urAx ж) - awomj/ruiwuAiJ с»гшл х О 4 wpuAa

rt. L,uuci cv-» i сг^^з доде и^л^у^ u icno>

5. Определить возможность переноса раститех^кы:*: селективны^: генов в гслубинкй гсро>: при помслрх ^robs^t^ri^ tiwgfoCiens.

w« jjotfiuhjHAU nw u u^iu о uлая^у} saj ± auUuwy

4. tuneTaciens для индуцирования регенерации in vi tro при культивировании клеток и тканей голубиного гороха

7. Разработать приеш генетической трансформации путем элек-ропорации протопластов в присутствии плазмидных ДНК, несувдсс маркерные эукариотические гены. •

u. A или uj/jriojwoi lutnauiir^iujii л jfiuyn/^jrioai^rijfi u №uU4wcuaa

нием инактивации одного кз партнеров гаьав-облучекием.

9. Выявить возможность перекоса селективных ¡.аркерных признаков и развития растений с маркерная чертами.

10. Определить возможность передачи голубиному гороху шрфо-генетической способности от диких видов растений путем слияния облученных протопластов донора с протопластами реципиента.

11. 'Доказать трансгенную природу отобранных растений при помощи ДКК-ДКК гибридизация по Саузерку и определения активности ие-омицинфссфотрансферазы.

Каучядя новизна; Были стандартизованы методы регенерации растений in vitro к идентифицированы эксплантаты, способные к регенерации растения. На;,а; получены такяа растения-регенеранты.

Впервые разработаны и стандартизованы экспериментальные протоколы для изоляции протопластов мезофилла и каллуса и получения каллуса из изолированных протопластов.

Впервые обнаружена совместимость хозяин-патоген при передаче плазмидной ДНК между голубиными^ горохом и A. tunefsciens.

Впервые показано, что интеграция генов Т-ДНК мутанта "shooty" A tumefscieris в геном растения голубиного ropGxa, не обладающих признаком регенерационкой способности, приводит к появлении такого признака у трансгекных линий.

Впервые получены канамицпнрезистсктные клеточные линии и рас—

текия-регенеранты посла введения з голубиный горох гена с помощь и Agrobac tc-r 2 ил

Впервые мэзофклькые протопласта голубиного гороха были трансформированы ялззмиднсЯ. ДНК посредством злектрспорации и показана интеграция селективного признака в трансгеняые клеточные линии

Впервые отработана методика мехсемействеккого' асимметричного слияния между облученными маркерными (канампцикрезистентнымк) протопластами //, tabacum и протопластами С. cajan. Продукты сияния делились к образовывали клеточные линии, которые были отселектиро-ваны на среде, содержащей канамицин.

Практическая ценность: Разработанный нами способ выделения и культивирования протопластов может Сыть использован в клеточной и генетической инженерии растений для получения ценного исходного селекционного материала у голубиного гороха.

Открытие совместимости Agrobscten um tumsfaciens и клеток или тканей голубиного гороха при инфицировании открывает возможность непрямой передает гена этому сельскохозяйственному растению, имею-¡цему большое практическое значение. Нам удалось получить траксген-ные канамицкнрезистентные растения, представляющие интерес для дальнейших исследований.

Стандартизация экспериментальных протоколов и идентификация эксплантатов, способных in vitro регенерировать растения, делают реальным их различное практическое применение. Использование этих эксплантатов для индукции сомаютональкой изменчивости и переноса генов с помощью Agrcbacterium посредством совместного культивирования имеет большое практическое значение в программе улучшения полезных качеств голубиного гороха.

Попытка асимметричной парасексуалькой гибридизации протопластов голубиного гороха с протопластами N. tabacum оказалась успешной. При дальнейшем культивировании продуктов слияния были получены клеточные линии. Это имеет большое прикладное значение в отдаленной гибридизации голубиного гороха с родственны®! видами, имеющими желаемые агрономические признаки.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были доложены на: 1. XI International Symposium, Embryology and Seed Reproduction. July 2-7, 1990, Leningrad, L'SSR.; 2. International protoplast synposium, June 16-20, 1991, Uppsala,' Sweden; 3. International Symposium on Plant- Biotechnology and Its contribution to tha Improverent. Geneva, Switzerland, April 19-20, 1991.; 4. First symposiün 'Trends in Plant Biotechnology', November 20-22, 1991 r. Pusohino, Mosoow, USSP.

Публикации: Основные результаты диссертация отражены в еосььп печатных работах, список которых приводится а конце автореферата.

Структура и сйьеа райоти Диссертация состоит из "Введения" глав "Обзор литературы", "Материалы я методы", "Результаты исследований", "Обсуждение полученных результатов", "Выводов" и "Списк литература", вкаачакацрга 330 библиографических ссылок. Рабата изломана на 160 страницах ыааикоаиси, содержит 5 таблиц и 8 рисунков, вклвчавдих 45 фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

В работе использовали следующие сорта и линии видов из семей ства бобовых. Семена голубиного гороха, Cajanus cajan (L.) Mi 11 sp., сорт ICR,-87 (arfcsr), RA'í-l (Raygada local) и KAIJ-1 (kandula) получены из (Regional Pulse Research Station, Kayagarh, Qrissa India). Транегенкые растения Ihcotiam tatacara L., устойчивые : канаыицинсульфату либезно предоставлены ¡с б. к. Зубко Е. И. , йнсти тут клеточной биологии и генетической инженерии АН Украины.

У всех вышеперечисленных видов после стерилизации семян 2 раствором Ajatine (Slovakcfanna, Czekoslovakia) а течение 15-2 мин. и троекратной отмывки стерильной дистиллированной водой был получены асептические растения. Растения выращивали на безгормо калькой питательной среде ,\5 (i.lurashiga & SKoog, 1952) в культу ральной комнате (13-часовой фотопериод, освещение 2-3 тыс. люкс температура 25 ±2° С). Эксплантаты и культура каллуса.

Семядоли, семядольные сегменты, гипокотиль, листья и стебел были взяты из проростков различного возраста и высажены на агари зованную среду MS с различными концентрациям фитогормонов (БАЛ кинетин, аденкнсульфат, зеаткн, ГКд, 2,4-ДиНУК), для того чтоб исследовать возможность каллусогенеза и регенерационную способ ность.

Фрагменты семядолей к декантированных проростков культивирс вали на твердой среде !.S с добавлением 1,5 мг/л или 1.0 мг/л БАЕ чтобы индуцировать органогенез и регенерацию растений.

Различные эксплантаты, такие как семядоли, листья, эпикотил и стебель дедифференцирогади в каллус на агаризованной среде МЗ В5 (Gamborg et al. , 1963). Каллусы поддерживали на питательной среде, содержаний 0,5 мг/л ВАН, 0,5 мг/л 2.4-Д и 0,5 мг/л НУР и в дальнейшем испсльззоаали для выделения протопластов.

- 5 -

РьЩелеИЪ»? И Л'í»ÍC1 TIpQTOrKSCTQB.

Листья асептически выращенных растений или гародышн нарезали полосками размером 1-2 мм и помешдли в ферментативную смесь следующего состава: 2,0% Onozuka RÍO (SERVA), 0,8% Macerozime RIO (SERVA), 0,3% Pectinase (KOCH-LIGHT), 0,8% Drisslase (SISMA), 0,4% Cellulysin (Calbiochsm). В качестве ссмотика использовали 0. 4 М

О и. Л/Л { ¿ji k-í a J. i lU'C U HOi írf ¿llllyjUL CK/iu;.

Инкубация растительных тканей в указанной смеси продолжалась в течение 16-18 часов. После инкубации смесь фильтровали через капроновый фильтр (диаметр пор 50-80 мкм) я затем центрифугировали при

РПО^ОЛГЛ гчЛ А/ггтт -п m.—.Tir- »tT»o О *rt#rr TI-i T» -\rv «-* ■»»<-* »»*т*г«л vrt* •»»**/■%/•» int. itrtwt» 3

uuü uuu ии/ «a-i-i. si Acr-icín/ic a* ¿vijrxn* А^аДииjf w x jj ^¿^сиил-ил/ d

осадок суспендировал;: в 0,5 M растворе сахарозы и наслаивали сверху раствор V5 (ifedgyesy е£ si, 1980). Полученный градиент центрифугировали при 200 об/мин. в течение 10 мин. Флотирующие протоп-

lOaDD U ¿ UA'J^'C^J-Ji, L J i? j-'O^ ¿ÜL'^J" IIU 'i L'UO.'r^a.Ut tl^íL tjfSlíi

рифугировании S00 об/мин. з течение 3 млн.

Изолированные протопласты использовали в экспериментах по генетической и клеточной инженерии бсбсвых или ж суспендировали в модифицированной среде KM Sp с конечной плотности 2 х 104- 3 х 10^ протопласта/мл и переносили в чайку Петри и ставили в термостат при 28°С. Через 3-5 суток культивирования приступившие к делению протопласты разбавляли разным обьемом питательной среды С с 0,35 М маннитолом, 0,4 мг/л 2,4-Д (SISMA) и 0,5 мг/л кинетина (5I0LMA). Спустя еще две недели культивирования образующиеся микроколснии разбавляли равна,! объемом питательной среды С с 0,25 М маннитолом я теми ' жг фитогормонами. После одного месяца культивирования в жидких- питательных средах растительные клеточные колонии при помоги пастеровской пипетки наслаивали на плотную питательную среду С ;Catoche, 1980) с 0,??» агаром (DIFC0) я варьирукцими концентрациями различных фитогормонов для поддержания клеточного роста, образования зеленеющих на свету колоний и .регенерации растений. Электрошрация протопластов

Злектропорацкю протопластов экзогенными плазмидными ДНК ссу-цэствляли по модифицированной нами методике, разработанной 3otrykus et ai. (1985). После месяца культивирования образовавшиеся клеточные колонии пастеровской пипеткой наслаивали на питатель-lyio среду С, содержащую 1 мг/л БАЛ, 0.5мг/л'2,4-Д, 0,5 мг/л зеати-ia и 100 мг/л канаъкцинсульфата. Спустя 3-4 недели культивирования «ленещие колонии отбирали и ■ переносили на авеяув питательную :реду того же состава, но с 50 мг/л какамгаушсульфата.

Бактерии и шшлмиди.

Agrcbactenw fdimfaasns вкличает плазмиду рАСЗЗЗ, которая содержит мутантный ген Arabiüopsjs AHA5/ALS (Acetohydroxy acid synthsse/scetolaotate synthase),. клонированный в pBinl9 (Sathasivan et ai., 1990). Эта плаэмида представляет 5,5 kb :-:ba I фрагмент, содержащий ген Arabidcpsis AHAS с мутацией а аминокислоте if 653. вмененный AHAS фермент определяет селективную резистентность к имидазолишюыу классу гербицидов. Вместе с этим конструкция также сохраняет NPT II ген под промотором для селекции капами-цика.

. A. tumi Гас is г,s, штамм GV3101, несет плазмиду p8V2205' (Leenans et al., 1981), производную октспиновой плазмиды TiE6S3, у которой гены синтеза ауксинов замещены бактериальным геном устойчивости к канампцинсуяьфзту с сохранением нормальных функций других генов Т-ДНК, в том числе и гена биосинтеза цитокининов.

A. rhi zage nés содержит плазмиду pRiA4, перенос которой е растительные клетки определяет фенотип "бородатого корня".

Escherichia coli, итамм К 2013, несет pSA472.

йзе бактериальные штаммы выращивали на среде Ltí с добавлением 20 мг/л канампцлксульфата (КУРГАНСКИЙ ЗАВОД МЕДПРЕПАРАТОЕ, РОССИЯ) ,

Выделение плазмид осуществлял!} по методу, изложенное Man i at is et al. (1982).

Генетическую трансформации у голубиного гороха, опосредованную Agrûbacteriusi tuirefaciens, проводили следующим образом. Кусочки стеблей и листьев длиной 0,4-0,6 см суспендировали в жидкой питательной среде С, М5, содержащей разные концентрации 2,4-Д, КУК, кинетика или ВАЛ, и добавляли к ним ночную культуру A. turne fаг ciens. Подобным образом различные эксплантаты погружали в ночную культуру A. tunzfaci&rs, быстро высуживали на фильтре и кокульти-вировали в жидкой среде с различными концентрациями 2,4-Д, БУК, кннетина, БАЛ, а также- на безгоршнальнсй среде. Совместное культивирование продолжалось в течение 4S часов при постоянном перемешивании. Затем кусочки растительны:-: тканей извлекали из среды, высушивали стерильной фильтровальной бумагой и раскладывали 'на плотную питательную среду С, MS с добавлением 300 мг/л карбеницил-лина (ПО "ЫССИЕДПРЕИАРАТК", РОССИЯ), 200 мг/л цефотаксима (CALBI0-СНЕМ) и различных концентраций 2,4-Д, НУК, кинетика, БАП или без фитогормонов, Спустя две недели культивирования растительные ткани и образующиеся клеточные линии переносили на питательную среду

того же состава с 200 мг/л карбенициллина и 200 мг/л цефотаксима. В случае использования агрсбактеряй, несущих ген устойчивости к канамицинсульфату, в эту питательную среду добавляли также 100 мг/л канамицинсульфата. Через две недели культивирования клеточные ткани переносили на свежуй питательную среду, содержащую 100 мг/л карбенициллина и 100 мг/л цефотаксима. Образующиеся на этой питательной среде змбриоиды перекосили на свежую среду того же состава. В случае использования агробактерий, несущих ген устойчивости к канамицинсульфату, отобранные клеточные линии пассировали на питательной среде !.Б с 50 ыг/л канамицинсульфата, 1,0 иг/л 2,4 Д,

0.5 мг/л НУК и 1,0 мг/л ЕАП.

Слияние протопластов проаодили по методу, предложенной' Neg-rutiu et al. (1983) для слияния мегсфи.тьных протопластоз. Предварительное облучение протопластов th cotí ana taüacuzi проводили на установке "Исследователь", используя з качестве облучателя 60Со с удельной активность» 22 рентген/сек.

Отбор асимметричных соматических гибридов проводили на питательной среде С, содержащей 50 мг/л канамицинсульфата в качестве селективного агента, а такле 0,5 мг/л кикетина, 1,5 мг/л ЕАЯ, 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л аденинсульфата.

Растительные ДНК выделяли по методу, предложенному Dellaporta eí ai. (1983).

Гидролиз аликвот растительных ДНК проводили рестриктазами, (НЮ "ФЕРМЕНТ", г. Вильнюс, Литва) в буферах и условиях, рекомендованных изготовителем. Электрофорез а агарозных гелях проводили стандартным методом (Maniatis et ai., 1982).

ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну проводили по методу, описанному в методическом руководстве фирмы A'-ERSHAM.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Регенерация многочисленных растений и изолированьа сегмеитон семядолей и декапктиропшсадс проростков.

Так как регенерация растений in vitro необходима для использования техники клеточной а генетической инженерии, были проведены эксперименты, чтобы определить составы питательных сред для инициации и пролиферации каллуса и регенерации растений голубиного тороса. Различные эксплантаты, такие как листья, стебель, пшокотиль и :емядоли культивировали на твердой среде КБ и В5 с рядом комбинаций ростозых- регуляторов. Среди них ауксин 2. 4-Д был более зффэк-

- а -

тивен, чем НУК, в тс время как. йУй сказывал о<кнь слабое действие при индуцирований каллус^образования в комбинации с ЕАП или кинетином. Хотя комбинации 2,4-Д с ЕАП или кинетином индуцировали раннее калусообразование, каллусы быстро темнели во время дальнейшего культивирования. Комбинации НУК (1,0 да/л -2,0 мг/л) с БАЛ (0,5 мг/л) индуцировали калусообравование в течение 7-10 дней, и каллусы сохраняли жизнеспособность при дальнейшем культивировании по крайней мере 4-6 месяцев. Комбинации 2,4-Д с кинетином были худкими для индукции каллусообраэования,, так же как и для последующего поддержания (сохранения) каллусов. Подобным образом комбинации КУК с кинетином оказались неподходящей для этих целей. Детальное изучение листьев семядолей и изолированных сегментов семядолей было предпринято, чтобы обнаружить возможность регенерации растений. Поскольку каллусообразование и рост каллусов из всех типов эксплантатов происходил лучше на f,E среде, чем на В5, первая была выб-

рЗКВ ДЛЯ ДпЛЬКёйИшл *1ССЛ£Ди£оНИй.

PergKc'pSIyîn р5СТ6НИЙ ИЗ ЯоОЛж'рОВдНЫХ Cgr«fôHTGB С6 Мл ДО Дуй.

Еа среде Î.S с добавлением БАЛ проксимальные сегменты семядолей, полученные при поперечном отсечении семядольных листьев, продуцировали органогенный каллус, на котором дедиференцировались приыордии проростков в течении 3-4 недель культивирования. На среде ï.G с добавлением 1,0 мг/л ЕАП вначале происходило каллусообра-аование, за которым следовала регенерация проростков. Проростки, регенерировавшие из органогенного каллуса, не образовывали корней, несмотря на длительное культивирование. Концентрации БАП ниже чем 1,0 мг/л индуцировали несколько проростков только из центральной части каллуса, тогда как периферическая часть каллуса оставалась неорганогенной. В течение первых 3-4 недель культивирования . были получены проростки 1-1,5 см, после чего дифференцируются каллусы переносили на свежу» культуральную среду с тем же самым гормональным составом. В течение последующих 3-4 недель культивирования полученные проростки достигали размера до 5 см. Таким образом, в течение одного периода (7-а недель) при использовании предложенной методики из проксимальных сегментов семядолей можно получить многочисленные здоровые проростки. , ,

, Снижение концентрации ЕАП ниже 0.5 мг/л приводило к • плохому каллусообразованию и, наоборот,■ при увеличении концентрации БАП (более 1,0 мг/л) имело место обильное каллусообразование. 'В дальнейшем эти каллусы были неспособными к органогенезу. Другие регуляторы роста, такие как кинетин, адекин сульфат и аденин были не-

эффективными как для инициации органогенного каллуса, так и для регенерации растений. Дистальные сегменты семядолей не проявляли признаков морфогенеза. При продольном рассечении семядольного листа, регенерационная способность сегментов уменьшалась, так как проксимально локализованная регенеративная часть семядольной ткани рассекалась. Частота и процент регенерации варьировали в зависимости от возраста донорного семядольного листа. В таблице 1 суммированы эти результаты.

Таблица I. Влияние возраста донорных семядолей на регенерацию изолированных сегментов семядолей голубиного гороха на среде Ш с 1,0 кг/л БАП

Количество дней ■ после высева семян для получения семядольных эксплантатов (дни) Процент регенерации + среднее отклонение (кол-во побегов на 40 эксплантатов) Продолжительность культиви- ■ рования (Дни) Среднее число побегов

1 10 + 5 (4/30) 60 2

2 60 + 5 (24740) 60 5

О и 50 + 5 (20740) 60., 4

4-5 5 (2/40) 60 1

6-7 0 60 0

Регенерация растений из дэкапитированных проростков

Через несколько дней после посева семян, проросшие побеги из проростков■ отсекали у основания узла я эти декапитированные проростки культивировали на твердой среде КБ с различными концентрациями различных регуляторов роста, таких как БАП, кинетин, аденин-сульфат,аденин. На среде с добавлением 0,5 кг/л БАЛ происходил обильный прямой органогенез побегов из узловой части декапитиро-ванных проростков. Через 2-3 недели культивирования на регенераци-онной среде были получены побеги размером 3-4 см. Затем вся регенерирующая масса переносилась на ту же среду, без фитогормонов, но с добавлением 10-15 мл жидкой безгормональной среды Это облегчало рост периферических побегов, которые. в противном случае. . погибали. В итоге в течение 3-4 недель культивирования были получены многочисленные побеги длиной 5-6 см..

На среде, содержащей кинетин, нам удалось получить всего 1-2 побега, способных формировать корни. Побеги не были регенерированы

на среде с добавлением аденнксульфата и адекика. ¿начитедькые различия в регенерации проростков были обнаружены при декапитировании сеянцев через различные сроки после высева семян. Эти данные суммированы в Таблице II.

Таблица II. Влияние возраста донсрных проростков на регенерацию декапктированных семян голубиного гороха на среде 1.S с 0,5 кг/л БАЗ

День декапи-тации после высева семян Процент регенерат:;! + среднее отклонение Гкол-во псб-егов на 50 зксплантатов) Время культи-рования (дни) Среднее число побегов

3 50+2 (25/50) 20 Л •а

4-5 70+2 (25/50) 20 6

6-10 5Q+-2 (25/50) 20 2

Формирование корней из побегов

Отдельные побеги, полученные на регекэрационной среде, изолировали и высаливали на твердуа среду Í.S с добавлением 0. 5 мг/л КУК для корнеобразовакия. Отдельные побеги, регенерировавшие из декалити-рованных проростков формировали корки на безгормональной среде MS, содержался 0,4% агара.

flftöTTfV»»»*** ^^ Т тт г-*>»»»>rnin mrr»'

Б 13Х0Г£ KS}»SÍ CLUül ЛОЛу^ЭКО ДЗоД Ц£*ТЬ ПОЛКССТЬЕ СфОрл^'рОВоККЬСС

растений-регенерантов (15 регенерировало из декапитироваккых проростков и 5 - из изолированных сегментов семядолей). Заметного различия в морфологии мевду контрольными растениями и растениями, регенерирозавсими из декаптированных проростков, не отмечено. Однако для „.растений, регенерировавши из изолированных семядолей, Taraje различия обнаружены. Отмечены следующие отличия: а - образование пучков утоларных побегов; в - формирование тонких и длинных побегов, несущих на верхуи-ке только одну спираль маленьких листьев.

Из пяти растений, полученных из изолированных сегментов семядолей, два были ненормально высокими с тонким стеблем и особым расположением листьев. Тонкие бэсчереяковые листья развивались на вершине побега в виде спирали.

О регенерации растения из эксплантатов' сеьядолей, семядольных узлов и проростков бобовых часто соо6:цэлось. При использовании этих эксплантатов регенерация растений in vitro была получена у видов Vigr.a (Sulati a-.d jai val, 2S90; .Vathovvs and Rao, 1934; Gill

et al. , 1937; itethsvs, 1SS7), Slyans (Cheng et ah , 1980),

niobcuiuo OJ Ладена; uojauj cuiu nui iui I noni,

1980; Kurar et al., 1983, 1984). Wright et al. (1937) и Rubluo and Kartha (1935)" предполагает, что только в случае использования специфических эксплантатов у зерно-бобовых культур, может быть достигнут успех в регенерация растений. Так, i.fehta and Mohan Ram (1980), культивируя -целые интактные семена на средах с фитогормо-нами,- получали из каждого семени многочисленные растения-регене-ранты. В отличие от них в настоящем исследовании из семян удаляли зародыши. В культуре изолированных сегментов семядолей было обнаружено, что проксимальная часть семядолей в отличие от дистальной способна дифференцироваться. 1,йогочисленньа побеги регенерировали та этих сегментов ка КБ среда с добавлением БАЛ в относительно низких концентрациях. Одновременно' с каллусообразовакием происходила дифференциация примордиев проросткоз. Вторичные примордии побегов развивались как из прилегающего каллуса, так и из уже обра-зававшихся примордиев в течение культивирования. Kunar et al (1983) сообщали о регенерации растений из изолированных семядолей, ко ко не уточняли какие именно части семядолей способны к морфогенезу; Ш обнаружили, что только проксимальные сегменты изолированных семядолей, прилегающие к эмбриональной оси и району узла, сохраняют способность к регенерации растений.

Возраст, размер и ориентация эксплантата имеют больксе значение для регенерации побегов у бобовых ( Каяеуа and Widhclm, 1981; Wright et al., 1937; Gulati and Jaiwal, 1990). Сокращение частоты регенерации голубиного гороха, связанное с возрастом донорного проростка,- превышающим 3 дня, сходно с тем, что обнаружено у других видов зерно-бобовых культур (Gulati and Jaiwal, 1990). Способность к морфогенезу проксимальных сегментов семядолей Cajarus cajan также уменьшается с возрастом. Сходным образом половинки семядолей, полученные в результате продольного разреза, демонстрируют более низку» частоту регенерации растений, так как в этом случае органогенная ткань проксимальной части семядолей рассекается.

Регенерация многочисленных растений у голубиного гороха имеет больше практическое значение для индуцирования вариабельности. Поскольку каллусная ткань является источником генетического разнообразия, регенерация растений из такой тка^и может способствовать получению исходного ценного материала для генетического улучшения згой зерно-бобывой культуры. Ддентификация и характеристика определенных эксплантатов, способных к морфогенезу, делает возможным

посредством генетической трансформации осуществлять прямую и непрямую передачу генов атому виду растений. 2. Культкпироза5»18 протопластов голубиного гороха. Выделение и культивирование мезс-фильных и каллусних протопластов.

До настоящего времени нам неизвестны публикации о выделении и культивирования протопластов голубиного гороха. Из растений, выращенных в асептических условиях, собирали листья различного возраста и использовали для изоляции мезофильных протопластов. Различные эксплантаты из зткзс же растений были дедифферекцированы на твердой среде КБ, содержащей ЕАЛ и НУЯ или 2,4-Д. Образующиеся рыялыэ каллусы использовали для изоляции протопластов.

Максимальный выход протопластов (2-2. Е х 104 протопластов из 1 г листьев) был получен из молодых листьев 20-дневного возраста. Кусочки листьев подвергали плазмолизу в 0.4М маннитоле, 0,1% (и/у) КЕЗ и инкубирували в 1.2% (у/у) ферментном растворе в течение 15 часов - при 28 С в темноте. Рыхлые каллусы 8-10-дневного возраста, полученные на среде ¡,Е с добавлением 2.0 мг/л КУК, плазмолизироза-ли в 0.4М маннитоле и инкубировали смесью ферментов в течение 15 часов в темноте при I 23° С. Средний выход протопластов составил 1 х 104 протопластов на 1 г каллуса.

При использовании различных оомотиков, таких как глисоза (0.6,4), маннитол (0.4М и 0.614) и У5 солевой раствор, для плазмолиза ткани мезофилла и каллуса, 0.4М ыанкитол был определен как наиболее подходящей. Листья разрезали на кусочки размером 1-5 мм, а каллусы мацерировали растиранием; затем их подвергали плазмолизу а осмотическом растворе в течение 1 часа а добавляли в ферменту» смесь. 15-17 часов инкубации были найдены оптимальными для выделения мезофильньпс протопластов; их выход был значительно ниже при инкубации, превыврищэй 17 часов. Стационарная инкубация была наиболее приемлемой, так как при постоянном перемешивании тканей в ферментном растворе выход жизнеспособных протопластов значительно снижался.

Среда 8р (Као й М; chul.uk, 1975) была модифицирована Кучуксм (1936) и протопласты 5 видов бобовых успешно культивировали. Модифицированная Као и М1сМ!Лик среда с добавлением 0.4 мг/л 2,4-Д, 1.0 мг/л ПУК, 0.5 мг/л БАЛ и 0.5 да/л Кин была найдена как-оптимальная для индуцирования делений как мезофильных, так и каллусных протопластов при плотности культуры 2 х 104 - 5 х ТО протоплас тов/мл культуральной среды.

Первое деление протопластов происходило через 72 часа и в течение 9-10 дней были получены группы из 20-30 клеток. Дальнейшее культивирование клеточных групп (кластеров) прогодилось при разбавлении в 2 раза. Первое - на стадии клеточных кластеров - равным сбемом Caboche среды с'О. 4 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л Кин и 0.35М макни-тола. Наслоение этих прстоколокий на агареодержащуа среду с 0.25 M маннитолом производилось с 20-30Х успехом а.получении каллусов из клеточных линий. Второе растворение культуры равным количеством той же среды, но содержащей 0.25М приводило к образованию каллусов

0.5-1.0 мм диаметра спустя 2 недели. Еа зтей стадии более чем 30% протскаллусов были способны в дальнейшем формировать каллус при переносе на вгаризованную среду с О. маннитола. Дальнейшее жидкое культивирование давало качало колониям 1.5-2.0 ш диаметра,которые позднее могли быть перенесены на твердую Catoche среду без

г*.«»

JWMU Í.

Аьульгивярс-Зокиэ кзллуссз KS СВсТУ в жкдкей Cat- WW1 is среде с

1. Oi.tr/Л БАЛ, 0. 5МГ/Л Кин, 40,Омг/л АднС и 0.25М маниэтола приводишь к формировании зеленых каллусных колоний в течение 10-15 дней. Разнообразные регуляторы роста растения или одиночные или в комби-1ации оказывались неспособными индуцировать органогенез в жидкой 1ли агаризованней среде. Протопласты, изолированные из листьев, гак же как и из каллусов давали сходные- результаты. Результаты армирования каллусов суммированы в табл. III. Для немногих видов ¡ерновых бобовых, таких как Glycine, Pisan sativum, 'Signs, 5haseolus и Cicer были определены экспериментальные протоколы для ¡золяции протопластов и их культивирования .

"аблкца III Нормирование каллусов из протопластов на Caboche среде

!остав регуляторов Концентрация Формирование •

юста регуляторов каллуса

роста в ыг/л

О. 5-2.0; 0.5-1.0; 0.1-0. 5 + +

0. 5-2.0; 0.5-2.0; 0.1-0. 5; 0.1-0.5 + +

О. 5-2.0; 0.5-2. 0:40. О + + +

0. 5-4. D; 0.5; 40.0; 0.2-0. 5 +

0.5; 1.0-5. 0;40. 0;0.1:0.2 + + +

0.5-1. 5; 0. 5-1.5; 40.0; 0.2-0.5; + + + 0.2-0. 5

0.5-4 0; 40.0; 0.2-0.5; 0.2-0. 5 + '

бозначения:

+ - слабое каллусообразование, быстрое потемнение каллуса. ++ - умеренное каллусообразование, каллус остается зеленым в

течение 2-3 недель. +++ - Зоропее каллусообразование каллус остается зеленым в течение 4-6 недель.

¡ин; БАЛ; КУК ¡ин; ЕАП; НУК; 2,4-Д iîH; БАБ; Адн С; ïffl; БАЛ; Адк С;ГА3

1йЯ;ЕАП;Адн С;2,4-Д íih; ЕАП; Адн с;3еа;.

h

ЙН;Ади С;Зеа;ГАд

Большой выход мэзофильных протопластов был получен из все;: трех сортов голубиного гороха ICPL-87 Kaxdula и Rayagada local (Rahadá). Полностью раскрытые молодые листья были наиболее подходящи»! источником для изоляции протопластов, чем зрелые листья, которые становились кеерофитньми и плохо растворялись смесью ферментов. Больная часть каллусов голубиного гороха быстро темнела при высоких концентрациях ауксинов и каллусы становились непригодными для дальнейкего использования. Однако при комбинации 0.5 кг/д 2,4-Д и 1.0 мг/д НУК с 0.5 мг/л БАЛ формировались рыхлые каллусы. Но эти каллусы сохранялись не более, чем 4 недели, несмотря на частое пассирование.

yjttt ft г cnt«r->T»r-w> г г «nrsmri т ff-i Л r i »»л*, л*».-» »»i. »"i I »m r * o # f#

nui/^rvuc r\y wxü x mi&u^u^iaauc uyuiuii^a^iuo ucww u чсяи оцл^лг í\a r¿nnauvi jri

значительно сокращало время получения каллуса. Заключение клеточных кластеров в агаризованную среду с осмотиком требовало около 4 месяцев для того, чтобы получить каллусы равного размера; такие же каллусы меж» получить в течение 1 месяца при культивировании в такой же жидкой среде.

Don nn.'ii лт.глV-.1 г»гт»*^ DC гя ^nunTitti (Л пт™* í"i т^"* 3

Ь l^c/j,, i. tJ ^vn^u^l.v 1'—IJ i_/l_i 1 i 1С UWAUXmOiC t-

нымн гормональными добавками были использованы для культивирования протоколоний, колоний, так же как протопластов, производящих каллус. Трудности при получении регенерации побегов из протопластов выглядят очень сходными с теми, которые возникают при культивировании тканей голубиного гороха. 3. Гекехическаа трансформация голубиного гороха. Прямая передача генов, злектропорация протопластов. .

Протопласты мезофила листа были злектропорированы с экзогенной плазмидной ДНК, имевдгй растительные селективные маркерные гены. Плазмидная ДНК, содержали химерный канамицин резистентный ген была почти пригодней. Протопласты з концентрациях 5 х 106 в злект-ропоративном буфере были злектропорированы в поле различного напряжения с различной продолжительностью импульсов, так что 50-60Z от общего числа протопластов оставались живыми после электропора-ции. Комбинированное действие ПЗГа и электрического импульса использовали для проникновения экзогенной ДНК.

Условий злектропорация сильно влияли на деление протопластов. Отмывка обработанных протопластов в та солевом растворе увеличивала жизнеспособность и делимость протопластов. Когда протопласты формировали протоколонии, последними наносились на агаризованную среду с 0.2М осмотиксм (маннитол), 1.0 мг/л БАП,. 0.5 мг/л Нин, 40.-О мг/л АднС и 100 мг/л канаыицинсудьфата.

Около 20 зеленых колоний Снял селектированы и культивировались в дальнейшем з той т среде с 50 мг/л канамицинсудьфата и 50ЛЫЗИЭ каллуеные массы были получены. Эти каллусы сохраняли (под-зерждивали) на агаросодер.чащей среде с 1.0 мг/л БАЛ, 1.0 мг/л 2,4-Д, 0. 5мг/л канамэдинсульфат?..

Сбиэн ДНК из каллусов была гибридизована с N'PT II пробой ДНК ю Саузерну и локализация фрагмента была определена на аутсрадиог-замме.

Это первое сообщение об успешной передача и интеграции чужеродной ДНК в геном голубиного гороха через злектрспорацига яротоп-1астов. Результаты показывают возможность прямой передачи гена в слетки этого растения.

Непрямая передача генов с помола Agrobszterium

Не было ракыь'8 никаких сообщений об исследовании сорвмести-.{ости хозяин-патоген между Agrcbscteriuin и голубиным горохом. Для гого чтобы установить это стебли асептически выращенных растений мьецировали (микроиньекции) вирулентные; линиями Л. tunefaciens и 1 rhizogenes. Различные эксплантаты, такие как стебель, гипоко-:иль, семядоли и листья инфицировали и культивировали как списано )аньсе. Корончатые галлы появлялись на стебле в местах укола, ко ссрневые волоски не формировались. На безгормекзльной агаризован-;ой IJS среде эксплантаты, культивированные с A. tuxefaciens проду-деровали каллусы в участках икфици рования и морфология каллусов 5ыла очень сходка с опухоль», индуцированной на стебле. Но ни кал-цгеообразования, ни формирования волосатых корней не происходило зри использовании А.. rhizogenes. Регенерация с shc-oter линией A. tuns fastens.

Плазмиды pGV2205 индуцируют побеги формирование (Leemans st si, 1981; Snugocki and Ov/ег.з, 1988). Различные эксплантаты были знфицированы и культивировались с pSV2203 , как описано в раэде-1е"Материал и методы". Каллусообразование происходило в зоне разре-;а и местах кнфьцирования. Каллусы были зелеными, гранулярными, (¡едленно растущими я продолжали'расти на среде, свободной от регу-шторов роста, -в отличие от контрольных эксплантатов, которые высы-:али на безгормональкой среде. В нескольких случаях каллусы, обра-ювавпмеся из гипокотильных сегментов, становились эмбриогенными и зегенерировали побеги на безгершкальной среде Кб . Процесс реге-герации побегов, также как их удлинение происходил очень медленно. 1ереэ 4-5 месяцев 4 побега сформировалось. Проростки были карляко-шми с хили,гл стеблям;, очень укороченными междоузлиями и малень-

каш листьями. Зти проростка гереноеилк на безгормонгльнув агари-зованную среду, а также- на ту »а среду с 0. 5 мг/л НУК для индукции корнеобразования. Ко зти растения никогда не образовывали корней и уыирали через 3-4 месяца.' Каллусы, сформировавшиеся на безгормо-налькой среде а результате культивирования с 'shooter'линией, имели свои особенности. Зти каллусы темнели во время культивирования при интенсивном освещении и после перекоса их в условия низкой освещенности зеленели и начинали свежее каллусообразование.

Саузерн Слот гибридизация с общей ДНК из каллусов и регенерировавшими shoots с "FT II пробой ДНК фрагментом подтверждали интеграции Т-ДНК.

Генетическая трансформация голубиного гороха посредством кокульти-ааыии семядольных сегментов и декапктировакных проростков Установив, что опосредованная Agrabacterium передача гена в клетки голубиного гороха возможна; регенеративные эксплантаты кокультиви-ровалл с различными линиями >5. tunefaciens, несущими гекы растительных селективных признаков. Регенеранты селектировали на регенерирующей среде (описано в материале и методах ) с 100 мг/л канамицинсульфата после совместного культивирования (кокультивирова-кия) с A tunefaciens, несущей ллазмиду рАСЗЗЗ.

Канамицинрезистентные клеточные линии пролиферировали каллусы ка различных средах с каиамицином . Хорошо растущие побеги формировали корни ка безгормональной жидкой среде KS и впоследствии их перекосили в ту же самую среду с 50 мг/л канамицинсульфата. Кана-мицинрезистентные растения содержали в культуральной комнате. Сегменты из этих растений изолировали и помещали на KS среду с 1.0 мг/л НУК и 0.5 мг/л ЕАП с 50 мг/л канамицинсульфата. Эксплантаты дедифференцировались в каллус и формировали роскошную каллусовую массу на какамицкнсодержащэй среде. Саузерн Слот гибридизация об-цей ДНК из этих растений, также как каллусы с NPT II пробой ДНК подтвердили их природу трансформации .

Об использовании 'stealer strain' (pGV2205) в регенерации растений из "непокорных" видов сообкдярсь (Kuchuk, 1990). В атом случае, хотя перенос цитскинин биосинтезирукирго гена и его экспрессия были подтверждены анализами и наблюдениям!, его роль в диф-. ференциации побега является противоречивой. Когда использовали молодые гипокотильные эксплантаты , регенерация растений на безгормональной среде происходила, но с другими типами эксплантатов формировался только каллус. Среди факторов совместного культивирования: погружение эксплантатов в свежарастущув бактериальную культу-

ру, саге« культсзпрованкз г" на ai *рсг:;цер.ясп;*Л среде бале более

П0Д1С0ДЯ1Ц**М| ЧЭМ CGBM8CTHG8 КУ-Xi ТI* л п П рО 3 К * " S 3 /^'ДКСй Ср8 ДЭ. ТйК

s последнем случае эксплантаты темнел!! яри послед/идем культпзнро-

OÎ3 •

iitfycnuu i cha eu с^иси uuu^c^wiflwm uuw«icL>auju л^.лш.а.^.о**

ровакия с плазмидой pAC323 был достаточно успешный, и около Б трансформированных растений было получено. В этом случае также совместное культивирование на агаризованной среде оказалось более подходяща!, чем на жидкой среде. 3 некоторых елучаяхлрсЕОДилось прекультивирование эксплантатов з течение 1-2 дней перед инфицированием бактериальным агтаьаом, однако никаких сколь-нибудь заметных и важных различий не было отмечено.

3. Асиивхрхчдоя пересексуалькая гибридизация келду голубиным горохом и табаком.

ДЬрмирозанке соматических гибридных клеточных линий- из продуктов слияния мезофильных протопластов голубиного гороха и облученных канамицинрезкетентных протопластов табака

Протопласты мезофилла листа голубиного гороха можно было индуцировать к слиянии с канамицинрезкетектными протопластами .мезофилла M.tsbscun, ияактивированннп! облучением (250Gy) (20мин), как описано в материале и методах. .Слияние протопластов и формирование гетерокарионов наблюдали в инвертированном микроскопе. Продукты слияния культивировали з дадкой среде KVSp а темноте, как описано для культуры протопластов. Спустя один месяц протоколонии развивались и всю культуру заключали в агаризованную Caboche среду с С.1 U маннитола, 1.5 мг/л БАЛ, 0.5 мг/л Кин, 0.5 мг/л Адн, 0.5 мг/л 2.4-Д и 50 мг/л канамицинсульфата. Предполагаемый асимметричные гибридные каллусы были получены на МЗ среде с 3.0 мг/л БАЛ, 1.0 мг/л Зеа, 0.5 мг/л НУК и 50 мг/л канамицинсульфата. Эти каллусы использовали для установления их гибридной природа

лрвдлдгашш ртшятщ.

1. Для использования в работе по получению новых форм и сортов для научных организаций и других ведомств, занимающихся 'селекцией эти культур, предлагаются высокоэффективные способы культивирования протопластов, генетической трансформации и соматической гибридизации.

2. Полученной растение со встроенными, генами Т-ДНК мутанта "shootу" Agrobactenum tun&rsciens показивает возможность преодоления непокорной природы, которое могло бы быть полезным при индуцировании регенерации ira культивируемых каллусов.

3. Предлагается получать асимметричные соматические гибридизация между Cajanus cajan и друпн-и видами, а также его диким;' родственниками, сохраняемый кятакткым свой геном к опредленные гена, контролирующие важные агрономические признаки.

ВЫВОДУ.

1. Впервые разработаны и стандартизованы экспериментальные протоколы -для регеяера^п; растений vitro голубиного горохг Cajanus cajan.

2. Проведена идентификация эксплантатов, способные: к морфогенезу. Обнаружено, что только пражималькая часть семядолей и дека-питироваккыэ проростки обладает достаточно высоким регекерационкьз. потенциалом.

3. Впервые предложены аффективные методы выделения и культивирования меэофкльных и каллускых протопластов голубиного гороха.'

4. Впервые отработаны методики генетической трансформации Cajanus cajan методом кокультизировакия с Agrcbacteri ил tumefaciers и прямого переноса генов с помощью электропорации протопластов.

5. Lis годом кокультизировакия семядолей и декапитированньа проростков с Agrcbacterium tumfaciens получены трансгенные клеточные линии и растения голубиного гороха С помогу» ДНК-ДНК гибридизации показана стабильная интеграции генов в геном растительных клеток.

6. Показана возможность асимметричного слкякиия протопластог Cajanus cajan и tucotiana tabacun Продукты слияния были способными к делений и образованию колоний на среде, содержащей канамицин. Список раСст, опуй-таговакльк ко тег® диссертации

(1) Sarangi В. К., il Mohanty and S.N. Patnaik, Callus response and plantlet regeneration in Cajanus cajan, Atylosia cajanifcliz and their Fl hybrids. Plant Science Reseaoh (Journal of the Orisss Botanical Society) (1983) 10:7-13.

(2) Sarangi В.K., In vitro ¡rarphogenetio potential of Cajar.ui cajah for the induction of somaclonal variation. Abstracts; XJ International Symposium, Embryology and'Seed Reproduction. Julv 3-7, 1930, Leningrad, USSR, pp-143.

(3) Sarangi В. K. and Y. V. Gleba, Direct multiple regenerate in Cajanus cajan (L) Mi lisp.. International Symposium on Plant Biotech!^ lor/ and Its contribution to the Iirprovsrent. Geneva,

Iwitzerland, April 19-20, 1991. Acta Horticulturae (1991) 289: 49-150.

(4) Sarangi B. K., N. V.Kuchuk, Y.Y. Gleba, Electroporation of esophyll protoplasts aid production of transgenic callus in 'ajanus cajan. Abstracts; 8th International protoplast spposium, une 16-20, 1991, Uppsala, Sweden. Physiologia PI ant arum (1991) 82 1): A 33. ...

(5) Sarangi B.k., N. V. Kuchuk, Y. Y. Gleba. Agrcbacterium ediated transformation of pigeonpea, Cajams cajan (L. ) Mi lisp, bstraots; First syirposium 'Trends in Plant Biotechnology', ovember 20-22, 1991, Moscow, USSR, pp-144.

(5) Sarangi B.H., N.V. Kuchuk and Yuri Y. Gleba. Isolation nd culture of protoplasts of pigeonpea. Plant Cell Rep., 1992)11:482-485.

3m.Jt95'$opim 60x84/16 OiSji. - nwfl. apx. 1,06 ntjuwcaHo AO ApyKy 20.11.1992 p. Tups* 100.

noflirpa$tuha jùjimîuhh titcthtyty reopetuvmoï ^îshkh aîi yjtpaîhh