Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых способов получения ДНК-сорбентов для аффинной хроматографии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых способов получения ДНК-сорбентов для аффинной хроматографии"

Пб

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТШШОШИЖЙЙ ИНСТИТУТ (ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ.

РАЗРАБОТКА НОВЫХ СПОСОБОВ ПОЛУЧВШ ИНК-СОРБЕНТОВ ДЛЯ АФФИННСЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология ,

АВТОРЕФЕРАТ ,

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

САНКТ-ПЕТ] 1994

Работа выполнена в лаборатории химии к технологии полимеров Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепарата. :

Научный руководитель: АЛЕНИН

кандидат химических наук - ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ

Научный консультант: доктор химических наук, ГИНАК

профессор Анатолий Иосифович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук ДМИТРИЕНЮ

профессор Леонид Васильевич

кандидат химических наук •,— КУЛИКОВ

Сергей Владимирович

Ведущая организация: Институт, цитологии РАН(СгШ)

Защита состоится МД Л 1994 г в ¿Отаоь ъ6{ аудитории на заседании специализированного совета Д 063.25.09. э Санкт-Петербургском технологическом институте по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр.,26, Санкт-Петербургский технологический институт.

С диссертацией можиз ознакомиться в библиотеке института. Замечания и отзывы на автореферат, заверенные гербовой печатью, проси« высылать по адресу института.

Автореферат разослан Ученый секретарь специализированного

совета, к.т.н. Лискцкая Т.Б.

; ' -3-

Актуальность проблемы. Многие задачи,стоящие перед современной молекулярной биологией и генетической инженерией могут быть решены только с помощью аффинных ДНК-сорбентов, нагруженных лигандом со строго определенной после' доаательностьи нуклеиновых оснований. В ряде случаев требуются аффинные сорбенты, содержащие в качестве лиганда не однонитевой, а нативный двунитевой конкретный фрагмент ДНК.

Существующие методы получения ДНК-сорбентов с одно-и двунитевыми ДНК-лигандами не лишены недостатков (larsoa C.J.,Yerdine G.l. ,1992) и включают по крайней мере три относительно независимые стадии: получение лигавда, его выделение, очистка и иммобилизация на матрице (Kadonaga. •J.T.,Tjian R.,1986; Rosenfeld P,J., Kelly I.J7V1986 ; Blanks R., Mclaughlin b.w., 1988). Разработаны методы автоматического синтеза ДНК-лиганда на матрице с последующим избирательным деблокированием синтезированного олигонук-деотида без его отщепления ( Pochet S. et al. ,I987;Yoski-hiro H. з-t ai. ,1990). Однако, эта методы предусматривают • •• выполнение дополнительных процедур, таких как предварительный синтез спейсера, иммобилизация первого нуклеозида и : двух-, трехстадийные обработки матриц сложными химическими реагентами при деблокировании ДНК-лиганда. Вследствие многостадийности существующие методы получения ДНК-сорбентов не могут быть полностью автоматизированы. В связи с этим актуальной является разработка полностью автоматизированных способов получения аффинных сорбентов, содержащих в качестве лигавда одно- и двунитевые фрагменты ДНК задан-■ ной последовательности и пригодных для аффинной хроматографии и изучения индивидуальных ДНК, РНК и сайт-специфических ДНК-связывающих белков.

Цель работы заключалась в разработке метода, позволяющего получать сорбенты с одно- и двунитевым ДНК-лигандом заданной последовательности непосредстввнно на ДНК-синтезаторе в автоматическом режиме, и изучении возможности ис-

—пользования таких сорбентов для-очистки-ДНК,—РНК и сайт-----

специфических ДНК-связывающих белков.

Для достижения этой цели необходимо было решить следом ицие задачи:

1. получить матрицы, пригодные одновременно как для тве» рдофаэного синтеза лиганда, так и в качестве носителя в аффинном сорбенте ;

2. модифицировать программу, по которой осуществляется процедура фосфит-аыидного автоматического синтеза с целью обеспечения как предварительного синтеза спейсерной группировки любой требуемой длины, так и последующего синтеза ДНК-лиганда любой заданной последовательности;

3. обеспечить ковалентную связь лиганда с матрицей, стабильную в условиях деблокирования олигонуклеотида.

Научная новизна.Ь работе впервые продемонстрирована возможность получения ДНК-сорбентов с одно- и двунитёвш иммобилизованным фрагментом ДНК непрерывным синтезом спей-сера и олигонуклеотида в рамках фосфоамидитной процедуры с помощью автоматического ДНК-синтезатора, минуя стадии ввделения, очистки и иммобилизации лиганда.

1-0-Димвтокситритил-триэтиленгликоль-9-0-(^-цианоэтил-N,Н-диизопропиламино)фос$оаыидит впервые применен в качестве мономера в фосфит-амидном синтезе с целью получения иммобилизованной спейсерной группировки.

В качестве матриц для синтеза аффинных ДНК-сорбентов впервые использовались специально полученная для этого сферическая гранульная целлюлоза повышенной прочности и нейтральный гель "Биохром".

Разработан новый способ получения f-цианоэтанола - реагента, необходимого для получения фэсфоамидитных производных, используемых в качестве мономеров в синтезе спей-сера и олигонуклеотидного лиганда.

Внесены изменения в конструкции ДНК-синтезатора "беле Assembler (Pharmacia }, позволяющие экономить моторесурс распределительного клапана и сокращать расход дорогостоящих реагентов, используемых в качестве мономеров.

Практическая значимость работы. Предложенный и разработанная г и&стоядай-работе метод технологически-проще-и----

требует меньших затрат в сравнения с синтезом олигонукяео-

"................; -5-

тидов, однако позволяет в автоматическом режиме и с высоким выходом получить готовые сорбенты, имеющие в качестве ; лиганда одно- и двунитевые фрагменты ДНК заданной последовательности. Достигаемая плотность лиганда на матрице - существенно большая, чем при иммобилизации синтезированного или выделенного лиганда, что позволяет более эффективно осуществлять аффинную хроматографию биополимеров. В качестве матриц используются носители, технология получения которых разработана в Гос.НИИ особо чистых биопрепаратов. Полученные аффинные сорбенты успешно использованы для выделения сайт-специфических ДНК-связывающих белков и обогащения специфическими последовательностями тотальных препаратов ДНК.

Апробация работы. Результаты' работы докладывались на П-ой Всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохозяйственны^ животных (Ленинград,1968), на научно-технической конференции'"Полимериэационные иикросферические материалы для биотехнологии"(Ленинград,1989), на семинаре, организованном фирмой £Ьагпас1а-1ХЗ "Текущие методы синтеза и очистки пептидов и олигонунлеотидов"(Ленинград, 1989 ), на 1У-ОЙ Европейсхой конференции-выставке "По материалам ' и технологиям восток-запад" (Санкт-Петербург, 1993 ).

Публикации. По теме диссертации получено три авторских свидетельства на изобретение и опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на $6 страницах машинописного текста, и состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов исследования , результатов и обсуждения собственных исследований, выводов и списка литературы, содержащего {79 названий. Работа иллюстрирована {6 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЩОВАНИЯ

Получение носителей для твердофазного синтеза ДНК-сорбентов. Сферическую гранулированную целлюлозу получали по методике (К^а Б .,1980). Целлюлозные гранулы подвер-Тал;Г уплотнений ~по разработанной нами методике уг "поперечной сшивке'1 обработкой эпихлоргидрином в водной щелочи .

(Porat J. et al .,1971). Нейтральный гель "Биохром" получали по разработанной нами методике (Гаврюченкова Л.П. и др., 1988). Химическую модификацию носителей проводили ; обработкой диметокситритилхлоридом в безводном пиридине (Schaller Н. et al, 1963). Ацилирование оставшихся свободных гидроксильных групп осуществляли обработкой уксусным, ангидридом в абсолютном пиридине. Модифицированные таким образом носители исрользовали для получения ДНК-сорбентов.

Синтез олигонуклеотидов и ДНК-сорбентов осуществляли на автоматическом синтезаторе ДНК "Gene Assembler " (Pharmacia ). В качестве исходных веществ использовали коммерческие тетразол и 5-0-лМТг, 3-0-{р-цианоэтил-Н,Ы-диизопро-пиламино) фосфоамцдитные производные дезокситимидина, )г-бензоил-дезоксицитидина, N -бенэоил-дезоксиаденозша и N -изобутирил-дезоксигуаноэина (Pharmacia ).

Однонитевые олигонуклеотиды, необходимые для тестирования ДНК-связываюш'их белков методом ретардации, получали с помощью ДНК-синтезатора, а их очистку осуществляли на колонках с сефадексом <3-25 (NAP-25,Pharmacia ) и на колонке с анионообменником { Mono Q , Pharmacia ) по стандартным методикам.

Синтез ДНК-ссрбентов, содержащих 39-56-членные олигонуклеотиды, осуществляли, помещая матрицу в реакционную колонку стандартного реактора, предназначенного для синтеза олигонуклеотидов з масштабе 0.2-1.3 мкмоля. Эффективность синтеза на кавдой стадии контролировали спектрофо-. тометрически по количеству ЛМТг-катиона, удаленного с концевого нуклеозидного остатка.

Деблокирование ДНК-сорбентов и олигонуклеотидов проводили в стандартных условиях (конц.всьл.аммиак, 50*С,16ч) Реактор с колонкой, содержащей 90 мкл готового ДНК-сорбен-талиспользовали в качестве хроматографической колонки .

Модификация конструкции и схемы работы распределительного клапана в синтезаторе. При проведении реанции конденсации смесь тетразола (А) и соответствующего фосфоами-

дитнсго" произзодного~за1цищбнного-нуклеоэида (В)" подана----

лась в рваятрр по cxeMe:A+(BvA)g вместо схемы: А+В+А;

предлагаемой фирмой. Также произведено перераспредгление положения растворов фосфоамидитов заниженных нуклеозидов (A,C,G,T) к тетразола (Тетр.) по каналам распределительного клапана №1 : вместо предлагаемого фирмой распределения A-C-G-Т-Татр., использовалось следующее распределение-А-Т«тр.-G-Т-Тетр.-С„ Предложенные новшества позволили без ущерба для эффективности синтеза : сократить з 4 раза расход дорогостоящих реагентов - б-О-ЙМГг-Ы-задищенных-З-О--(р-цианоэтил-М,Н-диизопропиламино)фосфоамидитоа и тетразола; сделать минимальным шаг клапана пои переключении с одного канала на другой, что экономит его моторесурс; исключить контакт с другими каналами во время переключения, что гарантирует попадание в реакционную смесь только требующегося на данной стадии фосфоамидита.

Аффинная хроматография на ДНК-сорбентах. Связывание полиШ-РНК (sigma ) с олиго(4Т) ^-сорбентом проводили в 5 M трис-HCI буфере '(рН 7.5), содержащем 0.5 M KCI. Элю-цию сорбированной на ДНК-матрице поли(А)~РНК и спектрофо-тометрическое определение ее концентрации осуществляли по описанным методикам ( Маниатис Т. и др.,1984). ДНК .тимуса теленка фрагментировали ультразвуком (35 кНг, 10-30 мин), нагревали до 100°С и быстро охлаждали. Полученный раствор ДНК пропускали через колонки с ДНК-сарбентами 5 течение 24 ч при 42 С в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 6.8), содержащем 0.25 M NaCI и 10 mî<I Э&ТА. Элюат с колонки анализировали методом д"т~гибридизации, используя ^Р-мече-ные олигонуклеотиды, идентичные лигандам соответствующих ДНК-сорбентов. В качестве неспецифич^ского конкурента использовали ДНК спермы лосося. \

В качестве источника ДНК-свяэьшающихчбелков использовали частично очищенный белковый экстракт из штамма-продуцента ДНК-связывагацего белка GCN4 дрожяей Sacc'naromyces eerevisiae , полученный в лаборатории биохимической генетики СПбГУ. Грубый ядерный экстракт, ссдерявдий ДНК-свя-зывагацие белки человека, получали из культуры клеток HeLa по методике" CSchreibêr M.et al г, 1989)~.~Кояцентрацига белька определяли методом Брэдфорда (Bradferd ,1983). - .

ДНК-связывавдие белки в буферном растворе (pH 7.9), со держащем 10 мМ HEPES , 15% глицерин, 8 ыМ MjCIg , I Мм ЭДГА и I Ш дитиотреитол, пропускали через колонки с соогу ветствувщими ДНК-сорбентами в течение 30-45 минут при комнатной темп, со скоростью 15 мл/ч. 3 качестве неспецифического конкурента использовали ДНК тимуса теленка. Колонки промывали тем же буферным раствором, но без ДНК и содержащем 0.1 М KCl. Связавшиеся белки элюировали,уаеличи- ' вал концентрацию KCl до 0.8 М. Элюаты анализировали методом ретардации при комн.темп., используя ^Р-меченые дву-нитевые олигонуклеотиды, идентичные лигандам соответствующих ДНК-сорбентов. В качестве неспецифического конкурента испоАьзовали поли (А)-поли(У)-сополимер. Образовавшиеся ДНК-белковые комплексы радделяли~электрофорезом в 41Р" ном полиакриламидном геле и выявляли методом радиоавтограф фии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕШЕ I.Принцип синтеза аффинных сорбентов; Фосфит-ашдная ' процедура ( Baaucage S.L.,Caxuihers H.H.,1981; Sinha S.D., et al. 1985}фосфит-триэфирного метода синтеза (betainger •R.l.,et al.,I9?5) олигодезоксирибонуклеотадов, применяемая в работе синтезаторов ДНК, была использована для получения ДНК-оорбентов.Нами предложен способ синтеза, который предусматривает образование связи между ДНК и матрицей, стабильной в условиях деблокирования синтезированного лигавда. Согласно атому способу связь между первым нук-леотидным остатком и гидрофильной матрицей осуществляется ' посредством фосфит-амидной конденсации соответствующего фосфоамидита с гидроксильными группами самой матрицы (I) (Рис.1). Эта связь образуется как фосфчт-триэфнрная, после окисления она превращается в фзсфотриэфирную Ш) и остается таковой во время синтеза всего ДНК-лиганда. При деблокировании после окончания синтеза, в уоловиях амыоноли-. эа;эта связь превращается в стабильную в этих условиях фосфодиэфирную связь ЦУ). Таким образов, при синтезе ДНК -сорбента" ног разработанной тйотодикб йредварталБнад ~иммо-" бидиаация л ер ею го (с.3-конца) нуклеозидкого остатка не

1 ' 1ЛКГгС</Ру

I ь*

ДЯК-Синтеэатор

I

НО

••■•С. -О-Р-О,

нн4си

V У АсО-

(сн2)2 (сн2)г .

сн ' сн

о

>

%0 -С-

IV

Рис.1. Схема синтеза ДНК-сорбентов.

(I)- псперечно-сшятая гранульная пеллюлоза или нейтральный гель Биохром"; (П)~ модифицированные матриш, которые использовались непосредственно для синтеза ДНЙ-лзга-нда ; (Ш)--ДНК-сорбенты с блокированным ДНК-лисандом ] (1У)--ДНК-оорбенты, готовые к использованию в а^иннои хроматографии ; В* , Во ,...Вл - Л-зашкгоенные гетероциклические основания нуклеотидов; В», 32,...В*- деблок;фо-■ ■ ванные гетероциклические основания нуклеотндов. „ |

требуется.

Нами был найден способ ограничения количества реак-; ционноспособных центров гидрофильней матрицы, который ; состоял в предварительной этерификаяии заранее заданного! числа' гищроксалышх функций о помощью димето'коитригяль- 1 ных групп(Рис.1.) с последующим апетшгарованием всех ос-' тальных. Для автоматического синтеза ДНК-сорбента на мо-1 дафиггарованной таким образом матрице не требуется проведения каких-либо дополнительных процедур, т.к. каждый . реакционный цикл, согласно стандартной программе, начяна-; ется с удаления диметокситритильных защитных групп.После окончания синтеза ДНК-сорбента в условиях аммонолиэа происходит деблокирование не только ДКК-лиганда, но и ьгатри-цы.

2. Получение матриц. Матрица, которую мокно исполь-: зовать одновременно в качестве саппорта в твердофазном

син-

тезе олигодэзэксирибонуклеотздов и носителя в аффинном со»" рбенге, должна отвечать двум основным требованиям:

1.Размер пор матрицы должен быть достаточным, чтобы обеспечивать разномерную доступность реагентов к реакционно-епособкш центрам во время сянтеаа ДНК-лиганда и возможность комплементарных взаимодействий при использовании ДНК-сорбента в аффинной хроматографии ;

2.В твердофазном фосфит-амидном синтезе может использоваться только такая матрица, которая имеет высокие гидродинамические характеристики. !

Для получения матриц-носителей были использованы два различных гидрофильных сорбента - сферическая гранульная целлюлоза повышенной_прочности и синтетический полимерный нейтральный гель "Биохром". Сферическая гранульная целлюлоза, полученная по методике (Кида 5.,1980), вследствие ее низких гидродинамических свойств^ не могла быть непосредственно использована а качестве матрицы. Нами разработан метод уплотнения сферических гранул целлюлозы, каторг после поперечной сшивки обработкой эпих.юргидрином_, позволил получить носитель, пригодный для олигонуклеотид- . ного синтеза по гидродинамическим и поровым характеристикам. Проницаемость матрицы составила: до 2'107 Д по белкам и до 5*10® Д по декотранам.

Наряду с целлюлозной матрицей мы использовали полимерный гидрофильный носитель "Биохром", который получают методой суспензионной сополимеризации глицидилметакрилата . я пентаэритритолдиметакрилата,о последующей обработкой активированными многоатомными спиртами. Технология получения отого носителя разработана в лаборатории химии и технологии полямеров Гоо.НИИ особо чистых биопрепаратов . и внедрена в производство на опытном участке Гос.ШИОЧБ и в НПО "Ярскитвз".(г.Ярославль). Гель "Биохром", как носитель, превооходит гранулированную целлюлозу повышенной прочности по целому ряду показателей, таких,как механическая прочность, химическая и термическая стабильность, по-стоянстмНоЗъвма'прк смене растворттелей ¿Густо-ЛчивосТь' н воздействию,микроорганизмов. Этот носитель также харак-

, -п_ - -

теризуется низким уровнем неспецифической сорбции белков, . достаточной пористостью (0.5) и проницаемостью (до 10^ Д по белкам и до 10^ по декстранам}.

3. Новый способ получения ^-цианоотанола - реагента, широко применяемого для получения производных мононуклео-тидов, используемых в олигонуклеотидном синтезе^ начиная с работ Х.Г.Кораны ЙсЛаПег Н. et а1.19бЗ ) до наших дней. Этйленциаягидрин (У1) синтезировали из акрилонитрила (У1) • по следующей схеме :

НрО а,с«сн-см

Н2С=СН-СН СН2-СН2-С?{ * » 0(СН2-СН2-СН)2

У л УП

•Как известно, при реакции акрилонитрила (У) с водой в~~ присутствии щелочи сначала образуется 2-цианоэтанол (У1), который в щелочной среде существует в виде 2-цианоэ?илат-аниона. Последний способен конкурировать с гидроксил-ионом в реакции нуклеофильного присоединения к другой молекуле акрилонитрила, давая, таким образом, 2,2-бас-цианэтиловый эфир (УП). Очевидно, для получения 2-цйеноэтанола (VI), необходимо остановить*реакцию акрилонитрила с водой на первой стадии. Нами найдено, что образование эфира (УП) практически подавлено уже при 1.8-молярном избытке щелочи по отношению' к исходному количеству акрилонитрила. Использование больших избытков КаДН приводит к увеличению скорости реакции гидролиза цианогруппы в молекулах акрилонитрила и гидракрилонитрила. По разработанному методу 2-цианоэтанол получали"с выходом 92$ .

4. Синтез спейсерньос последовательностей. На первом этапе работы^при использований в качестве матрицы-носителя модифицироэанннх целлюлозных гранул, перед синтезом значащей нуклеэтедной последовательности мы синтезировали олиго(ЛТ)- или олигоЫО-спейсеры, состоящие из 8-10 нук-леотидных остатков. В дальнейшем, при использовании в качестве матрицы-носителя модифицированного геля "Биохром",

" нами быЛ5~прЗДяожшггдля~йи:чтеэ£ спейсера/зкбста дорогаато-. лщих фосфоамвдитов защищенных нуклеоэидов, использовать

аналогичное соединение, но вместо защищенного нуклеозид-ного остатка, содержащее остаток триэтиленгликоля, а именно 1-0-^МГг-триэтиленгликоль-9-0-{ р-цианоэтил-Н,Л-диизо-пропилашно)фзсфоаыидит (ХУ),структура которого представлена на рис.2. Химические свойства этого соединения позволяют оставаться в рамках фосфоамидитной процедуры в процессе последовательного синтеза спейсера и олигонуклеоти-да, что не исключает автоматизации всего процесса синтеза Соединение (ХУ) получено по описанным методикам по схеме, представленной на рис.2.

РС1д +■ « —» РС^О-СН-з-СР^-СН (У») . (IX) .Рг4

IX + лРг-МН-г-Рг —♦ Ш-СН2-СН2-0-^ - " ____;

ЬРг-Н

(X) (XI) . сРг

¿МГгСХ + Н0-4-СН2-СН2-0-^з Н —^МТг0-4-СН2-СН2-0-43Н (ХП) (ХШ) (Щ)

XI + Х1У —^ ДМТг-0-4-СН£-СН2-0-).з -Р-0-СН2-СН2-СМ

.• (ХУ) ^ - 1Рг^Мч\Рг: .

Рис.2. Схема получения соединения (ХУ), используемого в качестве мономера в фосфит-амидном синтезе спейсера.

Ранеефо.<;фоа\шдит(ХУ) Использовался для сшивки различных олигонукдеотидов, отщепляемых ст матрицы после их твердофазного фосфит-выедного. синтеза. Синтез иммобилизованной; снейсерной группировки с использованием в качестве мономера-соединения (ХУ) позволяет: удешевить процеду ру полунения аффинного сорбента; получать спейсер любой -требуемой длины; вести последовательный синтез спейсера и олигонуклеотеда как • единый процесс, поддающийся автоматизации; получать спейсер, у которого остатки триэтиленгликоля соединены о матрицей,друг с другом и с ДНК-лиган-дом посредством фосфодиэфирной связи - по природе идентичной межнуклеотидной связи.

.. - 5, - Синтез-аффинных_ДНК-.оорбентов , ,Синтез. ДШС-сорбентов (Ш),(ХУП) и (ХШ), содержащих однонитевые ДНК-лиганды

................-13- ;

t SGC )—(T)j3 -5' (Ш) •

t SGC >~(С)10 —rCTATTGACATGTAGGACrCTG, -5* (ХУП)

f-FSHI

I SSC I— (C)IQ -rSCCTACSAAACTGSACSGAT. -5* (ХУШ) • f-FSH2

_Aw _, T-A.

f SGC I —TmTTTTGAGGMCCGGAGGGTTl/ T

KyAAAAAAAAGTCCTTGgCCTGCgAAA4 A (XIX)

о - A-T

Alu-P-сайт

Coi_ QJ>

I Н-У 1 —(TEG) P —CACAGACITGAGTACgAA'/ чг гт,\ ° 5VGTGTG,TGAGTQATGGTTv ■ tAA)

API-сайт ' C-°

j н-У I—(TES)g —GCTGTACGGGGCCGTACA6G/C"(] V

a ^.GGACATGCCCGGGGATGTCG4 У (XXI) о J-—- C-C

р53-сайт

^ис.З, Структура синтезированных ДНК-сорбентов. SGC -сферическая гранульная целлюлоза.; H-Jf- нейтральный гель "Биохром" ; ' •

О .

TEG - -0-Р-0-(СН2)2-0-(СН2)2-0-(СН2)2-0- .

.. -о , ■ ■ . , • - ..

^-FSHI и ^-FSH2 - соответственно, олигонукдеотиды, комплементарные началу (кодирующая цепь) и концу (не-1 кодирукхдаяя цепь) структурной области гена|3 —FSH , кодирующего f -субъединицу фолликуяостимулируюдего' гормона коровы ; .• Al и. - фрагмент повторяющейся последовательности Afa.-семейства человека, содержащий А1аР-сайт, узнаваемый ДНК-связыващими белками ;

Со1 - фрагмент промоторной области.коляагеназного гена человека, содержащий API-сайт, узнаваемый ДНК-связыва-кщши белками API-семейства ;

_ р53-сайт_--- фрагмент.. ДНКг узнаваемый ДНК-связыващим______

белком р53.

• ................ ......~......" -14- ...... ; " ""...... ■

(Р'.с.З), проводили в автоматическом реяиме, используя в качестве матрицы модифицированную сферическую гранульную целлюлозу повышенной прочности. В случае синтеза сорбентов (ХУЛ) и (ХУШ) слейсером являлся цитидиловый деканук-леотид. Целлюлозная матрица также была использована для получения ДНК-сорбента (XIX) .содержащего двунитевой фрагмент, связанный с матрицей двунитевым олиготимидиловым-олигоацениловым декануклеотидом. В этом случае последовательность спейсера и ДНК-лкганда составлялась с таким рас-счетом, чтобы после деблокирования в соответствующих условиях лиганд "складывался" в ДНК-шпильку, образуя двунитевой участок заданной последовательности.

Олигодезокситимидиловый сорбент (ХУ1), синтезированный в начале работы, получен с выходом 72 %. Сорбенты (Ш),(ХУШ) и (XIX) получены с выходами 65 %, 66 % и 30 % соответственно. Плотность посадки ДНК-лигалда составляла 1.0 мкмоль/мл .

На основе модифицированного геля "Био^сром" синтезированы ДНК-сорбенты (XX)'и (XXI),. содержащие.двунитевые фра- ' гменты ДНК (в виде ДНК-шпильки)' с сайтами для связывания ДНК-связйваадих белков^ соответствекно^АРХ-. и ,р53-семейст- . ' ва. В этом случае использовали спейсер, состоящий из' чаре- : дуягаихся фосфодиэфирнзх групп ,и остатков три&тиленгликоля и "гибкий" однонитевой цитидиловый пентануклэотид, соединяющий комплементарные цепи ДНК. ДНК-сорбенты (XX) и (XXI) получены с выходом 51 % и .46 % соответственно. Плотность лиганда, иммобилизованного на матрице, составляла 1.0 - 1Д мкмоля/мл , что существенно выше плотности, достигаемой (2-3 нмоля/мл) при получении ДНК-сорбентов с друнитевш ДНК-'ЛИгандом по наиболее яироко используемой методике-( КаАопа^а^.2.,1Дап Р. .,1986).,

6. Использование синтезированных ДНН-сорбентоа для аф финной хроматографии биополимеров. Возможность использова-¡Ш(Голигс-(а[Т)^-сорбента (ХУ1) изучали по связыванию коммерческого препарата поли(А}-РНК. 3 высокосолевом буферном растворе пояи(А')-РНК специфически' связывается с со'рбентом

~ " "......-15-

(ХУ1) и мояет бьггь десорбирована низкосолевкм буфером. Сорбент (ХУ1) способен специфически связьгаать 160-230 о.е поли А-РНК на I г. сухого сорбента и пригоден для вьще-ления полкаденилированной РНК из препаратов тотальной зу-кариотической РНК.

ДНК-сорбенты (ХУЛ) и (ХЛ1) были использованы для обогащения коммерческого препарата ДНК тимуса теленка последовательностями, кодирующими ^-субъединицу фолликулостя-мулирующего гормона короны. Для этого ДНК тимуса теленка фрагментировали ультразвуком и фрагменты размером 1-3 т. п.о., после прогрева и быстрого охлаждения, хроматографи-ровали на колонках с сорбентами (ХУЛ) и (ХУШ), содержащими в качестве ДНК-лиганДа,соответственно,однонитевые оли' гонуклеотиды, комплементарные началу (кодирующая цепь) и концу (некодирующая цепь) структурной области гена p-PSH. Полученные при аффинной хроматографии фракции анализировали методом дот-гибридизации, используя Р-меченые олиго-нуклеотидные зонды, идентичные ДНК-лигандам сорбентов. По данным радиоавтографии фрагменты ДНК, не сорбировавшиеся на колонках, практически не содержат последовательностей, дающих гибридизацию с мечеными зондами. Фракции, де-сорбированные с колонок (содержащие по'50. o.e. ДНК), дают сильный сигнал при дот-гибридизации и содержат в 100 раз большее количество последовательностей, комплементарных ДНК-лиганду, чем исходный препарат.

Для аффинной хроматогафии ДНК-свяэывающих белков использовали ДНК-сорбенты (Х1Х-ХШ , содержащие специфические . сайты, узнаваемые ДНК-авязываящими белками различных семейств. (Рис.3 }. В качестве источника белков использовали экстракты из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и грубые ядерные экстракты, полученные из культуры клеток Не La и HL60 человека. ДНК-связывающив белки тестировали методом ретардации в 4 %-ном полиакриламидном геле по появлению полос задержки, соответствующих образованию специфических ДНК-белковых комплексов с ^Р-мечеными двуни-—тев&ми- олигонукяеотидаыи,- содержащий- &оответатвутиь~спв-цнфическиз сайты, узнаваемые этими белками. Сорбция ДЕК-

связывающих белков на ДНК-матрицах осуществляли в том же буферном растворе, в котором эти белки образуют с двуни-тевыда олигонуклеотидами специфические ДНК-белковые комплексы, выявляемые методом ретардации. Белки элюировали с сорбентов, увеличивая концентрацию HaCI от 0.1 до 0.8Ы. При аффинной хроматографии грубых ядерных экстрактов из клеток HeLo. на ДНК-сорбентах (XIX-XXI) белки, связывающиеся со специфической ДНК-последовательностью, практически полностью элюируются буферным раствором, содержащим 0.3 - 0.75 М NaCI и отсутствуют во фракциях, не сорбировавшихся на колонках. При хроматографии грубого ядерного экстракта из клеток HL60, в которых ДНК-связыващий белок р53 практически не синтезируется, "полосы задержки", характерные для этого белка, не выявляются как в исходном-препарате, так и в элтте с колонки.

Определение концентрации общего белка в исходных ядерных экстрактах и фракциях, содержащих (по данным ретардации) ДНК-связь'вавщие.белки, показало, что при аффинной хроматографии удается Очистить Ata-связывающие белки, белок р53 и белки API-оемейстза в 50-200 раз. В случае аффинной хроматографии.белкового экстракта из.дрожжевого атадаа-продуцента белка GCN4 Л относящегося к 'семейству , дрожжевых API-белков)^ удается.отделить этот белок от.других дрожжевых. API-белйов и получить', его в практически гомогенном состоянии. - На рисунке Ч предотавлены данные анализа фракций, полученных при аффинной хроматографии белковых экстрактов, содержащих белок 0СН4.

Рие.4. Анализ белковых фракций, полученных в результате аффинной хроматографии на сорбенте (XX ) дрозгасввого вкетракта,(выделенного из дрожжевого штамма-продуцента белка (ЗСН4} методом ретардации.

неидентифицмро-ганшв АР1--белки

«¡N4

свободный мечв' ный олигонук-леотвд -

I - исходный белковый экстракт до хроматографии ; 2-6 - элвция буферннм раствором, содеруыцчн ОЛ М ЯаСХ ; 7-10 - эдщия буферным раствором, содержащим 0.7 И НаС1 ; 11-12 - Элщия буферным раствбром, содвржащгм I Н НаС1 ; А - ДНК-белковый компдеко, образованный нвидентифициро- . эаннымя дрожжевыми АРХ-белками_; В - ДНК-белковый комплекс, образованный ботом $СХ4 ; С - свободный ^Р-мвченый оаигонуклеотйд.

ВЫВОДЫ

X, Предложена более рациональная схема подачи в реактор . едаси тетразола к соответствующего фосфоамидатного производного защищенного иуклоозида, а таюее схема размещения раагентов по каналам первого распределительного клапана автоматического синтезатора ДНК "<?еле Asssmiier", что позволяет сократить расход дорогостоящих реагентов и сберечь ыотореоуро указанного клапана.

2. Предложено проводить аа тоыатазированную сортировку отработанных растворителей и растворов реагентов (путем ко-шлектацаи синтезатора ДЕК дополнительным распределительным клапаном) о цадыз существенного облегчения их пооле-дуыазй ,регенерации.

2. Предложен н разработан нозый опооскЗ получения 2-циано-©танола « ванного реагента, используемого для Пйяучьнвя ионошроа s одигоиуклеогвдном синтезе. 4» Предложено ионольвование 1-0-йМТг-три8тиденгликоль-9-^(^чцишоэтш~Н,Н-дивзощ}опшшшно)$оо$оамидита для она-, тева ишобшшаовавного ошйоера в ДИК-сорбенте. 6, Предложен в разработав новый способ получения еффктшх да-сороентов о одно- и двуввтевнм ДНК-ашгандсм, о единой процедурой последовательного автоматического оивтеаа опей-сераой группировки и одигонуклеотида на юшичеоки модифицированных гидрофильных матрицах « оферичеоко* гранульное шдишаом повышенной прочности в нейтральном геле "Шохром? б. Показано, что синтезированные ДНК-сорбента позволяют быстро к аффективно осуществлять аффинную хроматография различных биополимеров,'

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШ ДКССЕРТАЩ1

1. А» С. II33263 СССР, ЩИ С 07 С 121/34, 120/00. Споооб получение ^-циановтаноле/В.В, Константинов, А.Ю. Мишарин (ССС?).- ЗБ6942Ц Заявл.28.03.83} Опубл.07.01.85, Бюя»* I.

2. А, с. 1676536 СССР, ЩИ С 07 H 21/04, С ОТ В 15/06. Способ получения псдцнухяаотад-сор^нта/В.Б.Константинов, Ю.П.Зсров, В.М.Божков (СССР).-* 4377220; Заявл.03.02.68j ОяуСИ. 07,07.90, Бм.й 26.-30.

3. Константинов B.B. .Шиарин A.C. Новый опоооб получения 2-цианоэтанола// Кури. орг.химии. - I987.-T. 23, выл.8.-С. 1203-1205.

4. Казаков В.И,.Константинов В.В.,Боаков В.М. Сннтэа оли-гонуклвотидов о иопсльаоваяиэи органических растворителей отечественного производства // Бая. Воеооювн.НИИ раавзда-ния и гонэтики оольокохоз.янвотн. - Л., 1988.-Вал. 102.-С. 12-17.

6. Синтез олигонукяеотддов о иопольвованязи отечествен®« растворителей / В.И.Казаков, В.В.Константинов, В.М.Божков // Тов.докл.П Воеооюзн.конф. по пдтогвнетккв сельокохоз. жнвотн. .икп, - 1988 г.- Ленинград, 1988. с. М.

6, А.О. 1398902 СССР, МКЙ В 01 3 20/26. Способ похргвтя . полимерных гидрофильных нооит&лей для хроматографам / Л.П.Гаврючэнкова, С.М.Морозов, А. Г. Болдырев, Л.Н.Цуканова, В.В.Константинов, С.Ф.Белал, В.А.Паовчвкк (СССР).- й 4169364$ Заявл. 29.12.86; Опубл. 30.05.88,, Бши ^ 20. - ?о.

7. Газрхгаонкова Л.П. .Мороаов С.М..Громова O.A., Цуванова Л.Н., Константинов В.В., Болдырев А.Г., Белая С.Ф., Чураяи-на С.В., Оошова И.Н. Нейтральные галя солоад. H-Y дня видело ния и очистки биологичаоки активных ввиэств //Научно-технический информационный od, о татей "йаредовой производственный опыт в шдацннокой и микробиологической промышленности, рекомендуемый для внедрения".- М. 1989.- Внп.з. -С.20-21.

8. Псдашеризацнонныв дакросфвричэзкне материалы для биотехнологии / Л.П.Гаврюченнова, О.А.Гршова, В.В.Константинов, Т.А, Хрущева» Т.П.Сушко, Л.Н.Давидт // Тб«.докд.науч.-*твхн. кояф, ВНИИОЧБ, Л., 1989. С.Ч.

9, Гаврлтанкова Л.Н., Громова O.A., Константинов В.В. , Хрущева Т.А., Сушко Т.П., Даввдш Л.Н. Виохроы - универсальные патрицы и сорбенты для медицинской биотехлологси и медицин» / Мат. 1У Европейской коа$.-выот. "По материале» к технологиям вооток-вападГ.-СПб., 1993.

19.04.94г. Зак 33S-50, РТП ИХ С;ПГГЯЗ, .Московский пр. 26