Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура хроматина домена, включающего ген дигидрофолатредуктазы, в культуре клеток яичников китайского хомячка

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура хроматина домена, включающего ген дигидрофолатредуктазы, в культуре клеток яичников китайского хомячка"

V , *

РГ6 од

2 9 МАЙ 1935

На правах рукописи

ПЕМОВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ДОМЕНА, ... ВКЛЮЧАЮЩЕГО ГЕН ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ, В ХУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЯИЧНИКОВ КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук

С.Г.Бавыкин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.В.Козлов кандидат.биологических наук Д.Г.Николаев

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН.

Защита состоится "¿Р2 * 1995 г. в ^

В

часов

Автореферат разослан.

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

А.М.Крицын

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Хроматин эукариотического ядра - это сложный динамичный ДНК-белковьШ комплекс, структурной основой которого являются нуклеосомы,* выполняющие не только функцию компактизации ДНК, но и играющие важнейшую регуляторную роль (как позитивную, так и негативную) в процессах транскрипции, репликации, рекомбинации ДНК. Полное.понимание этих процессов, протекающих в клеточном ядре с участием большого количества регуляторных факторов и ферментативных комплексов, возможно лишь в "контексте" хроматина.

Репликация и транскрипция ДНК - одни из основных процессов, происходящих в живой клетке. Иследование. этих процессов у млекопитающих - сопряжено со значительными трудностями, вызванных больвими размерами их генома. Одной из наиболее удобных и исследованных систем для изучения структуры и функции хроматина млекопитающих является культура клеток яичников китайского хомячка (СИОС 400), несущих амплифицированный приблизительно в 1000 раз геномный домен длиной 240 т.H.H., включающий... нескольких генов (наиболее изученным из них является ген дигидрофолатредуктазы - ДГФР), .две области инициации репликации (Orí-beta и Orí-gamma), а также участок прикрепления ДНК к ядерному матриксу (MAR).

'Haba 'работа посвяшена "изучению структуры Хроматина различных областей домена ДГФР в клетках линии СНОС 400.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Цель работы -заключалась в исследовании

специфики структуры хроматина различных областей домена ДГФР, в первую очередь, регуляторных - участков начала репликации ДНК и промоторной области гена ДГФР, а также участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу (MAR).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. з Впервые была исследована структурная организация хроматина в регуляторной области начала репликации и участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу в клетках млекопитающих. Также впервые были получены данные о характере ДНК-гистоновых взаимодействий , в, протяженной области конститутивного - умеренно транскрибируемого гена ДГФР. Для регуляторных областей гена ДГФР. и одного из Orí было показано

> 1

"li

сушествование необычных нуклеосом, гистоны которых утратили большую часть гистидиновых контактов с ДНК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на

Конференции по регуляции репликации эукариотической ЛИК (McGill University Conference) в Монреале в 1990 году,, на Симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Keystone Symposia) в Кистоуне (США) в 1992 году, на Гордоновской конференции по белкам клеточного ядра, структуре хроматина и регуляции генов (Gordon conference, Tilton, NH) в Тилтоне (США) в 1994 году.

По материалам диссертации опубликованы три Список публикаций приведен в конце

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трех

глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов, и списка цитированной литературы. Работа изложена на 80 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков и 3 таблицы.

ПУБЛИКАЦИЙ, печатные работы, автореферата.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ч

Все эксперименты проводили на ядрах, выделенных из культуры клеток яичников китайского хомячка (СНОС 400), которые содержат участох генома длиной 240 т.п.н., амплифицированный приблизительно в 1000 раз (Milbrandt et al., 1981). Аыпликоны расположены в трех хромосомных локусах, попарно чередуясь в порядке "голова-к-голове* и "хвост-к-хвосту" (Looney and Hamlin, 1987^ Ma et al., 1988; Milbrandt et al., 1981). Каждый ампликон включает несколько генов, в т.ч. ген' ДГФР, область инициации репликации ДНК, а также область MAR.

Были исследованы три аспекта структуры хроматина различных участков домена ДГФР: 1) ДНК-гистоновые взаимодействия - методом ДНК-белковых сшивок; 2) нуклеосомная организация и длина нуклеосомного повтора - частичным гидролизом хроматина микрококковой нуклеазой; и 3) присутствие в различных областях домена негистоновых белковых факторов и позиционированных нуклеосом - методом непрямого концевого мечения. Схема эксперимента представлена на Рис.1. Карта домена ДГФР и расположение ДНК-проб, использованных в эксперименте, показано на Рис.2.

В. __ экспериментах 1) и . 2) (Рис,1, А. и В), ; ядра предварительно обратимо фиксировали формальдегидом, чтобы предотвратить перераспределение или потерю гистонов в участках "активного" хроматина (Bavykin et al., 1993; Nacheva et al., 1989). В дальнейшем, перед электрофоретическим разделением ДНК-белковых комплексов и фрагментов ДНК, формальдегидную фиксацию удаляли. В. эксперименте 3) (Рис.1, С) фиксацию хроматина формальдегидом не проводили, поскольку концентрацию микрококковой нуклеазы подбирали так, чтобы свести к минимуму возможные артефактные изменения структуры хроматина.

1. Количество сшивающихся с ДНК гистонов резко снижено в 5'-области гена ДГФР и в одном из участков начала репликации — Ori-gamma.

Для исследования ДНК-гистоновых взаимодействий в различных участках домена ДГФР использовли метод гибридизации с

ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР

Исследование ДНК-гистоновых взаимодействий

В

Исследование нухлеосоыной организации хроматина

Картирование чувствительных к мк.нуклеазе 'сайтов

ФИКСАЦИЯ ЯДЕР ФОРМАЛЬДЕГИДОМ

I I

ДНК-БЕЛКОВАЯ . ГИДРОЛИЗ ХРОМАТИНА ЯДЕР МК.НУКЛЕАЗОЙ

СЛИВКА ДИМЕТИЛ-

СУЛЬФАТННМ МЕТОДОМ

. УДАЛЕНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИДНОЙ ФИКСАЦИИ

I

ВЫДЕЛЕНИЕ СЖИТЫХ - ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ

I -

2-0 ДИАГОНАЛЬНАЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В ПААГ

\

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФРАГМЕНТОВ ДНК

ГИДРОЛИЗ ДНК РЕСТРИКТАЗАМИ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗЕ

ПЕРЕНОС ФРАМНГГОВ ДНК ИЗ ГЕЛЯ НА МЕМБРАНУ

\ I /

ГИБРИДИЗАЦИЯ С ДНК-ПРОБАМИ

Рис.1. Схема эксперимента. Подробности указаны в разделе "Материалы и методы"

о ю

90 240

АГФРгвн

' I ir~T

X -Н X н

1

7.25

103, CAT

CS

OR!

X X X

еэ га IUI EX

ORMwU

w

X X

ORl-g

mai

H H 4Л

14(700/ а а а ^xn —15

ii3826Z7 6 мая4т 14ПООО)

Рис.2. Схема домена ДГФР в культуре клеток СНОС 400 и расположение проб, использованных в эксперименте. Экзоны гена ДГФР (1-6) показаны черными прямоугольниками, интроны -белыми, область MAR - заштрихованным прямоугольником, Участок инициации и направление транскрипции гена ДГФР горизонтальной стрелкой, участок инициации репликации 0BR (Burhans et al., 1990), - вертикальной стрелкой. Расположение проб-показано прямоугольниками под схемой домена ДГФР. X и R -положение сайтов гидролиза ДНК рестриктазами Xbal и Hindlll, соответственно. Рестриктные фрагменты Xbal и Hind III, в которых определяли положение чувствительных к микрококковой нуклеазе сайтов, показаны фигурными скобками, обращенными вниз. Длина каждого фрагмента в т.п.н. указана под скобкой.

"белковыми тенями" (Кагро\ ег а1., 1984; КНггаЬекоу ег а1., 1989), основанный на химической сшивке белков с ДНК диметилсульфатным методом (Рис.1, А).

Для идентификации и оценки количественного содержания сшивающихся с ДНК гистонов в определенном участке, обогащенные ДНК-белковые комплексы фракционировали с помощью диагонального 2-Э электрофореза (КИггаЬекоу е1 а1., 1989). После разделения во втором направлении' фрагменты суммарной ДНК располагались вдоль трех диагоналей, как показано на. окрашенном бромистым этидием геле (Рис.3, А)., Диагональ . 1 содержит свободную ДНК,

□ DD

диагонали 2 и 3 содержат ДНК, которая была сшита с гистонами нуклеосомного кора и гистоном Н1, соответственно (Кагрог е1 а!., 1984). После электропереноса ДНК из геля на мембрану количество гистонов, сшитых с ДНК в том или ином участке, определяли гибридизацией с соответствующей пробой и денситометрическим сканированием 2-4 авторадиограмм с'различным временем экспозиции. Используя калибровочную кривую, определяли значение Э (см. раздел "Материалы и методы") для каждой диагонали. Количество сшивающихся с ДНК гистонов кора и гистона

15

Рис.3. 2-D электрофорез сшитых ДНК-белковых комплексов. Определение количества сшивавшихся с ДНК гистонов в различных областях домена ДГФР. ДНК-белковые сшивки гфоводили как описано в разделе "Материалы и методы". Гистоны в составе ДНК-белковых комплексов после электрофоретического разделения в геле первого направления гидролизовали непосредственно в геле, затем фрагменты ДНК разделяли во втором направлении. После переноса на мембрану фрагменты ДНК гибридизовали с соответствующими пробами. Диагональ 1 соответствует свободной ДНК, диагонали 2 и ' 3 соответствуют фрагментам ДНК, которые были сшиты с гистонами кора и гистоном Н1, соответственно. А. 2-D гель, ~ содержащий суммарную ДНК, окрашенную бромистым этидием. B-Ö - последовательная гибридизация мембраны с пробами 103САТ, 1.3R1, INT, ЕХ, 11, 38, 26, 27,- б, MAR, 47, 14(1000), 14(700) и 15, соответственно. 1

Hi в области MAS принято равным 10095. Количество гястонов в остальных областях домена выражено в процентах от значений, полученных для области MAR. Усредненные данные сканирования представлены в Таблице 1. Погрешность измерений составила -896.

Результаты гибридизаций блота с различными пробами из домена ДГФР (Рис.2)' представлены на' Рис.3. Длительность экспозиций авторадиограмм подбирали так, чтобы интенсивность диагонали 1 (свободная ДНК) была примерно одинаковой для всех использованных проб (за исключением Рис.3 В, С, М - для проб ЗОЗСАТ, 1.3R1, и 14(1000), на которых интенсивность диагонали 1 примерно вдвое выше, чем на остальных, что было необходимо для выявления слабых диагоналей 2 и 3).

Гибридизация с пробой 1.3R1, соответствующей 5*-области гена ДГФР на участке от -900 до +400 п.н^ относительно AUG-кодона, включаюшей промотор и первый экзба гена (Рис.2), показала, что в этой области количество гистонов, сшивающихся с ДНК, резко снижено по сравнению с Шй (22% для гистонов кора и 20% для гистона HI) (Рис.3, С и К). В области промотора гена на участке от -103 до -16 (проба 103САТ), включающего сайт основного старта транскрипции, количество сшивающихся с ДНК гистонов еще более снижено и составляет 8% для гистонов кора (гистон HI не идентифицируется) (Рис.3, В). Напротив, в З'-обла'сти гена (5-ый интрон и 6-ой экзон," пробы INT и ЕХ, соответственно) (Рис.3, D и Е) количество сшивающихся с ДНК гистонов кора значительно выше и составляет 75% по сравнению с MAR. Необходимо отметить относительно низкое содержание гистона HI (50%) на участке длиной 1.2 т.п.н. в центральной части 5-го интрона (Рис.3, D), в то время как содержание гистона HI в области 6-го экзона (Рис.3, Е) составило 6596.

Относительно высокое количество гистонов, сшивающихся с ДНК, было обнаружено в области Ori-beta (Рис.3, F-I). Для участков, соответствующих пробам 11, 38 и 26, количество сшивающихся с ДНК гистонов колеблется от 67% до 79% для гистонов кора и от 63% до 7096 для гистона Hi (Таблица 1). В районе расположения пробы 27 зафиксировано максимальное количество сшитых с ДНК гистонов по домену: 13296 и 105% для гистонов кора и гистона HI, соответственно (Рис.3, I). Интересно отметить, что участки, занимаемые пробами 26 и 27, вплотную прилегают друг к другу, при этом содержание в них

Таблица 1.

Содержание (%) сшивающихся с ДНК гистонов в различных областях домена ДГФР.

Область домена Проба Гистоны кораа Гистон Н1а

1.3R1 22 20

103САТ 8 ■ Ъ

Ген ДГФР

INT 75 50

EX 74 65

11 79 65

38 . 74 70

Ori-beta

26 67 63

27 132 105

6 49 38

MAR и прилегавшие MAR

100 100

области - -

47 47 30

14(1000) 23 9

Ori-gamma 14(700) 56 45

15 66 50

а Данные для каждого исследованного участка получены сканированием 2-4 авторадиограмм с различным временем экспозиции, определением среднего значения величины D и ошибки измерения и представлены в % относительно значений для области MAR, в которой количество сшитых с ДНК гистонов было принято равным 100%. Ошибка измерения составила -8S.

k Не определяется.

сшитых с ДНК гистонов отличается приблизительно в два раза.

В области Ог^авша (пробы 14(1000), 14(700) и 15) наблюдается снижение обоего количества сшитых с ДНК гистонов (Рис.3, М-0 и Таблица 1).- Из трех исследованных участков наболее высокое количество свитых гистонов обнаружено в области пробы 15 (бб% для гистонов кора и 50% для гястона Н1), что несколько ниже( чем в 3'-области гена ДГФР и в области Оп'-Ьега. На участке, занимаемом пробой 14(1000), наблюдается резкое снижение количества спитых с ДНК гистонов (Рис.3, М) -2395 и 9% для гистонов кора и гистона Н1, соответственно. В районе пробы 14(700), расположенном между пробами 14(1000) и 15, значения промежуточные и составляют 5696 и 4596 для гистонов кора и гистона Н1 (Рис.3, И).*

Количество сшивающихся с ДНК гистонов в области МАЙ оказалось одним из самых высохих из исследованных областей (Рис.3, К, Таблица 1). . Однако,в участках, соответствующих пробам 6 и 47 (функции этих участков неизвестны), расположенных в тесном соседстве с областью МАЯ, количество гистонов кора снижено более, чем в вдвое, а гистона Н1 в 2.5-3 раза (Рис.3, J и Ь, Таблица 1).

Результаты наших исследований показывают, что характер ДНК-гистоновых взаимодействий в различных областях домена ДГФР весьма неоднороден. В большей* части области ОН-Ье1а характер ДНК-гистоновых взаимодействий сходен с транскрибируемой З'~~областыо гена ДГФР, тогда как в ОН^ашта, особенно в левой части; контакты гистонов с ДНК резко ослаблены, тах же, как это имеет место в 5*-области гена ДГФР. Ранее было показано, что резкое снижение количества сшитых с ДНК гистонов характерно для регуляторных областей генов, а также для транскрибируемых участков активно экспрессируемых генов (Кагроу а1., 1984; ВеНкоу ег а!., 1990; ВеНкоУ еГ а]., 1993; №с>1еуа а а1., 1989). Снижение количества сшивающихся с ДНК гистонов в той или иной области указывает на то, что эти области либо- частично свободны от гистонов, либо содержат нуклеосомы, в которых гистоны взаимодействуют с ДНК способом, не характерным для тотального хроматина. Такая ситуация описана для гена У^р 70 П. melanogaster. . При его. активации контакты между ДНК и гистидиповыми остатками аминокислот гистонов в хроматине кодирующей части гена значительно ослабевают, однако,

взаимодействие лизин-богатых N-концевых фрагментов гистонов с ДНК сохраняется (Nacheva et al., 1989).

2. Регулярная нуклеосоыная организация нарушена в 5*-области гена ДГФР, в то время как в других исследованных участках домена структура хроматина упорядочена.

Нуклеосомная организация различных областей домена ДГФР была исследована с помощью частичного гидролиза хроматина в составе выделенных ядер микрококковой нуклеазой (Рис.1, В). Фрагменты ДНК фракционировали электрофорезом в 1.5% агарозном геле, переносили на мембрану, которую гибридизовали с теми же пробами, которые использовали для определения количества сшивающихся с ДНК гистонов. Величину нуклеосомного повтора определяли как описано ранее (Noll and Kornberg, 1977).

Гибридизация с пробой 1.3R1 выявила сложную картину (Рис.4, В). Длины большинства фрагментов не соответствуют длинам мультимеров обычного нуклеосомного повтора (180-200 п.н.), относительная интенсивность и ширина полос не изменяются монотонно, как это имеет место для всех других областей (ср. Рис.4','В и 4," C-N). В большинстве случаев разница в длине двух" соседних полос составляет менее 145 п.н. (длина ДНК минимальной нуклеосомы). В дополнительном эксперименте, в котором степень гидролиза хроматина была значительно. выше, мы показали, что дискретных частиц с длиной ДНК менее 165 п.н. практически не образуется (данные не приведены). Такой характер гидролиза хроматина, по-видимому, связан с нерегулярным расположением нуклеосом, соединенных спейсерной ДНК разной длины, что может быть вызвано взаимодействием негистоновых белков Spl и E2F с ДНК этой области (Azizkhan et al., 1993). ■ Такая 'модель организации хроматина 5'-области гена ДГФР находится в соответствии с данными работы Тази и Берда (Taxi and Bird, 1990), показаввих, что нуклеосомы в - областях, включающих 5*-регуляторные участки и первые экзоны конститутивно экспрессируемых генов, могут быть организованы в виде олигонуклеосомных "островков", разделенных мехнуклеосомной ДНК различной длины. Эти нуклеосомы, в отлйчие от нуклеосом тотального хроматина, содержат гиперацетилироваккые формы

М- 1JR1 INT EX 11 38 26 27 6 MAR 47 74 14 15

1000 700

Рис.4. Нуклеосомная' организация хроматина различных облаете^ домена ДГФР. Хроматин в составе выделенных ядер гидролизовали микрококковой нуклеазой как описано в разделе "Материалы и методы", ДМ после электрофореза вагарозном геле переносили на мембрануi и гибридизовали с различными пробами. А - маркерная дорожка, содержащая мультимеры фрагмента длиной 123 п.н., нижний фрагмент является димером и имеет длину 246 п.н. B-N — последовательная гибридизация мембраны с пробами 1.3R1, INT, ЕХ, 11, 38, 26, 27, 6, MAR, 47, 14(1000), 14(700) и 15, соответственно. DN, TN, 4N, и т.п. обозначают положение ди-, три-, тетра- и т.п. нуклеосом.

гистонов и пониженное количество гистона HI. Для 5*-области гена ДГФР мыши, включающей первый экзон и прилегающие с обеих сторон области (1-2 нуклеосомы), также было показано наличие необычных нуклеосом, содержащих HMG. белки и убиквктированные гистоны (Barsoum and Varshavsky, 1985). Возможно, снижение

количества сшивающихся с ДНК гистонов в 5'-области гена ДГФР связано как с присутсвием свободных от нуклеосом участков, так и с наличием нуклеосом, содержащих модифицированные гистоны и HMG белки.

Гибридизация с остальными пробами показала, что З'-область гена ДГФР, обе зоны начала репликации, а также область MAR и прилегающие к ней участки имеют регулярную нуклеосомную структуру (Рис.4, B-N), включая участок Ori-гамма, в котором количество гистонов, свивающихся с ДНК, резко снижено. Интересно отметить, что хроматин этого участка (проба 14(1000)) наиболее устойчив к действию микрококковой нуклеазы - интенсивность нуклеосомных полос в дорожке (Рис.4, L) заметно снижена по сравнению с интенсивностью нуклеосомных полос в других дорожках (Рис.4, М, N).

Величина нуклеосомного повтора в различных участках домена изменяется незначительно (Таблица 2), разница между максимальным значением, найденным для участка, занимаемым пробой 15, и минимальным - для 14(1000), составляет 10 п.н.

Таблица 2;

Величина нуклеосомного повтора, (п.н.) в исследованных областях домена ДГФР.

Проба 1.3R1 INT ЕХ 11 38 26 27 / 6 MAR 47 14 (1000) 14 (700) 15

В.н.п? - 193 189 189 191 1 192 190 189 194 191 185 193 195

а Величина нуклеосомного повтора.

Таким образом, различия в количестве сшиваюкихся с ДНК гистонов в исследованных областях дсмена ДГФР, за исключением 5"-области гена ДГФР, в которой регулярная нуклеосомная

структура нарушена, обусловлены прежде всего спецификой ДНК-гистоновых взаимодействий, 1 не количеством реально присутствующих гистонов.

3. Области начала репликации - Ori-бета и Ori-rauua - в отличие от 5'-области гена ДГФР не содержат гиперчувствительных к действию микрококковой нуклеазы сайтов.

Для локализации позиционированных нуклеосом и негистоновых белковых факторов, взаимодействующих с ДНК 5'-области гена ДГФР и областей начала репликации, мы использовали метод непрямого концевого мечения (Wa, 1980; Nedospasov and Georgiev, 1980). В качестве гидролизующего ДНК агента использовали микрококковую нуклеазу. Концентрацию мк. нуклеазы подбирали так, чтобы на каждые - 10 т.п.н. ДНК приходился один сайт гидролиза. После очистки, ДНК расщепляли рестриктазами Xbal или Hindi II, чтобы картировать сайт - гидролиза - ДНК микрококковой нуклеазой относительно сайта рестрикции. Фрагменты ДНК фракционировали электрофорезом в 1.5% агарозном геле, переносили на мембрану и гибридизовали с пробами, . прилегающими к одному из сайтов рестрикции. Сайты гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой сравнивали с соответствующими сайтами в. препарате .свободной . ДНК.

Мы обнаружили 5 типов сайтов гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой: 1) гиперчувствительные сайты -присутствуют только в хроматине, интенсивность соответствующих им полос в геле значительно- выше (минимум в 10 раз) интенсивности других полос; 2) вновь появившиеся сайты -присутствуют только в хроматине, однако, интенсивность соответствующих им полос сравнима с остальными полосами; 3) исчезнувшие сайты - отсутствуют в хроматине, но присутствуют в свободной ДНК; 4) усиливающиеся - и S) ослабевающие по сравнению со свободной ДНК сайты.

Возникновение большинства гиперчувствительных к действию различных нуклеаз участков в хроматине вызвано взаимодействием с ДНК данной области негистоновых белковых факторов (Gross and Garrard, 1988; Elgin, 1988; Wallrath et al.? 1994). Разумно предположить, что вновь появившиеся и усилившиеся сайты в хроматине, хотя и менее доступные действию микрокохковой

с

DNA Chrom

"at

«4« *» —

ff=

»» -

В:

Xbol

Xbal

Hind Ж

D

DNA Chrom

Hind HI

5'

i

I I

53 52

47

43

Ш I-'2 11

38

.... 3'

4241 I I ' kb 504948 45 44 39 57

3130292625

g IL

14

»

kb

39 Jт 3332 13

I

iHliUüM'F Г1

jr-t-----3' -

s kb

Рис. 5. Картирование чувствительных к микрококковой нуклеазе сайтов в протяженной 5*-области гена ДГ4Р. А-Б -свободная ДНК и выделенные ядра гидролизовали микрококковой нуклеазой. После депроитенизации, ДНК гидролизовали рестриктазами ХЪа1 (А и В) и Нш<Ш1 (С и Ь). После электрофореза в 1.5% агарозе фрагменты ДНК переносили на мембрану и гибридизовали с пробой 1 .ЗЬ1. В и О - более длительные экспозиции авторадиограмм, представленных на А и С, соответственно. Е - детальная карта участка длиной 12 т.п.н. хроматина 5'-области гена ДГФР, показывающая положение гиперчувствительных сайтов (вертикальные стрелки), вновь появившихся сайтов -<( квадратики), исчезнувших сайтов

¡кружочки), усиливающихся или ослабевающих сайтов вертикальные линии напрвленные вверх или вниз, соответственно), по сравнению с соответствующими сайтами в свободной ДНК. Длина и толщина линий соответствует степени усиления или ослабления этих сайтов. Показаны все 53 сайта, которые идентифицированы на этих авторадиограммах.

7

14

нуклеазы, чем гиперчувствительнъгё, также обусловлены взаимодействием с ДНК негистоновых белков. Мы рассматриваем гиперчувствительные, вновь появившиеся и усилившиеся сайты в хроматине, как вероятные места связывания негистоновых белков с ДНК.

Для картирования позиционированных нуклеосом мы использовали критерий, предложенный Симпсоном: каждая область ДНК, длиной не менее 140 п.н., защищенная от действия микрококковой нуклеазы в составе хроматина и доступная гидролизу в препарате свободной (контрольной) ДНК, может рассматриваться, как занимаемая позиционированной нуклеосомой (Simpson, 1991).

Сайты гидролиза хроматина 5*-области гена ДГФР идентифицировали гибридизацией' пробы 1.3R1 с двумя перекрывающимися рестриктными фрагментами - Xbalдлиной 7.2 т.п.н.(от -6240 до +940 п.н.), и-с Hindi 11 фрагментом, длиной 7.25 т.п.н. (от -1240 до +6010 п.н.) (Рис.2). Результаты представлены на Рис.5. •- г ■

Мы обнаружили ряд гиперчувствительных сайтов, организованных в два отдельных кластера в 5'-области гена: проксимальный - в участке от -150 до +100 п.н.. и дистальньш -от -550 до -300 п.н. Наиболее сильный гиперчувствительный сайт (N26, Рис.5) находится ^в положении -20 п.н.- относительно AUG-кодона, другой сайт с увеличенной чувствительностью к микрококковой нуклеазе (N27, Рис.5) находится в положении -133 п.н. Этот участок содержит точки главного и второстепенного старта транскрипции гена ДГФР в положении -63 и -107, соответственно (Mitchell et al., 1986). Три других несколько более слабых гиперчувствительных сайта, образующих дистальный кластер, картированы в положениях -520, -405 и -325 (NN29-31, Рис.5). Два сильных гиперчувствительных сайта были картированы в 5 * -фланкирующей области гена ДГФР. в положении -3270 п.н. и в области 3-го интрона гена ДГФР в положении 2950 п.н. (NN51 и 3, Рис.5).

Этот ' эксперимент показал, что специфические сайты расщепления в хроматине 5'-области гена значительно- отличаются от таковых в свободной ДНК на протяженном участке длиной 9 т.п.н. от .-4300 до +4700: из 53 сайтов, различимых в двух картинах гидролиза хроматина (для фрагментов Xbal и Hindi II),

только один (N40) совпадает с соответствующим сайтом в свободной ДНК.

Данные о расположении чувствительных к микрококковой нуклеаэе сайтов в области Ог¡-Ье1а получены гибридизацией пробы 11 с ХЬа1 фрагментом длиной 4.6 т.п.н.; в области Ог¡^атша -гибридизацией пробы 14(-700) с Н!п<1 III фрагментом длиной-4.8 т.п.н. (см. Рис.2). Результаты показаны на Рис.6.

DNA Chrom

.В

DNA Chrom

Xbal

Hind Ж

ХЬ*1 ,

® | 1

О з т Hind Ж

" 17

13 9 13 9

т 1 — 1

Jp 1 О

ом

м

Xbal

к й

tt»

JL

Hind Ж ->3*.

@кь ©

®

Рис.6. Картирование чувствительных к микрококковой нуклеазе сайтов в хроматине участков ОН-Ъега и ОН-ватта. А, В — те же мембраны, показанные на Рис.5, гибридизовали с пробами- 11 и 14(700), соответственно. С и Б - карты, показывающие расположение чувствительных к микрококковой нуклеазе сайтов на, рестриктных фрагментах ХЬа1 (4.6 кЬ) и п<3III (4.8 кЬ), соответственно. Обозначения как на Рис.5.

Также как в. 5'-области гена ^ГФР, в обоих участках начала репликации содержится ряд сайтов, в которых, доступность микрококковой нуклеазы к хроматину изменена по сравнению со свободной ДНК. Однако, количество таких измененных сайтов в этих областях значительно меньше, чем в 5'-области гена. Более того, ни в Ori-beta, ни в Ori-gamaa мы не обнаружили гиперчувствительных сайтов (Рис.6). Это также отличает эти участки от областей начала репликации у дрожжей и некоторых эукариотических вирусов, обладающих повышенной

чувствительностью к действию нуклеаз (Gefard et al., 1985; Jongstra et al., 1984; Thoma et al., 1984).

Интересно отметить, что в хроматине области Ori-beta в районе OBR (Origin of Bidirectional Replication) (Burhans et al., 1990) нами были картированы два сайта NN14 и 17, специфичные для хроматина и отсутствующие в свободной ДНК •(Рис.6, А и С). Между ними находится участок длиной 300 п.н., защищенный от действия микрококковой нуклеазы (исчезнувший сайт N15). Возможно, такой характер гидролиза хроматина этого участка связан с тем, что в его центре находится позиционированная нуклеосома, к которой с обеих сторон прилегают участки ДНК, взаимодействующие с белками, .. участвующими, .в .регуляции, репликации. Подобная модель организации хроматина предложена для промотора гена hsp 26 D.melanogaster: HSF и GAGA факторы, связывающиеся с ДНК на расстоянии 200 п.н. друг от друга, оказываются в непосредственной близости между собой и транскрипционным комплексом, благодаря тому, что разделяющая их ДНК "накручена" на октамер гистонов (Thomas and Elgin, 1988; Lu et al., 1993).

Для хроматина области Ori-gamma, необходимо отметить, что большая часть сайтов с измененной чувствительностью к микрококковой нуклеазе располагается в участке от 0.7 до 1.7 т.п.н. от З'-конца Н i rid 111 фрагмента (сайты 8-21, Рис.6, В и D). Этот район соответствует пробе 14(1000) (Рис.2) и обнаруживает резкое снижение сшивающихся с ДНК- гистонов.

Структура хроматина ДГФР-домена.

Исползование клеточных линий с эмплифицированными

участками генома наряду с преимуществами (повышение чувствительности методов, включающих гибридизационный анализ) имеет один существенный недостаток: разные копии в одной и той же клетке могут находиться в различном ^ функциональном состоянии и, возможно, обладать различной структурой хроматина. Однако, исследования структуры хроматина ДГФР гена в клетках HeLa, содержащих 2 копии гена на диплоидное ядро, и в линии клеток, устойчивых к метотрексату и содержащих 80 копий гена, показали, что расположение,метилированных участков и гиперчувствительных сайтов в обоих случаях практически идентично (Shimada and Nienhuis, 1985). Более того, для промоторной области гена ДГФР человека было показано, что формирование характерной структуры хроматина ь первую очередь зависит от нуклеотидной последовательности ДНК (Shimada et al., .1987). Расположение гиперчувствительных к ДНКазе! сайтов в 5'-прилегающей области гена ДГФР в двух линиях СНО клеткок, содержащих 300 и 1000 копий ДГФР-гена, также оказалось практически идентичным (Mitchell et al., 1986; Azizkhan et al., 1986). Учитывая эти данные, можно считать, что структура хроматина одинакова для всех копий домена ДГОР.в клетках СНОС 400. -

.Модели организации хроматина в 5'-области гена ДГФР и в

участках инициации- репликации ДНК • -Ori-beta и- Ori-gamma, -

■ s.

суммирующие данные трех экспериментов, представлены на Рис.7.

Регулярная нуклеосомная организация нарушена в 5'-области гена ДГФР, что, в первую очередь, связано с присутствием в этой области ряда гиперчувствительных сайтов (Рис.7, А). Показано, что" гиперчувствительные области, как правило, занимают от 200 до 400 п.н. ДНК (1-2 нуклеосомы) и свободны от нуклеосом (Gross and Garrard, 1988). Практически полное отсутствие сшивающихся с ДНК гистонов в области, соответствующей пробе 103САТ и включающей точку основного старта транскрипции гена, связано с наличием здесь проксимальной гиперчувствительной зоны. Снижение количества сшивающихся с ДНК гистонов в участке, соответствующем пробе 1.3R1, отчасти связано с наличием свободных от нуклеосом гиперчувствительных зон, а также, по-видимому, с тем, что существующие здесь нуклеосомы, подобно опнсаным ранее для 5'-областей некоторых конститутивных генов, содержат

модифицированные формы гистонов и белки HMG (Tazi and Bird, 1990; Barsoum and Varshavsky, 1985), что может оказывать влияние на характер ДНК-гистоновых взаимодействий.

3'-область гена ДГФР, включающая 5-ый интрон и 6-ой экзон, обладает регулярной нуклеосомной структурой, что характерно для транскрибируемых областей умеренно экспрессируемых генов (Barsoum and Varshavsky, 198э; Mitchell et al., 1986; Shinada et al., 1987). Обнаружено относительно высокое количество сшивающихся с ДНК гистонов в этом участке (Таблица 1).

А

сюр * ^^'¿fefpSpob-----^

Xbal

OBR

4£кЬ

HindlH

\0fat

Askb 3

iW1«

Рис.7. Модель организации хроматина в регуляторных областях домена ДГФР. А - 5'-область гена ДГОР в пределах от -1000'п.н. до +1000 п.н. В - Ori-beta, Xbal фрагмент (4.6 kb). С - Ori-gamma, Hindi II фрагмент (4.8 kb). Обозначения сайтов гидролиза ДНК хроматина микрококковой нуклеазой как на Рис.5. Окружности большего диаметра обозначают нуклеосомы. Заштрихованные окружности - нуклеосомы, о которых нельзя сказать позиционированы они или -нет. Белые окружности, показанные сплошной линией - позиционированные нуклеосомы. Окружности, показанные пунктирной линией - позиционированные нуклеосомы с ослабленными ДНК-гистоновыми контактами. Заштрихованные овалы - негистоновые белки и/или их комплексы.

По характеру ДНК-гистоновых взаимодействий участок Огi-beta сходен с 3*-областыо гена и обладает регулярной нуклеосомной организацией. Мы картировали положение нескольких позиционированных нуклеосом и негистоновых белков (Рис.7, В). В районе OBR (Burhans et al., 1990) мы идентифицировали позиционированную нуклеосому, к которой с обеих сторон прилегают участки, взаимодействующие с негистоновыми белками (Рис.7, В). В экспериментах ¡a yitro показано, что в районе OBR содержится последовательность ДНК, . связывающая регуляторный фактор RIP60, участвующий в репликации клеточной ДНК (Held and Heintz, 1992). Определение первичной последовательности нуклеотидов и структкрные исследования ДНК области Orí-beta показали наличие ДНК-разворачивающих элементов, участков постоянного изгиба ДНК и ряд сайтов связывания транскрипционных факторов, таких как octl и API (Caddie et al., 1990a; Dai ley et al., 1990; Caddie et al., 1990b).

Другая область инициации репликации - Or i-gamma - так же, как Ori-beta, обладает регулярной нуклеосомной организацией (Рис.7, С). Однако, ДНК-гистоновые взаимодействия в' ней значительно ослаблены по сравнению с другими (за исключением S'-области гена) исследованными участками домена. Левая часть области Ori-gamma содержит нуклеосомы, гистоны которых утратили большую часть гистидиновых контактов с ДНК. Этим нуклеосомы участка Or i-gamma сходны с нуклеосомами, входящими в состав 5'-области гена ДГФР. Мы" считаем, что это особый тип нуклеосом, которые являются составной частью регуляторного механизма транскрипции или репликации. Как для промоторов генов, так и ARS дрожжей и Orí некоторых вирусов, описаны нуклеосомы, позиционированные' относительно определенной последовательности ДНК и репрессирующие транскрипцию или репликацию ДНК, экранируя cis-последовательности от - их связывания с traiis-факторами (см. обзор Simpsoa, 1991). Ослабление ДНК-гистоновых взаимодействий в таких нуклеосомах могло бы облегчить доступ активирующих факторов к сайту связывания на ДНК.

В отличие от 5'-области гена, ни в одном участке начала репликации ДНК нами не было обнаружено гиперчувствительных к действию микрококковой нуклеазы районов.

Область MAR и прилегающие к ней области обладают выраженной нуклеосомной структурой. Количество 'сшивающихся с ДНК гистонов в области MAR оказалось одним из самых высоких из исследованных областей домена. Лэмли с сотр. (Izaurralde et al., 1989) показали, что гистон HI предпочтительно связывается с ДНК ■ области-■ MAR, вероятно, благодаря структурным и/или конформационным особенностям входящих в нее

последовательностей олиго(dA)=олиго(dT). Высокое содержание гистона HI характерно для областей хроматина с высокой компактизацией (Zlatanova, 1990). Вероятно, этим и объясняется высокий уровень сшивки гистонов кора и гистона HI в этой области по сравнению другими областями домена ДГФР (Табллица 1).

По предположению Грунштейна (Grunstein, 1990), к MAR могут прилегать специфические последовательности типа LCR (Locus Control Region), которые, вероятно, взаимодействуя с определенными регуляторными факторами, опосредованно влияют на ферменты модификации гистонов, что, в свою очередь, инициирует декомпактизацию' хроматина. Мы предполагаем, что резкое снижение количества сшитых с ДНК гистонов в участках, соответствующих пробам 47 и б, по сравнению с областью MAR, возможно, связано-с наличием таких регуляторных областей.

В целом, мы обнаружили высокую степень гетерогенности структуры хроматина исследованных участков домена ДГФР.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Стуктурная организация хроматина области инициации репликаций в клетках СНОС 400 значительно отличается от структуры хроматина регуляторной области гена ДГФР.

2. Регулярная нухлеосомная организация нарушена в 5'-области гена ДГФР, что, по-видимому, определяется наличием здесь гиперчувствительных участков. Входящие в состав 5'-области гена нуклеосомы позиционированы относительно нуклеотидной последовательности ДНК и характеризуются чрезко ослабленными ДНК-гмстоновыми взаимодействиями по сравнению с 3'-транскрибируемой областью гена, обладающей регулярной нуклеосомной структурой.

3. Область инициации репликации Ori-beta по характеру ДНК-гистоковых взаимодействий сходна с 3'-областью гена ДГФР, содержит регулярно расположенные нуклеосомы, часть которых позиционирована, и взаимодействующие с ДНК негистоновые белки. В отличие от ¿'-области гена, здесь отсутствуют гиперчувствительные сайты.

4. Область Ori-gamoa также, как Ori-beta, обладает регулярной нуклеосомной организацией и не содержит гкперчувствительных участков, однако, резко ослабленные ДНК-гистоновые взаимодействия . в левой части области делают похожей ее на 5'-область гена.

5. Для регуляторных- областей гена ДГФР и Ori-gamma показано присутствие необычных нуклеосом, позиционированных относительно нуклеотидной последовательности ДНК и утративших большую часть контактов с ДНК через остатки гистидина.

6. Относительно большие количества сшивающихся с 'ДНК гистонов кора и гистона Н1 в области MAR, возможно, свидетельствуют о высоком уровне компактизации хроматина этого участка. Значительно ослабленные ДНК-гистоновые взаимодействия в областях, с обех сторон прилегающих к MAR, могут быть связаны с локализацией в них регуляторных элементов типа LCR.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Bavykin S.G., Pemov A.Yu., Hamlin J.L. (1992). Chromatin structure of replication origin, gene promoter and matrix attachment region in the amplified dihydrofolate reductase domain, f. Cell. Biochem., suppl. v. 16B. p.57. Theses of Keystone Simposia on Molecular and Cellular Biology (1992).

2. Pemov A.Yu., Bavykin S.G., Hamlin J.L. (1995). Proximal and long-range alterations in chromatin structure surrounding the Chinese hamster dihydrofolate reductase promoter. Biochemistry v. 34. p. 2381-2392.

3. Пемов А.Ю., Хэмлин Дж., Бавыкин С.Г. (1995). Гетерогенность структурной организации хроматина домена, включающего геи дигидрофолатредуктазы, в культуре .клеток яичников китайского

хомячка (СНОС 400). Молекулярная биология, т.29. стр.

л '