Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и характеристика кодирующих последовательностей на B-хромосомах сибирской косули

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление и характеристика кодирующих последовательностей на B-хромосомах сибирской косули"

На правах рукописи

>553544«

ДЕМЕНТЬЕВА ПОЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НА В-ХРОМОСОМАХ СИБИРСКОЙ КОСУЛИ

03.01.07 - молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ОКТ 2013

Новосибирск - 2013

005535440

Работа выполнена в лаборатории сравнительной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Новосибирск.

Научный руководитель: Трифонов Владимир Александрович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Беляева Елена Сергеевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Новосибирск

Высоцкая Людмила Васильевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет», г. Новосибирск Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт-

Петербургский государственный университет», г. Санкт-Петербург

Защита состоится: 27 ноября 2013 г. на заседании диссертационного совета Д 003.074.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8/2.

Тел: +7- 952-916-7858. e-mail: kokoza@mcb.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН. Автореферат разослан« ¡(J » (О 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ;/;

кандидат биологических наук оь^ы^/^^—Е. Б. Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

B-хромосомы или добавочные, сверхчисленные хромосомы обнаружены у животных, растений, грибов и характеризуются необязательностью для жизнедеятельности организма (Camacho et al., 2000). Основная часть исследований по молекулярной организации B-хромосом показала, что добавочные элементы богаты повторенной некодирующей ДНК: LINE и SINE, теломерными и центромерными повторами, рибосомной ДНК, гистоновыми генами и не несут экспрессирующихся уникальных генов. Имеющиеся данные наводили на мысль о функциональной инертности B-хромосом. Однако с применением молекулярных методов в последнее время был обнаружен целый ряд уникальных аутосомных генов, расположенных на В-хромосомах, у различных организмов (Han et al., 2001; Lamatsch et al., 2011; Yoshida et al., 2011; Maitis et al., 2012). В частности, на B-хромосомах хищных был обнаружен протоонкоген С kit, что позволило сделать предположение о присутствии генов в добавочных элементах и других видов млекопитающих, в частности, сибирской косули Capreolus pygargus (2n=70+0-12B) (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007; Duke Becker et al., 2011).

Вопрос о транскрипционной активности генов, расположенных на В-хромосомах млекопитающих, долго оставался спорным и открытым. Была показана экспрессия рибосомных генов, лежащих на добавочных элементах, у растений (Leach et al., 2005) и животных (Rubtsov et al., 2004; Ruiz-Estevez et al., 2012). Однако обнаружение в данном исследовании транскрипта FPGT-TNNI3K, экспрессирующегося с дуплицированных генов на B-хромосомах в культуре фибробластов сибирской косули - является первым примером транскрипционной активности уникальных генов, расположенных на добавочных элементах кариотипа млекопитающих. Варьирование копийности функционально значимых генов в зависимости от числа B-хромосом может оказаться критическим для жизнедеятельности вида. Таким образом, проведенное в данной работе подробное картирование B-хромосом сибирской косули выявило важные функциональные последовательности, локализованные на добавочных элементах, и показало их экспрессию, что способствует пересмотру представления о B-хромосомах и необходимости учитывать их возможную роль в жизнедеятельности организма и в эволюции геномов.

Целью представленной работы было детальное картирование В-хромосом сибирской косули и выявление транскрипционной активности дуплицированных генов, расположенных на B-хромосомах. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Стандартизация кариотипа косули и выявление гомологичных районов

хромосом косули, верблюда и коровы с помощью хромосомного пэйнтинга.

2. Разработка метода идентификации генов на добавочных хромосомах.

3. Картирование последовательностей ДНК, локализованных на В-хромосомах косули, с помощью флуоресцентной in situ гибридизации ВАС клонов коровы и ПЦР.

4. Определение копийности аутосомных участков, присутствующих на добавочных элементах у сибирской косули с разным числом В-хромосом, с помощью ПЦР в реальном времени.

5. Выявление возможных различий первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом с помощью секвенирования.

6. Оценка эволюционной консервативности генов, локализованных на В-хромосомах, путем сравнения экзонов этих генов у косули, лося, марала, мазама и других видов позвоночных.

7. Доказательство транскрипционной активности дуплицированных копий генов, расположенных на В-хромосомах, путем выявления аналогичных нуклеотидных замен в ДНК В-хромосом и в клонах кДНК.

Научная новизна работы и практическая значимость

Впервые проведена стандартизация кариотипа косули относительно кариотипов коровы и верблюда. Обнаружено восемь перестроек, разделяющих кариотипы коровы и косули, из них шесть слияний хромосом в линии косули, одно слияние хромосом в линии коровы и одна инверсия на хромосоме 11 сибирской косули.

Предложен оригинальный метод идентификации последовательностей, расположенных на В-хромосомах. Впервые показано, что В-хромосомы сибирской косули содержат аутосомные копии генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 вместе с прилегающими к ним последовательностями. Участок, гомологичный хромосоме 3 коровы (74.6 - 76.4 м.п.н.), на добавочных хромосомах составляет около 2 м.п.н. Установлено, что копии генов TNNI3K, FPGT и LRRIQ3, локализованные на В-хромосомах, очень консервативны. Однако в двух случаях удалось выявить несинонимичные В-хромосом-специфичные замены. Поскольку замены, обнаруженные на добавочных хромосомах, совпали с заменами, обнаруженными в клонах кДНК, был сделан вывод о транскрипционной активности этих генов. Показано, что гены TNNI3K, FPGT характеризуются высокой консервативностью в ряду млекопитающих.

Использование разработанных нами молекулярных подходов по картированию В-хромосом сибирской косули в дальнейшем может облегчить задачу исследования молекулярной организации добавочных хромосом у других видов позвоночных.

Положения, выносимые на защиту

Сибирская косуля обладает высококонсервативным кариотипом, близким предковому кариотипу оленьих. Добавочные хромосомы косули содержат крупный дуплицированный фрагмент хромосомы 1, включающий уникальные

гены TNNI3K, FPGT и LRRIQ3. Кодирующие гены, локализованные на В-хромосомах сибирской косули, транскрибируются.

Апробация работы

Результаты исследования были доложены на следующих конференциях:

1. Симпозиум, посвященный 130-летию со дня рождения Левитского Г.А. "Хромосомы и эволюция" (Санкт-Петербург, 26-27 ноября 2008 г);

2. Международная конференция "Хромосома 2009" (Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009 г);

3. II международная научно-практическая конференция "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика" (Новосибирск, 14-17 ноября 2011

г);

4. 19-я международная хромосомная конференция (Болонья, Италия, 2-6 сентября 2013г).

Личный вклад соискателя

Автором выполнена вся экспериментальная работа, включающая локализацию ВАС клонов с помощью FISH и скрининг В-хромосомных библиотек с помощью ПЦР. Автором также проведена оценка копийности участков, представленных на добавочных хромосомах, с помощью ПЦР в реальном времени и секвенирование копий генов, лежащих на B-хромосомах и аутосомах сибирской косули, европейской косули, лося, марала и мазама. Стандартизация кариотипа косули с помощью хромосомного пэйнтинга была проведена совместно с к.б.н. А.И. Кулемзиной (ИМКБ СО РАН, Новосибирск). Обработка, анализ, интерпретация данных и подготовка публикаций были выполнены при участии автора.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 216 ссылок. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 18 рисунков и 4 приложения.

Публикации

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в виде трех статей в рецензируемых научных изданиях, а также доложены на четырех отечественных и международных конференциях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Суспензии хромосом коровы и сибирской косули без В-хромосом, сибирской косули с 4 и 8 B-хромосомами, а также образцы ДНК европейской косули, лося, марала, сибирской косули без B-хромосом, сибирской косули с 4 и

8 B-хромосомами, коровы и мазама были приготовлены в лаборатории цитогенетики животных ИМКБ СО РАН.

Библиотека B-хромосом сибирской косули была получена с помощью хромосомного сортинга П.О'Брайен (Центр сравнительной геномики, Кембриджский университет, Великобритания) и В.А. Трифоновым (ИМКБ СО РАН, Новосибирск) из культуры фибробластов сибирской косули, отловленной в Новосибирской области (8 B-хромосом). Амплификацию фрагментов ДНК сортированных B-хромосом осуществляли с помощью метода DOP-ПЦР.

В-хромосом-специфичная библиотека кДНК была получена В.А. Трифоновым (ИМКБ СО РАН, Новосибирск) на основе метода SHAC ("Selection of Hybrids by Affinity Capture " - отбор гибридов афинной сорбцией) (Chen-Liu et al., 1995). Из культуры клеток фибробластов сибирской косули с 8 В-хромосомами была выделена тотальная РНК и получена кДНК библиотека с помощью BD SMART PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences) по протоколу производителя. Затем полученная кДНК библиотека была амплифицирована со специфичным праймером (BD Biosciences) и гибридизована in vitro с В-хромосом-специфичной биотинилированной библиотекой, которая была помечена с помощью метода DOP-ПЦР. Захват полученных гибридов производили магнитными микрочастицами с иммобилизованным авидином. Фрагменты кДНК амплифицировали с помощью ПЦР со специфичным праймером (BD Biosciences). Продукты ПЦР клонировали с использованием TOPO ТА Cloning Kit (Invitrogen, UK) и секвенировали по стандартному протоколу. Полученные последовательности были выровнены относительно генома коровы UCSC genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6. l/bosTau7).

Клопы ВАС библиотеки коровы CHORI-240 были предоставлены д-ром Д.М. Ларкиным (Аберистуитский университет, Великобритания).

Препараты метафазных хромосом исследованных видов и GTG-окраска были получены по стандартному протоколу (Графодатский, Раджабли, 1988).

Библиотеку ДНК ВАС клонов получали в реакции DOP-PCR (Backx et al., 2008).

Мечение ДНК ВАС клонов для FISH проводили с использованием аналогов нуклеотидов: биотина-11-дУТФ или дигоксигенина-11-дУТФ и ООР4-праймера (5 '-GGAAACAGCCCGACTCGAG-3').

Флуоресцентную in situ гибридизацию выполняли по ранее предложенному протоколу (Yang et al., 1999).

Скрининг библиотек сортированных добавочных хромосом проводили с помощью ПЦР. Подбор праймеров осуществлялся по геному коровы UCSC

genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6.1/bosTau7). Температуру отжига праймеров подбирали с помощью программы "OLIGO".

ПЦР в реальном времени проводилась на приборе С1000 Termocycler фирмы "BioRad" с использованием красителя SYBR Green I. Анализ данных осуществлялся с помощью метода калибровочных прямых.

Секвенирование ПЦР-продуктов осуществлялось с использованием ABI Big Dye системы на приборе ABI3130XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) по стандартному протоколу.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стандартизация кариотипа косули, выявление гомологичных районов аутосом косули, коровы и верблюда

Поскольку косуля не относилась к числу видов, вовлеченных в исследования по картированию генома, то генетический состав и гомология хромосом косули с хромосомами хорошо картированных видов не были известны, а кариотип был охарактеризован только классическими цитогенетическими методами. Поэтому необходимым этапом работы было проведение стандартизации кариотипа косули относительно кариотипа коровы.

Использование сравнительного хромосомного пэйнтинга с пробами верблюда позволило выявить гомологичные районы на хромосомах косули и восстановить сценарий кариотипической эволюции этого вида. Мы выявили восемь хромосомных перестроек, разделяющих кариотипы коровы и косули. Из них - шесть слияний в линии сибирской косули, одно слияние в линии коровы и инверсию на хромосоме 11 косули (Рис.1).

Кроме того, мы установили, что кариотип косули является очень консервативным и почти не отличается от предкового кариотипа оленьих.

Разработка метода идентификации генов на В-хромосомах

Метод идентификации генов на B-хромосомах строился на получении В-хромосом-специфичной библиотеки кДНК. Наиболее важным шагом метода была гибридизация библиотеки кДНК косули с В-хромосом-специфичной биотинилированной библиотекой, что дало возможность отобрать только те клоны кДНК, которые оказались гомологичны последовательностям с В-хромосом. Специфичность и той и другой библиотек была подтверждена методом FISH. Из В-хромосом-специфичной библиотеки кДНК были отсеквенированы 45 клонов. Среди них встретились транскрипты уникальных генов, в частности, гомологичные ген-содержащему району хромосомы 3 коровы. Последовательности данных клонов депонированы в GenBank под следующими номерами: JN871269-JN871285.

ш * т ?\и

«с- I

■У и

I тщ Не

»

п Р

! 51

!

зг

ш

ш ш § # к 0

% § > * У ^ £ $ И1

Лч* 1

,и>

I»

«1 а® ,11 1 м

Шш № (■ ■ И «* йМИ 1 ш Ш 1

г% ^ Шщ " * » Р

1 1 I 1 Р г 1

н

в

\ 3 <7

»

59 1

1« !;1Э 1К

„О* 5»

| 3

п

I ¥« I Й

¿1

I Л

I §Й ) эв 24 II Ш

I « * Ш

Й

«»44

Я

I 8'*

91|| Г2

$9

Рисунок 1. Сравнительная карта гомологичных районов косули (СРУ), верблюда (СБК) и коровы (ВТА), основанная на данных хромосомного пэйнтинга. «В'з» -В-хромосомы.

Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах сибирской косули

Нами была получена В-хромосом-специфичная библиотека кДНК, клоны из которой оказались гомологичны уникальным аутосомным генам РРСТ, ТМШЗК, LRRIQЗ, расположенным на хромосоме 3 коровы и, соответственно, на хромосоме 1 сибирской косули. Поэтому дальнейшей задачей нашего исследования стало картирование копий этих генов и участков, прилегающих к ним на В-хромосомах сибирской косули.

Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы К району хромосомы 3 коровы, содержащему участки гомологии В-хромосом-специфичных кДНК, были подобраны ВАС клоны из библиотеки СНС)М-240. При локализации ВАС клонов (СН240-10Н15, СН240-44418, СН240-493Р4, СН240-515СЗ, СН240-454022, СН240-351113) можно было видеть сигналы на хромосоме 1 и В-хромосомах косули, а также на хромосоме 3 коровы. При локализации ВАС клонов СН240-131121 и СН240-385С2 сигналы на добавочных хромосомах отсутствовали. По распределению ВАС клонов, давших сигнал на добавочных хромосомах, удалось установить примерное местоположение участка, присутствующего на добавочных элементах, относительно хромосомы 3 коровы, а также примерный размер этого участка, который был уточнен с помощью ПЦР-картирования (Рис.2).

***» ВАС клоны» т дающш кжнж ма В-хромошмах шт 8АС клоны, дающш сигнал •*"« Фрагменты ПЦР, Фрагменты ПЦР, н$

mm-ASi t

IМЫЩ4 Дфйй

ртп I

ТШКЩ rtrrrr™ —) r~n UWtQS

Ш I i 11 it

iliuiuiii

7&fi IBM 78,0 ?ij

Рисунок 2. Схема района хромосомы 3 коровы с координатами и нанесенными маркерами, картированными на В-хромосомах сибирской косули. "TNNI3K", "LRR1Q3", "FPGV, "FGD5-AS1", "RNPS1", "Агрс2" - названия генов, располагающихся на хромосоме 3 коровы (по данным UCSC genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6.1/bosTau7)).

Картирование участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом

Для уточнения границ дуплицированного участка на добавочных элементах подбирали 40 пар праймеров по геномной последовательности коровы UCSC genome browser on Cow Oct. 2011 (Baylor Btau_4.6.1/bosTau7). ПЦР проводили с использованием DOP-библиотеки сортированных добавочных хромосом в качестве матрицы. ДНК коровы и ДНК косули с В-хромосомами использовали как контроли. В результате с использованием каждой пары праймеров на всех контрольных матрицах был получен ПЦР-продукт ожидаемого размера. Принимая во внимание полученные данные, а также данные о распределении кДНК и локализации ВАС клонов, мы установили, что участок, расположенный на В-хромосомах, составляет примерно 2 м.п.н. и несет важные функциональные гены: TNNI3K, FPGT и LRRIQ3 (Рис.2).

Оценка копийиости генов, присутствующих на добавочных хромосомах сибирской косули ПЦР в реальном времени проводился для трех разных образцов ДНК сибирской косули с различным числом В-хромосом по трем генам TNNI3K, FPGT, LRRIQ3. В качестве внутреннего стандарта был использован консервативный участок однокопийного гена PTGFR. В результате проведенных экспериментов было показано, что копийность генов FPGT, TNNI3K и LRRIQ3 коррелирует с числом В-хромосом, хотя их зависимость не всегда является прямой (Рис.3).

СРУ(ОВ) СРУ(4В) СРУ(8В)

Образцы ДНК

Рисунок 3. Степень копийности генов ШМЗК, РРСТ и ЬЯШ()3 относительно однокопийного аутосомного гена РТСРЯ, у сибирской косули (СРУ) без В-хромосом (0В), у сибирской косули с 4 В-хромосомами (4В) и 8 В-хромосомами (8В).

Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом

и В-хромосом

Мы определили последовательности аутосомных и В-хромосомных копий второго и четвертого экзонов гена ЬВШЦЗ длиной 222 п.н. и 153 п.н., соответственно. Последовательности второго экзона гена LRR1QЗ представлены в генном банке под номерами: Ж871294 и Ж871295. Также мы определили аутосомные и В-хромосомные последовательности трех экзонов гена РРОТ общей длиной 345 п.н. (примечание 1, 2, 3 текста диссертации) и промоторной области гена ТЖ13К длиной 234 п.н. (ЛМ871289-Ш871293). В результате секвенирования мы обнаружили две В-хромосом-специфические замены: во втором экзоне гена ЬШиОЗ (валин 141 на изолейцин141) и во втором экзоне гена РРОТ (лизин 83 на аргинин 83) (таблица 1).

Таблица 1. Аминокислотные замены, специфичные для В-хромосом.

Источник ДНК и, К CQ СП о т оо .—i и -J < о о fS

>> > и < и

Позиция и и

141 позиция гена ыиидз I I V V

83 позиция гена РРОТ R R К R к к к к

"кДНК" - В-хромосом-специфичная кодирующая ДНК. "ВТА" — Bos tattrus, "CPY (OB)" — Capreolus pygargus, сибирская косуля без В-хромосом, "CPY (8В)" — Capreolus pygargus, сибирская косуля с 8 B-хромосомами, "CEL" — Cervus elaphus, "MGO" - Mazama gouazoubira, "AAL" - Alces alces, "В" - B-хромосомы.

Как видно из таблицы 1, аргинин в 83 позиции гена FPGT встречается при секвенировании кДНК, DOP-библиотеки В-хромосом и тотальной ДНК сибирской косули с 8 B-хромосомами. В последнем случае, очевидно, что при секвенировании получается последовательность В-хромосом, поскольку вклад аутосомной компоненты данного района в тотальную ДНК сибирской косули с 8 B-хромосомами ничтожно мал. При секвенировании ДНК сибирской косули без В-хромосом получали последовательность аутосомной ДНК сибирской косули, где в данной позиции был лизин.

Таким образом, данный пример ярко демонстрирует, что обнаруженные нами замены действительно являются В-хромосом-специфичными.

Оценка эволюционной консервативности генов, локализованных па В-хромосомах

В связи с обнаружением копий генов FPGT и TNNI3K на добавочных хромосомах оказалось интересным оценить их консервативность в эволюции путем сравнения последовательностей экзонов у косули, лося, марала, мазама и других видов позвоночных. Мы получили последовательность гена FPGT у разных видов оленьих длиной 1788 п.н. (JN871286-JN871288), а также последовательность промоторной области и первого экзона гена TNNI3K (JN871289-JN871293; примечание 4 текста диссертации) общей длиной 345 п.н.

В начале первого экзона гена FPGT, в качестве кодона, выполняющего функцию инициации трансляции, выявлен кодон GUG на В-хромосомах и у сибирской косули с 4 и 8 В-хромосомами вместо классического стартового кодона AUG, также характерного для сибирской косули без В-хромосом, лося, марала и мазама. Как видно из таблицы 2, валин встречается при секвенировании DOP-библиотеки В-хромосом и тотальной ДНК сибирской косули с 4 и 8 В-хромосомами, тогда как в аутосомной ДНК, представленной сибирской косулей без В-хромосом, встречается метионин. Видно, что валин связан с наличием В-хромосом в геноме и это подтверждает тот факт, что кодон GUG встречается именно на В-хромосомах. В третьем экзоне гена FPGT были обнаружены две аминокислотные замены, характерные для семейства оленьих по положению 89 и 104 (таблица 2).В копии четвертого экзона гена FPGT было найдено восемь замен в положениях 165, 175, 177, 248, 279, 393, 468 и 589 а.к., специфичных для сибирской и европейской косули (таблица 3).

Таблица 2. Значимые аминокислотные замены, обнаруженные на В-хромосомах и у оленьих в трех экзонах гена FPGT относительно ряда млекопитающих.

\ Источник V ДНК Позиция \ кДНК m СРУ (0) СРУ (4, 8) CEL AAL MGO via VPA ECA HSA LAF О CPO DVI OAN

1 V M V M M M M M M M M M M M

89 A A A A A A A s s S S S S s s A

104 E E E E E E E к E К К К E к M к

Í\/4,X1IV — U-ApUMU^UlM-UlitlVaL^Jairia^ IVUAWpj'I^iM*^ — UlJ.l luwtlij,

"CPY (0В)" - Capreolus pygargus, сибирская косуля без В-хромосом, "CPY (4, 8В)" — Capreolus pygargus, сибирская косуля с 4 и 8 В-хромосомами, "CEL" — Cervus elaphus, "MGO" - Mazama gouazoubira, "AAL" - Alces alces, "VPA" -Vicugna pacos, "ECA" - Equus férus caballus, "HSA" - Homo sapiens, "RNO" -Rattus norvégiens, "CPO" - Cavia porcellus, "LAF" - Loxodonta africana, "OAN" -Ornithorhynchus anatinus, "DVI" - Didelphis virginiana.

Таблица 3. Значимые аминокислотные замены, обнаруженные у оленьих в экзоне гена РРйТ относительно млекопитающих.

\ Вид Позиция\ СРУ (8В) CCA CEL BTA VPA ECA HSA

165 S S T T T T T

175 Т т I I T V I

177 D D E E E E E

248 L L F F F F F

279 S S К К К К К

393 S S P P P P P

468 А A T T T T T

589 M M L L L L L

"ВТА" — Bos taurus, "CPY (8В)" — Capreolus pygargus, сибирская косуля с 8 В-хромосомами, "CCA" - Capreolus capreolus, "CEL" — Cervus elaphus, "VPA" — Vicugna pacos, "ECA" — Equus ferus caballus, "HSA" — Homo sapiens.

Обнаружение транскрипционной активности копии гена FPGT, расположенного на В-хромосомах

Поскольку замена во втором экзоне гена FPGT (лизин83 на аргинин83) была обнаружена как на В-хромосомах, так и в В-хромосом-специфичной кДНК, стало ясно, что копия гена FPGT с В-хромосом транскрибируется. Мы исключили возможность наличия данной мутации в аутосомной копии гена сибирской косули с помощью генотипирования отдельных хромосом 1 и добавочных хромосом, полученных с помощью микродиссекции. Для исключения возможной гетерогенности добавочных хромосом по данной мутации, мы отсеквенировали десять разных клонов, полученных из библиотеки добавочных хромосом. Таким образом, мы показали, что обнаруженный транскрипт имеет В-хромосомное происхождение.

Другая В-хромосом-специфичная замена (G—>А) была обнаружена во втором экзоне гена LRRIQ3. Для того чтобы проверить гипотезу о транскрипционной активности копии этого гена, расположенного на добавочных хромосомах, мы получили последовательность исследуемого нами участка с В-хромосом-специфичной кДНК и тотальной кДНК, выделенной из культуры клеток фибробластов сибирской косули с 8 В-хромосомами. В кДНК и тотальной кДНК в искомой позиции был обнаружен аденин, как и на В-хромосомах. Этот факт говорит в пользу транскрипционной активности гена LRRIQ3, расположенного на В-хромосомах. Однако не исключена возможность того, что данная мутация присутствует в аутосомной копии данного гена. Поэтому необходимы дальнейшие исследования этого района.

ОБСУЖДЕНИЕ

Картирование В-хромосом сибирской косули показало, что на добавочных элементах присутствует крупный аутосомный сегмент, содержащий ряд уникальных генов. Эти данные согласуются с результатами, полученными на других видах позвоночных: у лисиц и енотовидных собак, у амазонской моллинезии РоесШа /огтоза (СурппосЬпИАэгте, РоесПМае) и у эндемичного вида цихлид озера Виктория. Кроме аутосомных копий генов или их фрагментов, на добавочных элементах присутствуют протяженные области, прилегающие к этим генам. Участки, картированные нами на В-хромосомах, имеют значительное сходство с гомологичными участками ДНК аутосом косули. В связи с этим можно заключить, что В-хромосомы представляют собой сегментные дупликации генома. Дуплицированные гены на В-хромосомах могут накапливать мутации (как было нами обнаружено в случае фрагмента второго экзона гена ЬИШСЭЗ и второго экзона гена РРСГ), что теоретически может приводить к возникновению новых функций этих генов, кроме того, возможно смешение доменов ранее не связанных генов и образование новых комбинаций геномных сегментов. Таким образом, добавочные элементы служат дополнительным источником новых вариантов кодирующих последовательностей и являются "горячими точками" эволюции. Эти данные становятся особенно важными в свете возможности транскрипции новых вариантов генов с В-хромосом. Известно, что сегментные дупликации обладают рядом общих закономерностей. В большинстве случаев сегментные генные дупликации располагаются тандемно. Со временем, дуплицированные копии перемещаются в другие районы хромосом. Кроме того, большинство генов дуплицируются полностью или частично, представляя собой часть больших дуплицированных сегментов. Особенно интересным является то, что гены с частично дуплицированным кодирующим районом могут быть функциональными. В нашем случае при оценке копийности одного из экзонов гена РРвТ у европейской косули без В-хромосом мы обнаружили дупликацию этого экзона. Таким образом, можно предположить, тандемное расположение дуплицированных сегментов у европейской косули с последующей интеграцией одного из сегментов в добавочные хромосомы, часто образующиеся при видообразовании, которое в большинстве случае происходит по районам, содержащим сегментные дупликации.

Гены ШШЗК, РРСТ и ЫШ[()3, локализованные на добавочных хромосомах, играют важную функциональную роль в жизнедеятельности организма. Известно, что продукт гена FPGT' участвует в утилизации фукозы -моносахарида, формирующего существенную часть сложных углеводов, гликолипидов и гликопротеинов (РавШвгак й а1., 1998). Продукт гена ШШЗК участвует в регулировании клеточного роста, пролиферации и дифференциации кардиомиоцитов (Наш^ап й а1., 1996). В связи с этим, особенно интересным оказалось обнаружение экспрессии копии гена РРБТ, локализованного на В-

хромосомах и появились весомые доказательства в пользу транскрипционной активности гена ЬЯР^З. Кроме того, в результате альтернативного сплайсинга генов РРСТ и ТЫШЗК, могут возникать различные варианты транскриптов, оказывающих то или иное важное влияние на функционирование организма. Однако в первом экзоне гена РРСТ, в первой аминокислотной позиции на В-хромосомах была выявлена замена метионин1 на валин1 относительно рассмотренного ряда позвоночных. Тогда как у европейской косули в этой позиции присутствовал полиморфизм, что может говорить о наличие псевдогена. Триплет ОТО, кодирующий валин, в стартовой позиции дуплицированного гена РРСТ, расположенного на В-хромосомах, может говорить о низкой степени экспрессии этого гена с добавочных хромосом или об образовании усеченной формы белка (ЯесМу е( а!., 1985; Яеуау с( а1., 2012).

Секвенирование и сравнение копий генов, представленных на В-хромосомах и аутосомах представителей семейства оленьих, показало, что копии генов, локализованные на добавочных хромосомах сибирской косули, имеют высокую степень гомологии с аутосомными копиями лося, марала, мазама и европейской косули. Эти данные говорят о недавнем происхождении добавочных хромосом от хромосомы 1 сибирской косули.

Использованные нами подходы для картирования В-хромосом — локализация ВАС клонов, ПЦР-картирование, ПЦР в реальном времени по отдельности не дают исчерпывающего ответа на вопрос о локализации аутосомных генов на добавочных элементах. Однако применение комплекса сразу нескольких подходов, включающих анализ геномной ДНК и отдельных компонентов генома (В-хромосом и аутосом), а также секвенирование транскриптов, позволяет с уверенностью ответить на вопросы о размере и свойствах дуплицированных сегментов.

ВЫВОДЫ

1. Кариотип сибирской косули является очень консервативным и представляет собой сохранившийся предковый кариотип семейства оленьих. Кариотипы коровы и сибирской косули разделяются восемью перестройками, из них шестью слияниями хромосом в линии косули, одним слиянием в линии коровы н одной инверсией на хромосоме 11 сибирской косули.

2. В-хромосомы сибирской косули содержат копии аутосомных генов ТМЫ13К, РРСТ и ЫОиОЗ с прилегающими к ним межгенными областями. Общий размер района, гомологичного участку (74.6 - 76.4 м.п.н.) хромосомы 3 коровы на добавочных элементах составляет около 2 м.п.н.

3. Копийность участков генов ТМКЧЗК, РРСТ и ЫШЩЗ коррелирует с числом В-хромосом.

4. Сравнение генов ТЫШЗК, РРСТ у оленьих относительно ряда млекопитающих показало, что данные гены консервативны

5. Показана экспрессия копии гена РРСТ-ТМШЗК, расположенного на добавочных хромосомах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Dementyeva Р.У., Trifonov V.A., Kulemzina A.I., Graphodatsky A.S. Reconstruction of the putative Cervidae ancestral karyotype by chromosome painting of Siberian roe deer (Capreolus pygargus) with dromedary probes // Cytogenet Genome Res. - 2010. - V. 128. - P. 228-235.

2. Трифонов B.A., Дементьева П.В., Беклемишева B.P., Юдкин Д.В., Воробьева Н.В., Графодатский А.С. Добавочные хромосомы, сегментные дупликации и эволюция // Генетика. — 2010. - № 46. - С. 1234-1236.

3. Trifonov V.A., Dementyeva P.V., Larkin D.M., O'Brien P.C.M., Perelman P.L., Yang F., Ferguson-Smith M.A., Graphodatsky A.S. Transcription of protein-coding gene on В chromosomes of the Siberian roe deer (Capreolus pygargus) // BMC Biology. - 2013. - 11: 90.

4. Dementyeva P., Makunin A., Graphodatsky A., Trifonov V. Genes on В chromosomes of vertebrates // Genetics and Molecular Biology, (in press)

5. Трифонов B.A, Найденко П.В. (Дементьева П.В.), Юдкин Д.В., Воробьева Н.В., Нестеренко А.И., Беклемишева В.Р., Рубцова Н.В., Ларкин Д.В., Ферпосон-Смит М.А., Графодатский А.С. Молекулярная организация В-хромосом сибирской косули // Симпозиум, посвященный 130-летию со дня рождения Левитского Г.А. "Хромосомы и эволюция". 26-27 ноября, 2008. Санкт-Петербург. С.91.

6. Трифонов В.А., Найденко П.В. (Дементьева П.В.), Юдкин Д.В., Воробьева Н.В., Нестеренко А.И., Беклемишева В.Р., Рубцова Н.В., Ларкин Д.В., Фергюсон-Смит М.А., Графодатский А.С. Добавочные хромосомы, сегментные дупликации и эволюция // Сборник трудов Международной конференции "Хромосома 2009". 31 августа-6 сентября, 2009. Новосибирск. С.35.

7. Дементьева П.В. Молекулярная организация В-хромосом сибирской косули // Тезисы II Международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика". 14-17 ноября, 2011. Новосибирск. С. 33.

8. Trifonov V.A., Dementyeva P.V., Makunin A.I., Larkin D.M., O'Brien P.C.M., Perelman P.L., Yang F., Ferguson-Smith M.A., Graphodatsky A.S. Amplification of genes on mammalian B-chromosomes // The 19,b international chromosome conference Bologna (Italy). September 2-6, 2013. Bologna, Italy. P. 167.

Подписано в печать 1.10.2013 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1 Объем 16 стр. Тираж 100 экз. Заказ № 163 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ni

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дементьева, Полина Владимировна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

на правах рукописи

04201364547 ДЕМЕНТЬЕВА ПОЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НА В-ХРОМОСОМАХ СИБИРСКОЙ КОСУЛИ

03.01.07 Молекулярная генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Трифонов В. А.

Новосибирск-2013

Работа выполнена в лаборатории сравнительной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Новосибирск.

Автор выражает благодарность своему руководителю Владимиру Александровичу Трифонову и научному консультанту Александру Сергеевичу Графодатскому (ИМКБ СО РАН) за участие и помощь в работе. Автор благодарит Дмитрия Аркадьевича Афонникова (ИЦИГ СО РАН, Новосибирск) за ценные советы по компьютерному анализу последовательностей и важные замечания при прочтении данной работы.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории сравнительной геномики ИМКБ СО РАН и лаборатории цитогенетики животных ИМКБ СО РАН за постоянную помощь и поддержку.

Оглавление

Список принятых в работе сокращений и условных обозначений..........................................6

Введение.........................................................................................................................................8

1. Обзор литературы....................................................................................................................14

1.1 В-хромосомы..........................................................................................................................14

1.1.1. Происхождение В-хромосом.......................................................................................15

1.1.1.1 Происхождение В-хромосом от аутосом......................................................................15

1.1.1.2 Происхождение В-хромосом от половых хромосом....................................................16

1.1.1.3 Происхождение В-хромосом в результате межвидовой гибридизации.....................17

1.1.2 Отличительные свойства В-хромосом.............................................................................19

1.1.2.1 Перспективы использования В-хромосом в биотехнологии.......................................21

1.1.3 Структура В-хромосом......................................................................................................21

1.1.3.1 Молекулярный состав В-хромосом...............................................................................21

1.1.3.2. Локализация уникальных аутосомных генов на добавочных хромосомах..............25

1.1.4 В-хромосомы млекопитающих.........................................................................................31

1.2 Сегментные дупликации и амплификация генов...............................................................36

1.3 Структура и функции генов TNNI3K, FPGTn LRRIQ3......................................................40

1.3.1 Структура и функции гена TNNI3K..................................................................................41

1.3.2 Структура и функции гена FPGT......................................................................................43

1.3.3 Структура гена LRRIQ3......................................................................................................44

1.4 Род косуля Capreolus.............................................................................................................44

1.4.1 Филогенетические связи семейства Cervidae..................................................................46

1.5 Хромосомная эволюция семейства оленьих (Cervidae).....................................................52

1.6 Заключение.............................................................................................................................53

2. Материалы и методы...............................................................................................................55

2.1 Материалы..............................................................................................................................55

2.2. Методы..................................................................................................................................59

2.2.1 Культивирование культур клеток фибробластов и получение суспензии хромосом.. 59

2.2.2 Приготовление препаратов метафазных хромосом........................................................60

2.2.3 GTG-бэндинг.......................................................................................................................61

2.2.4 Флуоресцентная in situ гибридизация..............................................................................61

2.2.4.1 Гибридизация...................................................................................................................61

2.2.4.2 Постгибридизационные отмывки, детекция и усиление сигнала...............................61

2.2.5 Полимеразная цепная реакция..........................................................................................62

2.2.6 DOP-ПЦР.............................................................................................................................63

2.2.7 Получение DOP библиотеки ДНК ВАС клонов..............................................................63

2.2.8 Мечение ДНК ВАС клонов...............................................................................................64

2.2.9 Полимеразная цепная реакция в реальном времени.......................................................64

2.2.10 Получение Cot 10 ДНК косули........................................................................................66

2.2.10.1 Реассоциация ДНК........................................................................................................66

2.2.10.2 Гидролиз однонитчатой ДНК 8]-нуклеазой................................................................66

2.2.11 Секвенирование ДНК.......................................................................................................67

2.2.11.1 Секвенирование ДНК....................................................................................................67

2.2.11.2 Переосаждение ДНК.....................................................................................................67

3. Результаты и обсуждение.......................................................................................................68

3.1 Стандартизация кариотипа косули, выявление гомологичных районов аутосом косули, коровы и верблюда........................................................................................................70

3.2 Картирование участков ДНК, лежащих на B-хромосомах косули...................................77

3.2.1 Картирование участков ДНК, лежащих на B-хромосомах косули с помощью ВАС клонов коровы..............................................................................................................................77

3.2.2 Картирование участков ДНК, лежащих на B-хромосомах косули, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом............................................................82

3.3 Оценка копийности генов, присутствующих на добавочных хромосомах у сибирской косули...........................................................................................................................................89

3.4 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом......................................................................................................................................92

3.4.1 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом гена LRRIQ3................................................................................................................93

3.4.2 Сравнение первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом генов TNNI3K и FPGT...............................................................................................95

3.5 Оценка эволюционной консервативности генов TNNI3K и FPGT...................................96

3.5.1 Сравнение первого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих.....................................99

3 .5.2 Сравнение второго экзона гена FPGT в ряду млекопитающих...................................102

3.5.3 Сравнение третьего экзона гена FPGT в ряду млекопитающих..................................106

3.5.4 Сравнение четвертого экзона гена FPGT в ряду млекопитающих..............................107

3.5.5 Сравнение промоторной области гена TNNI3Ky оленьих...........................................110

3.5.6 Сравнение первого экзона гена TNNI3Ky оленьих......................................................111

3.6 Обнаружение транскрипционной активности копии гена FPGT, расположенного на В-хромосомах.............................................................................................................................112

4. Заключение.............................................................................................................................114

5. Выводы...................................................................................................................................118

Список литературы....................................................................................................................119

Приложение 1. Нуклеотидные последовательности первого экзона гена FPGT у

представителей семейства оленьих.........................................................................................144

Приложение 2. Нуклеотидные последовательности второго экзона гена FPGT у

представителей семейства оленьих.........................................................................................146

Приложение 3. Нуклеотидные последовательности третьего экзона гена FPGT у

представителей семейства оленьих.........................................................................................147

Приложение 4. Нуклеотидные последовательности первого экзона гена TNNI3K у представителей семейства оленьих.........................................................................................148

Список принятых в работе сокращений и условных обозначений

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ - дезоксигуанидинтрифосфат дТТФ - дезокситимидинтрифосфат дЦТФ — дезоксицитидинтрифосфат дУТФ — дезоксиуридинтрифосфат дНТФ — дезоксинуклеозидтрифосфат кДНК - кодирующая ДНК

Для сокращенных латинских названий использовали трехбуквенные

обозначения: первая буква родового названия и две видового (например,

Capreolus pygargus — Сру)

п.н. — пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

м.п.н. - миллион пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТАЕ (Tris-acetate Buffer) - трис-ацетатный буфер

ЭДТА - этилецдиаминтетраацетат

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - метод, применяющийся для исследований полиморфизмов ДНК

ВАС - искусственная бактериальная хромосома (Bacterial Artificial Chromosome)

CHORI (Children's Hospital Oakland Research Institute) - библиотека ВАС

клонов различных организмов

DAPI - 4, 6-диамидино-2-фенилиндол

DOP (Degenerated Oligonucleotide Primer) - частично вырожденный праймер FISH - флуоресцентная in situ гибридизация FITC - флуоресцеинизотиоцианат

GTG (G-band by Trypsin using Giemsa) — бэндинг, полученный лимитированной протеолитической обработкой препаратов метафазных хромосом и последующей окраской красителем Гимза

LINE (Long Interspersed Elements) - длинные диспергированные повторы LTR (Long Terminal Repeats) - длинные концевые повторы, характерные для ДНК ретротранспозонов, фланкирующие функциональные гены PBS (Phosphate Buffer Solution) — фосфатный буфер

PSR (Paternal Sex Ratio) - добавочная хромосома у осы Nasonia vitripennis SINE (Short Interspersed Elements) - короткие диспергированные повторы SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) - вариация в последовательности ДНК в одном нуклсотиде

SSC (Standard Saline Citrate solution) ~ стандартный солевой буфер

VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - вариабельные тандемные

повторы

Введение

Актуальность проблемы

B-хромосомы щш добавочные, сверхчисленные хромосомы обнаружены у животных, растений, грибов и отличаются необязательностью для жизнедеятельности организма (Camacho et al., 2000). Основная часть исследований по молекулярной организации В-хромосом показала, что добавочные элементы богаты повторенной некодирующей ДНК: LINE - элементами и SINE - элементами, теломерными и центромерными повторами, рибосомной ДНК, гистоновыми генами и не несут экспрессиругощихся уникальных генов. Имеющиеся данные наводили на мысль о функциональной инертности B-хромосом. Однако с применением молекулярных методов в последнее время был обнаружен целый ряд уникальных аутосомных генов, расположенных на В-хромосомах, у различных организмов: у паразитического гриба Nectria haematococca (Miao et al., 1991), у представителей семейства хищных (Graphodatsky et al., 2005; Yudkin et al., 2007; Duke Becker et al., 2011), у амазонской моллинезии Poecilia formosa (Cyprinodontiforme, Poecillidae) (Lamatsch et al., 2011), у эндемичного вида цихлвд озера Виктория (Yoshida et al., 2011), а также в рисе Seeale cereale (Martis et al., 2012). Кроме того, в B-хромосомах риса были обнаружены копии митохондриальной и хлоропластной ДНК (Martis et al., 2012).

Вопрос о транскрипционной активности генов, расположенных на В-хромосомах млекопитающих, долго оставался спорным и открытым. Была показана экспрессия рибосомных генов, лежащих на добавочных элементах, у растений (Leach et al., 2005) и животных (Rubtsov et al., 2004; Ruiz-Estevez et al., 2012). Однако обнаружите в данном исследовании транскрипта FPGT-TNNI3K, экспрессирующегося с дуплицированных генов на В-хромосомах в культуре фибробластов сибирской косули — является первым примером транскрипционной активности уникальных генов,

расположенных на добавочных элементах карнотипа млекопитающих. Варьирование копийности функционально значимых генов в зависимости от числа В-хромосом может оказаться критическим для жизнедеятельности вида. Таким образом, проведенное в данной работе подробное картирование В-хромосом сибирской косули выявило важные функциональные последовательности, локализованные на добавочных элементах, и показало их экспрессию, что способствует пересмотру представления о В-хромосомах и необходимости учитывать их возможную роль в жизнедеятельности организма и в эволюции геномов.

Первоочередной задачей нашего исследования была разработка метода идентификации генов на В-хромосомах позвоночных. В основу нашей методики был положен метод БНАС (глава 2.1). Были созданы библиотеки кДНК, гомологичные В-хромосомам разных видов млекопитающих, и, в частности, сибирской косули. Из них было отсеквенировано 45 клонов. Некоторые из этих клонов были представлены в генном банке под следующими номерами: Ж871269-Ж871285 (глава 3, таблица 2). Среди клонов были обнаружены транскрипты уникальных генов, большинство из которых были гомологичны ген-содержащему району хромосомы 3 коровы.

Цель и задачи исследования

С учетом имеющейся базы целью представленной работы было детальное картирование В-хромосом сибирской косули Саргео1ш pygargus (2п=70+0-12В) и выявление транскрипционной активности дуплицированных генов, расположенных на В-хромосомах.

Поскольку косуля не относилась к числу видов, вовлеченных в исследования по картированию генома, то генетический состав и гомология хромосом косули с хромосомами хорошо картированных видов не были известны, а кариотип был охарактеризован только классическими цитогенетическими методами. Поэтому первой задачей данной работы являлась стандартизации кариотипа косули и выявление гомологичных

районов хромосом косули, верблюда и коровы с помощью хромосомного пэйнтинга. Второй задачей нашей работы было проведение "грубого" картирования участков ДНК, лежащих на В-хромосомах косули, с помощью флуоресцентной in situ гибридизации ВАС клонов коровы. А также выявление границ и примерного размера аутосомных участков ДНК косули, локализованных на В-хромосомах, с помощью ПЦР на библиотеке сортированных добавочных хромосом.

Данные картирования добавочных элементов не дают ответа на вопрос о копийности участков, расположенных на В-хромосомах, поэтому третья задача нашего исследования заключалась в оценке копийности генов, лежащих на добавочных элементах, у сибирской косули с разным числом В-хромосом с помощью ПЦР в реальном времени.

Четвертая задача нашего исследования — выявление различий первичной структуры гомологичных фрагментов ДНК аутосом и В-хромосом с помощью секвенирования - позволила обнаружить В-хромосом-специфичные замены. Данные замены выступают в качестве маркеров при оценке экспрессии генов, расположенных на добавочных элементах.

Пятая задача нашего исследования — оценка эволюционной консервативности генов, локализованных на В-хромосомах, путем сравнения экзонов этих генов у косули, лося, марала, мазама и других видов позвоночных. Степень консервативности генов, расположенных на В-хромосомах, позволит ответить на вопрос о роли добавочных хромосом в эволюции геномов.

Доказательство транскрипционной активности дуплицированных копий генов, расположенных на В-хромосомах, путем выявления аналогичных нуклеотидных замен в ДНК В-хромосом и в клонах кДНК было шестой задачей нашего исследования.

Научная новизна и практическая ценность

Впервые проведена стандартизация кариотипа косули относительно кариотипов коровы и верблюда, с помощью хромосомного пэйнтинга

выявлены гомологичные районы хромосом косули, верблюда и коровы. Обнаружены восемь перестроек, разделяющих кариотипы коровы и косули, из них шесть слияний хромосом в линии косули, одно слияние в линии коровы и одна инверсия на хромосоме 11 сибирской косули. Впервые показано, что на добавочных хромосомах сибирской косули локализуется район размером около 2 м.п.н., гомологичный участку хромосомы 3 коровы (74.6 - 76.4 м.п.н.) и несущий такие важные гены как TNNI3K, FPGT и LRRJQ3.

Удалось установить, что копийность участков генов TNNI3K, FPGT и LRJRIQ3 коррелирует с числом В-хромосом, но не всегда в прямопропорциональной зависимости. Не все В-хромосомы содержат копии участков этих генов, что говорит об их гетерогенном составе.

Обнаружено, что копии генов, локализованные на В-хромосомах сибирской косули, имеют высокую степень гомологии с аутосомными копиями и не подвергаются влиянию отбора. Однако в двух случаях были обнаружены несинонимичные В-хромосом-специфичные замены: во втором экзоне гена LRRIQ3 и во втором экзоне гена FPGT. Кроме того, в начале первого экзона гена FPGT, в качестве кодона, выполняющего функцию инициации трансляции, выявлен кодон GUG на В-хромосомах вместо AUG относительно рассмотренного ряда позвоночных. Поскольку замены, обнаруженные на добавочных хромосомах, совпали с заменами, обнаруженными в клонах кДНК, был сделан вывод о транскрипционной активности этих генов. Хотя степень экспрессии этих генов может быть низкой, о чем свидетельствует наличие альтернативного кодона GUG, отвечающего за инициацию трансляции. Вместе с тем, добавочные хромосомы могут служить дополнительным источником новых вариантов кодирующих последовательностей за счет накопления мутаций в локализованных на них дуплицированных генах и, ввиду показанной нами экспрессии этих генов, оказывать огромное влияние на жизнедеятельность организма.

Использование разработанных нами молекулярных по�