Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунопатологических реакций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунопатологических реакций"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ сРОСТОВСКИЙ-НА-ДОНУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КОЗЛОВСКИЙ ВИКТОР НИКОЛАЕВИЧ

ЖИВЫЕ ТУЛЯРЕМИЙНАЯ И БРУЦЕЛЛЕЗНАЯ ВАКЦИНЫ КАК ИНДУКТОРЫ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

ОЗ. 00.07 - микробиология 14.Я0.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ростов-на-Дону, 1997

На правах рукописи

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном науч но-исследовательском противочумном институте.

Научные консультанты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских на ук, профессор, академик АЕ РФ Ломов В.М

доктор медицинских наук, старший научный сотрудни

Васильева Г.И

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАТН,

Адамов А.К.

доктор медицинских наук, профессор Сизякина Л.Л

доктор медицинских наук, старший научный сотрудни

Рьшко И.Б

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский противочумнь институт "Микроб"'

Защита состоится 23 октября 1997 г. в 14 часов на заседав диссертационного совета Д 084. 53.01 при Ростовском государстве} ном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, Нахич£ ванский пер., 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовско1 государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " " ССЛ^^^ьЛ^ 5997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доцент ■ Н. Я. КОРГАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. До настоящего времени туляремия и бруцеллез остаются в числе заболеваний, представляющих серьезную опасность для человека и животных. Широкое распространение природных очагов этих инфекций, постоянная активность эпизоотии, захватывающих обширные территории с животноводческой ориентацией, устойчивость возбудителей во внешней среде, тяжесть клинических проявлений вызываемых ими у человека заболеваний, высокий процент случаев инвалидности среди больных и отсутствие полноценной иммунной защиты вакцинированных контингентов обусловливают необходимость изучения механизмов иммуногенеза при туляремии и бруцеллезе. Определение механизмов формирования иммунного ответа и причин нарушения функционирования иммунной системы должно способствовать усовершенствованию специфической профилактики и оптимизации терапии с помощью адекватной иммунокоррекции фармакологическими препаратами. Имеющиеся на сегодняшний день препараты для профилактической вакцинации людей, с одной стороны, как в случае туляремии, не позволяют добиться стопроцентной невосприимчивости вакцинируемых не только к заражению высоковирулентными штаммами американского подвида, но и к заражению штаммами F. tularensis, распространенными в природных очагах России, особенно при аэрогенном пути инфицирования (Олсуфьев Н.Г., 1975; Павлович Н.В., 1993; Anthony L.S.D. et al., 1987; BellJ.F., 1981; HoodA.M., 1977; Tarnvik A., 1989). С другой стороны, как в случае бруцеллеза, вакцинация сопряжена с высоким уровнем аллергизации макроорганизма, приводящим к существенным сдвигам иммуногомеостаза вплоть до развития парадоксальных реакций на инфицирование или ревакцинацию с развитием тяжелых клинических форм болезни и переходом ее в хроническую форму (Беклемишев Н. Д., 1965, 1975,1979,1986; Белазеров Е.С., 1985; Вершилова П. А. и др., 1972, 1974; Грекова Н. А., 1968; Елынина Г. А. и др., 1991; Ременцова -М.М., 1991; Суходоева Г.С. и др.. 1971. 1980; Таран И. Ф. и др., 1996; ТихенкоН. И. и др.. 1983; Цирельсон Л. Е. и др., 1977; Montaraz J.A. et al., 1986; Patterson J.M. et al., 1976; Plommet M. et al., 1983). Известно также, что патогенез склонных к хроничес-

кок}' течение иифзкцконны>: болезней, в том числе и бруцеллеза, б первую очередь связан с патологией иммунитета (Беклемишев Н.Д., 1979,1936; Белозеров Е.С., 1985; Вартазарян Н.Д., 1983). Известно также, что патогенез склонных к хроническому течению инфекционных болезней, в том числе и бруцеллеза, в первую очередь связан с патологией- иммунитета (Беклемишев Н.Д., 1979,1986; Белозеров Е.С., 1985; Вартазарян Н.Д., 1983).

Несмотря на вышеизложенное на сегодняшний день наиболее прочного и длительного иммунитета против инфекционных заболеваний можно добиться только при использовании для вакцинации препаратов на основе живых аттенуированных микробных клеток, а не смесей химически чистых антигенов или убитых микробных клеток. Применение живых вакцин имеет целый ряд преимуществ перед убитыми в отношении силы и продолжительности вакцинального иммунитета. Однако использование этих средств специфической профилактики инфекций, как правило, осложняется их высокой реактогенностыо, степень которой сильно варьирует в зависимости от использованного для приготовления вакцины микробного штамма. В последние годы стало очевидным, что различные микроорганизмы способны изменять иммунный ответ зараженного хозяина на последующее или одновременное введение неродственных антигенов, то есть неспецифически модулировать иммунный ответ (Прилепин H.A. и др., 1980, 1981; Санин A.B. и др., 1987; Станиславский Е.С., 1976; Kaufmann S.H.E. et al., 1989). Поствакцинальные осложнения связаны с наличием в составе бактериальной клетки структур (например, ЛПС), обладающих стрессорными, сенсибилизирующими, анафилактогенными и другими неблагоприятными свойствами, и проявляются в виде местных и общих реакций макроорганизма (Брагинская В.П. и др., 1990; Покровская Н.Я. и др., 1981; Соколова А. и др., 1986; Turner-Lowe S., 1991). Наибольшее значение в патологии, обусловленной введением живых вакцин, имеют поствакцинальные осложнения, обусловленные нарушениями иммуного-меостаза. Вместе с тем характер иммунопатологических изменений, вызванных вакцинацией, изучен недостаточно.

Несмотря на неослабевающий интерес исследователей-к изучению иммунологических сдвигов, происходящих в зараженном макроорганизме как в отношении бруцеллеза, так и в отношении туляремии, до настоящего времени нет единой точки зрения на механизмы иммуноло-

гической перестройки макроорганизма при инфицировании или вакцинации и формировании иммунной защиты. Нет четкого представления о роли различных субпопуляций ЖК б процессе иммуногенеза, о нарушениях функциональной активности одних и активации других клеточных элементов, неясна роль индуцируемых в значительных количествах и'сохраняющихся десятилетиями сывороточных антител (Белозеров Е.С., 2985; Борсук Г. И. и др., 1993 Вершилова П.А. и др., 1974.; Корзенко В.Н., 1974,1980; Anthony L.S.D. et al., 1987; Koskela P., 1985, 1982; Tamvik A., 1989), недостаточно изучены вопросы биологической целесообразности и функциональной нагрузки наблюдаемых феноменов антителообразования и ГЗТ. Мало изучены процессы взаимодействия туляремийного и бруцеллезного микробов с МФ ин-тактных и иммунизированных животных, отсутствуют данные об изменениях рецепторного аппарата МФ и их корреляции с напряженностью противоинфекционного иммунитета. Констатируемое G. Sandstrom положение о ведущей роли Т-ЛФЦ в защите от туляремии - лишь вершина айсберга. Очевидна необходимость расширенной аргументации, основанной на изучении взаимосвязей Т-ЛФЦ с другими лимфоидными клетками и МФ, определяющими характер реагирования этих клеток. Известно, что активация Т-ЛФЦ (и выполнение ими каких-либо эффек-торных функций) не может быть осуществлена антигеном напрямую. В связи с этим нарушение функций антигенпрезентирующих клеток не может не сказаться на уровне активации Т-ЛФЦ. Феноменология этого явления, как и многих других иммунных процессов, способствующих или препятствующих формированию иммунологической защиты от туляремии и бруцеллеза, до настоящего времени остается неизученной. Изложенное свидетельствует о том, что многие вопросы иммуногенеза туляремии на сегодняшний день не могут считаться разрешенными, что в той асе степени может быть отнесено и к бруцеллезу. Получение ответов на поставленные вопросы позволит определить эффективные пути воздействия на отдельные этапы иммуногенеза с целью коррекции иммунологических реакций и предотвращения развития иммунопатологии.

Таким образом, очевидно, что в ряду актуальных задач в области изучения инфекционной патологии, вызываемой возбудителями особо опасных инфекций, одно из ведущих мест занимает совершенствование методов специфической профилактики туляремии и бруцелле-

за, основанное на изучении антигенного строения микробных клеток и механизмов взаимодействия микро- и макроорганизмов и формирования иммунной защиты макрооргачизма при его инфицировании, исследовании функциональной активности различных популяций ИКК и их роли в процессе деградации и элиминации возбудителя, функциях антител (в том числе и моноклональных), продуцируемых в ответ на различные микробные антигенные субстанции, в иммуно- и патогенезе инфекции (Каральник Б. В. и др., 1990, 1991; Козловский Б.Н., 1989-1992; Кормилицына и др., 1996; Мещерякова И.С., 1968,1970,1995; Олсуфьев Н.Г.. 1975; Салмаков К.М. и др., 1989,1990; Студенцова В.К. и др., 1991; Сухарь В.В., 1965-1987; Хлебников B.C. и др., 1992,1993; Bascoul S. et al., 1978; Eell J.F., 1981; Bundesen R.G. etal., 1985; Bundle D.R. etal., 1984,1989; Cannat A. etal., 1978; Chin J. etal., 1989; Cloecka-ert A. et al., 1992; Fulop M.J. et al., 1991; Golovliov I. et al.. 1995; HolmanP.J. etal., 1985; Hood A.M., 1977; Khlebnikov V.S. etal., 1991; Lilliehook B. etal., 1989; Limet J. etal., 1987,1989; MeikleP.J. etal., 1989; MontarazJ.A. etal., 1986; Pardon P. etal., 1977; Patterson J. M. etal., 1976; Phillips M. etal., 1989; Plommet M. etal., 1983,1987; Roop R.M. etal., 1987; Sandstrom G. etal., 1984-1994; Sulitzeanu D., 1955; Tarn-vik A., 1989; Vendrell J.P., 1985-1992; Vizcaino N. etal., 1992).

Близость филогенетического происхождения возбудителей туляремии и бруцеллеза, общность проявления различных иммунологических феноменов, антигенное родство, проявляющееся в высокой степени перекрестной реактивности туляремийных и бруцеллезных сывороток (Желудков М.М., 1980; Олсуфьев Н. Г., 1975; Behan К.A. etal., 1982; Tarnvik А., 1989) обусловили необходимость проведения параллельных исследований механизмов иммуногенеза обеих инфекций.

Таким образом, выяснение роли отдельных популяций и субпопуляций ИКК, а также определение функций, выполняемых индивидуальными антителами, при иммунологической перестройке, вызванной возбудителями бруцеллеза и туляремии, являются актуальными, так как будут способствовать расшифровке некоторых аспектов противотуля-ремийного и противобруцеллезного иммунитета и служить основой для разработки направленной иммунокоррекции вакцинального иммуногене-

за, в том числе и с помощью фармакологических средств.

Представленные в диссертации материалы исследований являются результатом работы по 4 плановым темам, выполнявшимся в рамках КИР РЛЧИ:

Исследование антигенных детерминант возбудителей чумы и туляремии на основе набора моноклональных антител; номер государственной регистрации 01.88.0. 053371;

Создание панели моноклональных антител к антигенам возбудителей чумы и туляремии; номер" государственной регистрации 01.09.10. 053231;

Получение набора моноклональных антител к антигенам возбудителя бруцеллеза; номер государственной регистрации 003543 01.9.50

Влияние антигенов вакцинного штамма В. abortus 19-ВА на функциональную активность иимунокомпетентных клеток животных; номер государственной регистрации 114-3-96.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение функциональной активности различных иимунокомпетентных клеток и роли гуморальных антител в формировании иммунитета у животных, иммунизированных вакцинными штаммами возбудителей туляремии и бруцеллеза, а также нарушений иммуногомеостаза в результате иммунизации и возможности их фармакологической коррекции.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

\. Оценить количественные изменения, пролиферативную и синтетическую активность Т-, В-ЛФЦ и макрофагов (МФ) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза при введении вакцинных штаммов F.tularensis 15 (НТВ) и В.abortus 19-ВА 0КБВ).

2. Изучить баланс системы интерлейкинов 2,4,5 и 6, продуцируемых лимфоидными клетками, в регуляции иммунного ответа на антигены (АГ) указанных микроорганизмов.

3. Исследовать кинетику образования регуляторных клеток при иммунизации мышей F.tularensis" 15 и В. abortus' 19-ВА.

4. Оценить^In vitro и in vivo взаимодействие указанных штаммов микроорганизмов с МФ интактных и иммунизированных животных и изучить функциональную активность этих клеток в процессе иммуно-

генеза с определением баланса монокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ПГЕ2 и ФНО-а.

5. Получить набор гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) к различным поверхностным АГ возбудителей туляремии и бруцеллеза.

6. Определить серологическую специфичность и функциональную роль индивидуальных МКА в реализации противоинфекционного иммунитета, в том числе их протективный эффект и влияние на эффективность фагоцитоза.

7. Изучить влияние иммунокорригирующих препаратов на течение вакцинального процесса in vivo и в модельных опытах in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Продемонстрированы колебания отвечаемости ЛФЦ иммунизированных животных на тюликпоналъные митогены и гетерологичные АГ, количественные и качественные изменения "иммунокомпетентных клеток (ИКК) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

2. Показано, что при введении экспериментальным животным ИВ наблюдается преимущественное образование антител (AT) с высокой аффинностью, в то время как живые бруцеллезные бактерии индуцируют существенные количества низкоаффинных AT.

3. Определена функциональная значимость AT в реализации защиты против туляремии и бруцеллеза.

4. Показано влияние AT на взаимодействие живых микробных клеток F. tularensis 15 и В. abortus 19-ВА с леритонеальными макрофагами (ПМ) иммунизированных животных.

5. Подтверждена возможность получения МКА определенной специфичности методом направленной иммуносупрессии с помощью цикло-фосф ана.

6. Установлена эффективность некоторых фармакологических препаратов при коррекции поствачцинальных нарушений ишуногомеос-таза иммунизированных животных.

7. Получен дополнительный к описанному нами ранее набор ач-титуляремийных МКА, направленных к небольшому количеству АГ имму-нодоминантного комплекса F.tularensis 15, ответственных за качественно однообразный спектр AT.

8. Впервые установлено, что ЖТВ индуцирует формирование в организме AT, направленных против АГ соматических клеток.

9. Впервые установлено, что введение ИЕ обусловливает формирование вторичного иммунодефицита по В-системе иммунитета, сопровождающегося снижением продукции ИЛ-5 и ИЛ-6.

10. Подтверждено, что воздействие АГ ЖТВ обусловливает в ранний лоствакцннальный период временное нарушение продукции ФИО-а.

11. Впервые установлено, что введение ЖТВ обусловливает формирование преходящего иммунодефицита по Т-системе иммунитета, сопровождающегося фазными колебаниями ответной реакции ЛФЦ на ге-терологичный АГ, увеличением активности супрессорной популяции Т-клеток и продукции ПГЕг.

12. Получен оригинальный набор антибруцеллезных МКА, обладающих родо-, группо- и видоспецифичностью.

13. Показана возможность видовой дифференциации бруцелл с помощью МКА.

14. Подтверждено протективное действие антибруцеллезных АТ, способствующих клиренсу крови от введенных бруцелл и уменьшению степени обсемененности селезенок.

15. Впервые установлено, что иммунизация ЖБВ сопровождается развитием глубокого поствакцинального иммунодефицита как по Т-, так и по В-системе иммунитета, заключающегося в подавлении пролиферации ЛФЦ иммунизированных животных в ответ на поликлонапьные активаторы и гетерологичные АГ.

16. Показано, что относительный дефицит ИЛ-2 в результате иммунизации ЯБВ обусловлен его активной рецепцией стимулированными бруцеллезнымиЛГ В-ЛФЦ.

17. Впервые установлено, что утяжеление относительного дефицита ИЛ-2, обусловленного иммунизацией ЖБВ, связано с заместительной ролью ИЛ-4, увеличением спонтанной продукции ИЛ-1 МФ, активацией продукции ИЛ-6 и ФНО-а и нарастанием количества неспецифических и ЛПС-специфических Т- и В-супрессорных клеток.

18. Показано, что индуцированные ЖБВ опсонины активно способствуют захвату микробов фагоцитами, при этом интенсифицируется процесс внутриклеточного переваривания бруцелл.

19. Подтверждено, что длительная персистенция бруцелл в клетках системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) приводит к формированию низкозонной толерантности, сопровождающейся снижением от-вечаемости В-ЛФЦ на гетерологичный ЛПС.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате впервые проведенного комплексного сравнительного изучения формирования поствакцинального иммунитета получена отсутствовавшая до настоящего времени базисная информация о клеточно-медиаторных взаимоотношениях в процессе иммуногенеза, индуцируемого живыми микробными клетками вакцинных штаммов F. tularensis 15 и В. abortus 19-ВА, включающая сведения об эталности количественных и качественных изменений ИКК, их синтетической и иммунорегуляторной активности, механизмах формирования иммуносупрессии" при бруцеллезе и туляремии и влиянии AT на взаимодействие живых микробных клеток указанных штаммов микроорганизмов с клетками СМФ иммунизированных животных.

Результаты исследования представляют существенный интерес для понимания иммуногенеза туляремии и бруцеллеза и механизмов формирования неполной защиты от них при иммунизации применяющимися в настоящее время живыми вакцинами, что необходимо для решения важной медико-социальной задачи - оптимизации и усовершенствовании специфической профилактики туляремии и бруцеллеза и определения путей коррекции поствакцинальных и инфекционных иммунодефици-тов.

Впервые проведен расширенный анализ интерлейкиновой регуляции иммуногенеза, индуцированного АГ F. tularensis 15 и В. abortus 19-ВА, описаны и оценены продукция, баланс и взаимоотношения моно- и лимфокинов.г- в том числе ИЛ-1, ИЛ-2. ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ПГЕг и ФНО-ot, в ходе развития поствакцинального иммунитета.

В экспериментальных условиях моделирования вакцинального и инфекционного процессов изучены клеточные основы гуморального иммунного ответа при воздействии микробных клеток F. tularensis 15 и В.abortus 19-ВА и аффинитет синтезируемых иммуноглобулинов. Определена функциональная значимость AT в реализации защиты против туляремии и бруцеллеза.

Высоким потенциалом практического использования обладают полученные МКА, позволяющие оптимизировать как диагностические про-. цедуры, так и работы по аффиннохроматографическому выделению антигенов, представляющих интерес в плане приготовления химических (молекулярных) вакцин. Получена и охарактеризована по эпитопной

специфичности синтезируемых иммуноглобулинов оригинальная серия гибридом-продуцентов антибруцеллезных иммуноглобулинов, продуцирующих МКА ра'зличной серологической специфичности, направленных как к общим с другими микроорганизмами (йерсиниями, франциселла-ми, холерным вибрионом, кишечной палочкой, сальмонеллами) антигенным детерминанта}.!, так и к эпитопам, экспрессировачным только на микробных клетках представителей рода Brucella. Среди них выделены гибридомы, продуцирующие МКА к видоспецифическим АГ, присущим штаммам В. abortus, и группоспецифическим эпитопам, обнаруживаемым на штаммах В.abortus et suis и отсутствующим на клетках В.melitensis. Полученные моноклональные иммуноглобулины, будучи испытаны на полевом материале в ИФА, показали высокую активность, позволяя однозначно идентифицировать род Brucella, а также судить о видовой принадлежности возбудителя. Идентифицирован ряд "про-тективных" МКА, обеспечивающих повышение клиренса крови от бру-целл, уменьшение степени обсемененности селезенки, активацию фагоцитоза, сопровождающуюся его завершенностью. Выявляемые этими иммуноглобулинами антигены могут быть использованы для конструирования химической (молекулярной) вакцины.

Гибридный клон Д10-12В, продуцирующий моноклональные IgGl к поверхностному родоспецифическому антигену возбудителей бруцеллеза, экспрессированному на микробных клетках всех представителей рода Brucella, депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером ВСКК/П/615 Д.

Отработанная технологическая схема получения продуцирующих гибридом доступна любой культуральной лаборатории. Практически важной представляется оптимизированная процедура получения продуцентов антител необходимой специфичности путем направленной имму-носупрессии с использованием циклофосфана.

Полученные данные об иммунологических сдвигах в организме экспериментальных животных позволили определить критические периоды, требующие применения иммунокорректоров. Показана возможность проведения фармакологической иммунокоррекции поствакцинальных нарушений иммуногомеостаза и эффективность некоторых иммуномодуля-торов в процессе ее проведения. Подавление отвечаемости на гете-рологичный АГ должно быть учтено при составлении плана вакцинации.

Результаты исследований, представленных в диссертации, стали основой составления "Методических рекомендаций по использованию иммуноферментного анализа для лабораторной идентификации голарктической разновидности туляремийного микроба с помощью монокло-нальных антител", утверждении Ученым Советом Ростовского-на-Дону противочумного института в декабре 1990 года.

Видоспецифические и подзидоспецифические МКА, конъюгировач-ные с ФИТЦ, в виде "Иммуноглобулинов диагностических .туляремийных мэноклонапьных люинесцирукзщкх сухих" были представлены в сентябре 1990 года на экспозиции ВДНХ "Прогрессивная технология в производстве лекарственных средств" и в 1991 году в Милане (Италия) на "Международной неделе науки" в разделе "Советская технология".

Набор антитуляремийных МКА был передач для сравнительных исследований д-ру G.Sandstrom в Университет г. Умеа (Швеция), использовался для дифференциации измененных штаммов туляремийного микроба в лаборатории академика РАМН профессора А. Г. Скавронской в НИИЗМ им. Н. Ф. Гамалеи, а также в ряде лабораторий РПЧИ и ПЧС СКВД.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Микробные клетки живых туляремийной и бруцеллезной вакцин при введении в организм млекопитающих вызывают существенные изменения функциональной активности основных популяций иммунокомпе-тентных клеток, сопровождающиеся выраженными колебаниями их количества, с накоплением в первом случае значимого пула коммитиро-ванных клеток и клеток иммунологической памяти, а во втором -преимущественно незрелых В-ЛФЦ с фенотипом IgM+.

2. F. tularensis 15 не вызывает существенных изменений в по-пуляционном составе лимфоцитов, в то время как при иммунизации животных В. abortus 19-ВА эти изменения, сопровождающие глубокие нарушения иммуногомеостаза, Еесьма значительны.

3. Введение ITB сопровождается формированием преходящего иммунодефицита по Т-системе иммунитета с повышением активности суп-рессорной "популяции Т-лимфоцитов, увеличением продукции ПГЕг и фазными колебаниями ответной реакции ЛФЦ на гетерологичный АГ, нарушением в ранний поствакцинальный период продукции ФНО-d, а также вторичного иммунодефицита по В-системе иммунитета, сопро-

воздающегося снижением продукции ИЛ-5 и ИП-6.

4. Иммунизация 1ББ сопровождается развитием глубокого поствакцинального иммунодефицита как по Т-, так и по В-системе иммунитета, заключаюцегося в длительном подавлении пролиферации ЛФЦ иммунизированных животных, индуцируемой поликлональными активаторами и гетерологичными антигенами, что сопряжено с относительным дефицитом ИЛ-2, заместительной ролью повышенных количеств ИЛ-4, увеличением спонтанной продукции ИЛ-1, активацией продукции ИЛ-6 и ФНО-ct и нарастанием количества неспецифических и ЛПС-специфи-ческих Т- и В-супрессорных клеток.

5. Длительная персистенция бруцелл в клетках СМФ приводит к формированию низкозонной толерантности, сопровождающейся снижением отвечаемости В-ЛФЦ на гетерологичный ЛПС.

6. F. tularensis и В. abortus индуцируют в макроорганизме синтез широкого спектра антител, обладающих различной функциональной активностью и специфичностью, в том числе, в случае туляремии, направленных против антигенов ряда соматических клеток млекопитающих, а в случае бруцеллеза - обладающих протективными свойствами. обеспечивающими ускорение клиренса крови от бруцелл и уменьшение степени обсемененности селезенки.

7. Иммунокоррекция с помощью фармакологических препаратов позволяет нивелировать отрицательные последствия иммунизации ITB и ЖБВ и обеспечивает оптимизацию вакцинального иммуногенеза.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: результаты исследований были представлены на научных конференциях:

- Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций (рабочее совещание), Оболенск, 1990;

- Современные направления создания медицинских диагностику-мов (Всесоюзная конференция), Москва, 1990;

- Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций, Саратов, 1991;

- Актуальные проблемы профилактики туляремии (Всесоюзная конференция), Москва, 1991;

- Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток (Всесоюзная конференция), Новосибирск, 1991;

- I съезд иммунологов России, Новосибирск, 1992;

- Иммунология и специфическая профилактика ООН (Российская

научная конференция),' Саратов, 1993;

- Итоговая научная конфёренция Ростовского-на-Дону медицинского университета, Ростов-на-Дону, 1994» 1995, 1996;

- Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний (Межгосударственная научно- практическая конференция, посвященная 100-летию открытия возбудителя чумы), Ставрополь, 1994;

- Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера", Ростов-на-Дону, 1995;

- Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники (Всероссийская научная конференция), Чита, 1995;

- Современные достижения биотехнологии (Всероссийская конференция), Ставрополь, 1996;

- 4th Scientific Meeting of the European Society'of Chemotherapy (ESC), Athens, Greece, 1996;

- The Federation of Immunological Societies of Asia-Oceania, First Congress, Adelaida, Australia, 1998;

- VII съезд Всерос. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997;

- IX Международный симпозиум по иммунитету слизистых оболочек (9th International Congress of Mucosal Immunology), Sydney, Australia, 1997;

- 8th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Lausanne, Switzerland, 1997.

Материалы диссертации обсуждены на общеинститутской научной конференции РПЧИ в июне 1997 г.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ: основные положения диссертации отражены в 33 опубликованных научных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: диссертация состоит из введения, трех разделов, включающих 5 глав собственных исследований, общего заключениями выводов. Текст работы изложен на SZP страницах машинописного текста, иллюстрирован 48 таблицами, 27 рисунками и 2 фотографиями. Библиографический указатель состоит из 2Of источников отечественной и зарубежной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В качестве биологической модели исследования и источника иммунных сывороток, спленоцитов, тимоцитов и макрофагов были использованы 4700 половозрелых беспородных белых и инбредных мышей линий Balb/c и СВА обоего пола массой 18-20 г в возрасте 6-10 недель.

Бактериальные штаммы F. tularensis. В.melitensis, abortus & suis, V. cholerae, Y. enterocolitica и др. были получены из музея живых культур Ростовского НИПЧИ. Бактерии туляремийных штаммов выращивали при 37°С в течение 48 час на свернутой желточной среде Маккоя или агаре ACT pH 6,9-7,5 с \% глюкозы и 0,1% цистина, штаммы бруцелл - на глюкозо-глицериновом агаре pH 6,9, клетки Y.enterocolitica - на агаре Хоттингера pH 7,0-7,2, холерный вибрион выращивали на щелочном агаре.

Количество Т- и B-лимфоцитов в селезенках иммунизированных животных определяли с помощью цитотоксического теста с использованием диагностических сывороток против Т- и B-лимфоцитов мыши (кооператив "Микрофлора" при НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского).

Определение поликлональной активации B-лимфоцитов проводили, определяя число антителообразующих клеток, спонтанно продуцирующих антитела к эритроцитам барана (Cunningham A.G., 1968).

Функциональную активность Т-хелперов гуморального иммунного ответа исследовали на модели кооперативного взаимодействия Т- и B-лимфоцитов при гуморальном иммунном ответе на тимусзависимый антиген (эритроциты барана), реализуемой в системе адоптивного переноса тотально облученным мышам. Влияние исследуемых антигенов на индуцируемую ими хелперную активность Т-лимфоцитов оценивали по количеству формирующихся А0К у реципиентов через 7 дней после введения эритроцитов барана.

Постановку РБТЛ иммунизированных мышей осуществляли в микромодификации "(Хоробрых В. В. и др., 1983). Учет реакции производили по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток (имп/мин).

Оценку продукции ИЛ-1 макрофагами проводили методом, осно-

ванным на способности этого цнтокина обеспечивать костимуляцию пролиферативного ответа тимоцитов мышей, активированных субмито-геннон дозой Кон А или ФГА-Р (Phillips R. et al.,1983).

Активность ИЛ-2 тестировали по (Martensen H. et aî.,1987), используя 96 часовые Т•-клеточные бласты, актиЕкрованные 5 мкг/мл Кон А в течение 24 часов.

Методы детекции активности ИЛ-4 и ИЛ-5 основывались на их комитогенном эффекте в отношении покоящихся малых В-ЛФЦ, стимулированных антииимуноглобулиновыми антителами (ИЛ-4), и нормальных больших активированных in vivo или стимулированных декстран-суль-фатом in vitro В-клеток (ИЛ-5) (Лимфоциты. Методы/Под ред. Дж. Клауса.-М. : Мир, 1990; Yokota T. et al.,1987).

Определение мультифункционального цитокина ИЛ-6 осуществляли методом, основанным на способности ИЛ-6 индуцировать дифференци-ровку нормальных активированных B-клеток в антителопродуцирующие клетки, с последующей оценкой продукции ими иммуноглобулинов (Лимфоциты. Методы/Под ред. Дж.Клауса. -М. : Мир, 1990).

Определение ФНО-ct на клетках перевиваемых фибробластов мьшш L-929 осуществляли модифицированным методом (Fisch H. et al., 1983).

Для получения гибридом использовали перевиваемую линию мышиных миеломных клеток P3-X63/Ag8.653 (Х653). Культивирование мие-лом и гибридом in vitro осуществляла в среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЗТС), 2 мМ L-глутамина, 10 мМ НЕ-PES. Для изучения цитотоксических компонентов бактериальных клеток использованы перевиваемая линия озариальных клеток китайского хомячка СН0-К1 и линия перевиваемых мышиных фибробластов L-929, растущие в виде прикрепленного монослоя в среде ДМЕМ с 1071 ЗТС, 2 мМ L-глутамина, 5 мМ HEPES. Использованные линии клеток были получены из коллекции перевиваемых клеточных линий Института вирусологии им.Д. И. Ивановского РАН. Клетки мышиной тимомы EL-4 были получены из Института цитологии РАН и культивированы в виде стационарной суспензии в ростовой среде P.PMI 1640 с 10% ЗТС, 2 мМ L-глутамина, 4 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES.

Иммуноферментный анализ проводили в соответствии с описанием Tijesen Р., 1985, используя иммуноферментные наборы для скрининга мышиных гибридом, для определения классов (изотипов) мышиных им-

муноглобулинов, для определения субизотипов мышиных иммуноглобулинов, а также козью антисыворотку против иммуноглобулинов мыши фирмы Calbiochem, США. Учет реакции осуществляли с помощью фотометра Uniscan (Flow, Великобритания).

.Иммуноблотинг проводили по Towbin Н. et al., 1979. Электрофорез и иммуноблотинг проводили, используя комплект приборов и оборудования фирмы "LKB" (Швеция). Величину радиоактивности определяли на счетчике "Mark II " (США). Все измерительные приборы прошли метрологический контроль и были признаны соответствующими госстандарту.

Для экспериментального изучения были использованы официальные коммерческие лекарственные и биологические препараты индоме-тацин, анаприлин, гидрокортизон, рекомбинантный ИЛ-2 человека (Институт органического синтеза АН Латв.ССР, Рига), генно-инженерные i-интерфероны и ФНО-ct ("Гаммаферон" НПО "Фермент" и "Био-ген" АН СССР и Минмедбиопрома СССР), препарат бета-каротина M-U Тепе (Beta Carotene) (New Spirit Naturals, Inc.).

Статистическую обработку материалов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М), ее ошибки (ш) и определения достоверности различий между группами с помощью вычисления значений t-критерия Стъэдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении настоящего исследования иммуномодулирующая активность микробных клеток бруцелл была первично детектирована по значительному увеличению количества ядросодержащих клеток в селезенках иммунизированных мышей. Этот феномен проявлялся в меньшей степени при иммунизации F. tularensis 15, однако в обоих случаях отмечались выраженные изменения популяционного состава лимфоидных клеток селезенок, свидетельствующие о выраженной способности исследуемых вакцин изменять миграцию лимфоцитов (Табл. 1,2). В результате введения ЖБВ количество Т- и В-клеток существенно нарастало к концу продуктивного периода, при этом увеличение количества В-клеток происходило за счет их незрелых форм с фенотипом IgM+, что свидетельствует о неадекватности реакции

Влияние ЖТВ и ЖБВ на количество Т-ЛФЦ в селезенках иммунизированных мышей

Срок после иммунизации (сутки) Цитотоксический индекс (М ± ш) мышей .

контрольных (0,15 М NaCl) иммунизированных

F. tularensis 15 В. abortus 19-ВА

1 3 5 7 14 21 28 31,6±0, 85 33,0±1,14 34, ОЮ,95 33,4±0, 76 31,4±0, 96 31, ОН, 30 32,0+1,14 36,2Ю,85* 40,6±1,62*-43, 5Ю, 85** 48, 9+1,14** 40, 8±0, 80** 37,2±0, 96* 34,1±1,10 30, 8±1, 14+ 36,0±0,85 34,4±0, 76++ 37, 8Ю. 60**++ 36,8±0, 57**+ 39, 6±0, 20** 40» 1И,14**+

** ++

достоверная разница с контролем при р<0,05 и р<0,01 достоверная разница друг с другом при р<0, 05 и р<0,01

Влияние ЖТВ и ЖБВ на количество В-ЛФЦ в селезенках иммунизированных мышей

Таблица 2

Срок после иммунизации (сутки) Цитотоксический индекс (М ± ш) мышей

контрольных (0,15 М NaCl) иммунизированных

F. tularensis 15 В. abortus 19-ВА

1 3 5 7 14 21 28 48, 9Н,38 49, 2±1, 54 48,^513,33 48,1И,19 49,011,08 48.7U, 19 47,811,14 45, 95±1,43 48, 310, 92 49.2И, 35 52,0И.04 66,6И,19** 60,9И,43** 58, 313,13** 50, 9И,37 55, 6И, 30*++ 60, 310, 86**++ 67, 5И,26**++ 70,4И,43** 66.8il,25**+ 61,311,23**

*, ** - достоверная разница с контролем при р<0,05 и р<0,01 +, ++ - достоверная разница друг с другом при р<0.05 и р<0,01

иммунной системы на контакт с живыми бруцеллами (Рис.1). Это обстоятельство отражает продолжающуюся во времени стимуляцию иммунной системы персистирувдим в макроорганизме бруцеллезным- антигеном за счет -продолжающегося примирования спленоцитов in situ и вовлечение в иммуногенез новых популяций В-ЛФЦ, реализующих первичный иммунный ответ, а также возможные нарушения в процессе пе-

реключения изстипое антибруцеллезных иммуноглобулинов зрелыми ан-тителопродуцентами.

В результате иммунизации ИВ изменения количества Т-клеток, возвращаясь к исходному уровни, отражали этапы иммунного ответа, указывая на его начало, максимум развития и завершение. Нарастание к концу исследования количества В-клеток преимущественно с фенотипом или свидетельствовало о накоплении су-

. щественных количеств клеток иммунологической памяти, что соответственно предопределяет высокий уровень формирования вторичного иммунного ответа при повторном контакте иммунизированного макроорганизма с антигеном.

Выявлено, что оба вакцинных препарата обладают выраженной активностью в качестве поликлональных стимуляторов В-ЛФЦ селезенок (Рис.2), обеспечивая увеличение числа АОК, продуцирующих 1§М к эритроцитам барана. При этом на поздних этапах иммуногенеза по-ликлональная активность ЖТВ сменяется супрессией, в то время как при иммунизации ЖБВ количество АОК, определяемых даже на 112 сутки поствакцинального периода, остается значимо выше исходного уровня.

Исследование иммуногенеза у животных, подвергнутых воздействию ЖТВ и ЖБВ, показало наличие выраженных изменений пролифера-тивного ответа примированных иммуноцитов в ответ на поликлональ-ные активаторы, гетеро- и гомологичные антигены. При этом в результате введения ЖТВ отмечались определенные периоды снижения ответной реакции-ЛФЦ, в то время как ЖБВ обусловливала длительное ингибирование способности ИКК отвечать на стимуляцию. Показано, что предшествующая иммунизация ЖТВ неоднозначно отражается на способности иммунной системы реагировать с гетерологичным антигеном. Она подавляется в первые 3 суток поствакцинального периода и на его финальных стадиях и стимулируется в период с 3 по 21 сутки. ЖБВ-примированные спленоциты с первого дня после иммунизации и до конца наблюдения существенно снижают уровень пролиферации в отношении гетерологичного АГ. В связи с этим можно заключить, что адъювантный эффект ЖТВ, о котором есть сведения в литературе, проявляется в определенных временных рамках, ограниченных 7-21 сутками. В связи с этим подавление ответной реакции иммунной системы на гетерологичный АГ должно быть учтено при составлении пла-

5 7 14 21 28

Срок после иммунизации (сутки)

Рис.1 Количество незрелых В-ЛФЦ в селезенках мышей, иммунизированных ЖТВ и ЖБВ

Срок после иммунизации (сутки)

Рис. 2 Динамика изменений ИПС В-ЛФЦ селезенок мышей, иммунизированных ЖТВ и ЖБВ

на вакцинации.

Выявленные в случае использования НТВ изменения пролифера-тивной активности ИКК б ответ на стимуляцию Кон А отражают фазные изменения активации популяции супрессорных клеток и временного дефицита ростовых факторов, необходимых для пролиферации Т-кле-ток, тогда как нарушение ответной реакции на ФГА может свидетельствовать об увеличении числа мигрирующих в селезенку Т-хелперов и последующем подавление их функциональной активности. Нарастающая супрессия пролиферации ЛФЦ ЖБВ-иммунизированных животных на Кон А отражает развивающийся дефект иммунорегуляции в ее супрессорном" звене, который сопровождается снижением пролиферации ФГА-чувстви-тельных Т-клеток, свидетельствующем о параллельных нарушениях и хелперных механизмов иммуногенеза.

Анализ пролиферативной активности спленоцитов в ответ на В-клеточные митогены продемонстрировал значительное активирующее влияние предшествующей иммунизации ЖТВ на способность иммуноком-петентных клеток реагировать на использованные лектины за исключением декстран-сульфата. Последнее отражает один из механизмов развивающегося после воздействия ЖТВ иммунодефицита - нарушение продукции/потребления ИЛ-5. В результате иммунизации ЖБВ подавляется пролиферативная активность ЛПС и S.aureus Cowan 1-чувствительных популяций В-клеток и активируется ответ на декстран-сульфат. Эти результаты, оцененные вместе, свидетельствуют о выраженном подавлении реакции иммунной системы на стимуляторы и нарушении иммунорегуляции, связанной с повышением активности ИЛ-5.

Исследования показали, что в результате иммунизации ЖТВ существенно активируется продукция ИЛ-2, при чем эта активация отмечается даже на завершающих этапах иммуногенеза, а супрессия пролиферативной активности Т-ЛФЦ при воздействии Кон А в ранний поствакцинальный период связана с дефицитом этого иммуномедиатора (Рис.3). При иммунизации ЖБВ дефицита продукции ИЛ-2 в начальный период иммуногенеза не выявлено, однако, начиная с 7 суток, она линейно снижается, обусловливая подавление митогениндуцированного бластогенеза примированных антигенами бруцелл Т-ЛФЦ.

Эксперименты по восстановлению пролиферативной' активности ЛФЦ иммунизированных животных с помощь» экзогенных интерлейкинов показали, что ингибиция пролиферации ЖБВ-примированных ЛФЦ обус-

ловлена дисбалансом системы регуляторных лимфокинов, в основе которой помимо развивающегося абсолютного и относительного дефицита ИЛ-2 лежат гиперпродукция ИЛ-4 и ИЛ-5 и существенная активация простагландинзависимого механизма иммуносупрессии (Рис.4,5; Табл.3,4,5). Отсутствие стимулирующего влияния экзогенного ИЛ-2 на пролиферацию ЖТВ-примированных ЛФЦ свидетельствовало о том," что продукция этого лимфокина не нарушена, а подавление пролифе-ративного ответа спленоцитов обусловлено повышенной продукцией макрофагами ПГЕг, функционированием активированной популяции суп-рессорных Т-ЛФЦ и дисбалансом регуляции, в основе которой лежат конкурентные взаимоотношения ИЛ-2 и повышенного количества ИЛ-4.

Как показал дальнейший анализ (Табл. 6), одними из первых нарушений баланса продукции факторов роста Т-клеток при иммунизации ЖБВ являются нарушения синтетической активности клеток СМФ, которые перестают отвечать продукцией ИЛ-1 в ответ на дополнительную стимуляцию. При иммунизации ЖТВ отмечается если не недостаток продукции ИЛ-1, то во всяком случае отсутствие ее значимой активации, что может быть на отдельных этапах иммуногенеза причиной относительного дефицита регуляторного влияния этого иммуномедиа-тора.

Ео всех случаях обнаруживалась определенная зависимость между синтезом ИЛ-1 и ИП-6. Увеличение ЛПС-индуцированной продукции ИЛ-6 во второй половине поствакцинального периода клетками пери-тонеального смыва мышей, иммунизированных как ЖТВ, так и ЖБВ, является косвенным-подтверждением активации популяции сулрессорных Т-ЛФЦ, с которыми 1411-6 связан прямой корреляционной связью, причиной увеличения числа АОК и гиперпродукции незрелых В-клеток, для которых он является аутокринным/паракринным фактором роста. При этом в комплексе изменений, происходящих в макроорганизме после иммунизации ЖТВ и ЖБВ, активация супрессорной популяции Т-клеток в большей степени регистрируется у ЖТВ-иммунизированных животных, а политональная активация и увеличение незрелых форм В-ЛФЦ - у мышей, подвергнутых воздействию ЖБВ.

Повышение продукции острофазовых монокинов, в том числе ИП-6, ИЛ-1 и ФНО-а, сопровождающее патологическую активацию СМФ, характерно для многих аутоиммунных заболеваний. Наличие подобных изменений, обнаруженных при иммунизации исследуемыми вакцинами.

3 5 7 14 21 Срок после иммунизации (сутки)

-жтв

•ЖБВ

- зараженные F.tularensis 15 павшие -зараженные F.tularensis 15 выжившие -зараженные В. abortus 19-ВА

• Интактные мыши

-Контроль пролиферации Кон А бласгов

Рис. 3 Активность ИЛ-2 в супернатантах лимфоцитарных культур экспериментальных животных

3 5 7 14 21 ■ Срок после инокуляции (сутки)

•ЖТВ

---ЖБВ

F.tularensis 15 зараженные пазшие

*—F.tularensis 15

зараженные выжившие

B.abortus 19-ВА зараженные

Интакгные

Рис. 4 Активность ИЛ-4 в супернатантах культур ЛФЦ экспериментальных животных

Р.1и1агел5(5 15 зараженные павшие РЛи1агег>5'|5 15 зараженные выжившие В.зЬст^ 19-ВА зараженные

Интакгные

3 5 7 14 21 Срок после инокуляции (сутки)

Рис. 5 Активность ИЛ-5 в супернатантах культур ЛФЦ экспериментальных животных

□ЖТВ | Б ЖБВ I □ Контроль|

1 3 5 7 14 21

Количество суток до переноса реципиентам лимфоидных клеток доноров

Рис. 6 Кинетика образования Т-супрессоров

Восстановление Кон А-индуцированной пролиферации спленоиитов мьпзей индометацином

Препараты Показатели Индекс стимуляции (М ± ш) спленоцитов животных

иммунизированных "зараженных"

ЖТВ - ЖБВ Г. Шагег^г 15 В. аЬогЧив 19-ВА 7 сут

5 сут 21 сут павших выживших

5 сут 3 сут

Исходные показатели % к контролю 4, 7±0, 4 4, 0±0,2 0,2±0, 007 1,1 ±0,1 1,0±0,1 75 64 3 18 16

индометацин 5 мкг/мл ■ % к"контролю % восстановления 5, 4±0, 5 5, 5±0, 3 3, 8±0, 4 3, 3±0,1 4, 5±0, 3 86 88 61 52 71 И . 24 .58 34 ■ 55

рИЛ-2 + индометацин % к контролю % восстановления 6, 2±0, 3 6,0±0, 5 4, 9±0, 3 4,1 ±0,1 5, 4±0, 5 98 95 78 65 86 39 31 75 47 70

Супернатант Кон А-стиму-лированных ЛФЦ интакт-ных мышей + индометацин % к контролю % восстановления 5, 5±0, 3 5, 7*0, 7 5,410,3 3,8±0, 5 5, 0±0, 3 88 90 86 61 80 13 ' 26 83 43 64

Супернатант клеток ЕЬ-4 (ИЛ-2>ИЛ-4) + индометацин % к контролю % восстановления 6,3±0,3 6,1 ±0,5 5,7±0, 5 4, 0±0,1 5,7±0, 7 100 96 • 90 63 - 90 25 32 . 87 45 74

Интактные 6, 3±0,5 животные

Восстановление Кон А-индуцированной пролиферации спленоцитов мышей экзогенными интерлейкинами

Препараты Показатели Доза Индекс стимуляции (М ± ш) спленоцитов животных

иммунизированных "зараженных"

НТВ ЕБВ Р. Шагег^Б 15 В. аЬог^ив 19-ВА 7 сут

5 сут 21 сут павших выживших

5 сут 3 сут

Исходные показатели %_к контролю ; 4,710,4 4, 0±0,2 0,2±0,007 1, 3 ±0,1 1,0±0,1 75 64 .3 18 16

рИЛ-2 % к контролю % восстановления 100 ЕД/мл 5,0±0,5 5,2±0,3 3,140.3 1.9±0,3 3,3±0,3 79 82 49 30 53 4 18 46 12 37

Супернатант Кон А-стиму-лированных ЛФЦ интакт-ных мышей % к контролю % восстановления 1:2 5,ОЮ,3 4,9±0, 5 2, 9±0,4 1,9±0,3 3,3±0,3 79 77 46 30 53 4 12 43 ■ 12 37

Супернатант клеток Е1-4 (ИЛ-2>ИЛ-4) % к контролю % восстановления 1:2 5,0±0,6 5,4Ю,3 3,8^0,5 2,1Ю.З 4,0Ю,4 80 86 60 34 63 5 22 57 16 47 •

Интактные 6,3±0, 5 животные

могло бы свидетельствовать о присутствии аутоиммунного компонента в иммуногенезе туляремии и бруцеллеза.

Проведенные исследования показали, что иммунизация НТВ пов-реждающе действует на функциональную активность клеток СМФ и при-

Восстановление Кон А-индуцированнок пролиферации спленоцктов мышей с помощью комплекса лимфокинов и индометацина

Препараты Показатели Индекс стимуляции (М ± т) спленоцктов животных

иммунизированных "зараженных"

ЖТВ ЖБВ Р.1и1агепз1Б 15 В. аЬогШБ 19-ВА 7 сут

5 сут 21 сут павших выживших

. 5 сут 3 сут

Исходные показатели % к контролю 4, 7±0, 4 4, 0±0,2 0,2*0, 007 1,1 ±0,1 1,0*0,1 75 64 3 18 .16

Супернатант клеток ЕЬ-4 (ИЛ-4>ИЛ-2) % к контролю % восстановления 4,7Ю.З 5,4±0, 5 3, 7*0,3 2, 3±0,1 2, 9±0, 5 75 86 58 36 46 0 22 55 18 30

Супернатант клеток ЕЬ-4 + рИЛ-2 % к контролю % восстановления 5,0±0, 3 5,8±0, 5 5. 5±0, 3 2,8*0,1 5, 7±0, 5 80 92 88 45 90 5 28 85 27 74

Супернатант клеток ЕЬ-4 + рИЛ-2 + индомета-цин % к контролю % восстановления 6,3*0,3 6, 3±0.7 6,2±0,3 4, 4±0, 5 6,3*0,3 100" 100 98 70 100 25 36 95 52 84

Интактные 6, 3±0,5 животные

водит в первые"3 суток после иммунизации к достоверному снижению спонтанной продукции перитонеапьными макрофагами ФН0-с(, сме- -няющемуся ее увеличением с 7 по 21 сутки поствакцинального перио-

Комитогенная активность супернатантов культур ПМ мышей, подвергнутых воздействию антигенов F.tularensis 15 и В.abortus 19-ВА, в отношении пролиферации мышиных тимоцитов (ИС - индекс стимуляции, (М ± ш)

Срок после иммунизации (сут) ИС тимоцитов (М ± е) при добавлении супернатантов культур ПМ мышей, иммунизированных

F.tularensis 15 В.abortus 19-ВА

„ нестимулиро-ванных стимулированных ЛПС нестимулированных стимулированных ЛПС

1 3 5 7 14 21 28 2, 8±0,4 1, 8±0, 4 3, 4±0, 3 3, 9±0,3* 4, 0±0,3* 3,8±0,2* 2, 9±0,5 7, 9±0, 5** 7, OiO, 3** 8, 5±0, 7** 7,4±0, 5** 8, OiO, 5** 7,1±0, 4** 6,4±0, 3* 2,8±0,3 3,6±0,1* 5,1±0, 7* 5, 9±0, 7* 4,2±0, 2* 5, 6±0, 4** 5,1±0, 5* 7, 7±0, 4»* 6, 6±0, 3* 6, 0±0, 4 5,1±0,3 5, 0±0, 5 4, 5±0, 3 3, 9±0, 4

Пролиферация тимоцитов в ответ на Кон А (1 мкг/мл) 2,1 ±0, 3

Пролиферация тимоцитов в ответ на Кон А при добавлении супер-натанта интакт-ных МФ нестимулированных . стимулированных ЛПС

2,7Ю,3 4,1 ±0,5

Пролиферация тимоцитов в ответ на Кон А при добавлении рИЛ-1р (10 ед/нл) 7, 3±0, 7

*, ** - достоверная разница с контролем при р<0,05 и р<0,01

да. Введение ЖБВ обусловливает достоверное повышением ФНО-й-син-тетической активности ПМ с первого дня иммунизации. Сниженная стимулированная ЛПС продукция ФН0-с( ПМ ЖТВ- и ЖБВ иммунизированных мышей восстанавливается при использовании индометацина - бло-.катора синтеза,простагландинов, свидетельствуя о .нарушении регу-ляторного влияния клеток СМФ на иммуногенез и значительной роли

простагландинов в развитии иммуносупрессии.

Отрицательное влияние иммунизации НТВ в ранний поствакцинальный период и ЖБВ в продуктивную фазу иммуногенеза является отражением усиления этими препаратами процесса формирования лим-фоидных клеток, обладающих супрессорной активностью, которые инактивируют Т-хелперы или "подавляют антигензависимую дифференци-ровку В-клеток в антителопродуценты (Рис. 6, 7). ЖТВ индуцировала в селезенке появление Т-клеток, обладавших супрессорной активностью на 1,3 и 5 сутки после иммунизации. Т-клетки, выделенные от иммунизированных животных на 7-28 сутки, проявляли хелперную активность. Иммунизация мышей НБВ, не сопровождаясь накоплением в их селезенках Т-клеток с супрессорной активностью в ранний поствакцинальный период, обусловливала их появление, начиная со второй недели после введения вакцины. При оценке иммунорегуляторной функции селезеночных В-клеток, полученных" от иммунизированных мышей, показано, что 1БВ обеспечивает с 7 суток поствакцинального периода формирование пула активированных В-клеток-супрессоров, а ЖТВ, наоборот, стимулирует на 14-28 сутки накопление хелперной популяции В-клеток.

В результате проведенного исследования антительного репертуара, который обеспечивает иммунизация ЖТВ и ЖБВ, методами гибри-. домной технологии идентифицированы моноклональные антитела к ряду поверхностных антигенных детерминант исследованных микрорганиз-мов. Показано, что антитуляремийные антитела вместе с нарушениями в системе клеточного иммунитета, связанными с продукцией острофазовых цитокинов, принимают участие в становлении аутоиммунной патологии. Выявлено, что возбудитель туляремии имеет антигены, сходные с антигенами тканей организма млекопитающих (бронхиальные эпителиоциты, тимоциты, эритроциты, Т-клетки лимфоузлов и селезенки), антитела к которым могут способствовать деструкции тканей в условиях формирующегося при прогрессировали инфекции иммунодефицита и утяжелении ее течения (Табл.7). Протективных антител за исключением иммуноглобулинов, уменьшающих цитотоксические потенции франциселп в отношении МФ и соматических клеток, не обнаружено. Это обстоятельство, с одной стороны, подтверждает мнение ряда исследователей о том, что в защите от туляремии сывороточные антитела, кроме опсонинов, не участвуют, с другой, - противоречит

0,4 Г"

Количество суток до переноса реципиентам лимфоидных клеток донора

Рис. 7 Кинетика образования В-супрессоров

полученным группой проф. В.С.Хлебникова результатам, свидетельствующим о протективной роли антитуляремийных антител, направленных к ЛПС Р. ги1агепБ1Б, особенно если он ассоциирован с мембранными белками 37. кД и 43 кД.

Проведенные исследования показали некоторую разницу в спекг-~ ре иммуногенных для человека и мыши антигенных детерминант Р. 1агеп51Б, что является основанием для продолжения начатых исследований с помощью МКА человеческого происхохсдения. С другой стороны, наличие антител сходной специфичности (нпр.,ВЗ/2) (Табл. 8) позволяет с определенной степенью вероятности экстраполировать полученные результаты на человека. Кроме этого, описанное в литературе наличие у человека клонов Т-хелперов, аналогичных мышиным Тх1 и Тх2, позволяет надеяться на более высокую степень вероятности проявления обнаруженных на мышиной модели явлений на механизмы иммуногенеза у человека.

Исследование антибруцеллезных МКА показало (Табл.9), что они

Взаимодействие антитуляремийных МКА с антигенами эукариотических клеток

Клетки- Титр МКА в ИФА*

мишени

В2/3 П/30 01/51 Е7/22 Г5/21

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2

тимоцкты 640 640 1280 320 1280 3280 640 640 1280 3280

клетки 640 640 1280 1280 1280 640 640 640 1280 3280

костного

мозга

В-ЛФЦ се- 640 640 1280 1280 1280 1280 640 640 1280 1280

лезенки

Т-ЛФЦ се- 640 640 1280 320 1280 1280 640 640 3280 1280

лезенки

эритроци- 640 320 1280 640 1280 160 640 640 3280 360

ты гепатоци- 640 640 1280 1280 1280 1280 640 640 1280 3280

ты клетки 640 640 1280 320 3280 1280 640 640 1280 1280

лимфоуз-

лов

эпителио- 640 80 1280 1280 . 3280 1280 640 40 1280 1280

циты

* - представлены обратные значения титров антител

Таблица 8

Результаты конкурентного ИФА сывороток крови больных туляремией людей с набором мышиных МКА

Антитела Исследуемые сыворотки

А В С 0 Е

без антител 512 ООО* 51 ООО 256 ООО 532 ООО 3 024 ООО

МКА А6/67 512 ООО 51 ООО 256 ООО 512 ООО 3 024 ООО

Н3/31 128 ООО 12 800 64 ООО 64 ООО 256 ООО

04/8 80 ООО 10 ООО 64 ООО 64 ООО 256 ООО

Н12/34 64 ООО 6 400 32 ООО 64 ООО 32 ООО

ВЗ/2 64 ООО 12 800 32 ООО 328 ООО 64 ООО

поликлональ- 32 ООО 6 400 128 ООО 64 ООО 128 ООО

ная антиту-

ляремийная

мышиная сы-

воротка

* - указаны обратные значения титров антител

Свойства ачтибруцеллезных МКА

МКА Изотип Специфичность■ Клиренс крови Ингибиция обсеменения селезенки РА Бак-те-рио-стаз РСК

Brucella

ab mel s лпс

I гр.

F10-12A D10-12B

IgM IgGl

G1-3B IgGl

G4-6B

Н10-12А

А1-ЗА

IgG3

IgG23

IgG2*

+ +

■f-+

+ + +

+ + + + +

(поздно) + +

(поздно)

+ +

+ +

+ +

II гр.

A4-6B E1-3C

E7-9B B10-12B

IgM IgGl

IgG2a IgG3

+

(поздно) +

+ +

III rp.

A10-12A IgM + -+ +_ - + + +

B4-6B IgM + -+ +- - + - +

IV rp.

El-ЗА IgM '! + -._-- - +

A7-9H IgM + - - - +

B10-G5 IgM + - - - +

+ + + +

обладают определенным спектром биологической активности, подтверждая свою важную роль в реализации иммунной защиты против бруцеллеза. способствуя клиренсу крови от введенных бактерий, уменьшению степени обсемененности селезенки и обладая прямым бактери-цидным/бактериостатическим эффектом в отношении живых бруцелл. Так, -6 МКА из 15 исследованных могут быть обозначены как "протек-тивные", причем 3 из них как "слабо протективные" в связи со сравнительно поздним влиянием на процесс освобождения крови от

Влияние антител на взаимодействие В. abortus 19-ВА с перитонеальными макрофагами интактных мышей

Антитела Процент - разрушенных МФ через 1 час инкубации (М±т) Количество ■м/кл. внутри МФ через 1 час инкубации (М±ш) И 3 Ф (Mim)'

Без антител 28, Oil, 2 32.0il,9 -0,28i0, 03

Миеломный асцит (нормальный) 26, Oil, 6 30, 3±1, 7 -0, 32±0, Ol

Поликлональ-ная мышиная антибруцеллезная сыворотка 18, Oil,3 44, 3±1, 9 +0, 07 iO, 003

МКА F1Q-12A D10-12B I G1-3B G4-6B Н10-12А AI-ЗА 16. ЗЮ.7 19, 3±0,5 23, 1±1,1 24, 3±0,9 25, OiO, 7 26, 5i0,9 15, 3±1, 1 19,6±0. 9 29, 9±1, 1 30, 7±0, 5 65, 3±3,1 60,1±2, 7 +0, 27±0, 005 +0,16±0,001 +0,24i0,003 -0,04i0,003 +0.52±0,017 +0,60i0,019

II А4-6В Е1-ЗС Е7-9В В10-12В 12, 4i0,1 19,610,7 27, 311, 3 24,6±1,1 18, 1±0,5 20,1±0, 7 66, 7±3, 3 61,5±3,3 -0, 56±0, Ol 1 +0, 20Ю, 003 +0, 56±0, 017 +0, 16i0, 001

III А10-12А В4-6В 18,2±0, 3 ' 16,1±0,5 14, 3±0,3 19.311,1 •0 +0,11±0, 001

IV El-ЗА А7-9Н B10-G5 14,HO, 3 14,110,3 19, 7±0, 5 17,7±0, 3 21, 3±0, 5 12,1±0, 1 -0,53i0, 017 -0, 43±0, 031 -1,25±0, 043

Контроль культуры 6, 810, 9 0 0

инокулята. Исследование•комплементфиксирующих свойств ггротектив-ных и непротективных МКА показало, что из всей анализированной панели антибруцеллезных моноклональных иммуноглобулинов все про-тективные МКА связывали комплемент, подтверждая его непосредс-

тЕенное участие в осуществлении протективного эффекта.

Результаты проведенных экспериментов позволяют констатировать неоднозначность роли антител б процессе взаимодействия м. кл. В. abortus 19-ВА с фагоцитирующими клетками макрооргачизма (Табл.10). На. основании полученных- результатов можно выделить следующие функциональные группы:

- МКА, которые затрудняют процесс поглощения бруцелл макрофагами, но не оказывают влияния на их дальнейшее размножение внутри клеток СМФ, приводя к увеличению отрицательного значения показателя индекса завершенности фагоцитоза;

- МКА, обработка которыми затрудняет поглощение бруцелл макрофагами, но сопровождается в дальнейшем активным перевариванием внутриклеточно расположенных и.кл. и завершенностью фагоцитоза.

- МКА. способствующие активному захвату бруцелл фагоцитами, который сопровождается существенной стимуляцией процесса внутриклеточного переваривания м. кл. ;

- МКА, которые слабо влияют на процесс поглощения бруцелл фагоцитами, но активируют процесс внутриклеточного переваривания микробных клеток.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о чрезвычайной сложности, взаимосвязи и взаимозависимости событий, происходящих в макроорганизме после введения туляремийной и бруцеллезной вакцин, знание которых несомненно положительно скажется не только на совершенствовании специфической профилактики этих инфекций и оптимизации условий сочетанной, комплексной или ассоциированной вакцинации против других инфекций, но и на патогенетической терапии туляремии и бруцеллеза. Кроме того, можно полагать, что полученные сведения о механизмах иммунопатологических реакций, индуцируемых возбудителями туляремии и бруцеллеза, закладывающие теоретический фундамент для продолжения научного поиска в области изучения и разработки новых подходов к осуществлению коррекции поствакцинальных и постинфекционных нарушений иммуного-меостаза, будут служить основой интенсификации исследований иммунного ответа макроорганизма на антигены возбудителёй'и других особо опасных инфекций с целью решения прикладных задач их профилактики и терапии.

- за -

Решение многих проблем, сопряженных с использованием живых вакцин для специфической профилактики инфекционных заболеваний, в настоящее время связывают с использованием фармакологических средств иммунокоррекции, способных модулировать реактивность прививаемого организма. На основании полученных в работе результатов для коррекции нарушений иммуногомеостаза, индуцируемых вакцинацией ЖТВ и ЖБВ, были использованы бета-блокаторы в целях нивелирования стрессорной реакции при инокуляции микроорганизмов, сопровождающейся выбросом катехоламинов, обладающих иммуносупрессорны-ми свойствами. Использовали неселективный блокатор бета-адренер-гических рецепторов анаприлин в дозе 1 иг/кг однократно за 3 часа до и в 1,2 и 3 сутки после иммунизации ЖТВ. С целью нормализации повышенной активности Тх при иммунизации ЖБВ использовали гидрокортизон в дозе 12,5 мг/кг, который вводили через день в течение 2 и 3 недели или 1 раз в неделю, начиная со второй недели поствакцинального периода, когда отмечалась гиперактивация хелперных клеток.

Введение анаприлина при иммунизации мышей ЖТВ привело к отчетливому иммуностимулирующему эффекту, проявившемуся нормализацией функции иммунной системы и увеличением показателей пролифе-ративной реакции ЛФЦ иммунизированных животных как на гомо-, так и на гетерологичный АГ. Однако показатели пролиферации спленоци-тов мышей на 1-3 сутки после введения туляремийной вакцины достигали лишь уровня контроля. Обнаруженный факт является свидетельством того, что стрессорный выброс катехоламинов в ответ на введение живых микробных клеток Г. Шагег^Б 15 не является единственной причиной ранней поствакцинальной иммуносупрессии, индуцируемой ЖТВ. С учетом результатов исследований Денисова Л. А. и др. ,1991; Федорцова К. К. и др. ,1992; Юрова С. В. и др., 1992 и наших данных о балансе продукции ФНО-й были проведены эксперименты по комплексному введению анаприлина и рекомбинантного человеческого ФНО-а (НПО "Фермент" с удельной- биологической активностью 7,1*107 МЕ/мг белка) в дозе_ 0,001 МЕ на особь за 24 часа до иммунизации и одновременно с-ней. Подобный прием позволил практически ликвидировать супрессорную фазу в ранний поствакцинальный период после иммунизации ЖТВ и обеспечить, судя по показателям пролифе-ративной активности ЛФЦ примированных животных, оптимизацию вак-

цинального иммуногенеза и уменьшение разб&пансировки иммунной систеш.

Таким образом, снижение влияния иммунизационного стресса в ранний поствакцинальный период с помощью блокаторов бета-адрено-рецелторов может нивелировать подавление иммунной системы, реализующееся через катехоламины. однако в случае использования УЛВ этот механизм иммуносупрессии не является единственным, поскольку параллельно развивающаяся недостаточность продукции острофазового цитокина ФНО-а требует хоть и в минимальных дозах, но обязательного его дополнительного введения мытам, подвергнутым воздействию антигенов Р.1и1агепБ1£ 15.

Результаты введения гидрокортизона, полученные в ходе экспериментов по оценке степени снижения поликлональной активации, индуцируемой антигенами КБВ, продемонстрировали отчетливый иммуно-супрессивный эффект препарата, проявившийся нормализацией функции иммунной систеш и заключавшийся в значительном уменьшении хел-перной активности Т-клеток, индуцированных антигенами ЖБВ. При этом в отличие от интактных животных, не получавших гормонотерапии, поликлональная активация В-лимфоцитов, свидетельствующая о неадекватном функционировании иммунной системы в использованной модельной системе не регистрировалась уже по истечении 4 недель поствакцинального периода. Таким образом, использование гидрокортизона позволяет, с одной стороны, оптимизировать функционирование иммунной системы и существенно уменьшить неадекватно повышенный уровень' ответной реакции спленоцитов иммунизированных мышей на гомологичный антиген в реакции антигенспецифической бласт-трансформации. С другой стороны, уровень пролиферации примирован-ных антигенами бруцелл спленоцитов в ответ на воздействие гетеро-логичного АГ хоть и повышается, но все же остается в пределах контрольного уровня, свидетельствуя о сохраняющейся депрессии иммунной систеш, требующей дополнительной коррекции.

Несомненно также, что в этом процессе существенную роль играет неполноценность фагоцитарного звена иммунитета, поскольку считается что персистенция бруцелл в фагоцитах "помимо того, что продукты жизнедеятельности бруцелл вызывают антигенспецифическую депрессию фагоцитоза, может зависеть от их аденилатциклазной активности, следствием которой является повышение внутриклеточного

уровня цАМФ, блокада слияния в этих клетках лизосом с сагосэмами и подавление фагоцитоза. Это обстоятельство еще раз свидетельствует в пользу использования блокаторов бета-адренергических рецепторов для коррекции иммунных нарушений, связанных не только со стрессорным эффектом иммунизации, развивающимся в первые часы и дни после введения вакцины, но и в последующие периоды вакцинального иммуногенеза для модуляции функций различных ИКК, в частности, фагоцитов и Т-хелперов 2 типа.

Выявленные в ходе исследования изменения функционирования Т-клеток и их синтетической активности, а также недостаточность фагоцитоза при вакцинации против туляремии и бруцеллеза явились основанием для оценки иммунокорригирующего действия экзогенного ИФН-tf в отношении оптимизации вакцинального иммуногенеза. Введение рекомбинантного ИФН-tf в дозе 500 ООО МЕ/кг веса мышей осуществляли за 24 часа до инокуляции ЖТВ или ЖБВ и через каждые 3 дня в последующий период. Показано, что введение этого цитокина сопровождалось оптимизацией вакцинального иммуногенеза: существенным снижением поликлональной активации В-ЛФЦ мышей, иммунизированных ЖБВ, сглаживанием противоположно направленных пиков кривой показателей Кон А-индуцированной бласттрансформации ЛФЦ иммунизированных ЖТВ мышей, свидетельствующим об уменьшении "раскачивания" иммунной системы антигенами ' франциселл, значительным уменьшением депрессии иммунной системы, развивающейся при воздействии антигенов ЖТВ с 7 по 28 сутки. При этом фаза иммуносуп-рессии в ранний поствакцинальный период (1-3 сутки) при введении рИФН-tf практически исчезала~при ответе ЛФЦ ЖТВ-примированных мышей как на гомо-, так и на гетерологичный АГ. Исследование функциональной активности ЛФЦ ЖБВ-примйрованных мышей при введении рИФН-tf продемонстрировало увеличение ответной реакции ИКК на гомологичный АГ с формированием пика на 14 сутки и последующим плавным снижением почти до уровня контроля. Это объективно свидетельствовало о подавлении гиперфункции Тх, вызванной В. abortus 19-ВА, и активации супрессорных механизмов, в задачу которых входит 'ограничение силы и продолжительности иммунного ответа на антигенный стимул. При использовании гетерологичного АГ, как и Кон А," наблюдали во все сроки исследования отсутствие подавления ответной реакции примированных антигенами ЖБВ ЛФЦ. Показатели от-

ветной реакции ИКК на Кон к колебались на уровне контроля, г фаза иммуносупрессии, наиболее выраженная при введении ЖБВ с 7 по 35 сутки поствакцинального периода, при использовании иммунокоррек-ции рИФН-tí практически не была выражена.

Внимание к жирорастворимым витаминам - витамину А, прс-вита-мину А (бета-каротин) - обусловлено тем, что они обладают выраженными противовоспалительными свойствами и повышают резистентность к различным инфекционным заболеваниям. Учитывая данные литературы, мы исследовали возможность использования каротиноидов в качестве средства неспецифической коррекции нарушений иммуногоме-остаза с помощью препарата M-U Тепе (Beta-carotene) (бета-каротин - БК) фирмы New Spirit Naturals,Inc. Исследуемый препарат скармливали мышам, иммунизированным ЖТВ, ежедневно в дозе 25 мг/кг. Введение БК в течение 4 недель сопровождалось увеличением переваривающей способности макрофагов, что документировалось повышенными показателями положительных значений ИЗФ с 14 по 28 сутки поствакцинального периода. При этом на 7 сутки после иммунизации ИЗФ МФ мышей, которым вводили бета-каротин, в отличие от показателей контрольных животных из отрицательного становится положительным. Обнаруженный факт может быть оценен как позитивный в плане формирования противотуляремийного иммунитета, поскольку свидетельствует об адекватном функционировании клеток СМФ, обеспечивающих гибель внутриклеточно расположенных микроорганизмов и блокирующих их репликацию. Таким образом, бета-каротин является эффективным дополнительным средством коррекции нарушений фагоцитарной активности МФ мышей, подвергнутых иммунизации ЖТВ.

Полученные в ходе выполнения этого раздела результаты свидетельствуют о том,- что совместное с живыми туляремийной и бруцеллезной вакцинами использование иммунокорригирующих средств не только показано, но и реально. При этом необходимо учитывать фазу развития иммунного ответа и повреждаемое функциональное звено иммунной системы. Понимание механизмов регуляции различных популяций и субпопуляций ИКК, дополнительная информация о молекулярных событиях, "ассоциированных с активацией иммуноцитов, поможет содействовать разработке способов модуляции их активности in vivo, сделать возможным оказание благоприятного влияния на исход вакцинации или заболевания. Однако иммунокоррекция тесно связана с

оценкой иммунного статуса и может проводиться только с учетом его результатов, поскольку только в этом случае она позволяет осуществить избирательное и дифференцированное фармакологическое воздействие с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы организма.в целях восстановления или уравновешивания ее дисбаланса и модификации иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Микробные клетки живых туляремийной и бруцеллезной вакцин при введении в организм млекопитающих вызывают существенные изменения функциональной активности основных популяций иммунокомпе-тентных клеток, сопровождающиеся выраженными колебаниями их количества, с накоплением в первом случае значимого пула коммитиро-ванных клеток и "клеток иммунологической памяти, а во втором -преимущественно незрелых В-лимфоцитов с фенотипом IgM+.

2. Введение F. tularensis 15 сопровождается умеренными изменениями количества ядросодержащих клеток и популяционного состава лимфоцитов селезенок мышей и незначительной поликлональной активацией В-лимфоцитов, а в результате воздействия антигенов В. abortus 19-ВА отмечаются глубокие нарушения иммуногомеостаза со значительными количественными изменениями популяций иммунокомпетент-ных клеток и выраженной поликлональной активацией В-лимфоцитов.

3. Введение живой туляремийной вакцины сопровождается формированием преходящего иммунодефицита по Т-системе иммунитета с повышением активности супрессорной популяции Т-лимфоцитов, увеличением продукции ПГЕг и фазными (индукция-супрессия) колебаниями ответной реакции лимфоцитов на гетерологичный антиген, а также обусловливает формирование вторичного иммунодефицита по В-системе иммунитета, сопровождающегося снижением продукции ИЛ-5 и ИЛ-6, и временное нарушение в ранний поствакцинальный период продукции ФН0-о(, которое препятствует адекватному развитию иммунного ответа.

4. Иммунизация живой бруцеллезной вакциной сопровождается развитием глубокого поствакцинального иммунодефицита как по Т-, так и по В-системе иммунитета, сопровождающегося""подавлением пролиферации лимфоцитов, индуцированной поликлональными активаторами и гетерологичными антигенами. Это обусловлено относительным дефи-

циток ИЛ-2, заместительной ролью повышенного количества ИЛ-4, увеличением спонтанной продукции ИЛ-1. активацией продукции ИЛ-6 и ФНО-а и нарастанием количества-неспецифических и ЛПС-слецифи-ческих Т- и В-супрессорных клеток.

5. Длительная персистенция бруцелл в клетках системы моно-нуклеарных фагоцитов приводит к формированию низкозонной толерантности, сопровождающейся снижением ответной реакции В-лимфоци-тов на гетерологичный ЛПС.

6. Живые туляремийные бактерии индуцируют формирование в организме антител, направленных против антигенных детерминант соматических клеток. При этом клоны лимфоцитов-продуцентов иммуноглобулинов такой специфичности в иммунокомпрометированном организме выходят из репрессированного состояния по мере утяжеления инфекционного процесса и обеспечивают усиление аутоиммунного процесса.

7. Живая бруцеллезная вакцина индуцирует формирование-про-тективных антител, обеспечивающих ускорение клиренса крови от бруцелл, уменьшение степени обсемененности селезенки и обладающих нейтрализующими свойствами, которые ответственны за реализацию пассивной иммунотерапии поликлональными сыворотками. Однако преимущественный синтез низкоаффинных антител свидетельствует о дефектном характере ответной реакции иммунной системы макроорганизма и низкой эффективности вакцинации.

8. Индуцированные живой бруцеллезной вакциной опсонины не только способствуют захвату микробов фагоцитами, но и опосредуют интенсификацию процесса внутриклеточного переваривания бруцелл. Антитуляремийные антитела в значительно меньшей степени способствуют перевариванию франциселл, однако снижают их цитотоксическую активность в отношении фагоцитов.

9. Иммунокоррекция с помощью фармакологических препаратов (индометацин, гидрокортизон, рекомбинантный ИЛ-2 и ФНО-с*, а'-интерферон, блокаторы р-адренорецепторов, бета-каротин и др.) позволяет нивелировать отрицательные последствия иммунизации живыми туляремийной и бруцеллезной вакцинами и обеспечивает оптимизацию вакцинального иммуногенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммунодиагностика туляремии с помощью моноьслональных антител /Черепахина И. Я. , Алексеева Л. П., Ефанова Е. А./. -//Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бакт. инфекций: Матер, рабоч. совещ. - Оболенск, 1990.-С.78.

2. Тест-система с использованием туляремийных моноклональных антител в эпидемиологической практике /Алексеева Л.П., Соколов В.Г./.-//Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бакт. инфекций: Матер, рабоч. совещ.- Оболенск, 1990.-С.75.

3. Иммуноферментный анализ для характеристики моноклональных антител к антигенам Р. Ш1агегш5 с целью создания тест-систем / Ефанова Е.А., Новохатский А.С., Король В.В., Черепахина И.Я., Забродин А.Н./.-//Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бакт. инфекций: Матер. рабоч. совещ. - Оболенск, 1990.-С.74.

4. Разработка диагностикума на основе моноклональных антител к мембранным белкам Р. 1и1агепБ1Б для иммуноферментного анализа (ИФА) /Ефанова Е. А., Сорокин В. М., Рожков Е. В./.-//Соврем, напр. созд. мед. диагностикумов: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М., 1990. -С. 25.

5. Специфичность моноклональных антител к антигенам возбудителя туляремии в условиях модификации антигена /Ефанова Е.А., Новохатский А.С., Король В.В., Черепахина И.Я., Забродин А. Н. /. -//Акт. пробл. и задачи биохимии, диагн. и иммунопрофил. особо опасных инфекций. - Саратов, 1991.-С. 115-121.

6.- Иммуноферментный анализ с использованием антитуляремийных моноклональных антител для серодиагностики туляремии /Алексеева Л.П., Москвитина З.А., Король В.В., Орлова Г.М., Адимов Л.Б., Черепахина И. Я. /.-//Акт. пробл. и задачи биохимии, диагн. и иммунопрофил. особо опасных инфекций, - Саратов, 1991.-С. 110-115.

7. Использование моноклональных' антител для идентификации возбудителя туляремии непрямыми методами иммунологического анализа / Алексеева Л. П., Ефанова Е. АГ/. -//Акт. пробл. профил. туляремии: Матер. Всесоюз. "конф.-М., 1991.-С. 7-8.

8. Усовершенствованный метод иммунофлуоресцентной диагностики туляремии с помощью моноклональных антител /Алексеева

- -

Л. П. /. -//Акт. лрсбл. профил. туляремии: Матер. Всесоюз. конф. -М., 1993.-С. 87-88.

9; Внутривидовая дифференциация Г.1и1агеп$1Б с помощью кс-ноклональных антител методом иммуноферментного анализа / Ефачова Е. А., Рожков Е.В., Сорокин В. М., Адимов Л.Б., Король В. В./.-//Акт. пробл. профил. туляремии: Матер. Всесоюз. конф.-М., 1991.-С.57-58.

10. Клонирование гибридом при пониженном содержании сьшоро-ток и возможности повышения их ростовых характеристик / Алексеева Л. П./.-//Питат. среды и сыворотки для культивирования клеток: Матер. Всесоюз.. конф.-Новосибирск, 3991.-С.60.

31. Бласттрансформация лимфоцитов в бессывороточной среде. -//Питат. среды и сыворотки для культивирования клеток: Матер. Всесоюз. конф.-Новосибирск, 1991.-С.62.

32. Влияние ростостимулирувщих добавок на пролиферативную и клонообразующую способность миеломных клеточных линий /Алексеева Л. П., Бурлакова 0.С., Бичуль 0.К., Гончаров А.В./.-//Известия Сев.-Кав. науч.центра высшей школы. Естеств.науки.-1991.-М 3.-С.115-120.

13. Эффективность реакции бласттрансформации лимфоцитов в зависимости от компоновки питательной среды.-// I съезд иммунологов России: Тез. докл.-Новосибирск, 1992.-С.225-226.

14. Использование моноклонапьных антител для изучения патогенеза инфекции /Алексеева Л. П. /. -//I съезд иммунологов России: Тез. докл.-Новосибирск, 1992.-С. 226-227.

15. Условия бласттрансформации фракционированной суспензии лимфоцитов /Тагиров 3.Т./. -// Иммунология и спец. профил. 00И: Матер. Российской науч. конф.-Саратов, 1993.-С. 131-132.

16. Моноклонапьные антитела к поверхностным антигенам бру-целл /Алексеева Л. П., Черепахина И. Я./.-//Иммунология и спец. профил. ООИ: Матер. Российской науч. конф.-Саратов, 1993. -С. 264.-265.

17. Иммуномодулирующее действие коклюшных антигенов при иммунизации белых мышей живой туляремийной вакциной /Тагиров 3. Т. /. -//Иммунология и спец. профил. ООИ: Матер. Российской науч. конф.-Саратов, 1993.-С.98-99.

18. Штаммы V. с1ю1егае не 01 группы, имеющие общие антигены с

туляремийным микробом / Фэцайлэва 0.П., Месорош В.Г., Махлин П. И., Павлозич Н.В., Ковалевская 0.Л., Власов В. П., Монахова Е. Е./.-//Иммунология и спец. профил. ООИ: Матер. Российской науч. кокф. -Саратов, 1993. -С.251.

19. Disbalance of interleukin production in the developraent of the early pastvaccinal immunodeficiency /Moskalenko E.P., Ta-guirov S.T./.- //Int. J. Iromunorehabilitation.-1994.-Nl.-Suppl.-P. 224. . .

20. Лимфокины в иммуногенезе бруцеллеза//Акт. вопр. профил. чумы и др. йнфекц. заб-й: Матер, межгосуд. науч.- практ. конф., посвящ'. 300-летию открытия возбудителя чумы. "Ставрополь, 1994.-С.189-190.

21. Функциональная активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов при бруцеллезе//Акт. вопр. профил. чумы и др. инфекц. заб-й: Матер.межгосуд. науч.- практ. конф., посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы.-Ставрополь,1994.-С.188-189.

22. Особенности антигенной структуры штаммов Vibrio cholerae не 01, выделенных из р.Невы /Фецайлова О.П., Павлович Н.В., Месо-рош В.Г., Махлин П.И.. Иванова Л. В., Власов В.П., Монахова Е. В./.-//Холера: Матер. Рос. науч.-практ. конф. по проблеме "Холера". -Ростов-на-Дону, 1995. -С. 144-146.

23. Фармакологическая коррекция поствакцинальных нарушений имуногомеостаза /Тагиров 3. Т. /. -//Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники: Тез. докл. Всерос. науч. конф. - Чита, 1995..-Т. 1. -С. 149-151.

24. Создание панели моноклональных антител к антигенам возбудителей чумы и туляремии / Алексеева Л.П., Щербакова Е.В., Би-чуль O.K./.-// Информационный бюллетень Межведомств, науч. совета по сан. -эпид. охране территории РФ. -Саратов, 1995.-N4.-С.47-48.

25. Местный иммунитет слизистой оболочки тонкого кишечника при бруцеллезе / Коновалова 0. В./.-// I научная сессия Ростовского гос. мед. ун-та: Тез. докл.-Ростов-на-Дону, 1996.-С.68-69.

26. Effective immunization against Brucella abortus respiratory infection in mice is dependent on induction of cell-mediated immunity//Med. Microbiology. -1996". -Vol. 5, Suppl. 1. -P. S65.

27. Характеристика мутантов и подвидов Francisella tularen-sis с помощью моноклональных антител /Алешкин Г.И., Ефанова Е.А.,

Комиссарова Л. В., Рожков Е.В., Захаренко Б. И. /. -//Яурн. микроби-ол. - 1S96.-К4.-С. 38-22.

28. Природа иммунологического конфликта при индукции гибри-домных асцитных опухолей.-//Совр. достижения биотехнологии: Матер. Всерос. конф.-Ставрополь,1996.-С.336.

29. Иммунодефицит при экспериментальном бруцеллезе.-//Матер. VII съезда Всерос. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -М., 3997. -Т. 3. -С. 294-295.

30. Mucosal immunity to Brucella abortus.-//Immunol.Cell Biology. -3997.-Vol. 75, Suppl. 3. -P. A84.

33. T-cell immunity in protection against Brucella abortus infection in mice.-//First Congress of the Federation of Immunological Societies of Asia-Oceania (F1MSA). Abstract book."Adelaida, 1996.-N350.

32. Mononuclear phagocytes'at brucellosis.-// First Congress of the Federation of Immunological Societies of Asia-Oceania (FIMSA). Abstract book.-Adelaida. 1996.-N349.

33. Cytokine regulation of immunogenesis at brucellosis. -//Clin.Microbiol.Infect.-1997. -Suppl. -P851.