Взаимодействие вирусов с микро- и наноразмерными сорбентами различной природы

Курочкина, Янина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие вирусов с микро- и наноразмерными сорбентами различной природы
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие вирусов с микро- и наноразмерными сорбентами различной природы"

11а правах рукописи

Курочкина Янина Евгеньевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ С МИКРО - И НАНОРАЗМЕРНЫМИ СОРБЕНТАМИ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

004601141

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Иванова Валерия Тимофеевна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, профессор доктор медицинских наук

Каверин Николай Вениаминович

доктор биологических наук

Мезенцева Марина Владимировна

Ведущая организация:

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится «26» апреля 2010г. в 12 часов

на заседании Диссертационного совета Д 0001.020.01 в НИИ вирусологии имени

Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи,16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук Е. И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современных условиях вирусные инфекции занимают ведущее место в патологии людей и животных, в том числе, те из них, в распространении которых водный путь передачи является одним из основных (гепатиты А и Е, энтеровирусы, ротавирусы, вирусы гриппа птиц и др.). В связи с этим возникают вопросы о деконтаминации и очистке воды, используемой для питьевых и хозяйственно-бытовых нужд, решение которых имеет большое значение для медицины, животноводства и ветеринарии.

Все это побуждает обращаться к поиску новых методических решений для усовершенствования профилактических и защитных мер с привлечением современных достижений различных областей науки, в том числе нанотехнологий, в которой вирусы как объекты и инструменты для исследований занимают особое место (Дорохов Ю.Л., 2008).

Нами в качестве моделей для исследования были взяты вирусы гриппа человека и птиц, энтеровирусы и бактериофаги. Выбор был обусловлен следующими обстоятельствами. Эпидемии и пандемии гриппа неоднократно возникали в человеческой популяции, их особенностью являлось быстрое распространение, высокие показатели заболеваемости, особенно в случае пандемий и летальности. Во время обычных эпидемий болеет около от 5 до 15% населения земного шара (примерно 500 млн. чел), во время пандемий - в 4-5 раз больше (Львов Д.К. и др., 2008, Гендон Ю.З., 2008). Интродукция вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию может свидетельствовать о возникновении потенциальных кандидатов в новые пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; MMWR, 2004; Webster R. et al., 2006г.; WER, 2009). Появление в апреле 2009г. в человеческой популяции вирусов гриппа A(HlNl)v, антигенно родственных вирусу гриппа свиней, и их широкое распространение в мире вынудили ВОЗ в июне 2009г. объявить о начале пандемии (WER, 2009, Львов Д.К., 2009). Энтеровирусы (или кишечные вирусы) занимают значительное место среди инфекционных заболеваний, распространяющихся фекально-оральным путем. Вирус полиомиелита, относящийся к энтеровирусам, может вызывать острое вирусное заболевание с поражением ЦНС. При энтеровирусных инфекциях, в том числе полиомиелите, требуется проведение профилактических мероприятий, как специфических (вакцинопрофилакгика), так и неспецифических (деконтаминация воды от микроорганизмов с помощью фильтров и дезинфектантов). Колифаги являются санитарно - показательными микроорганизмами по определению степени загрязнения водоемов (воды и открытых водоемов), и могут быть индикаторами загрязнения этих водных источников (Доскина Т.В., 2005). Работы проводились с бактериофагом T4D - классическим объектом для биохимических и санитарно-гигиенических исследований.

Изучение сорбционных свойств современных наноматериалов, отбор наиболее перспективных по ряду характеристик - необходимый этап работы для получения эффективных сорбентов для фильтров. В литературе имеется ограниченное число работ по сорбции вирусов гриппа из растворов. В качестве сорбентов предложены BaSO.i

(Захстельская Л.Я., Шендерович С.Ф. и др., 1979), в методе ионно-обменной хроматографии - аниониты и катеониты (Рыбинская J1.H. и др., 1979), которые обладали низкой сорбиионной емкостью, трудоемкостью и длительностью выполнения операций.

Углеродные материалы могут рассматриваться в качестве перспективных сорбентов для удаления вирусов из воды и растворов. Для детоксикации жидких и газообразных сред предложен ультрадисперсный графит - природный минерал с известной химической структурой и составом, у которого после специальной обработки увеличивалась сорбционная емкость. (Головач О.С. 2002, Буравцев В.Н. и др., 2008). Активированный уголь был предложен в качестве сорбента для наноразмерных патогенов - бактериофагов размером 25 нм (Тремблэй М.Э. и др. 2000).

С другой стороны современные синтезированные наноматериалы также могут стать предметом изучения, некоторые из них (фуллерены) уже предложены для медицинских целей в качестве противирусных средств (Носик Д.Н. и др., 2008), (углеродные нанотрубки) дм адресной доставки лекарств (Ткачук В.А., 2008). Материалы, обладающие магнитными свойствами, были предложены в качестве сорбентов для вирусов гриппа птиц (Ефременко В.И. и др., 2008). Современные полимеры, например, представители семейства полианилинов и их производные, обладающие широким спектром физико-химических свойств, включая спектральные свойства и электропроводимость в широких пределах, позволяют рассматривать их в качестве кандидатов для вирусных сорбентов. По данным Leiser, Robert-Matthias at all., (патент US, N 7018538, 2006) молекулы РНК Е. coli могут сорбироваться на полианилин (ПАн).

Цели н задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось определение возможности и условий сорбции вирусов гриппа человека и птиц, энтеровирусов (на модели вируса полиомиелита вакцинного штамма Сэбина тип 1), бактериофагов T4D, белков невирусной природы на современные микро- и наноразмерные материалы, с различной формой, структурой и физико-химическими свойствами.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: 1. Определить способность ряда микро- и наноразмерных материалов различной природы (углеродных материалов, включая нанотрубки, наноразмерных композитов, содержащих ПАн) сорбировать из различных растворов и воды:

а) вирусы гриппа человека А и В (эталонные и эпидемические штаммы), изолированные в период с 1977 по 2009 гг., отличающиеся антигенными свойствами и термочувствительностью гемагглютинина,

б) пандемический штамм A(HlNl)v, антигенно родственный вирусу гриппа свиней,

в) вирусы гриппа птиц A(H5N2, H7N7), реассортантные штаммы A(H5N1),

А(Н5№).

2. Оценить влияние различных факторов (температурного, временного воздействия, систем культивирования и степени очистки вирусов) на иммобилизацию вирусов гриппа на сорбенты.

3. Исследовать взаимодействия вирусов полиомиелита вакцинного штамма Сэбина типа 1 с сорбентами.

4. Изучить сорбцию бактериофага Т41) на сорбенты из различных растворов и воды.

5. Установеть возможность использования выбранных сорбентов для удаления белков невирусной природы из растворов.

Научная новизна работы

Получены приоритетные данные о возможности современных материалов-углеродных соединений, ПАна и композитов на его основе, обладающих различной структурой и физико-химическими свойствами, удалять из жидкостей вирусы человека, птиц и бактерий, а также белки невирусной природы.

Впервые показано, что вирусы гриппа человека и птиц, вакцинный штамм вируса полиомиелита типа 1, бактериофаг Т4П), бычий сывороточный альбумин, аллантоисная жидкость КЭ способны сорбироваться на ультрадисперсный углеродсодержащий сорбент (УДУС).

Впервые установлено, что полимерные наноразмерные комплексы производных ПАн, синтезированные с помощью низкомолекулярных и высокомолекулярных кислот, взаимодействуют с белками: вирусов гриппа человека типа А и В, пандемического штамма А(НШ1)у подобного свиному, вирусов гриппа птиц, вакцинного штамма вируса полиомиелита типа 1, бактериофага Т4Р; бычьего сывороточного альбумина, аллантоисной жидкости КЭ и белками сыворотки крови. Углеродные нанотрубки и композиты ПАна с углеродными нанотрубками обладают способностью сорбировать из растворов и воды вирусы гриппа человека, птиц и бактериофага Т40.

Показано, что иммуносорбенты - комплексы, образованные из вирусов гриппа с сорбентами: УДУСом, основанием ПАна, углеродными нанотрубками, с покрытием и без покрытия ПАн, обладают способностью удалять антитела из растворов.

Практическая значимость работы

Данные по сорбции вирусов гриппа из растворов на УДУС и производные ПАна были положены в основу при составлении патентов РФ № 2329505, 2007г., и №2372951, 2007г. Разработанный метод может быть рекомендован для деконтаминации растворов, резервуаров, зараженных различными вирусами, в том числе вирусами гриппа птиц. Это особенно важно, поскольку в последние годы участились случае передачи вируса гриппа А от птиц к людям в районах близкого контакта птиц с человеком и появилась возможность возникновения нового пандемического штамма, а с другой стороны вирус гриппа подобный вирусу гриппа свиней уже вызвал в 2009г. согласно ВОЗ, пандемию (http://www.who.int/csr/disease/swinefluenza/indexhtml).

Сорбенты, например, УДУС можно включать в состав тест-систем в качестве иммуносорбента для определения спектра антител в иммунных сыворотках при серологических исследованиях.

Полученные данные по сорбции вирусов на сорбенты - производные ПАна, композиты ПАна с углеродными трубками могут применяться в качестве материалов для фильтров, а также для определения спектра антител в иммунных сыворотках при диагностических исследованиях. С учетом уникальных физико-химических свойств ПАна (проводимостью, электрохромизмом, инертностью), экономичностью (дешевизной сырья), производные ПАн могут быть использованы при разработках детекторов на вирусы или на комплексы вирусов с антителами для экспресс - диагностики вирусных инфекций.

Апробация работы

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: Международной конференции по зооантропонозам (Ульяновск, 2006г.); Европейской конференции «Инфекционные болезни и болезни пищеварительного тракта» (Париж, Франция, 2006г.); Международной конференции по оптическим зондам я-коньюгированных полимеров и функциональным самосборкам (Турку, Финляндия, 2007г.), IV Российско-французском симпозиуме в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Москва, 2007г.), X международном симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (Сингапур, 2008г.), Первой международной конференции «Нано -2008» (Минск, Беларусь, 2008г.), 3-ей Европейской конференции по гриппу (Виламора, Португалия, 2008г.)., Пятом международном конгрессе «Биотехнология: состояние перспективы развития», (Москва, 2009г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», (Москва, 2009г.), 2-х Конференциях молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, (Москва 2008г, 2009г.), 2-х Международных форумах по ианотехнологиям «Роснанотех», Москва, 3-5 декабря 2008г. и 6-8 октября 2009г; Московской конференции - конкурсе молодых ученых, аспирантов и студеш-ов «ФИЗИКОХИМИЯ-2009», Москва, 6-8 октября 2009г.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела экологии вирусов с Це1пром по экологии и эпидемиологии гриппа и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 января 2010 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых российских научных журналах, 2 патента на изобретения №№ 2329505 РФ, 2372951 РФ, а также 12 материалов докладов в сборниках российских и международных конгрессов и конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 200 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц и 23 рисунка.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусы. Использовано 37 эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа типов А и В, циркулировавших в России и в мире в период с 1972г. по 2009г.; в том числе пандемический штамм A(HlNl)v, антигенно родственный вирусу гриппа свиней. Эти вирусы были получены из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов ЦЭЭГ, НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, а также из справочных центров ВОЗ; реассортанты вирусов гриппа A(H5N1), A(H5N2) были любезно предоставлены академиком РАМН, проф. Н.В Кавериным (лаборатория физиологии); вирусы полиомиелита получены от д.м.н., проф. H.H. Носика (лаборатория онтогенеза) обе лаборатории входят в состав НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, РАМН; бактериофаг T4D был любезно предоставлен K.6.H. М.П.Шнейдером (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Иммунные сыворотки к эпидемическим и эталонным штаммам вируса гриппа A(H1N1), A(H3N2) и вирусов гриппа В двух эволюционных линий.

Культивирование вирусов гриппа проводили на 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и на культуре клеток MDCK по методу (Davies H.W. et al., 1978г.), Бурцева, 2002.

Геакция гемагглютинации (РГА). Гемагглютинирующую активность вирусов определяли в РГА по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ с использованием 0,75% взвеси эритроцитов 0(1) группы крови человека. За гемагглютинирующий титр принимали последнее разведение, показавшее положительный результат.

Определение антигенной активности гемагглютинина вирусов гриппа А и В, методом РТГА. Изучение антигенной структуры гемагглютинирующих изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием референс-штаммов, а также иммунных сывороток, приготовленных к ним в ЦЭЭГ, и из диагностических наборов ВОЗ. Реакцию ставили по общепринятому методу, рекомендованному ВОЗ, и «Методом определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» МУ3.3.2.1758-03.-М., (2005).

Термочувствительность поверхностных белков гемагглютинина (НА) определяли по изменению гемагглютинирующего титра вируса в РГА по отношению к исходной активности после прогревания вируссодержащей жидкости при Т- 56°С в течение 60 мин.

Получение очищенных препаратов вирусов гриппа дифференциальным центрифугированием в ультрацентрифуге L5-50, ротор Ti-35, у=25000об./мин., t=l4ac; очищали в градиенте концентрации сахарозы 10-50%, \'=22000об./мин, ротор SW 27.1, Р=1час. Вирус ресуспензировали в буфере STE (рН=7,4).

Культивирование вируса полиомиелита (вакцинный цггамм Сэбина тип 1) проводили в культуре клеток Vero при 34"С в течение 48-72 часов. Для индикации вируса в растворе использовали титрование его в 96 луночных панелях, содержащих клетки Vero, и выявление по полному цитопатическому действию.

Культивирование бактериофага T4D проводили на культуре клеток E.coli. Титрование бактериофага в растворе осуществляли методом агар-агаровых слоев при температуре 37°С в течении 24 часов. Титр фага определяется по следующей формуле: титр(кол-во частиц/мл) = число бляшек (зон лизиса)х(1/мл добавленного раствора фага)хразведение.

Концентрации белка в вирусных препаратах, в сыворотках и в биологических растворах определяли по методу Lowry О. (1951).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Препараты белков анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, в 12 или 15% ПААГ в не восстанавливающих условиях по методу Laemmli U.K. (1976).

Получение иммунных сывороток к вирусам гриппа. Для иммунизации использовали аплантоисную жидкость с высокой концентрацией вируса (с титром от 12В до 1024 ГАЕ) проводилась путем введения взрослым крысам по 5 мл внутрибрюшинно 3 раза с интервалом через 2 недели. Через 5 дней после последнего заражения производили забор крови.

Электронную микроскопию выполняли совместно с д б.н., проф. Маныкиным A.A. (НИИ вирусологии РАМН). Негативное контрастирование препаратов осуществляли с помощью 2% водорастворимой фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН=6,0 (ФВК) и 2% водного раствора уранилацетата (УА).

Статистическую обработку результатов проводили стандартным методом Стьюдента, который включал вычисление показателей иммуногенности: средних геометрических гемагглютинирующих титров, средних квадратичных отклонений согласно Белякову В.Д. и др. (1981).

Сорбенты:

неорганический УДУС приготовлен в Учреждении Российской Академии Наук Институте химической физики им. H.H. Семенова РАН, Москва, д.ф.-м.н. Буравцевым В.Н. и в Институте физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова н.с. Тимофеевой A.B.

органические - полимеры-производные полианилина (ПАн) синтезированы разными способами с помощью низкомолекулярных и полимерных кислот в Учреждении Российской

Академии Наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н, Фрумкина РАН, Москва, д.х.н. Ивановым В.Ф.

углеродные трубки, углеродные трубки с покрытием ПАн - приготовлены в Учреждении Российской Академии Наук Институте высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, к.х.н. Сапуриной И. Ю.

Автор выражает благодарность ученым, предоставившим сорбенты и вирусы для работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика вирусов гриппа А и В, изолированных в 1972-2009гг.

Отбор штаммов для сорбционных исследований проводился по следующим критериям. Первым и главным критерием отбора стали антигенные свойства поверхностных белков вирусов гриппа. Вторым критерием была чувствительность к прогреванию поверхностного белка гемагглютинина. Различная чувствительность НА к прогреванию свидетельствует о неидентичности структуры этого белка. Третьим - была чувствительность вирусов к системе культивирования. Были отобраны штаммы, культивированные как в традиционной системе - куриные эмбрионы, так и в системе MDCK. При этом внимание уделяли штаммам, изолированным в последние десятилетия XX и первое десятилетие XXI века до 2009г. включительно. После анализа литературных данных по вирусам, выделенным до 2006г. и изучения антигенных свойств эпидемических штаммов, изолированных с 2005 до 2009г. с сыворотками к эталонам вирусов разных лет, были отобраны эталонные и эпидемические штаммы вирусов гриппа из коллекции вирусов ЦЭЭГ.

1.1. Антигенные свойства вирусов гриппа А и В

Вирусы гриппа A(H1N1). После возвращения в 1977 году, вирусы гриппа A(H1N1) стали регулярно циркулировать с различной активностью в эпидемические периоды. Антигенный дрейф НА исследованных эпидемических штаммов был в направлении НА штаммов А/Новая Каледония/20/99 —► А/Соломоновы острова/3/06 —► А/Брисбен/59/07. Всего было исследовано 9 штаммов, которые были ангигенно родственные этим эталонным штаммам.

Вирусы гриппа A(HlNl)v. В апреле 2009г. в человеческой популяции стали циркулировать в разных странах и были изолированы от людей вирусы гриппа подобные свиным. Первый пандемический штамм A/HV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, выделенный в РФ в Москве в мае 2009г., взят нами для исследования (Львов Д.К., 2009).

Вирусы гриппа A(H3N2) последовательно изменялись в процессе эволюции, начиная с их появления в 1968г. Антигенный дрейф НА вирусов гриппа шел от НА А/Калифорния/20/99 до А/Брнсбен/10/07. Всего было исследовано 12 штаммов, которые были антигснно родственные эталонам этого периода, а также некоторым эталонным штаммам, изолированным ранее.

Вирусы гриппа В принадлежали к двум эволюционным линиям: В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88-подобным (Викторианской и Ямагатской линии). В обеих группах выявлен

антигенный дрейф наружных белков. Исследовались эпидемические штаммы вирусов гриппа В Ямагатской линии подобные эталонному штамму В/Шанхай/361/02; викторианской линии В/Гонконг/330/01—>В/Малазия/2506/04. Всего было исследовано 14 штаммов, представителей обеих групп.

Вирусы гриппа птиц. Водоплавающие птицы являются природным резервуаром вирусов гриппа А. Наиболее обычный пуп. распространения вируса - фекально-оральная трансмиссия. Исследованы вирусы гриппа A/FPV/Weybridge/34(H7N7), A/Mallard/Pennsylvama/1024/84 (H5N2), а также реассортанты R22/II (H5N1) полученные скрещиванием вирусов AI Duck/ Primorie/2621 /01 (H5N2) с A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и R22 (H5N2) - A/Duck/Primorie/2621/01(H5N2) с A/Puerto Rico/8/34 (HIN!) согласно (Rudneva I.A., et al., 2007).

Глава 2. Получение, структура и свойства выбранных сорбентов. Разработка методов сорбции биологических объектов на сорбенты

Нами были исследованы 6 сорбентов. Их можно разделить на 2 класса: микросорбенты (углеродные материалы), наносорбенты (полимерные) и нанокомпозиты на их основе.

2.1. Ультрадисперсный углеродсодержащий сорбент

К неорганическим сорбентам относятся УДУС, приготовленный на основе модифицированного кислородсодержащего графита, представляющий собой один из продуктов термического разложения соединения графита (патент РФ 2198137, 2003). Для его получения модифицированный графит предварительно подвергали обработке водой при 95-100°С, затем центрифугировали, полученный осадок суспендировали в водном буферном растворе. Содержание графита (с удельной поверхностью 1500-2000 м3/г) в конечной суспензии сорбента - носителя не менее 2 мас.% (патент РФ2327517,2008).

Электроиомикроскопический анализ показал, что частицы УДУСа имеют различную форму, при этом их максимапыше размеры варьируют в пределах от 25 до 100 мкм (Рис.1 а,б,в).

Ä* ц *

1200нм

1750нм ▲

.....JWP^

а б R

Рис.1, а, б, в. Электронная микроскопия различных частиц ультрадиснерсного графита

2.2. Производные полианилина.

В качестве полимеров были выбраны полианилин (основание) и его производные, которые обладают широким спектром физико-химических свойств, включая спектральные

свойства и электропроводимость в широких пределах. Полианилин может существовать в различных степенях окисления. Они могут существовать в порошкообразной форме, а также образовывать пленки. Полианилин обычно получают прямым окислением анилина, используя соответствующие химические окислители или электрохимическим окислением на различных электродных материалах.

Производные полианилина ПАн-0 (основание) и ПАн-ПАМПСК (соль ПАн и поли-(2-акриламидо-2-метил-1-пропан-сульфоновой кислоты ПАМПСК)) использовали в виде порошков (рис.2).

н н

б) в)

Рис.2. ПАн-О: а) химическая структура, б) электронно - микроскопическое исследование ПАн-О в ФР в) модель молекулы ПАн-О.

ПАн-0 получали при комнатной температуре (Cao Y et all., 1989). После этого порошок полианилина в виде основания использовали для сорбции вирусов.

а) б) ПАн-ПАМПСК 1:1 в) ПАн-ПАМПСК 1:2

Рис.3. Интерполимерные комплексы полианилина и ПАМСК: а) электронно-микроскопическое исследование микросколия ПАн-ПАМПСК; б) модели цепей композита ПАн-ПАМПСК; в) 1:1; в) ПАн-ПАМПСК 1:2.

Химический синтез ПАн-ПАМПСК проводили при комнатной температуре при последовательном смешивании водных растворов ПАМПСК, анилина и персульфата аммония (Иванов и др., 2004 г.). Результаты исследования структуры сорбента с помощью

электронного микроскопа свидетельствуют о формировании интерполимерных комплексов ПАн-ПАМПСК длиной до 1500 нм диаметром 30-40 нм (рис.3).

2.3. Углеродные нанотрубки без покрытия и с покрытием ПЛн.

Следующей группой рассматриваемых сорбентов были нанотрубки. Использовались два вида трубок, состоящие исключительно из атомов углерода, а также трубки, покрытые полианилином по методу (Сапурина И.Ю., 2007г.). Нанотрубки представляют собой углеродные каркасные трубки, полые внутри (рис.4).

а) б) в) г)

Рис 4. Электронная микроскопия: а) углеродных нанотрубок, б) углеродных нанотрубок с покрытием ПАн; в) модель углеродной нанотрубки г) модель углеродной нанотрубки, покрытой НАн.

2.4.0пределение токсичности сорбентов в культуре клеток ]УШСК

Для определения токсического действия сорбентов на культуру клеток были проведены два вида исследования токсичности сорбентов, разведенных в ФР и смывов с сорбентов. В планшет с клетками МОСК. У= 180 мкл/лунку вносили суспензии сорбентов в ФР, У= 20мкл, С= 15 мкг/мл для сорбента УДУС; С=10 мг/мл для остальных сорбентов, делали дальнейшее разведение 1/10 и помещали на контакт в термостат при 37 °С на 18 часов. Микроскопическое исследование (визуальное) на культуре клеток МОСК показало наличие частичек сорбентов в разведениях 10", что объясняется нерастворимостью или частичной растворимостью сорбентов в жидкости. Наибольшие изменения выражались разрыве монослоя по краям лунок, меньшее в небольших деформациях клеток (сжатие). Действия сорбентов на клетки зависели от вида сорбентов и могли наблюдаться до его разведения 10"2 включительно, при этом наименее токсичным были УДУС и ПАн-О, а наиболее - ПАн-ПАМПСК 1:1. При изучении токсичности препаратов для культуры клеток МОСК цитотоксическая 50% доза (ЦТД50) была >1 мг/мл для ПАн-О, углеродных нанотрубок без и с покрытием ПАн, ПАн-ПАМПСК 1:1,1:2. Для суспензии УДУСа ЦТД50 была >2,5 мг/мл. В случае исследовании токсичности смывов с сорбентов на клетки МОСК установлено, что для всех исследованных сорбентов не происходило изменения монослоя.

2.5. Разработка метода сорбции биологических объектов на сорбенты

Дня исследования различных стадий взаимодействия биологических материалов на выбранные для сорбции современные материалы нами были разработаны методические

подходы. При изучение сорбции биологического объекта, например, вирусов, содержащихся в буферном (5ТЕ) или в ФР растворах, их смешивали во флаконе с сорбентом и помещали на шейкер для активного контакта (рис.5).

Смешивание Контакт

вирусы.

сорбент

Надосадок

Осадок:

(иммуносорбент)

Рис.5. Общая схема сорбции биологических материалов на сорбенты.

Центрифугирование

Затем смесь центрифугировали при 2 ООО тыс. об/мин. на настольной низкоскоростной центрифуге (Comb spin) в течение 4 мин, надосадочную жидкость исследовали на наличие вирусов или белков невирусного происхождения различными методами, в зависимости от материала (см. раздел материалы и методы). Титр вирусов гриппа до и после сорбции определяли в РГА. Снижение гемагглютинирующего титра вирусов в надосадочной жидкости, свидетельствовало об иммобилизации вирусов на сорбент. Осадок - комплекс вируса с сорбентом представлял собой иммуносорбент.

В опытах масса сорбента составляла от 50 до 200 мг (0,3 мг сухого вещества) для УДУСа; от 5 до 50 мг для полианилиновых сорбентов; 3-6 мг для нанотрубок; при постоянном объеме вируссодержащей жидкости V= 200 мкл. Исследования проводили при нескольких температурах 8, 22, 36°С. Длительность контакта вирусов с сорбентами на шейкере составляла от 15 до 120 минут.

Глава 3. Изучение взаимодействия вирусов с сорбентами.

3.1. Сорбция вирусов гриппа А и В, изолированных от разных хозяев

Вирусы гриппа А и В сорбировались на сорбенты из вируссодержащих жидкостей: буферных растворов, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, автоклавированной водопроводной воды по схеме с параметрами, приведенными в п. 2.1. Исследования показали, что в выбранных диапазонах масс от 50 до 200 мг для УДУСа и от 5 до 50 мг для ПАяа сорбция вирусов происходила интенсивно. Снижение титра вирусов гриппа, содержащихся в растворе после сорбции, происходило в 4 - 256 раз, в зависимости от концентрации вирусов (табл.3,4).

Таблица 3.

Сорбция вирусов гриппа А и В на сорбенты __

Сорбент Вирус Тип вируса Система культивирования (очистка) Растворитель Титр* до сорбции Титр после сорбции

УДУС А/Пенза/70/08 Н1Ы1 МОСК ФР 128 32

В/Малайзия/2506/04 В КЭ(очищ.) авН20 2048 512

ПАн-0 В/Малайзия/2506/04 В КЭ(очищ) ав.Н20 2048 8

АЛ1У-Мо5СОто'01/2009 А(НМ)5\У1 КЭ (ал.) ФР 64 2

ПАн-ПАМПСК 1:1 А/Владивосток/22/08 А(НЗК2) МОСК ФР 128 4

В/Малайзия/2506/04 . В КЭ(очищ.) ЭТЕ 2048 8

А/НУ-Мокочг/О1/2009 А(Н1Ш)5уЛ КЭ(ал.) ФР 64 2

ПАн-ПАМПСК 1:2 В/Малайзия/2506/04 в КЭ(ал.) ФР 128 8

А/11 V-Moscow/01/2009 А(НШ1)Ы КЭ(ал.) ФР 64 16

УНТ+ПАн А/Москва/72/07 A/HЗN2 МОСК ФР 64 0

AЛIV-Moscow/01/2009 A(HlNl)swl КЭ(ал.) ФР 64 8

Примечание: сорбщпо проводили при 22 °С; очищ. - очищенный концентрированный вирус; ал. - аллантоисные вирусы,'гемагглютинирующие титры вируса (ГАЕ).

Таблица 4.

Сорбент Вирус Тип Степень очистки вирусов Растворитель Титр* до сорбции Титр после. сорбции

УДУС А/Ма11аг(1/Репп5у1уаша/1024/84 А(Н5№) очищ. ав.Н20 128 4

1122/11 А(Н5Ы1) ал. ФР 512 16

ПАн-0 А/Ма11аг(1/Рещ15уи'аша/1024/84 А(Н5№) очищ. авН20 128 4

ш/п А(Н5Ы1) ал. ФР 512 16

ПАн-ПАМПСК 1:1 А/КРУЛУеуЬп1^е/34 А(НЖ7) очищ. ФР 2048 4

1122/11 А(Н51М1) ал. ФР 512 16

ПАн-ПАМПСК 1:2 А/РРУМеуЬпс^е/34 А(Н7№) очищ ФР 2048 16

И22 А(Н5№) ал. ФР 1024 256

УНТ А/Ма11агс1/Репп5у1уаша/1024/84 А(Н5Ы2) очищ. ав.Н:0 128 16

А/ТРУМеуЬп<1ге/34 А(Н7Н7) очищ. ФР 128 <2

УНТ+ПАн А/Ма11аг(1/Репп5у1уаш а/1024/84 А(Н5№) очищ. ав.НгО 128 2

АТРУЛУеуЬп^ёе/34 А(Н7Ы7) очищ. ФР 128 <2

Примечание: сорбция при 22 °С,*гемагглютинирующие титры вируса (ГАЕ).

Анализ влияния температур на сорбцию вирусов показал, что адсорбция вирусов происходила одинаково интенсивно в диапазоне температур 8, 22, 34°С для сорбентов ПАн-0 и УДУС. В случае углеродных трубок сорбция происходила менее интенсивно при 4°С (рис.6).

ТИТРО! ипрусоч но

Рис. 6. Влияние температуры на процесс сорбции вирусов гриппа на разные сорбенты.

По оси х - сорбенты; по оси у - температура; по оси х - титры вирусов в РГА, штаммы.

■ А/Сичуань/2/87(Н31Ч2), Ш А/Сичуань/2/87(НЗН2), □ В/Малазия/2504/06.

Для определения оптимального времени контакта вирус-сорбент, были проведены исследования влияния длительности взаимодействия вируса с сорбентом на сорбцию вирусов. Результаты исследования показали, что сорбция вирусов гриппа происходила одинаково активно в диапазоне времени от 15 до 120 минут (рис.7).

Рис. 7. Влияние времени на процесс сорбции вирусов гриппа.

По оси х- время (мин ); по оси у- сорбенты; по оси ъ- гемагглютинирующие титры вирусов до и после сорбции (ГАЕ), исследовали штамм А/Сичуань/2/87(НЗ№).

3.3. Десорбция вирусов гриппа с сорбентов.

Для определения стабильности связи вирусов с сорбентом в иммуносорбенте (вирус + сорбент) исследовали десорбцию вируса с иммуносорбента в два раствора: буфер STE

рН= 7,2 и ФР по схеме (Рис.8). Иммуносорбент смешивали с раствором, реакционную смесь помещали на шейкер на 1 час при 20°С или без шейкера на 72 часа при 35°С и на 18 часов при 4°С. Затем иммуносорбент осаждали и центрифугировали на настольной низкоскоростной центрифуге (Comb spin) в течение 5 минут. Надосадочную жидкость исследовали на наличие вируса в РГА.

десорбция

+ *

иммуносорбент Т=4,20,35°С, сорбент вирусы

(=1-18-72 ч

Рис.8. Общая схема десорбции вирусов с иммуносорбента в раствор.

Десорбция вируса с иммуносорбента была исследована на аллантоисных и очищенных вирусах при 20 и 35 °С в течение 1 часа и 72 часов в два раствора. Установлено, что процесс происходит слабо при Т=20, 35°С в исследуемые растворы. Титры вируса в надосадочной жидкости после десорбции варьировали от <2 до 8 ГАЕ. При начальных титрах вируса до сорбции от 2048 до 4096 ГАЕ (рис.9).

I г

II 11

I I

десорбция I | десорбция

после 1 после 24 |

часа ^ ^ часов

Рис.9. Сорбция и десорбция вирусов гриппа с сорбентов.

По оси х- этапы эксперимента. По оси у- гемагпнотинирутощие титры вирусов гриппа А/Сичуань/2/87.

3.4. Взаимодействие иммуносорбента с вирусов с антителами

Для определения сохраняется ли антигенная активность вирионных поверхностных белков, в частности наиболее важного - гемагглютинина, в иммобилизованном на сорбенте вируса, мы провели исследования взаимодействия сорбированных вирусов. Исследования проводили по следующей схеме.

Приготовленный иммуносорбент смешивали с иммунной сывороткой, содержащей гомологичные антитела к этому вирусу. Смесь ставили на контакт в различных условиях: в течение 30 мин при 22, 37°С и 16 часов при 4°С, затем центрифугировали. Надосадочную жидкость исследовали на наличие антител в растворе в РТГА (рис. 10).

- контакт

О? + С^^223

иммуносорбент антитела комплекс (иммуносорбент + антиген)

Рис. 10. Схема взаимодействия имунносорбента с антителами.

Сравнительный анализ титров сыворотки до и после взаимодействия с иммуносорбентом показал, что титры сыворотки снижались с 1/1280 до 1/80 для ПАн-О, 1/640 до 1/40 для ПАн-ПАМПСК, что указывает на сорбцию гомологичных антител к вирусу гриппа из сыворотки на иммуносорбенты в исследованных случаях. Связывание антител происходило при использовании любого из иммуносорбентов при различных температурных и временных условиях (табл.5).

Таблица 5.

Изучение сорбции антител к вирусам гриппа А и В на иммуносорбенты при 4 "С

иммуносорбент Сорбированное вещество-иммунная сыворотка к вирусу гриппа Титр сыворотки (РТГА) Контакт иммуносорбента с вирусом Т час.

До сорбции После сорбции

ПАн-0 + вирус A(H3N2) A(H3N2) 1:1280 1:80 18

ПАн-ПАМПСК + вирус A(H3N2) A(H3N2) 1:640 1:40

ПАн-ПАМПСК вирус В В 1:1280 1:40 24

УНТ+ вирус В В 1:320 1:160 24

УНТ+ПАн + вирус В В 1:320 1:80 24

УДУС A(H3N2) 1:640 1:20 18

Анализ раствора сыворотки в РТГА до и после взаимодействия с иммуносорбентом показал, что титр сыворотки снижался с 1/640 до < 1/20 для УДУСа и с 1/1280 до 1/40 для полианилиновых сорбентов. Для нанокомпозитов, углеродных трубок с покрытием ПАн, наблюдалось снижения титра сыворотки с 1:320 до 1:80. Для углеродных трубок при заданных условиях процесс взаимодействия иммуносорбента с гомологичными антителами был слабо выражен.

3.5. Возможная модель взаимодействия вирионов с производными ПАн

Как показали наши результаты, полианилин и его производные активно связываются с вирионными белками исследованных вирусов. Наблюдаемое взаимодействие вирусов гриппа с полианилином можно объяснить с учетом структуры вирионных белков и сорбентов, с состав которых входил полианилин. На основании данных по составу аминокислот в антигенных сайтах А и В, расположенных на вершине молекулы ГА (\¥Ш1еу Б, ЗЫЫв I. 1990), и данных по химическому составу полианилина и его интерполимерных комплексов (Иванов В.Ф.2006), природа взаимодействия этих сорбентов с вирусами, очевидно, обусловлена образованием различных связей (кислотно-основных, ионных, донорно-акцепторных, водородных, полярных и других) функциональных групп ПАна с соответствующими аминокислотными группами биологических объектов (рис 11).

Струвсгурные единицы ПАн

Функциональные группы в антигенных сайтах А и В гемагглютиннна вируса гриппа Л

эО

Концевая

аминная группа

Аминный

Катион-радикал

Функциональные группы ПАМПСК

0=0

Хинон-иминный фрагмент

донорно-акцепторные аодородные ковалентные полярные ионные

другие взаимодействия (дисперсионные, силы кулоновского притяжения)

Рис. 11. Взаимодействие функциональных групп аминокислот гемагглютинина с ПАи сорбентами.

4. Сорбция вируса полиомиелита

К числу кишечных вирусов относится одно из самых больших вирусных семейств -пикорнавирусов (Рюогпау^ае), которое включает в себя энтеровирусы, имеющие фекально-оральный путь распространения. Полиомиелит - острое инфекционное заболевание, вызываемое энтеровирусами, поражающее ЦНС. Размер вириона 27-30 нм, содержит РНК. Прекрасно выживает во внешней среде, он устойчив к дезинфектантам. Как показали результаты анализа, сорбенты ПАн-0 и УДУС обладают способностью взаимодействовать с вирусом полиомиелита вакцинный штамм Сэбина тип 1 не менее, чем 4,01§ТЦИД5о, способность ПАн- ПАМПСК сорбировать вирус была низкой (1,0 !§ТЦИД5о),

5. Сорбция бактериофага

Бактериофаги — субмикроскопические агенты, являющиеся вирусами бактерий, заражающие бактериальную клетку, воспроизводящиеся в ней и часто вызывающие ее растворение (лизис). Бактериофаги представляют собой весьма удобный индикатор качества питьевой воды. Они легко поддаются обнаружению и количественному подсчету, поэтому на протяжении многих лет их используют как своеобразный показатель качественности воды и се вирусной контаминации.

Бактериофаги различаются по размерам, типу нуклеиновой кислоты, клеткам хозяина и по характеру взаимодействия с микробной клеткой. Исследования были проведены с Т-четным ДНК-содержащим бактериофагом Т40. Его размеры достигают 90 нм в ширину и 200 нм в длину. Исходную концентрацию фага с титром 1,2*10'° разводили в 1000 раз и использовали для сорбции из ФР и автоклавированной воды на различные сорбенты. Результаты исследования представлены в табл. 6. Установлено, что фаги удалялись из всех растворов с помощью данных сорбентов, степень иммобилизации была выше у производных полианилила. Сорбция бактериофага на углеродные трубки с покрытием ПАн и без покрытия зависела как от вида трубки, так и от раствора, из которого происходила сорбция. Наиболее активно фаги удалялись трубками, покрытыми ПАн из ФР. В случае сорбции на УДУС тигр уменьшался в 1000 раз.

Таблица 6.

Исследование сорбции бактериофага Т41> на сорбенты

Сорбент Раствор Титр до сорбции, частиц/мл Титр после сорбции, частиц/мл

УДУС ФР 2,4*107 8*10'

ав.Н;0 3,4*10' 6,9*10'

ПАн-основание ФР 1,2*10' 0

ав.Н20 3,4* 107 0

ПАн-ПАМПСК 1:1 ФР 1,2* 10' 0

ПАн-ПАМПСК 1:2 ФР 1,2*10' 0

УНТ ФР 2,4*10' 620

ав.Н20 3,4*10' 6*10"

УНТ+ПАн ФР 5,0*10' 0

ав.Н20 3,4*10' 3*10'

Примечание: ФР-физиологический раствор; ав.Н20- автоклавированная вода.

б. Сорбция белков иевирусиой природы

Сорбцию белков невирусной природы проводили по схеме п. 2.1. на сорбенты УДУС и ПАн-0 при Т= 22° С в течении 30 мин. После центрифугирования комплекса (сорбент + белки) количество несорбированного белка в надосадочной жидкости оценивались качественно по наличию белковых полос после электрофореза в ПААГе и сравнению их с

белковыми полосами в препаратах до сорбции на ПАн, а также с препаратами с известной концентрацией белка (рис. 12).

1,2 3,4 5,6 7,8 9,10 11,12

Рис.12 Электрофоретический анализ сорбции бычьего альбумина и белков иммунной крысиной сыворотки на полианилиновый сорбент ПАн-О.

Дорожки 1-2 - бычий альбумин до сорбции, концентрация 1 мг/мл; 3-4 - контрольная концентрация 250 мкг/мл, 5-6 бычий альбумин после сорбции; 7-8 иммунная крысиная сыворотка до сорбции разведение 1:10; 9-10 - контроль: иммунная крысиная сыворотка, разведение 1:100; 11-12 -. иммунная крысиная сыворотка после сорбции.

Белки невирусной природы: широко используемый в иммунологических реакциях бычий сывороточный альбумин, аллантоисные белки КЭ были способны сорбироваться на УДУС и ПАн сорбенты. Анализ биологических материалов при электрофорезе в полиакриамидном геле до и после сорбции на полианилиновые сорбенты показал, что бычий сывороточный альбумин сорбируется примерно на 70 %, белки иммунной сыворотки сорбируются примерно 90%. Установлено, что процент сорбции белков на графит варьировал от 100 % в случае альбумина до 53% в случае белков сыворотки, аллантоисные белки иммобилизовались на 64 %.

Заключение: Данная работа посвящена разработке различных подходов в изучении взаимодействия вирусов с разными сорбентами, в зависимости от их размеров, структуры, физико-химических и биологических свойств. Объектами нашей работы являлись следующие вирусные модели: вирусы гриппа человека, птиц и реассортанты, вирусы полиомиелита и бактериофаги. В результате проведенных исследований было установлено, что углеродсодержащий материал - УДУС, разные формы полианилина и нанокомпозиты могут сорбировать из воды и растворов вирусы гриппа человека, независимо от антигенной структуры, вирусы гриппа птиц, реассортанты, пандемический штамм A(HlNl)v, подобный свиному, а также вирусы полиомиелита и бактериофаги.

Наиболее перспективным по совокупности всех характеристик при производстве фильтров является основание полианилина. Степень сорбции у данного сорбента была выше, чем у всех остальных. Он не оказывал цитопатического действия на клетки Vero и MDCK, а так же цена на его производство является достаточно низкой.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлена способность ряда наноразмерных материалов различной природы (углеродных материалов, углеродных нанотрубок, производных полианилина и композитов на его основе), сорбировать из воды и различных растворов вирусы гриппа независимо от антигенных свойств поверхностных белков из воды и различных растворов:

а) эталонные и эпидемические штаммы, изолированные в период с 1977 по 2009 гг., отличающихся антигенными свойствами, термочувствителыюстыо гемагглютинина,

б) пандемический штамм A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, антигашо родственный вирусу гриппа свиней,

в) вирусы гриппа птиц A(H5N2, H7N7), реассортантные штаммы A(H5N1), A(H5N2).

2. Установлено, что разные системы культивирования (куриные эмбрионы, культура клеток MDCK), а также степень очистки вирусов не влияют на процесс сорбции эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа на выбрашвде сорбенты.

3. Показано, что для сорбентов УДУ С, ПАн-О, ПАн-ПАМПСК 1:1, ПАн-ПАМПСК 1:2 сорбция вирусов гриппа происходила одинаково при температурах Т= 4, 22, 37 "С; во временном интервале Т=15-120 минут. Для нанотрубок сорбция вирусов снижена при 4°С.

4. На основе комплексов вирусов гриппа с выбранными сорбентами (УДУС, ПАн-О) получены иммуносорбенты, способные взаимодействовать с гомологичными антителами из растворов иммунных сывороток.

5. На модели вируса полиомиелита вакцинный штамм Сэбина типа 1 показана возможность сорбции энтеровирусов на УДУС, ПАн-О, ПАн-ПАМПСК 1:1, ПАн-ПАМПСК 1:2. Падение титра вируса было 41gTUHflso для УДУСА и ПАн-О,

1 lgTHH,H>o для ПАн-ПАМПСК 1:1, ПАн-ПАМПСК 1:2.

6. Установлено, что бактериофаг T4D сорбируются на выбранные сорбенты, причем наибольшее падение титров наблюдалось на ПАн и его комплексов и составляло

до 71g БОЕ/мл.

7. Выявлена возможность использования выбранных сорбентов (УДУС и ПАн-О) для сорбции белков невирусной природы: бычьего альбумина, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. P.O. Матюшина, В.Т. Иванова, Е.И. Бурцева, Т.А. Оскерко, Л.Н. Меркулова, С.В. Трушакова, Ю.В. Загорская, Я.Е. Курочкина, А.Н. Слепушкин. Биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, изолированных в сезоне 2005-2006 гг. //Материалы Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 21- 23 Июня 2006 г., Ульяновск, с.245-248.

2. В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкина, В.Н. Буравцев, А.В. Николаев, А.В. Тимофеева, Л.А. Баратова. Удаление вирусов гриппа и антител к ним из растворов с помощью неорганического сорбента. //Материалы Международной научной конференции «Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития» 10-12 Октября 2006 г., Москва, с.81-82.

3. V.T. Ivanova, Y.E. Kurochkina, V.N. Buravtsev, A.V. Nikolaev,A.V. Timofeeva, L.A. Baratova, A.A. Manykin. Sorbents and influenza disease. Adsorption of influenza viruses A and В on carbon sorbent. //Conference «Infections and digestive tract diseases», Abstract Booklet, 7th-8th of December 2006, Paris, France, p.46/07.

4. B.T. Иванова, Я.Е. Курочкина, JI.A. Баратова, А.В. Тимофеева, В.Н. Буравцев, А.В. Николаев. Способ получения иммуносорбента для связывания вирусспецифических антител. Патент РФХа 2329505 от 14 февраля 2007 г.

5. Я.Е. Курочкина В.Т. Иванова, В.Н. Буравцев, А.В. Николаев, А.В. Тимофеева, Л.А. Баратова, А.А. Маныкин. Метод очистки воды и растворов, контаминированных вирусами гриппа с использованием углеродсодержащих сорбентов. //«IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов», 26-27 апреля, 2007 г., Москва, том 1, с.247-248.

6. O.L., Gribkova, V.F. Ivanov, V.T. Ivanova , R.O. Matyushina , Ya.E. Kurochkina, A.V. Vannokov. Influenza viruses sensor based on polyanilina film. //In Abstract book OP 2007 of « 7lh International Conference on optical probes of п-conjugated polymers and functional self-assemblies» 1 lth-15th of June 2007,Turku, Finland, P006, Abstract Booklet, p.91.

7. О.Л. Грибкова, В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкина, В.Ф. Иванов, А.А. Некрасов, А.А. Маныкин, А.В. Ванников. «Супрамолекулярные комплексы полианилина с полиамиосульфокислотами, их применение в биологии» // IV Российско-французский симпозиум, XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 2007 том 5, с.81.

8. В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкина, В.Н. Буравцев, А.В. Николаев, А.В. Тимофеева, Л.А. Баратова. Изучение взаимодействия вирусов гриппа А и В с углеродсодержащим сорбентом. // Вопросы вирусологии, 2008, №2 с. 40-43.

9. В.Т. Иванова, P.O. Ракутина, А.Н. Слепушкин, Е.И. Бурцева, Т.А. Оскерко, Е.С. Шевченко, С.В. Трушакова, Я.Е. Курочкина, Е.Г. Черкасов, Л.Н. Меркулова, ЕЛ.

Феодоритова. Эпидемические штаммы вирусов гриппа Л и В в сезоне 2005-2006 гг. в России. // Вопросы вирусологии, 2008, Л;4 с.13-18.

10. В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкнна, Е.И. Бурцева, Т.А. Оскерко, C.B. Трушакова, Е.С. Шевченко, Е.Г. Черкасов, М.Ю. Щелкаиов, P.O. Матюшина, JI.B. Колотухина, ЕЛ. Феодоритова, А.Н. Слепушкин. Распространение и биологические свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, циркулировавших в сезоне 2006-2007 гг. в России. //Вопросы вирусологии, 2008, № 5 с.19-23.

11. Y.E. Kurochkina, V.T. Ivanova, S.V. Trushakova, E.I Burtseva. Activation of influenza viruses A(H1N1) in epidemic season 2006-2007 in Russia. Symposium «X International Symposium on Respiratory Viral Infections». February 28 - March 2, 2008, Rasa Sentosa Resort, Singapore, P-17.

12. В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкииа, В.Ф. Иванов, O.JI. Грибкова, А.В.Тимофеева, A.A. Маныкин. Применение современных полимеров в вирусологии. //Первая международная конференция «Наноструктурные материалы - 2008: Беларусь - Россия - Украина», Минск, 22-25 апреля 2008 г., с.631.

13. V.I Ivanova, Y.E. Kurochkina E.I. Bourtseva, S.V. Trushakova, T.A. Oskerko, R.O. Matyusina, A.N. Slepushkin. Spread and biological properties of influenza viruses in Russia in the period 2003-2008. // «Third European influenza conference». Abstract Booklet, 14th-17th of September 2008, Vilamoura, Portugal, p.142.

14. В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкина, M.B. Ильина, A.A. Маныкин. Применение наноразмерных комплексов полианилина в вирусологии. //Международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008 г., с.324-325.

15. В.Ф. Иванов, В.Т. Иванова, A.B. Тимофеева, A.A. Симукова, М.В. Ильина, Я.Е. Курочкина, C.B. Трушакова, О.Л. Грибкова, М.М. Шнейдер, Г.С. Катруха Сорбция различных биологических объектов наноразмерными частицами полианилина., «Пятый московский международный конгресс БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, Россия 16-20 марта Материалы конгресса 2009, том 2 с. 107.

16. Я.Е. Курочкина, A.B. Тимофеева Деконгаминация воды и растворов, загрязненных патогенными вирусами, с помощью сорбентов, приготовленных с использованием нанотехнологий. // XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов- 2009", Москва, 14-17 апреля 2009 г., с.18-19.

17. В.Т. Иванова, В.Ф. Иванов, Я.Е. Курочкина, OJI. Грибкова, М.В. Ильина, A.A. Маныкин «Взаимодействие вирусов гриппа А и В с наноразмерными комплексами полиапнлина» //Вопросы вирусологии, 2009, № 3 с. 21- 26.

18. В.Ф. Иванов, В.Т. Иванова, Я.Е. Курочкина, OJI. Грибкова. Полианилии в качестве сорбентов для удаления вирусов, белков невирусной природы и в качестве основы иммуносорбентов, способ удаления или фиксации вирусов с помощью этих сорбентов, способ сорбции с помощью этих сорбентов. Патент РФЛ"! 2372951 от 1 августа 2007г.

19. В.Т. Иванова, И.Ю. Сапурина, В.Ф. Иванов, A.A. Симакова, М.В. Ильина, A.B. Тимофеева, Я.Е. Курочкина, М.М. Шнейдер, О.Л. Грибкова, A.A. Исакова, Г.С. Катруха. Сорбция биологических объектов на нанокомпозиты полианилина и углеродных нанотрубок, Международный форум по нанотехнологиям, Москва, 6-8 октября 2009 г., с. 274-275.

20. A.A. Исакова, Я.Е. Курочкина. Наноразмерные комплексы полианилина и их использование в вирусологии и биологии, //Московская конференция - конкурс молодых ученых, аспирантов и студентов. «ФИЗИКОХИМИЯ - 2009», Москва, 1-4 декабря, 2009 г., с.28.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику Ивановой Валерии Тимофеевне за научное руководство.

Основные результаты получены в соавторстве с д.м.н. Е.И. Бурцевой, с.н.с. Т.А. Оскерко, дм.н. II.H. Носиком, дб.н., проф. A.A. Маныкиным, (Учреждение Российской Академии наук Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), д.х.н. Ивановым В.Ф. (Учреждение Российской Академии наук институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина, РАН), н.с. Тимофеевой A.B. (Институте физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова), д.ф.-м.н. Буравцевым ВН. (Учреждение Российской Академии Наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН), к.б.н. М.М. Шнейдером (Учреждение Российской Академии наук Институт Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам.

Автор выражает глубокую благодарность за постоянное внимание и ценные консультации при выполнении работы к.м.н. А.Л. Беляеву, а также другим коллегам за моральную поддержку во время выполнения диссертационной работы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ЦЭЭГ - Центр экологии и эпидемиологии гриппа

ГАЕ - гемагглютинирующие единицы

РГА - реакция гемагглютинации

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

КЭ - куриные эмбрионы

MDCK - перевиваемая культура клеток почки собаки породы

Vero - перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки

ТЦИД50 - 50% тканевая цитопатическая инфекционная доза

УДУС - ультрадисперсный углеродсодержащий сорбент

ПАн - полианилин

ПАн-0 - основание полианилина

ПАн-ПАМПСК - солиПАни-поли-(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновой кислоты)

УНТ - углеродные нанотрубки

ФР - физиологический раствор

Ав. НгО - автоклавированная вода

STE - 0,01М Tris-HCl, О,IM NaCl, 0,00 IM ЭДТА буфер, рН=7,4

MMWR - Morbidity and Motality Weekly Rreport

WER - Weekly Epidemiologic Record

hm - Нанометр; 1нм=10'9м

мкм - Микрон;1мкм=10"см

Подписано в печать:

25.03.2010

Заказ № 3462 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курочкина, Янина Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВИРУСОВ (ВИРУСЫ ГРИППА, 12 ВИРУСЫ ПОЛИОМИЕЛИТА) В СОВРЕМЕННОМ МИРЕ И ИХ СВОЙСТВА.

1.1. Вирусы гриппа.

1.1.1. Классификация и строение вирусов гриппа.

1.1.2. Структура и свойства поверхностных вирионных белков 15 гемагглютинина и нейраминидазы (НА и МА).

1.1.3. Структура и свойства внутренних и неструктурных белков вируса 20 гриппа А.

1.1.4. Факторы, обуславливающие изменчивость вирусов гриппа.

1.1.5. Распространение вирусов гриппа. Пандемии и эпидемии, 24 вызываемые вирусами гриппа.

1.1.6. Инфицирование людей вирусами гриппа птиц с гемагглютининами 28 А/Н5, А/Н7, А/Н9.

1.1.7. Инфицирование людей вирусами гриппа А(НШ1)у, подобными 29 свиному.

1. 2. Вирус полиомиелита.

1.2.1. Классификация и строение энтеровирусов.

1.2.2. Вирусы полиомиелита, распространение в природе. 32 1.3. Бактериофаги.

1.3.1. Классификация, строение и свойства бактериофагов.

1.3.2. Бактериофаг Т4Б.

ГЛАВА 2. КАЧЕСТВО И БЕЗОПАСНОСТЬ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ, 37 КОНТАМИНИР ОВ АННОЙ ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ.

2.1. Показатели безопасности воды.

2.2. Способы очистки и деконтаминации воды от различных примесей.

ГЛАВА 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ^ 44 ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ПОМОЩИ НАНОТЕХНОЛОГИИ, В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ.

3.1. Применение нанотехнологий в медицине.

3.2. Сорбенты и иммуносорбенты на их основе и их использование в 45 различных сферах жизни деятельности человека.

3.2.1. Неорганические сорбенты (уголь, графит, фуллерены, нанотрубки).

3.2.2. Органические сорбенты - биополимеры (полианилин). 52 3.3. Использование иммуносорбентов в медицине.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Вирусы.

1.1.1. В ирусы гриппа человека.

1.1.2. Вирусы гриппа птиц и другие вирусы, используемые в работе.

1.1.3. Вирусы полиомиелита, вакцинный штамм Сэбинатип 1.

1.1.4. Бактериофаги кишечной палочки T4D.

1.2. Иммунные сыворотки к эталонным штаммам.

1.3. Клеточные линии (MDCK, Vero).

1.4. Реактивы.

1.5. Методики, использованные в работе с вирусами:

1.5.1. Изоляция и культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах.

1.5.2. Изоляция вирусов гриппа в клетках культуры тканей MDCK.

1.5.3. Реакция гемагглютинации.

1.5.4. Получение иммунных сывороток к вирусам гриппа.

1.5.5. Определение антигенной специфичности гемагглютинина вирусов 59 гриппа методом реакции торможения гемагглютинирующей активности.

1.5.6. Определение термочувствительности поверхностного белка (НА).

1.5.7. Получение очищенных препаратов вирусов гриппа.

1.5.8. Получение очищенных препаратов вирусов гриппа 60 дифференциальным центрифугированием.

1.5.9. Определение титров вирусов полиомиелита в клетках культуры 61 тканей VERO по цитопатическому эффекту.

1.5.10. Культивирование бактериофага T4D на культуре клеток Е. coli.

1.5.11. Определение концентрации белка в препаратах.

1.5.12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

1.5.13. Электронная микроскопия.

1.5.14. Статистическая обработка результатов. 65 1.6. Используемые в работе сорбенты.

ГЛАВА 2 .ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ ГРИППА А и В, 66 ИЗОЛИРОВАННЫХ В 1977-2009г.

2.1. Антигенные свойства вирусов гриппа А и В.

2.2. Определение термочувствительности гемагглютинина эпидемических 69 штаммов.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ВЫБРАННЫХ 75 СОРБЕНТОВ. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СОРБЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ НА СОРБЕНТЫ.

3.1. Ультрадисперсный углеродсодержащий сорбент.

3.2. Полианилин, интерполимерные комплексы ПАн с другими кислотами 77 (ПАМПСК).

3.3. Углеродные трубки без покрытия и с покрытием ПАн.

3.4. Определение токсичности сорбентов в культуре клеток МОСК.

3.5. Разработка метода сорбции биологических объектов на сорбенты.

3.6. Определение степени очистки растворов от ПАн-0 после 87 центрифугирования методом спектрофотомерии.

ГЛАВА 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ И БЕЖОВ НЕВИРУСНОЙ 90 ПРИРОДЫ С СОРБЕНТАМИ.

4.1. Сорбция вирусов гриппа А и В, изолированных от разных хозяев.

4.1.1. Взаимодействие с сорбентами вирусов гриппа А и В с разной 101 чувствительностью к прогреванию гемагглютинина.

4.1.2. Десорбция вирусов гриппа сорбентов.

4.1.3. Взаимодействие иммуносорбентов с антителами.

4.1.4. Возможная модель взаимодействия вирионов с производными ПАн.

4.1.5. Лиофилизация.

4.1.6. Статистическая обработка результатов. 108 4.2. Сорбция вирусов полиомиелита тип 1, вакцинный штамм Сэбина. 110 4.3 Сорбция бактериофагов Т4Б. 111 4.4. Сорбция белков невирусной природы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие вирусов с микро- и наноразмерными сорбентами различной природы"

Актуальность проблемы

Нами в качестве моделей для исследования были взяты вирусы гриппа человека и птиц, энтеровирусы и бактериофаги. Выбор был обусловлен следующими обстоятельствами. Эпидемии и пандемии гриппа неоднократно возникали в человеческой популяции, их особенностью являлось быстрое распространение, высокие показатели заболеваемости, особенно в случае пандемий и летальности. Во время обычных эпидемий болеет около от 5 до 15% населения земного шара (примерно 500 млн. чел), во время пандемий - в 4-5 раз больше (Львов Д.К. и др., 2008, Гендон Ю.З., 2008). Интродукция вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию может свидетельствовать о возникновении потенциальных кандидатов в новые пандемические штаммы (Львов Д.К. и др., 2004; MMWR, 2004; Webster R. et al., 2006г.; WER, 2009). Появление в апреле 2009г. в человеческой популяции вирусов гриппа A(HlNl)v, антигенно родственных вирусу гриппа свиней, и их широкое распространение в мире вынудили ВОЗ в июне 2009г. объявить о начале пандемии (WER, 2009, Львов Д.К., 2009). Энтеровирусы (или кишечные вирусы) занимают значительное место среди инфекционных заболеваний, распространяющихся фекально-оральным путем. Вирус полиомиелита, относящийся к энтеровирусам, может вызывать острое вирусное заболевание с поражением ЦНС. При энтеровирусных инфекциях, в том числе полиомиелите, требуется проведение профилактических мероприятий, как специфических (вакцинопрофилактика), так и неспецифических (деконтаминация воды от микроорганизмов с помощью фильтров и дезинфектантов). Колифаги являются санитарно - показательными микроорганизмами по определению степени загрязнения водоемов (воды и открытых водоемов), и могут быть индикаторами загрязнения этих водных источников (Доскина Т.В., 2005). Работы проводились с бактериофагом Т4В - классическим объектом для биохимических и санитарно-гигиенических исследований.

Изучение сорбционных свойств современных наноматериалов, отбор наиболее перспективных по ряду характеристик - необходимый этап работы для получения сорбентов для фильтров. В литературе имеется ограниченное число работ по сорбции вирусов гриппа из растворов. В качестве сорбентов предложены Ва804 (Закстельская Л.Я., Шендерович С.Ф. и др., 1979), в методе ионно-обменной хроматографии - аниониты и катиониты (Рыбинская Л.Н. и др., 1979), которые обладали низкой сорбционной емкостью, трудоемкостью и длительностью выполнения операций.

Углеродные материалы могут рассматриваться в качестве перспективных сорбентов для удаления вирусов из воды и растворов. Для детоксикации жидких и газообразных сред предложен ультрадисперсный графит - природный минерал с известной химической структурой и составом, у которого после специальной обработки увеличивалась сорбционная емкость. (Головач О.С. 2002, Буравцев В.Н. и др., 2008). Активированный уголь был предложен в качестве сорбента для наноразхмерных патогенов - бактериофагов размером 25 нм (Тремблэй М.Э. и др. 2000).

С другой стороны современные синтезированные наноматериалы также могут стать предметом изучения, некоторые из них (фуллерены) уже предложены для медицинских целей в качестве противирусных (Носик Д.Н. и др., 2008), (углеродные нанотрубки) для адресной доставки лекарств (Ткачук В.А., 2008). Материалы, обладающие магнитными свойствами, были предложены в качестве сорбентов для вирусов гриппа птиц (Ефременко В.И. и др., 2008). Современные полимеры, например, представители семейства полианилинов и их производные, обладающие широким спектром физико-химических свойств, включая спектральные свойства и электропроводимость в широких пределах, позволяют рассматривать их в качестве кандидатов для вирусных сорбентов. По данным Leiser, Robert-Matthias at all., (патент US, N 7018538, 2004) молекулы РЫК Е. coli могут сорбироваться на полианилин (ПАн). Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось определение возможности и условий сорбции вирусов гриппа человека и птиц, энтеровирусов (на модели вируса полиомиелита вакцинного штамма Сэбина тип 1), бактериофагов (на модели колифагов - T4D), белков невирусной природы на современные микро- и наноразмерные материалы, с различной формой, структурой и физико-химическими свойствами.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Определить способность ряда микро- и наноразмерных материалов различной природы (углеродных материалов, включая нанотрубки, наноразмерных композитов, содержащих ПАн) сорбировать из различных растворов и воды: а) вирусы гриппа человека А и В (эталонные и эпидемические штаммы), изолированные в период с 1977 по 2009 гг., отличающиеся антигенными свойствами и термочувствительностью гемагглютинина, б) пандемический штамм A(HlNl)v, антигенно родственный вирусу гриппа свиней, в) вирусы гриппа птиц A(H5N2, H7N7), реассортантные штаммы A(H5N1), A(H5N2).

2. Оценить влияние различных факторов (температурного, временного воздействия, систем культивирования и степень очистки вирусов) на иммобилизацию вирусов гриппа на сорбенты.

3. Исследовать взаимодействия вирусов полиомиелита вакцинного штамма Сэбина типа 1 с сорбентами.

4. Изучить сорбцию бактериофага T4D на сорбенты из различных растворов и воды.

5. Установить возможность использования выбранных сорбентов для удаления белков невирусной природы из растворов.

Научная новизна работы

Получены приоритетные данные о возможности современных материалов-углеродных соединений, ПАна и композитов на его основе, обладающих различной структурой и физико-химическими свойствами, удалять из жидкостей вирусы человека и птиц и бактерий, а также белки невирусной природы.

Впервые показано, что вирусы гриппа человека и птиц, вакцинный штамм вируса полиомиелита типа 1, бактериофаг Т4Б, бычий сывороточный альбумин, белки аллантоисной жидкости КЭ способны сорбироваться па ультрадисперсный углсродсодержагций сорбент (УДУС).

Впервые установлено, что полимерные наноразмсрные комплексы производных ПАн, синтезированные с помощью низкомолекулярных и высокомолекулярных кислот, взаимодействуют с белками: вирусов гриппа человека типа А и В, пандемического штамма А(НШ1)у подобного свиному, вирусов гриппа птиц, вакцинного штамма вируса полиомиелита типа 1, бактериофага Т4Б; бычьего сывороточного альбумина, аллантоисной жидкости КЭ и белками сыворотки крови. Углеродные нанотрубки и композиты ПАна с углеродными нанотрубками обладают способностью сорбировать из растворов и воды вирусы гриппа человека, птиц и колифага Т4Б.

Показано, что иммуносорбенты - комплексы, образованные из вирусов гриппа с сорбентами: УДУСом, основанием ПАна, обладают способностью удалять антитела из растворов.

Практическая значимость работы

Данные по сорбции вирусов гриппа из растворов на УДУС и производные ПАна были положены в основу при составлении патентов РФ № 2329505, 2007г., и №2372951, 2007г. Разработанный метод может быть рекомендован для деконтаминации растворов, резервуаров, зараженных различными вирусами, в том числе вирусами гриппа птиц. Это особенно важно, поскольку в последние годы участились случае передачи вируса гриппа А от птиц к людям в районах близкого контакта птиц с человеком, и появилась возможность возникновения нового пандемического штамма, а с другой стороны вирус гриппа подобный вирусу гриппа свиней уже вызвал в 2009г. согласно ВОЗ, пандемию (http://www.who.int/csr/diseases/swinefluenza/index.html).

Полученные данные по сорбции вирусов на сорбенты - производные ПАна, композиты ПАпа с углеродными трубками могут применяться в качестве материалов для фильтров, а также для определения спектра антител в иммунных сыворотках при диагностических исследованиях. С учетом уникальных физико-химических свойств ПАна (проводимостью, электрохромизмом, инертностью), экономичностью (дешевизной сырья), производные ПАн могут быть использованы при разработках детекторов на вирусы или на комплексы вирусов с антителами для экспресс - диагностики вирусных инфекций.

Апробация работы

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: Международной конференции по зооантропонозам (Ульяновск, 2006г.); Европейской конференции «Инфекционные болезни и болезни пищеварительного тракта» (Париж, Франция, 2006г.); Международной конференции по оптическим зондам я-коньюгированных полимеров и функциональным самосборкам (Турку, Финляндия, 2007г.), IV Российско-французском симпозиуме в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Москва, 2007г.), X международном симпозиуме по респираторным вирусным инфекциям (Сингапур, 2008г.), Первой международной конференции «Нано -2008» (Минск, Беларусь, 2008г.), 3-ей Европейской конференции по гриппу (Виламора, Португалия, 2008г.)., Пятом международном конгрессе «Биотехнология: состояние перспективы развития», (Москва, 2009г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», (Москва, 2009г.), 2-х Конференциях молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, (Москва 2008г, 2009г.), 2-х Международных форумах по нанотехнологиям «Роснанотех», Москва, 3-5 декабря 2008г. и 6-8 октября 2009г; Московской конференции - конкурсе молодых ученых, аспирантов и студентов «ФИЗИКОХИМИЯ-2009», Москва, 6-8 октября 2009г.

Публикации

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Курочкина, Янина Евгеньевна

Основные результаты получены в соавторстве с д.м.н. Е.И. Бурцевой, с.н.с. Т.А. Оскерко, д.м.н. H.H. Носиком, д.б.н. A.A. Маныкиным, (Учреждение Российской Академии Медицинских наук Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН), д.х.н. Ивановым В.Ф. (Учреждение Российской Академии наук институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина, РАН), н.с. Тимофеевой A.B. (Институте физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова), д.ф.-м.н. Буравцевым В.Н. (Учреждение Российской Академии Наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН) к.б.н. М.М. Шнейдером (Учреждение Российской Академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Автор глубоко благодарен за постоянное внимание и ценные консультации при выполнении работы к.м.н. А.Л. Беляеву, а также другим коллегам за моральную поддержку во время выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была посвящена разработке различных подходов в изучении взаимодействия вирусов с разными сорбентами, в зависимости от их размеров, структуры, физико-химических и биологических свойств. Объектами нашей работы являлись следующие вирусные модели: вирусы гриппа человека и птиц, вирусы полиомиелита и бактериофаги.

В результате проведенных исследований было установлено, что углеродный материал - УДУС, разные формы полианилина и нанокомпозиты на его основе могут сорбировать из воды и растворов вирусы гриппа человека, независимо от антигенной структуры, вирусы гриппа птиц, пандемический штамм A(HlNl)v подобный свиному, а также вирусы полиомиелита и бактериофаги.

Наиболее перспективным по совокупности всех характеристик при производстве фильтров является основание полианилипа. Степень сорбции у данного сорбента была выше, чем у всех остальных. Он не оказывал цитотоксического действия на клетки Vero и MDCK. И что особенно важно для практического применения цена на его производство является достаточно низкой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курочкина, Янина Евгеньевна, Москва

1. Андреев С.М., Бабахип A.A. Анализ иммунологической активности фуллерена//Международиый форум по нанотехнологиям.- 2008.-е. 300.

2. Беляев A.JL, Слепушкин А.Н., Полиомиелит и др. энтеровирусные инфекции//Рэт-инфо.-2004.-№1.- с.32-34.

3. Беляков В.Д., Дегтярев A.A., Иванников Ю.Г. Качество и эффективность противоэпидемических мероприятий.//!!., 1981.-е. 130-131.

4. Бондарь B.C., Пузырь А.П., Пуртов К.В., Могильная O.A., Дегерменджи А.Г., Гительзон И.И. Наноалмазы с оригинальными свойствами: применение в биологии и медицине//Международный форум по нанотехнологиям.-2008.-т. 2.-е. 90-91.

5. Буравцев В.Н. Сорбент на основе ультрадисперсного графита для дезинтоксикации и стерилизации жидких или газообразных сред и способ его получения.-патент РФ2327517.-2008.

6. Валиев Р.З., Добаткин С.В.Объемные наноструктурные материалы для перспективных применений в технике и медицине// Международный форум по нанотехнологиям.-2008.- т. 1.-е. 19.

7. Витязь П.А. Наноматериалы и нанотехнологии: достижения и проблемы // Наноструктурные материалы.- 2008.-е. 9-10.

8. Гайдамович С.Я. Классификация вирусов.//В кн.: Общая и частная вирусология.- М. Медицина.-1982.-е. 26-60.

9. Гамбарян A.C. Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяев//Автореферат докторской диссертации.-2007.-Москва.

10. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: предположения и факты//Журнал микробиол.- 2008.-№5.-с. 109-118.

11. Гинзбург С.Э. и др. //в кн. Комплексное лечение полиомиелита у детей.-1959.-C.24-27.

12. Глушкова A.B., Радилов A.C., Рембовский P.C. Нанотехнологии и нанотоксикология взгляд на проблему/Популярные нанотехнологии.-2009.

13. Головач О.С., Махонин И.К., Фесенко A.B., Щербаков В.А., Чебышев A.B. Модифицированный графит и способ его получения// патент РФ.-2003.

14. Гринбаум Е.Б., Литвинова О.М., Банников А.И. и др. Полиморфизм популяции современных вирусов гриппа А и В человека//Вестник РАМН.-1994.-№9.-0.36-41.

15. Гурвич А.Е. Использование целлюлозных матриц в иммунохимии// Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии.-1987.-с.5-22.

16. Доскина Т.В., Дмитриева P.A. Контроль вирусного загрязнения водных объектов//РЭТ-инфо.-2005.-№3.-с.40-41.

17. Дьячков П.Н. в кн. «Углеродные нанотрубки: строение, свойства, примепение».-М.- 2008.- с. 5-121.

18. Ефременко В.И., Львов Д.К., Дерябин П.Г.и др. Экспериментальные данные по выявлению вирусов гриппа птиц с помощью магнитных иммуносорбентов // Вопр. вирусол. -2008.- №3 -с.43-45.

19. Закстельская Л.Я., Шендерович С.Ф. Использование иммуносорбента для удаления противогриппозных тел из диагностических сывороток.// Лабораторное дело,- 1979. -№12,- С. 748-749.

20. Занько Н.Г., Ретнев В.М. в кн. «Медико-биологические основы безопасности жизнедеятельности».- M.-2004.-C.48.

21. Злобин В.И. Полиомиелит в кн. «Медицинская вирусология».-М.- 2008.-е. 257-361.

22. Золотухин И.В. Углеродные нанотрубки//Соросовский образоват. журнал.-1999.-№3.-с.111-113.

23. Иванов В.Ф. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук.-Структура ми свойства полианилина и интерполимерных комплексов на его основе.-2007.

24. Иванов В.Ф., Грибкова О.Л., Чеберяко К.В. и др. Матричный синтез полианилина в присутствии поли- (2-акриламидо-2-2метил-1-пропан)-сульфовой кислоты//Электрохимия.- 2004.- т.40.-№3.-с. 339-345.

25. Иванов В.Ф., Иванова В.Т., Томилин М.Г. и др. Ракутина (Матюшина), A.A. Исакова, М.Ю. Яблоков. Оптический метод диагностики вирусов гриппа на основе нематических жидких кристаллов// Оптический журнал.- 2006.-т. 73.-№8.- с.90-92.

26. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н. и др. Характеристика эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2), циркулировавших в эпидемическом сезоне 2003-2004 гг. в России// Вопросы вирусологии.-2006.- №1.-с.19-32.

27. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н.и др. Особенности вирусов гриппа, обусловивших эпидемический подъем заболеваемости в России в 2002-2003 гг. Возврат в циркуляцию вирусов гриппа, подобных В/Виктория/2/87// Вопросы вирусологии.-2004.-№3.-с.12.

28. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А. и др. Изменчивость и особенности распространения вируса гриппа A(H1N1) в период 19901998гг. Вопр. вирусол. 2000, N 5, стр. 18-22.

29. Катруха Г.С., Тимофеева A.B., Буравцев В.Н., Толстых И.В., Баратова JI.A. Изучение сорбции антибиотиков-гликопептидов на ультрадисперсном графите УДУС//Биотехнология: состояние и перспективы.-2009.- т. 1.-е. 146.

30. Киселев О. И., Л.Б. Пиотровский. НаноМедицина: ближайшие перспективы. //Международный форум по нанотехнологиям.-2008.- т.2, с. 152.

31. Колобухина JI.B., Львов Д.К., Бурцева Е.И. Грипп//в кн. Медицинская вирусология.-2008.-с.З 83-387.

32. Ленинджер А. //Биохимия. -М.: Мир.-1974.-с.68.

33. Литвинова О.М, Юхнова Л. Г., Родионова В.Б. и др. Характеристика вирусов гриппа A/H1N1 1997-1998гг выделения// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями.-1998.-С.-П.-с.39.

34. Литвинова О.М., Лузянина Т.Я. Этиология гриппа, //в кн.: Грипп. С.-П., 2001, стр.7-31.

35. Луфтулин М.А., Шорникова О.Н., Авдеев В.В. Сорбционные свойства пенографита, модифицированного соединениями железа //Сбор. Тезисов 2-ой международной Конференции научных работ молодых ученых в области нанотехнологии.-2009.-с.430.

36. Львов Д.К. Рождение и становление вирусологии, //в кн. Медицинская вирусология.-2008.-с.16-17.

37. Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т. и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России в 1979-2002гг. //Вопросы вирусологии.-2004.-№3.- с.17-24.

38. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа.//Методические указания МУЗ .3.2.175 8-03 .-М.-2005.

39. Мукомоков С.А., Плотникова В.А., Жебрун А.Б., Вербов В.Н., Колобов A.A., Кампо-Немм Е.А., Шпень В.Н. Иммуносорбеит для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита «С» в сыворотке крови. Патент РФ № 2095814.-1997.

40. Носик Д.Н., Носик H.H., Лялина И.К., Калпина Л.Б., Кондрашина Н.Г., Раснецов Л.Д., Антиретровирусный препарат и аптигерпетический препарат на основе фуллерена//Роснанотех.-2008.- с.326.

41. Носик H.H., Львов Д.К. Пикорнавирусы (Picornaviridae) //в кн. Медицинская вирусология.-2008.с. 189-195.

42. Носик H.H., Носик Д.Н. Вирусные инфекции и дезинфекция. // РЭТ — инфо.-2006.-№.- с.13-15.

43. Носик H.H., Носик Д.Н., Дерябин П.Г., Желтухин СЛ. Вопросы биобезопасности и вирулицидные свойства дезинфицирующих средств.// «Дезинфекционное дело».- М.-2006.-№3.- с. 33-38.

44. Осин Н.С., Помелова В.Г., Ларичева С.Ю. Способ получения твердофазного носителя для иммупоапализа.-патент РФ №2095815.-2001.

45. Плиева Ф.М., Исаева Е.И., Лозинский В.И. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии.VI. Биоафинные сорбенты на основе сверхмакропористого носителя для работы с вирусными частицами//«Биотехнология».-1998.- №5.- с. 3237.

46. Радилов A.C., Глушкова A.B., Дулов С.А. Методические подходы к оценке токсичности и опасности наноматериалов.-//Международный форум по нанотехнологиям.-2008.-с. 685-686.

47. Ровнова З.И. Получение специфических противогриппозных сывороток «Вопросы вирусологии», 1959, №4, с.465-470.

48. Рыбинская Л.Н., Мельник A.B., Митченко В.П. К вопросу о механизме сорбции вирусов гриппа на анионообменных смолах // Микробиол. журнал.-1982- Т.44, №3.-с.41-46.

49. СанПиН 2.1.4.1074-01.Гигиенические требования и нормативы качества питьевой воды.-2001.

50. Сидоренко В.Г, Коваленко Б.М, Тульский В.Ф., Мерициди И.А. Применение сорбента СТРГ для очистки водной поверхности от разливов нефти, нефтепродуктов, жиров и различных водонерастворимых органических соединений. //Нефтепромысловое дело.-2002.- №12 с.

51. Слепушкин А.Н., Иванова В.Т., Бурцева Е.И. и др. Характеристика эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H3N2) 1997-1999гг. изоляции. Вирус А/Москва/10/99 кандидат в вакцинный штамм.//Вопросы вирусологии.-2000.-№4.-с.22-24.

52. Смирнов Ю.А. Молекулярно-биологическое действие ультрафиолета на РНК-содержащие вирусы, автореферат докторской диссертации,-1993.-Москва.

53. Стейниер Р., Эдельберг Э. и Иигрэм Дж. //в кн. Мир микробов.- 1979.-т. 2.-е. 165.

54. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии.- М.-1958.

55. Тимофеева A.B., Буравцев В.Н, Галатенко O.A., Тостых И.В., Терехова Л.П., Николаев A.B., Баратова Л.А., Катруха Г.С.// Изучение сорбции антибиотиков-гликопептидов на ультрадисперсном углеродном сорбенте.-Биотехнология.-2010.-№2.-в печати.

56. Ткачук В.А., Ширинский В.П., Парфенова Е.В. Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических средств в клетки и их органеллы.-//Международный форум по нанотехнологиям.-2008.- с.259.

57. Тремблэй М. Э., Фиштер С.Г, Колеас Д.Й. Способ удаления патогенов наноразмера из жидкостей.-патент.-№19856.-2004.

58. Филатов С.А., Долгих M.Ii., Кучинский Г.С., Ахремкова Г.С., Гункевич A.B., Жданок Е.В. Сорбционные свойства активированных углеродных наноматериалов, //Наноструктурные материалы.-2008.-С.705-706.

59. Фролов А.Ф., Чаплинская С.М., Белякова Е.М., Медведев И.Н. Исследование влияния ионной формы катионита па сорбцию вируса гриппа//«Микробиологический журнал».- 1980.-т.2.-№ 5.- с.422.

60. Химическая энциклопедия, М.- 1998.- Т.- с. 568.

61. Шадрин A.C., Карпухин Г.И. Эпидемиология гриппа. В кн.: Грипп. С.-П., 2001.- с.31-68.

62. Шахильдян И.В., Львов Д.К. Гепатит А. //в кн. «Медицинская вирусология».-2008.-С.369-372.

63. Шлегель Г.// Общая микробиология.-М.-1987.- с. 142.

64. Шляхто Е.В. Нанотехнологии в биологии и медицине.-//Международный форум по нанотехнологиям.- 2008.-c.306.

65. Шорникова О.Н., Коган Б.В., Сорокина Н.Е., Авдеев В.В. Пенографит-высокооффективный сорбент.-//Международный форум по нанотехнологиям.-2008.- с.581.

66. Энциклопедический словарь медицинских терминов.-1982.- т.1.- с.409.

67. Яворовский В.Н., Шиян Л.Н., Савельев Г.Г., Галанов А.И. Возможность использования волокнистого наноразмерного ALOOH в технологиях очистки воды.- //Международный форум по нанотехнологиям.-2008.- с.555.

68. Ягудаева Е.Ю., Муйдинов М.Р., Капустин Д.В., Зубов В.П.// Известия Российской академии наук. Серия химическая.-2007.-№7.

69. Air G.M., Gibbs A.J., Laver W.G., Webster R.G. Evolutionary changes in influenza B are not primary governed by antibody selection. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1990, N 87, p.3884-3888.

70. Allen H.J., Mc.Cauley, Waterfields M., Gething M.J. Influenza virus RNA segment 7 has the coding capacity for two polypeptides.// Virology. 1980.- N 107.- p.438-442.

71. Andrewes C.H., Laidlow P.P., Smith W. Influenza: observation on the recovery of virus from man and antibody contact of human sera.//Br J.Exp.Med.-1935.-17.-p.579-581.

72. Baughman R.H., Cui C., Zakhidov A.A., Iqbal Z., Barisci J. N., Spinks G. M., Wallace G.G., Mazzoldi A., De Rossi D., Rinzler A.G., Jaschinski O., Roth S., Kertesz M. Carbon Nanotube Actuators//Science.- 1999.-v.-284.-N. 5418.-p. 13401344.

73. Berton M.T., Webster R.G. The antigenic structure of the influenza B virus hemagglutinin: Operation and topological mapping with monoclonal antibodies.//Virology.-1985.-№ 143.- p.583-594.

74. Bidez R., Li S., MacDiarmid A.G. et al //Biomater.Sci.Polymer.Edn.2006.-V.17.-N 1-2.-P.212.

75. Bucher D.J., Kilbourne E.D. A2 (N2) neuraminidase of the X-7 influenza virus recombinant: determination of molecula size and composition of the active unit. J.Virol. 1972, N 10, p.60-66.

76. Buckler-White A.J., Murphy B.R. Nucleoproteine sequence analysis of nucleoprotein genes of an avian and a human virus strain identifies two classes of nucleoproteins. //Virology.- 1986- №155.- p. 345-355.

77. Burmeister W.P., Ruigrok R., Cusak S. The 2.2 Ao resolution crystal structure of influenza B neuraminidase and its complex with sialic acid. //EMBO.- 1992.-№ 11.- p.49-56.

78. Cao Y., Andreatta A., Heeger A. J., Smith P. Influence of chemical polymerization conditios on the properties of polyaniline //«Polymer».- 1989.- V.30.- N.12.-p.2305-2311.

79. Castrucci M.R, Donatelli I., Sidoli L., Kawaoka Y., Webster R.G. Genetic reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs //Virology.-1993.-193.-p.503-506.

80. Castrucci M.R., Kawaoka Y. Biologic importance of neuramidase stalk length in influenza A virus //J. Virol.- 1993.- v.61.- №2.- p.759-764.

81. Caton A.C., Browelee G.C., Yevvbell J.W. et al. The antigenic structure of the A/PR/8/34 hemagglutinin HI subtype virus. Cell. 1982, v.31, p.417-427.

82. Chandra S., Singh R., Singh H., Narula A.K., Broor S., Conducting polymer membrane and a process for the preparation of the same membrane, patent USA 6156202.-1999.

83. Choppin P.W., Schild A. The role of viral glycoproteine in adsorption, penetration and pathogenicity of viruses. Rev. Infect. Diseases. 1980; v.2, N 1, p.40-61.

84. Clark K.J, Sarr A.B et al. In vitro studies on the use of clay, clay minerals and charcoal to adsorb bovine rotavirus and bovine coronavirus//Vet. Microbiol. -1998.- v.63 (2-4).- p.137-146.

85. Colman P.M. Neuraminidase: enzyme and antigen.1989,p.175-210. In M.K.Krug (ed).The influenza virus. Plenum Press. New York.

86. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. //J.Virol.- 1972.-№10.- p.795-900.

87. Cox N.J., Bender C.A. The molecular epidemiology of influenza viruses. Seminars in Virology. 1995, v.6, p.359-370.

88. Davies H.W., Appleyard G., Cunningham P. et al. The use of continuous cell line for the isolation of influenza virus. Bull. WHO. 1978, v.56, p.5519-5524.

89. Dawood F.S., Finelli L., Shaw M.W., Lindstorm S. et al //New England journal of medicine. (N Engl J Med) Emergence of a novel Swine-Origin Influenza A(H1N1) virus in humans.-2009.-p. 1-10.

90. Ellis J.S., Alvarez-Aguero A., Zambon M.C. Impact of influenza A(H1N2) viruses isolated during the 2002-02 influenza season in the United Kingdom//The first European Influenza Conference St.-Julians.-Maita.-2002.- p.48.

91. Els M.C., Air G.M., Murti K.G.et al .An 18 amino acid deletion in influenza neuraminidase. //Virology 1985.-142.- №2.- p.241-247.

92. Field S., Winter G., Wraunlee G.C. Structure of the neuraminidase gene in human influenza virus A/PR/8/34. //Nature. 1981,- v.290.- p.213-217.

93. Gorman O.T., Bean W.J., Webster R.G. Evolutionary process in Influenza viruses: Divergence, Rapid Evolution and Stasis. Current topics in Microbiology and Immunology.-1992.-v.176.- p.75-97.

94. Gribkova O.L., Meshkov G.B., Ivanov V.F., Nekrasov A.A., Isakova A.A., Vannikov A.V., Yaminsky I.V. Nanoobjects of interpoiymer complexes of polyaniline and PAMPSA in aqueous solutions// J. Phys.: Conf. Ser. 61.- p. 359363.

95. Hogue B.G., Nayalc D.P. Synthesis and processing of the Influenza virus neuraminidase a type II transmembrane glycoprotein. //Virology.- 1992.-v.188.- p.510-517.

96. Iijima S. Helical microtubules of graphitic carbon. //Nature.-1991.-V.3 54- p.56-58.

97. Ishida M., Oya A. et al. The possible origion of I-I1N1 (Hswl N1) virus in the swine population of Japan and antigenic analysis of the isolates// J. Gen. Virol. -1982.-62.-p.171-175.

98. Ito T., Gorman O.T., Kavaoka Y., Bean W.J., Webster R.G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the Ml and M2 protein.// J. Virol. -1991.- v.65.- № 10.- p.5491-5498.

99. Ivanova V., Butrseva E., Hay A., Oskerko T., Slepushlcin A. Reemergence of Influenza A(H1N1) virus and its spread in Russia during the years 1995-1998.// Xl-the International Congress of Virology. Abstract book.- 1999.-p.262.

100. Kavakami K., Ishihsha A., Hamaguchi M. RNA polymerase of Influenza virus comparisson of the virion associated RNA polymerase activity of various strains of Influenza virus.// J. Biochem.-1981.- v.89.- p.1751-1757.

101. Khatchikian D., Orlich M., Rott R. Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the hemagglutinin gene of an influenza virus. //Nature.- 1989.-v.340.- p.156-157.

102. Klein C., Hurlbut S., Jr. Manual of Mineralogy: after Dana 20th ed.-1985.-p.135.

103. Klenlc H.D., Carten W., Bosch F.X., Rott R. Virol, glycoproteins as determinents of pathogenicity.//Med.microbiol. and immunol. -1982.-v.l70.-№3.-p.145-153.

104. Koopmans M., Wilbrink B., Conyn M., et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands. Lancet 2004; 363:587-593.

105. Kratschmer W., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Huffman D.R.// Nature.- V.347.-№354.- 1990.-p.1321.

106. Krug R.M., Alonso-Cazlin F.X., Julkenen I., Katz M.C. Expression and replication of the influenza virus genome. //The influenza viruses. Plenum Press, New York. 1988.-p.89-132.

107. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v.227, p.680-685.

108. Lamb R.A., Zebedee L.S., Richardson C.D. Influenza virus protein in an integral membrane protein expressed on the infected cell surface. //Cell.- 1989.-v.40.-p.627-633.

109. Laver W.G., Valentine R.G. Morphology of the isolated hemagglutinin and neuraminidase subunits of influenza virus. //Virology.- 1969.- v.38.- p.105-119.

110. Lazarowitz S.G., Compans R.W., Choppin P.W. Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes. //Virology.- 1979.- v.46.- p.830-843.

111. Leiser, Robert-Matthias, Plobner L., Yaroshevskaya E.M., Zubov V.P., Kapustin D.V., Yagudaeva E. .T. Use of a composite polymer-coated sorbent for separation, purification, desalting and concentration of biopolymers.-patent US.- N7018538.-2004.

112. Li S., Shulman J., Itamaurra S., Palese P. Glycosylation of neuraminidase determines the neuraminidase determines the neuravirulence of influenza A/WSN/33 virus.// J. Virol.- 1993.- v. 67.- №11.- p.6667-6673.

113. Li. D., Wang W.; Wang H. Jia, Xue-Shun; Wang, Jin-Ye. Polyaniline films with nanostructure used as neural probe coating surfaces// Applied surface science.- 2008.- v. 255. -Issue 2.- p.583-584.

114. Lin Y.P., Shaw M., Gregory V. et al. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses. Relationship between H9N2 and H5N1 human isolated. PNAS. 2000.-v.97.- №17.-p.9654-9658.

115. Liu C., Elhelberger M.C., Compans R.W., Air G.M. Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly or budding. //J. Virol.- 1995.- v.69.- №2.- p.1099-1100.

116. Long R.Q., Yang R.T. Carbon nanotubes as sorbent for dioxin removal. //J. Am.Chem.Soc.-2001.- v.123.- p.2058.

117. Lowry O.K., Rosebrough N.J., Faff A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin phenol reagent. J. Biol. Chcm. 1951, v. 193, p.265-267.

118. Luo G., Chung J., Palese P. Alteration of the stalk of influenza virus neuraminidase deletion and insertions. Virus Research.- 1993.-v. 29.- p. 141153.

119. Lvov D.K., Yamnikova S.S., Petrov N.A., Kawaoka Y., Webster R.G. Vatiety of influenza viruses isolated from atypical situations. //Option for the control of Influenza II, Excepta Medica, eds. C.Hannoun et al. 1993.- p.208-216.

120. Marusel N. Serological characteristics of a "new" serotype of influenza A virus the Hong Kong strain.- P. Bull.//WHO.-1969.-41.-p.461-468.

121. McKeon K.D., Lewis A., Freeman J. W. Electrospun Poly(D,L-lactide) and PolyanilineScaffoId Characterization// Wiley InterScience.- 2009.-www.interscience.wiley.com

122. Mir-Shekary S.Y., Asford D.A., Arvey D.J., Dwelc R.A., Shulze I. The glycosylation of the influenza A virus hemagglutinin by mammalian cell-a site specific study. J.Biol.Chem.-1997.-v.272.-p.4027-4036.

123. MMWR. Cases of Influenza A(H5N1) Thailand.-2004.-v.53.-№5.-p.l00-103.

124. MMWR. Outbreaks of Avian Influenza A(H5N1) in Asia and Interim recommendations for Evaluation and Reporting of Suspected Cases United States. 2002.- 2004.- v.53.-№5.-p.97-100.

125. MMWR. Outbreaks of Avian Influenza A(H5N1) in Asia and Interim recommendations for Evaluation and Reporting of Suspected Cases United States 2002. 2004,- v.53.-№5.-p.97-100.

126. Nakagawa Y., ICimuro N., Toyoda T., Mizumoto K. et al. The RNA PB2 subunit is not required for replication of the influenza virus genome, but is involved in capped mRNA synthesis.// J. Virol.- 1995.-v.69.- №2.-p.728-733.

127. Nakamura K., Compans R.W. Effect of glucosamine 2 deoxyglucose and tunicanycin on glycosilation, sulfation and assembly of Influenza viral protein.//Virology.-1978.-a,84.-№2.- p.303-319.

128. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potenthial of swine -origine H1N1 influenza virus.-Reviews.//Nature.-2009.-v.459.p.

129. Onoda M., Kato Y., Shonaka H., Tada K. Artificial musclc using conducting polymers.// Electrical Engineering in Japan.-2004.-V.149.-I.4.-p.7-13.

130. Osterhaus A., Openshaw P., Monto A. Influenza A(I-IINI) pandemic: the right steps were taken. Science-based arguments to support this statement.//ESWI.-2010.-p.l-16.

131. Pallansch M.A., Roos R.P. Enteroviruses: polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses, and newer enteroviruses. //In: Knippc D.M., Iiowley P.M., eds.Fields Virology. 5th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams and Wilkins.-2007.

132. Pingali S.V., Niu Z., Bruckman M.A., Li S., Lee A.L., Lee B., Wang Q., Thiyagarajan P. Pos Tobacco Mosaic Virus Assembly of Fibrous and Macroscopic Bundled Arrays Mediated by Surface Aniline Polymerization// Biophysical Journal.-2008.-V.94.- p.376-381

133. Porter A.G., Smith J.C., Emtage J.S. The sequence of influenza virus RNA segment 8 indicates that the coding regions for the NS1 and NS2 protein overlap. PNAS USA.-1980.-v.77.-p.5074-5078.

134. Pouget J.P., M.E. Jozefowicz, A.J. Epstein, X.Tang, A.G. //MacDiarmid X-ray structure of polyaniline.-Macromolecules.-1991.- 24.- p.779-789.

135. Rohm C., Zhou N., Suss J., Mackenzie J., Webster R. Characterization of novel influenza hemagglutinin HI5, criteria for determination of influenza A subtypes. //Virology.-1996.-V.217,- p.508-516.

136. Rota P.A., Hemphill M.L., Whistler Ii.L., Regnery H.L., Kendal A.P. Antigenic and genetic characterization of two hemagglutinins recent cocirculating strains of influenza type B virus.// J. Gen. Virol.-1992.- v.73.- p.2737-2742.

137. Sapurina I.Yu. M.E. Kompan, A. G. Zabrodskii, J. Stejskal, and M. Trchova. Nanocomposites with Mixed Electronic and Protonic Conduction for Electrocatalysis. //Russian Journal of Electrochemistry.-2007.-V. 43.-№5.- p.528-536.

138. Schreyer IT.B, N. Gebhart, K.J. Kim, M. Shahinpoor. Electrical Activation of Artificial Muscles Containing Polyacrilonitrile gel fibers. //Biomacromolecules.-2000.-p.642-647.

139. Schulze I.T. Effect of glycosylation of influenza virus gemagglutinin.//J.of Infection Disiases.-1997.- v.l76.-p.24-28.

140. Schulze I.T., Fitch W.M., Ludwig S. Evolution of pig influenza viruses.//Virology.-1991 .-V. 183.-p.61-73.

141. Shtyrya Y., Mochalova L., Rudneva I., Shilov A., Kaverin N., Bovin N. Adjustment of receptor-binding and neuraminidase substrate specificities in avian-human reassortant influenza viruses.//Glycoconj J. 26.- 2009.- p.99-109.

142. Skehel J.J., Waterfields M.D. Studies on the primary structure of the influenza virus hemagglutinin.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1975.- V.72.-N 1.- p.93-97.

143. Smirnov Y.A. et al. Effect of UV-irradiation on rotavirus // Acta viral.-1991.-V.35.-Nl.-p.l-6.

144. Smirnov Yu.A., Kuznetsova M.A., Kaverin N.V. The genetic aspects of Influenza virus filamentous particle formation.// Arch. Virol.-1991.-v.l 18.-p.279-284.

145. Somik B., Saikia J.P., Kumar A., Konwar B.K.// Antioxidant activity and haemolysisprevention efficiency of polyanilinenanofIbers.//Nanotechnology.-2010.-21.-p.l-8.

146. Steinhauser D.A., Holland J.J. Rapid evolution of RNA viruses. Ann Rev.Microbiol. 1987, v.41, p.409-43.

147. Ulmanen I., Broni B., Krug R.M. Role of two of the influenza virus core proteins in recognizing virus RNA transorphion PNAS USA.-1981.-v.78.-p.7355-7359.

148. Update: Novel influenza A(H1N1) virus infections worldwide, May 6, 2009.//CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR).-2009.-Vol.58.-N.17.-p.453-457.

149. Update: Swine A(H1N1) infection in two children southern California. MarchApril 2009.//CDC. (MMWR).-2009.-Vol.58.-N.17.-p.400-402.

150. Van Wyke K.L., Jewcell J.W., Reck L.J. et al. Antigenic characterization of influenza A matrix protein with monoclonal antibodies.// J. Gen. Virol.-1984.-v.49.-p.248-252.

151. Varghese J.N., Laver W.G., Golman P.M. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature. 1983, v.303, N 5912, p.35-40.

152. Ward C.W., Dopheide T.A. Primary structure of the Hong Kong H3 hemagglutinin.// Brit. Med. Bull.-1979.-v.35.- №1.- p.51-56.

153. Webster R., Guan Y., Peiris M., Chen H. H5N1 Influenza continues to circulate and change.//Microbe.-vol.1.- N 12.-2006.-p.559-565.

154. Webster R.G., Bean W.J., Corman O.T., Chambers T.H., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. //Microbiol. Rev.- 1992.- v.56.-p.152-179.

155. Weekly Epidemiological Record (WER). Recommendations for the composition of Influenza virus vaccines. 1997.-v.72.-№9.- p.58.

156. WER. Recommendations for the composition of Influenza virus vaccines.2000,- v.75.-№41.-p.329-336.

157. WER. Influenza. 2002.-v.77.-№49.-p.417; №46.-p.381-384; №10.-p.77-80.

158. WER. Influenza. 2006.-v.78.-№10.-p.l29-136; №1 l.-p.l69 -180, p.181-188.

159. WER. Influenza. 2007.-v.79.-№8.-p.77- 83; №9.-p.85-92; №10.-p.93-100.

160. WER., Influenza. 2009.-v.84, 47.-p. 485-492.

161. WHO: http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/en/index.html.

162. WHO: http://www.who.int/csr/disease/swinefluenza/index.html.

163. Wiley D.C, Fields B.N. Viral membranes// Fields Virology.-1990-vol.l.-p.63-85.

164. Wiley D.C., Skehel J.J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.//Annual Revier of Biochemistry. 1987.- v.56.- p.365-394.

165. Wiley D.C., Wilson I.A., Skehel J.J. Structural identification of the antibody -binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and twir involvement in antigenic variation. //Nature.-1981.-v.289.- p.373-378.

166. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of hemagglutinin membrain glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. //Nature.-London. -1981.-v.289.- p.365-373.

167. Wong S.S., Yuen K.Y. Avian Influenza virus infection in humans. //Chest.-2006.- 129.-p. 156-168.

168. Xu X., Guo Y., Rota P., Hemphill M., Kendal A., Cox N. Genetic reassortment of human influenza virus in nature.// Options for the Control of Influenza II.-1993.- p.203-207.

169. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda T., Ishihama A. Molecular assem by of Influenza virus association of the NS2 protein with virion matrix. //J. Virol.-1993.- v. 196.-p.249-255.

170. Ye Z., Pal R., Fox J.W., Wagner R.R. Functional and antigenic domains of the matrix (Ml) protein of influenza A virus.// J.Virol.-1987.-61.-p.239-246.

171. Zadorozhnaia V. I. The sorption of poliovirus type 2 by a carbon sorbent/ZMikrobiol. J.- 1996.- v.58(3).- p.83-87.

172. Zamarin D., Garcia-Sastre A., et al .// Influenza virus PB1-F2 proteins induces cell death through mitochondrial ANT3 and VDACI // PloS Pathog.-2005.-l.-p.4.

Информация о работе

Курочкина, Янина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Взаимодействие вирусов с микро- и наноразмерными сорбентами различной природы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы