Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Жирнокислотные производные углеводов микобактерий и родококков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Жирнокислотные производные углеводов микобактерий и родококков"

А КАДЕНЦИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИЯ имени С.В.ДУРМИШИДЭЕ

На правах рукописи УДК 579.873.2.23:577.144 БУАДЗЕ МАРИНА ОМАРОВНА

ХИРЯОКИСЛОТНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ УГЛЕВОДОВ МИКОБАКТЕРИЙ И РОДОКОККОВ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата

'у

биологических наук

Тбилиси - 1992

Работа выполнена в Институте биохимии растений им. С.В.Дурми-шидзе АН Республики Грузия и в Лаборатории биологически активных вешеста гидробионтов Минздрава России.

. - « Научный руководитель - доктор биологических наук,

Г.Я.Дараселия

Консультант - Доктор химических наук

Батраков С. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Царцидэе H.A. кандидат биологических наук, Гордеэиани М. Ш.

Ведущая организация - ГрузИНСКИЙ Технический

Университет

Защита диссертации состоится " 29" июня 1992 г. в ч. на заседании специализированного совета Д 007.04.01 при Институте биохимии растений им. С.В.Дурмишидзе АН РГ по адресу: 38005Э Тбилиси, Аллея Давида Агмашенебели, 10-ый км.

С диссергацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии растений им. C.B.Дурмишидзе АН РГ.

Автореферат разослан "^9 " i/AXH-S^ 1882 г.

Ученый секретарь . спеииализироваикого совета,

кандидат Биологичских ие\ук jf оьс^-'У \ м.в.Бендианишвили

ß-

- о - ■

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Нскардисподобные бактерии составляют большую группу широко распространенных в природе микроорганизмов. Многие представители этих бактерий имеют большое значение для промышленности, сельского хозяйства, медицины. Они являются прроду-иентами аминокислот, органических кислот, экзополисахаридов, антибиотиков, ферментов, нуклеотидов, стероидов, каротиноидов, витаминов группы В (Возняковская и др., 1969; Головлев, 1983; Дараселил, 1989).

Несмотря на важное значение нокардиоподобных бактерий, их систематика до последнего времени оставалась крайне несовершенной. Успехи в области систематики данных бактерий стали значительными благодаря исследованиям их хемотаксономических■ и генетических признакоз. Быстроразвивающаяся в настоящее время хемотаксономия охватывает липиды, ферменты, менахиноны, пигменты, нуклеионовые кислоти, состав клеточной стенки этих микроорганизмов.

В состав клеточной стенки бактерий семейства МусоЬасЬег 1асеае входят ряд специфических липидов, в частности, гликолипиды и мико--ловыо кислоты. Строение специфических липидов представляет особый интерес при решении сложных вопросов систематики этих микроорганизмов.

Специфические жирные кислоты (ЖК) микобактерий и родственных организмов - миколовые кислоты <МК) среди других природных объектов не встречаются. Строение МК рассматривается как один из самых надежных хемотаксономических признаков микобактерий и родственных организмов (М1пп1к1п, 1981, 1984).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью диссертационной работы являеусг. изучение возможности использования в таксономии

специфических гликолйпидов - миколоатов углеводов и миколовых кислот.

В связи с этим, в задачу ваших исследований входило:

- Сравнительная характеристика липидного состава бактерий се-

мейства МусоЬасЪег1асеае;

- Выделение жирнокислотных производных углеводов;

- Установление структур микодовых кислот;

- Установление структур миколоата глюкозы;

- Исследование динамики накопления жирнокислотных производных углеводов в процессе роста и развитьия культуры;

- Исследование токсического действия жирнокислотных эфиров Сахаров по их ингибированию дыхания митохондрий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенных исследований охарактеризован липидный состав бактерий семейства НусоЬао1ег1асеа (микобактерий-- 3 вида и 6 штаммов, родококки - 2 вида и 7 штаммов).

Выявлено, что соотношение жирнокислотных эфиров Сахаров (ЖКЭС) к фосфолипидам для микобактерий составляет 1:1,5, а для ро-дококков - 2,5:10,5.

Впервые установлено, что для микобактерий характерно накопление миколоат глюкозы (МГ) как доминирующего гликолипида, а для ро-дококков доминирующими являются димиколоат трегалоза (ДМТ) и моно-миколоат трегалоза (ММТ>. Выделение моно- и димиколоатов трегало-зы, известных как высокоактивные иммуномодуляторы, целесообразно осуществлять в логарифмической и заключительной стационарной фазе роста и развития культур.

С применением физико-химического анализа, в частности, ИК-, и масс-спектра, а такие с помощью ТСХ и ВЭЖХ установлено,

I

что гликолипиды фракции ЖКЭС культур Н. ь-юейта^э ИБВМ-44 и И.

BmegEatis ЛТСС-362 содержат МК C8Q-C70 с боковыми цепями Cjg-C^. _ Выделено два типа МК - нормальные а-МК и МК, содержащие нетилыг/н группу в качестве боковой цепи.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. На основании полученных экспериментальных данных можно утверждать, что по специфике строения МК и содержанию ЖКЭС наряду с другими хемотаксономическими признаками можно использльать в диагностике нокардиоподобиые бактерии, в частности, для разграничения родококков от микобактерий.

В результате скрининга и анализа экспериментального материала удалось выявить высокоактивный штамм Mycobacterium snegnatis ИВВМ-44 - продуцент ДМТ и ММТ (17,7 иг/г и 18 мг/г соотвэтственно), значительно (на порядок) превышающий описанный в литературе штамм, используемый для получения тех же гликолипидов. ДМТ и ММТ способны стимулировать у млекопитающих неспецифичную резистентность к патогенным микроорганизмам, а также обладают и противоопухолевой активностью.

Полученные результаты являются научным вкладом в Информационный Банк данных по культурам нокардиоподобных бактерий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы доложены на республиканской конференции молодых ученых " Достижения физико-химической биологии, биохимии и биотехнологии народному хозяйству" (Тбилиси,1987) и на 2-ой Всесоюзной конференции по теме:"Бактериальные токсины" (Юрмала, 1989).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из: введения, объектов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

чает _ лиц.

страницах машинописного текста, вклю-

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Объектами исследований служили

м<кобактерии и родококки, полученные из США, Венесуэлы, Великобри-

1 I

тании, Чехословакии, Москвы, Санкт-Петербурга, Киева, а также мутантов, полученных в лаборатории (Дараселия, 1982).

МИКОБАКТКРИИ: Mycobacteriun saegnatlE АТСС 14468; Hyoobaote-riu» BBegaatis ДТСС B07; Myuobacteriu«) seeg«iatlsHBBM-44; Hyoobao-teriun snegnatis АТСС ЗВ2 (М. enegaatis ВКМ 1205)J Mycobacterium title i АТСС 18248; Mycob&otoritm sp. В KM Ac 1168 (M.feavuia vac. Bethen icun ВКМ B-85Ö),

РОДОКОККИ: Rhodococeus erythropolis BKM Ac 1161 <M. mucosus ШМ B-462); Bliodooooous sp. (K. hyallnun ИБВМ-52); Bhodococcus sp. BKM В Ac UÜ5 (H. lactioolun ВКМ В-85Э); Rhodococoue sp. BKM Ac 1102 (H. seegmatis АН-ШГУ-817); Bhodoaoocua sp. BKM Ac 1170 (M.rubrua ВКИ B-874) и мутантиые штаммы RhodocooouE sp. шт. 44 (M. rubru« 44); Rhodoccocus ар. шт. 3 (H. rubrum 3).

Для хранения культур на косяках и для накопления биомассы в АНКУМ-2М в жидкой среде использовали синтетическую питательную сроду (Дараселия, 1079). Контроль роста культур осуществляли спек-трсфотометрическим и весовым методами.

Клеточные липиды экстрагировали смесями хлороформ - мэтанол , (2:1 и 1:1) из лиофнньно высушенных биомасс. Выделенные липиды анализировали при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с силцкагепем 0-80 ("Ketek", АРГО в системах гексан- , диэтиловый эфир» гексан-дизтиловый эфир-уксусная кислота, хлороформ- метанол-вода в разных соотношениях. Для обнаружения веществ на хроматег-рлммах применили как специфические, реагенты (Нирхнер, 1SS1). так и васпецифические реагенты, ва гликолипиды, нингидрино-Eue i>earo)iT и хлор-бензидановый рвзгемт, на фосфолипиды (раактив

.г

BilCtKCSCKoro) .

В качестве стандарте® служили фосфолипиды, димиколоат и моно-.миколоат трегалоэы (ДМТ, ММТ) и другие гликолипиды,. вьщвленнке иэ Rhodoeoccus erythropolis (Н. paraffinieun), 134 (Батраков, 1984).

Количество липидного фосфата в общих липидях культур определяли методом Васьковского (1975), а количество углеводов - Феноль-ним методом (Dubois Н.,1856).

ВЭХХ миколовых кислот (НК) и гликолипидов проводили на хроматографе " Милихром", снабженном колонкой (50x2 ми) и УФ--детектором в иэократическом режиме, силикаголь Silaaorb 600, 5мкм (Lachens, ЧСФР).

Масс-спектры регистрировали на приборе МАТ-44 Verlan (США) при энергии ионизирующих элактроярв 70 ЭВ. ИК-спектры записывали на приборе Shimtdru IR-435 (Япония) в пленке вещества.

Спектры 1Н-ЯМР получали на спектрометре Rrucker КМ-250 (Гер-о

мания) в растворе CHCLg. Оптическое врадбние измеряли на спектро-поляриметре Polsnat A. Carl ZeissJena (Германия) в CHCLg.

Кислотный и щелочной метанодиэ гликолипидов проводили по методу Батракова (1879, 1981), а ферментативный гидролиз - по методу

V

. Гордеева (1991).

Для определения степени иенасыщенности метиловых эфирон мико-ловых кислот (МЭМК) их подвергали посла ацетипирования уксусным ангидридом в пиридине препаративаной ТСХ на пластинках с аргенти-рованным силикаголем. Субфракции насыщенных моновновмх и диеновых веществ выделяли_ и анализировали методами ВЗЖХ и масс-спектромео-рии.

Для уточнения элементов структуры миколоата глюкозы гликоли-пиды подвергали расщеплению по Смиту(Каг1еоп К-А et al, 1979).

Дыхание митохондрий печени крыс линии Вистар регистрировали полярографиическим котодом < Коидрпшова М.Н., 1973).

- ь -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Веделйиие аирпокислсггных производят углеводов. Среди специ-

t

©»таем« липидов иокврдиоподсбных микобактерий и родококкоь жирно-».ксдотные эфира Сатаров (ЖКЭС) по своему физиологическом»/ действию ■з шимэют особое иесто iJoneda Т. et ы! 188Ö, Ватракоь, 1ЯЬ5]. Ans-и |з клвточиьи «кшадоя показал наличие четырех веществ, структура ¿оторык мокет содержать углеводный компонент. Для оценки количес-

i нетюго соо-гвоивния названных гликолипидов (I -1V; они были выде-лйш в виде фракции путем освобождения от веществ пептидной природа экстракцией гексаном (Батраков и др., 1Ö81) и флеш-/(■оматогрофией на силиках-еле от малополярных веиаств и пигментов, /.нализ фрашдии ЖКЛС. методом ВЭЖХ показал, что количество ее глико-г.ишедных компонентов I-IV соотносятся как 10:0:1:12. Для установления структуры этик липидов они были выделены в виде индивидуальны*. веществ методом адсорбционной хроматографии ка силикагеле.

Гликолипидам I—II вами была приписана структура 0,6'тдимиколоата и 6-мономиколоата трегалозы, соответственно, вследствие близости их хроматографической подвижности стандартным вещестдом, выделенным ранее из Rhodococeus erythropoiis (Mycobac-tiTius paraffinicua) 134 (Батраке®, 1979,1381). Образование трегалозы и метиловых зфиров миколовых кислот (ИЭМК) при кислотном и щелочном метанолизе названных липидов позволило сделать окончательный вывод о строении этих веществ (рис. 1).

Нетанопиуси гликолипидсв 111 и IV были получены MSMK, а в качеств« углеводного компонента глвкоза и сахароза.

Hi) основании этого и данных ИК-спактрое III. и IV (V 3200

OU

... 1

■;и , Чс~ 0 1738 см ) названные лип иды бшм от несены к миколоатам

глкжозц и сахарозы. Вследствие крайне малого количества миклолоата

t

счхьрхал уточнение его структуры на проводилось.

ОН

I

ЙСНСЯСООСН

он I

вснснсоосн

(III) В*=Н (III.) н*=сна

он I

• вснснсоосн

•ой»

он

Л - СН - СН - СООЙ»

I

Я"

(V) Й*=Н (V.) В'^СНд

(II)

Везде В*, и й - ал кил Рис. 1

Установленеиэ структуры миколовых кислот. Структура миколовых кислот, входящих в состав ЖКЭС является таксономическим признаком рода НусоЬтсЬег1всеае.

С помощью ТСХ и методов физико-химического анализа устяновле-

на идентичность МК, полученных при щелочном метанолиэе лиофилиэо-ваняызс бактериальных биомасс и кислот, образующихся при действии панкреатической липазы на ЖКЭС (Гордеев, 1991). МК (V) превращали МЭМК (*а> действием диаэометана. Вывод о структуре МК делали путем анализа ИК-, 1 Н~ЯИР и масс-спектров, а таае с помощью ТСХ и ВЗЖХ.

. ИХ-спектры МК содержали характерную полосу поглощения С=0 связи с максимумом 1730 см"1. С помощью колоночной хроматографии вымыли индивидуальные субфракции МЭМК (1) й^0,25 и(2) Л^О,21.

В спектрах 1Н-КМР субфракция обнаружила дублет триплетов в области метальных протонов (б 0,85 и 0,97 м.д.) в соотношении 2:1 и мультиплетный сигнал (б 2.72 м.д.>, соответствующий СИ-группе алифатической цепи вблизи СНЭ~группы. Что означает наличие раэвет-блэния в одной из алифатических цепей МК данной субфракции.

Масс-слектрометрмческий анализ субфракции (1) и (2) позволил установить, что ИК названных культур представляет собой разветвленные гидроксижирные кислоты Сц^-С^р.

Распад МЭМК при иониэацииэлектронным ударом показан на схеме (рис.2). Наличие в масс-спектрах пиков, соответствующих расщеплению по Мак-Лаферти с массами 383, 385 а.е.м. позволяет оценивать

: I ^

л -{— сн -4-' сн — соонв

г I

I——---, в

(Уа>

Рис. 2. Распад МЭМК при ионизации электронным ударом.

длину боковой цепи в а-полсжении С1& - С20. Основное количество МК составляли мсноаиовые (>80Х) и диеновые кислоты (22%).

/

Полученные результаты по микслоатам трегалозы не отличались

от вышеописанных.

Установление структуры микелоата глюкозы. При кислотном мета-нолиэе гликолипид идентифицированный как миколоат глюкозы, распадался на аномерные мэтилглюкозиры и МЭМК, а при щелочном - на глюкозу и МЭМК. В обоих метанолиэатах присутствовало небольшое количество продуктов дегидратации МЭМК. Для достоверного определдения состава миколоильных остатков гликолипида последний гидролизирова-ли панкреатической липазой {Гордеев, 1991). Свободные КК(7> превращали в МЭМК (Уя) действием диазсметана и подвергали масс-спектрометрическому анализу. Также анализировали тридейтерометило-вые эфиры (с)3-Уа). структуру МК. анализировали как описано выше.

Для уточнения расположения миколоильного остатка и размера углеводного цикла, исследуемый гликолипид подвергали расщеплению по Смиту (Каг1зоп, 1979). Продукты расщепления били идентифицированы при помощи ТСХ и ВЭЖХ как МЭМК (7Я) и тритилглицорина. Отсюда вытекает, что в молекуле нативного липида миколонпьннй остаток связан с первичной кислородной функцией глюкозного остатка (при С8) и, что последний имеет пиранозный цикл.'

V

Таким образом, гликолипид, выделенный из клеток микобактерий, представляет собой В-О-миколоил-О-глюкопиранозу. отнесение моноса-харидного остатка к 0-ряду сделано на основании данных оптического вращения обсуадаемого гликолипида (табл. 1).

Исследование динамики накопления жирнокислотных производите углеводов'в процессе роста культур. ДМТ и ММТ являются высокоактивными имиономодуляторами [Оогеп И., 1002].Также ДМТ может применяться в иммунофврментном анализе при диагностике микобакториоэов, нокардиозов и коринвбактериоэов [Кевз1аг<Зо 2. о1 а1 1960]. Поскольку в настоящее время ДМТ и ММТ получают в препаративном масштабе путем выделения из клеток микобактерий и родственных орга-

Таблица 1

оптическое вращение в-О-миколоид-Р-глюкопираноза (III)

ИЖолоЗтйТ Источник Ьол/чеиия град. град. Литература

III M-seeeaatiB АТСС 362 +20,7 +290 Дан.наст.раб.

III Rhodoooooue вр. urr.44 +33,4 +270 Гордеев К.Ю. и

ДР. 1991

III C.diphteri&e +28,4 +185 [Brennan Р.et al

1970]

низиов, очевидна целесообразность изучения зависимости содержания этих ЖКЭС от возраста культур.

Исследованные кулдьтуры характериэувтся семисуточным ростовым циклом и весьма близкими профилями роста. Анализ гликолипидов проводился в точках, наиболее показательных для каждой фазы развития культуда (табл. 2).

Фракции ЖКЭС изучавшихся штаммов оказались одинаковыми а качественном отнощэнеии. Основные компоненты их идентифицировали хроматографическнми методами (рис. 3) и при помощи масс-спектро-метрии как Д(fT, ММТ и МГ.

В сумме они составляют не мене« 8ЭЯ каждой фракции. Присутствие в клетках большого количества МГ закономерно, так как культуры выращивались на среде с относительно высокой концентрацией глюкозы, Микобактерии отличались от родококка более высоким содержанием суммарных ЖКЭС во всех фазах активного роста, причем количество этой фракции увеличивалось у всех трех штаммов. В заключительной стационарной фазе уровень ЖКЭС у микобахтерий несколько снижался.

Доминирующий ЖКЭС у микобактерий были МГ. Если по содержанию дат и ММТ исследованные культуры мало различались, тс по уровню

МГ микобактерий значительно превосходили культуру рсдококка.

вирования системы 80:20:1 (СНСЬ3:Не0Н:Н20) обнаружено* Н?Б04 экстракты из: 1. Н. зтейпа^в АТСС 362,

2. И. впёйоа^з ИБВМ-44,

3. йЬоаососеив вр. ВКМ Ас 1162. .

Йг: ММТ - 0,35 МГ - 0,5 ДМТ - 0,7

Именно этиг! обстоятельством обусловлено более высокое содержание фракции ЖКЭС в микобактерий. Не исключено, что последним свойственна болье высокая эстераэная активность,- ответственная н* синтез МГ из экзогенной глюкозы. Направленность количественных изменений ДМТ у микобактерий и родококков совпала и характеризооэ-

Таблица 2

Изменение содержания ЖКЭС в клетках и в оСтх клеточных лилвда! культур миксбактерий и родэкокка в динамике

Культуры Возраст кулыурн в час. Относительная масса сухих клеток, в Содержание общих липздов в сухих клетках,в мг/г Содержание 1£ЗС в сухих клетках в мг/г (в общи клеточных липидах в вес. X)

Сугка ЖХЭС| мг даст ММТ

48 138 120 31,4 (28,1) 18,5 (16,3) 1,1 (0.9) 10,2 (8,5)

K.sneginatis 72 240 152 43,3 (31,8) 34.0 (22,4) 2.6 (1,7) 11,2 (7,4)

АТСС-362 120 360 216 67,3 (31,2) 54,6 (25,3) 4.3 (2,2) 6,9 (3,2)

144 380 168 49,3 (29,7) 37,0 (22,3) 6,5 (3.9) 5,3 (3.2)

48 150 100 35,6 (35.6) 20,7 (20,7) 1,7 (1,7) 12,6 (12,6)

K.snegnatis 72 213 127 50,8 (42,3) 34,4 (27,1) 3,9 (3,1) 11,8 (9,3)

ИБВМ-44 120 325 218 86,4 (ЗЭ,6) 63,4 (29,1) 9,8 (4,4) 12,4 (5,7)

144 344 202 78,8 (36,0) 53,2 (28,3) 12,4 (8,1) 9,7 (4,8)

43 155 57 14,8 (28,0) 4,6 (8,1) 0,5 (0,9) 9,5 (18,7)

Rodocoecus sp. ВКМ 72 222 80 24,3 (31,1) 8,6 (10,8) 4,4 (5,6) 11,5 (14,4)

Ас 1162 120 294 100 38,3 (38,3) 16,1 (16,1) 8,8 (9,8) 12,1 (12,1)

144 317 127 49,7 (-39,0) 12,9 (19,1) 16,3 (12,8) 19,8 (15,5)

«> За 1002 принята касса клетск в культуре на 24 ч. роста

лась повышенным содержанием этого гликолипида в процессе роста культур, причем уровень ДМТ повышался и в клетках и в суммарных липидах. Что касается ммт, jto их доля в суммарных клеточных липи-дах заметно уменьшалась. Наблюдалась также тенденция к снижению содержания ММТ в клетках микобактерий, у родококка отмечена противоположная тенденция.

По полученным данным можно сказать, что во время роста культур микобактерий и родококков отмечено различив в накоплении ЖКЭС. Для микобактерий характерно накопление киколоата гллкжозы как доминирующего гликолипида, а для родококков, наоборот, доминирующим являются ММТ и ДМТ.

Полученные различия в составе ЖКЭС в процессе роста культур микобактерий и родококков предполагаем, что могут бьггь использованы в таксономии для разграничения этих объектов.

Описанные результаты позволяют сделать некоторые предположения относительно биосинтеза ЖКЭС. Так как липиды этого класса входят в структуру клеточной стенки, накопление ДМТ и. в особенности МГ в клетках в период активного роста культур, скорее всего.связано с протекающим одновременно интенсивным синтезом элементов стенки.

Преимущественный синтез МГ говорит о том, что этот гликолипид едва ли является артефактом, обусловленным низкой специфичностью ферментативной системы, осуществляющей ацилировэння трегалоац ми-коловыми кислотами. Представляется приемлемой высказанная ранее гипотеза, что миколоаты глюкозы и других моносахаридов могут функционировать аналогично ДМТ и ММТ СНlunikin D.,1Я02, Petladge, 1882]. Убывание дели ММТ в заключительной стационарной Фазе, вероятно, объясняется преобладанием процесса его распада над биосинтезом в условиях снижения концентрации глюкозы в среде. В то же ар®-

мя синтез ДМТ продолжается и, отчасти, он может идти за счет накопленных ММТ. Сравнительно высокое содержание ММТ в клетках, преобладание их уровня над уровнем ДМТ в первые 72 ч. роста и соизмеримое содержание этих эфиров трегалоэы при дальнейшем культивировании свидетельствуют о том, что ММТ служат не только промежуточными продуктами биосинтеза ДМТ или медиаторами при построении ми-колоил-арабиногалактанного компалекса, но выполняют также иные Функции. Допустимо предположить, что находясь во внешнем слое ткани, вместе с другими липидами участвуют в формировании ее гидрофобного слоя, особенно, на ранних этапах развития'культур. Превращением ММТ в ДМТ может регулироваться степень гидрофобности.

Прикладным значением проведенного исследования является то, что судя по данным таблицы, выделение ДМТ иэ культур целесообразно осуществлять в заключительной стационарной фазе, когда и содержание гликолипида и количество биомассы максимальное, то же относится к получению ММТ из ВЪойососсив зр. ВКМ Ас 1162. Для выделения ММТ из микобактерий предпочтительнее использовать культуры в логарифмической Фазе роста - хотя ва этой стадии не достигается максимально возможный уровень гликатшид», в объеме культуральной жидкости, однако, очистка ММТ не осложняется присутствием большого количества МГ, трудно отделяемого при хроматографии.

Характеристика липидного состава бактерий семейства МусоЬас-1ег1асеае. Выращивание нокардиоподобных микроорганизмов на среде, содержащей в качестве источников углерода глюкозу и сахарозу вместо гексадекана (Ватракоа и др. 107В, 1884) оказывает влияние на качественный и количественный состав клеточных липидов и прежде всего жирно-кислотные производные углеводов (Батраков С.Г., 1985, И1пп iki.ii Р.Е.1982). Для выявления специфических особенностей такого направленного воздействия на бактериальный метаболизм рассмат-

рипаяи культуры, представляющие два таксономически близких 1>ода -микобактерий и родококки, всего 13 штаммов.

В качественном отношении состав всех образное общих липидо» оказался довольно близким. Основными компонентами их были малопо-лярние липида <2^-80% суммы липидов) - три и диацияглицерины, соо-бодныо негидроксилированные жирные кислоты, миколовые кислоты, носка, менахиноны и каротинсиды, фосфолипидо-фосфатилэтаиоланин (главвым образом) и дифосфатидилглицерин; нейтральные гликолипиды - ДМТ, ММТ и МГ.

Среди минорных компонентов в большинстве культур обкаруаены пептидолиды (Батраков С.Г., 1985; Короналли Т.В., 1984), причем в И. soegnatis АТСС 14468 и Rhodococeus sp. (И. laotioolun ВКМ В-853, И. rubrua 3 и H. rubruo 44) их количество соизмеримо с количеством ДМТ и ММТ. В Rhcdoeoccus sp. ВКМ Ac 11S2 отмечено высокое содержание моно- и диманнозидов фосфатидил-мио-инозита (около ЗОХ суммы гликолипияов).

О количестве суммарных гликолипидов и фосфолипидов в обшил липидах культур судили по содержанию в них углеводов и фосфата соответственно ( тчбл. 3 ).

Поскольку в 12 штаммах на долю ДМТ, ММТ и МГ приходилось на менее 95% всего количества экстрагированных гликолипидов, термин "суммарные гликолипиды" относится именно к этим трен компонентам. Исключение составляет культура Rhodoeoccus яр. ККМВ Ас 1162 (15. smegamtis АМ-ИМГУ-817 ), обогащенная маннозвдами фосфатил-мио-инозита. Из приведенных в таблице данных можно сделать вывод, что в общих липидах исследованных штаммов nnko6aktepv.il и родококко» уровень гликолкнидов приблизительно одинаков (0,1 - 0,3 м*юдь 1 гр). Однако весла заметно par адчие между представителями того и другого рода в количественном, соотношении г'ликолипили/^ое^лнгииг;

Таблица- 3

Содержание глико- и фсхчолипидоа в исследи зюаа культурах микобактерий и редокоххс®

Еудьтура Экстрагированные общие лилиям,иг/г СУХИ! клеток Лчгвдкый фосфат пкиш/г обдан лилэдее Моносахарида обеда ЛКПИДОБ, мналь(мг) /г Отноигиие моносаха-руи/фос-фат в общих лини— дах, к/м Жирко-кислотные эфиры Сахаров, % х об^им липидам (в кг/г сухих клеток)

АНТ МИГ ИТ

«ИКОЕАКТЕРИИ Н.зюздпаив АТСС 14488 25,5 0,13 0,16 (28) 1,2 1,6 (4,0) 7,8 (20.0) 8,3 (15,9)

Н.звейюйдз АТСС 607 10,4 0,16 0,17 (31) 0,3 6,8 (8,9) 10,0 (10,4) 1,7 <1,7)

И.гтеагаЛ-дз ИБЕМ-44 •40,3 0,20 0,30 (54) 1,5 4,4 (17,7) 4,5 (18,0) 26,3 <10в)

Н.г®е8гал1з АТОС 302 16,6 0,06 0,24 (44) 4,0 3,9 (8,5) 3.2 (5,3) 22,3 <37,0)

Н.рМеа АТСС 19249 12,6 0,18 0,19 (34) 1,1 6,7 (8,4) 7,0 (8,8) 7.1 (9,0)

ЙусоЬаЛегшт зр. ВКМ Ас 1168 5,9 0,09 0,11 (19) 1,4 5,2 (3,0) 4,3 (2,5) 2,6 <1,5)

Р0ДОЮ1КИ

й.егу1Ьгоро12я ВКМ Ас 1181 6,8 0,02 0,21 (38) 10,5 11,1 (7,4) 2,7 (1,8) 10,6 (7,0)

(М.виеовии ВКМ-В-462)

М*х)ососсш> зр. 11,5 0,02 0,14 (26) 7,0 4,8 (5,5) . 7,2 <8;3) 3,6 (4,1)

(М.ЬуаНпип ИБВМ-52)

РЛюЗососсив ВКМВ Ас 1105 5,4 0,04 0,12 (22) 3,0 3,5 (2,2) 0,9 <0,6) . 8,8 (4,4)

<Н.1асисо1ит ВКМ В-253)

№ос!ососеиз зр. ВКМ Ас 1162 10,0 0,10 0,25 (44) 2,5 2,2 (2,2) 10,8 (10,8) 12,8 (12,8)

(К.заедааиЕ АН-ИМГУ-817)

Р1юс1ососсиБ БР. ВКМ Ао 1170 7,8 0,03 0,17 (30) 5,7 1,4 (1,1) 11,4 (8,9) 5,7 (4,5)

(И.гиЪгии ВХН В-974)

ЕЬоаососсиз ер. (М.гиЪгив 44) 10,5 0,04 0,13 (23) 3,2 1.5 (1,5) 5,9 (6,2) 5,7 (8,0)

Шга1ососсиз др. (И.гиЬгип 3). 12,8 0,02 0,09 (17) 4,5 0,8 (1,0) 3,0 (3,8) 6Д (7,7)

{или липидные моносахарида/липидный фосфат), если для мнкобактерий оно находится, в основном, в пределах 1,0-1,5 (кроме M.smegBfit.is ВКМ В-1205), то для родококков составляет 2,5-10,5. Не исключено, что констатированное различие вообще характерно для указанных родов. ДМТ и ММТ'обнаружены во всех изученных штампах. В 8-ми иа ких доминировали ММТ, причем в И. snegeatia АТСС 14468, Rhodoeoceus sp, ВКМ Вс 1170 (И. rubrum ВКМ Б-874) количественное соотношение ММТ/ДМТ составило соответственно Ь,0:4,1:4,9 и 3,1. В штаммах ми-кобактерий - М. snegnatis ИБН М-44, Н. smegoatle АТСС 382 содержание обсуждаемых липидов было довольно близким. Существенное преобладание ДМТ (в 4,1 раза) наблюдалось в R. erythropolis ВКМ Ас 1181 (И. nucjBun ВКМ В-462) заметим, что аналогичное соотношение глико-липидов найдено ранее а П. erythropolis 134 (Батраков С.Г. и др., 1979).

По литературным данным ДМТ и ММТ являются объектами интенсивного исследования во многих лабораториях мира. Причина этому их способность стимулировать у млекопитающих неспрецифическую резистентность к патогенным микроорганизмам, а также противоопухолевую активность [Assjlineau С, Asselineau J. 1978; Coren Н.,1982, Verea J. 1883].

С этой точки зрения, безусловно, интересным, был штамм И. sueSmatis ИБВМ-44, клетки которого содержат 17,7 ИТ ДМТ и 18 нг ММТ на 1 г веса сухого вещества, значительно больше, чем описавыв в литература штаммы, используемые для получения тех жа гликолипи-дов. В особенности, это относится к ММТ, который в некоторых сообщениях (Батраков С. и др., 1979; Kurano S et al., 1987) рассматривается как минорный липидвый компонент.

Исследование токсического а.йстеия миркокислотных эфиром Сахаров по их ингибированию дыхавия митохондрии. Известно, что (Hin-

и1 Win D.E. 1062; Asselineau С., Asselineau J. 1978, Asselineau J et al., 3981, Rato К. Assolineau J. 1071, Durand E. et al., 1978) действие димлколоатов трегалозы (I) некоторых их природных и полусинтетических аналогов на митохондрии проявляется , в частности, в подавлении дыхания и фосфорилирования, снижении дыхательного контроля и разобщении окисления и фосфорилирования. В связи с этим, определяли влияние ЖКЭС из микобактерии на скорость поглощения кислорода (V) суспензией митохондрий в трех состояниях: 1. при наличии в суспензии только субстрата-малата с пируватом или сукцина-та с добавлением ротенона (V^); 2. в присутствйи акцептора фосфата - АО? (Va); 0. в присутствии 2,4-динитрорфвнола, (DKP)-разобщителя окислительного фосфорилирования (V^p ) .

При использовании NAD-зазисимого субстрата (малат+пируват) все три гликолипида подавляли дыхание, причем величина эффекта возрастала со временем. Аналогичную картину наблюдали другие авторы при изучении действия димиколоатоэ трегалозы (1) и структурно родственных липидов и объясняли ее медленным включением этих веществ в митохондриальную мембрану (Kato И., 1970, 1972). Скорость дыхания митохондрий на сукцинате, наоборот, увеличивалась гликоли-пидами (I-IXI), откуда следует, что торможение транспорта электронов в первом случае происходит на участке цепи переноса, предшествующем включению электронов от сукцина в общую цеп^>, т.е. на участке HADH-дегидрогеназа-убихон. Ускорение окисления сукцината может бьггь связано с активацией транспорта протонов через митохондриальную мембрану и сопряженного с ним транспорта электронов по цепи.

Такой механизм ускорения дыхания имеет место при действии агентов, разобщающих окисление и фосфорилирований, например, 2,4-динитрофэнола. В этом случае, одновременно падает скорость фосфо-

рилирования, что проявляется в снижении скорости дыхания в присутствии акцептора фосфата АБР(Уд) и падении дыхательного контроля (У^У^). Соответствующие измерения показали, что ЖКЭС (1-Ш) снижают величину Уд/У^ до 1 и менее при использовании субстратов обоих видов, т.е. они не только ингибируют транспорт электронов на участке НАОН-дегидрогеназа-убихинон, но и разобщают окисление и фосфорилирование.

Все три гликолипида (1-111), внесенные в суспензию митохондрий в количестве 100 мкг/мг белка, подавляли возрастание скорости дыхания, вызываемое ОНР; индекс разобщения (У^р/Т^) в присутствии гликолипидов снижался до 1 и менее. Таксй же эффект дают высокие концентрации динитрофенола, ингибирующие перенос через мембрану (Зки1асЬеу V. et а1 1986).

Поэтому можно предположить совместное воздействие ЖКЭС (I-III) и динитрофенола на транспорт протонов. Однако, с другой стороны, нельзя исключить и прямое блокирование гликолипидами цепи переноса электронов.

Из вышесказанного следует, что миколоат глюкозы (III) воздействует на дыхание митохондрий подобно миколоатам трегалозы (1-11).

ВЫВОДЫ.

1. При анализе 13 штаммов микобактерий и родококков выявлено, что соотношение жирнокислотных эфиров Сахаров к фосфолипидзм для микобактерий составляет 1:1,5, а для родококков - 2,5:10,5.

Указанный факт может быть с успехом использован в качестве хемотаксономического признака.

2. Из культур КусоЬае1ег1шп БюебяаЬ1з АТСС 302' И НусоЬас1в-г!ип ИБВМ-44 в;аделека фракция жирнокислоткых афирсэ■ Сахаров, методами ВЗЖХ, ТСХ и колоночной хроматографии разделена па

мкколоат трегалозу, мбномиколоат трегалозу и миколоат глюкозу, установлено, что эти гликоллипиды содержат миколовые кислоты се0"с70 с боковыми Цепями с16-с;2СГ Вделано ДО3 -типа ииколовых кислот -нормальные микиловие кислоты и миколовые кислоты, содержащие ме-тилькуто группу в качестве боковой цепи.

3. Доказано, что при выращивании ка средах с высоким содержанием глюкозы, наряду с димиколоат трегалозой и мономиколоат трега-лсэой, гликолипвдная фракция содержит миколоат глюкозы,

4. Изучена динамика накопления жирнокислотных эфиров Сахаров в процессе роста H. smegmet.is ИББМ-44, И. enegoatisATCC 382 и Rho-doocccus sp. ВКМ Ас 1162. Установлено, что для микобакторий характерно накопление миколоата глюкозы кпк доминирующего гликолипида, а для родскокков доминирующим является димиколоат трегалозы и мо-номиколоат трегалозы. Выделенние мономиколоат трегалозы и димиколоат трегалозы, известных как высокозффзктивкыо ммунномодуляторы, целесообразно осуществлять в логарифмической и в заключительной стационарной фазе роста и развития культур.

5. Исследовано токсическое действие жирнокислотных эфиров Сахаров на дыхание митохондрий и устаяовлепно, что все три гликолипида разобщают окисление и фосфорилированиа в митохондриях in vit-if о . подавляют дьосание митохсздрий при использовании малата и пиру-вата в качестве субстрата, но ускоряют его при использовании сук-цината в отсутствии акцептора фосфата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Буадзе М.О., Багалишвияи М.Г. Изучение липиднэго состава s динчмике каротиясинтезирующих микобактерий. Республиканская конф. молодых учеаыых на тему:"Достижения физико-химической биологии, бчохимими и биотехнологии народному .хозяйству". Тезисы доклада, 4

ноября 1307г., Тбилиси, с. 15.

2. Ненашев В. А., Гордеев К. ИЗ. , Дараселия Г. Я., Буадзе М.О. / Проневич Л.А., Батраков С.Г,, "Действие на дыхание митохондрий гликолипидних токсинов сапрофитных микобактерий", 2-я Всесоюзная конференция/ "Бактериальные токсины". Тезисы, 27-30 ноября 1909, Юрмала, Латвия, с. 92.

3. Гордеев К.В., Б"йдзе М.О., Дараселия Г.Я., Батраков С.Г. "Жирнокислотныа эфиры Сахаров микобактерий и родококков "Микробиология, 1991, т.60. вып. 2 с. 263-26".

4. Гордеев К.В., Буадэа М.О., Дараседия Г.Я., Батраков С. Г. "Количественные изменения в составе жирнокислстных эфиров Сахаров у нокардам.одобных микобактерий и родококков з процессе культивирования" . Прикладная биохимия и микробиология, 19Я2 й 2. С 230-гЪ5

эолпбо паовпь оьдап ь;осЮ

ЗП^&ОЛОЙГШХ» ЛСТС?а^ГМ06П1'» ^ЬЭПЛбУЮбПЬ иЬПЗПЗибЭЗОЗОоП бОЛ8ПЗЬОГО№

^зипйозо^гп (йэизс аБ.Ло)

ШГОЪП -- 1992

íoiÜQ^nqno ¿ujjnEgraííSrtb An^^ScíoG^'bg

Z3¿>¿. " ¿eO