Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Жизнеспособность и стабильность бактерии после лиофилизации и хранения в разных условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Жизнеспособность и стабильность бактерии после лиофилизации и хранения в разных условиях"

л-к А Д;Е М и/я 4Н АС С Р ; иистит ут м н к росмо л о гм й = - -

. Н а правах: рукописи

ДАНИЛОВА Маргарита Всеволодовна

«ИЗНЕСПОСОиНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ БАКТЕРИП ПОСЛЕ ЛНОФИЛМЗАПИП И ХРАНЕНИИ В РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ

•.• г, . -

(03; 00. 07 Микробиология)

(Диссертация ишшеана на русском языке)

. ; • А в т о р.о ф е р диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

- / М о с к в а - 1972;

тдикя нляосср

ШСТЮТ ШИРОЯОМГМ

На права! доогася

ШИЛОВА Маргарет* Всааолодоага

ИЗНШЮСОШХГГЬ Я СТШиМОСТЬ ЕОПМ ПОСД8

моыивзшя я тигню в разных условиях

(03.00. ОТ Ъкробаоаогаа) СДиссвргаши аапвсааа аа русском пш)

вассвртацаа аа сошскааао ученой сгвпвы канжиага баалогачвсквх ид

Москве -1972

гавота выполнено > Институте кякробиояогяя АЯ СССР

¡ ' \ ■"

На/чяи! руководитеja:

профессор, донор Сшологичеемх KajK В.И.КХДРЯВЦЕВ

Сфицяаядеые опповеиты: *

доктор виожогачеспх aajri Л. В. КАЛАКЛШЯЯ кандидат бяол ora ческах naja В.Д.£73Н£ЦСВ

'¡и

Диссертация направлена ва отвыв на Кафедр; мхкробяохогая Московского Государственного Университета мм. М.ВЛоаовововя

Автореферат ре вое л ал ^zkaSbfu 1972 г.

Звана шссемваав состожтся " /i k 1973 г.

ш /2. ЬО чесов на веселели Ученого совета Института микробиологии АН СССР, Москве 6-312, Профсоюзная уа.д.7, корп.2

С диссертацией мокио оявакоммея в бабаяоте» Института микробиология АН СССР. ^

Ученый секретарь Института микробиологии АН СССР кандидат биологических иву*

(Л.К.Осяицкаи )

Основной аадачей микробных коллекция является не только поддержание «иэвеепособностж культур, во и с охранен же вх диагностических и практически важных свойств* Ли» при этих условиях коллекциониру е мы е культуры оставтоя ценными как для вауки - в качестве живых образцов ранее описанквх ендов , так и для практики: промышленности, сельского хозяйства* медицины и т.л* Поэтому в микробных коллекциях постоянно ведутся исследования по изыскании методов длительного хранения культур в максимально стабильном состоянии«

Кетод хранения культур периодическими аересевеив на питательные среди трудоемок) кроме того, изменчивость микроорганизмов при частых пересевах возрастает (Имиевецкив, 1952) Кузнецов о сад »т., 1962 идр.у.

К настоящему времени описано довольно много способов длительного хранения микроорганизмов.без периодических пересевов. Это хранение на питательных средах в герметически закрытых сосудах (Настюков, 1896} Morto», Fulaekl, 1938) , в почве ( Gre«a, Fred, 195*) Wales, 1957} ioanell, I960) , на вате, фильтровальной бумаге ( u«ias, 1952), в IO^-aou растворе сахарозы (Вапаео, I893j Flötatwr, liaoson, I939}Nietbajnmas, 194?}. Успеано сохранялись дрожжи в виде спор но поверхности "голодного агара" Т Абрамович, 1952, 1955; Еурьян, 1958, I960;

Piionjl, 1963). Широкое распространение нашел метод хранения микроорганизмов на питательных средах под слоем вазелинового наела { lumie'r« ¿.,Cb«vrotier,J.,l9I4TpouKHit, 1929; Brual, 1930; Pari«!!, 1932; iulaeki, I958(0ordon,Smith, 1947(He*tee 11, 194?, 1953, 1956) Пумпянская, 1964, Надирова, Данилова, 1972).

Но все этя методы не исключают возможности изменчивости сохраняемых культур.

Поддержание культур в анабиотическом' состоянии более всего отвечает требованиям, предъявляемым к хранению коллекционных культур. .'./''

В состояние внабиоза культуры могут бьиь переведет путем охлаждения до -10° ♦ -1% (Колесов, 1959; Smith, 1961»

Ими* , 1952, 1963} Nu-tla,I964| Wallnau А«ы.,1966, 1971/

A.U.,Walde®,1964, I9?l),e также Л утек высувяваяня иэ замороженного с оо тоьиия - лиофилиэацивй.

При лкофялизации свободна л а непрочно связанная с гидро-филышаи вежестеакя клеток вода замерзает и затеи удаляется в виде пара, ынвун жилку» фазу.

Нетод лаофияизацин впервые применил Алътмаи в IS90 г•

В Советском С ошв его использовал о 1921 г. Лаппа-Отвр-яенецкий.- Лиофилвэацдя в Советской Сосав авале широкое применение, к сожаления», пока только в практике кедищшской иикрс-Скологяи для получения х о охране ни я вакцин, сывороток, антибиотиков, патогенных микроорганизмов.

8а первую половши нашего столетия были достигнуты бохьоне успех» в этой области, тек не пенао влияние различных факторов этого процесса на жизнеспособность и диагностически» свойства бактерий, особенно сапрофитных форм, но нашло должно? го отражения в литература.

Настоящая работа посвящена изучен*» и уточнению влияния различны* факторов диофилнзации да жизнеспособность бактерий. Изучалось влияние разных катодов и твмлеротур охлаждения, длительности пребывания материале в охлаждением состоянии при атмосферной давлении в в ивкууые, Кроме того исследовалось влияние степени обезвоживания на »иэяеолособиость бактерий как непосредственно после ллофилизаци», так и после длительного хранения в лабораторных условиях, а гакяге стабильность штт п диагностических а других свойств бактерий.

Диссертация состоит иэ введения, литературного обзора, раздела оосвявднного ыатеркавам и методам исследования, экспериментальной части, заключения, общих выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован № таблицами и 14 рисунками, в г заложении привелев список лиофилизированных бактериальных культур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились со следувдкмя коллекционным кудьтуракн:

Bfecterlun ртoilglosum B-85I*» Kocherlcbl» coll BKIt B-I25

leo tobaelllne агяМпэ» ВКМ В- 5 eu*

PeaudOBO&aa euxaatLaca BKU B-875 Pettudmoaas fluoresceas BKÍÍ B-54I BKM B-542 . ВКИ B-561

-•v. ' pjocj«oes BKIt B-527 Staphylococci)« «ureu» вки &-I28 Streptococcus faec»li« ЩЩ

Культуры для лиофилизации предварительно выращшвалшаь на иясопелтоввоы агаре . а куяътура Btieptococcu» feeceJ.1» -яа сусло-агаре в течение 48 tacos при 28°<

В качестве суспевзиоввых сред исполъвовалисъ: сехарово-желатино агаровая среда - с.я.а.(Файбяч, Тамарааа, 1945) к иолочно-лантозо-сахарс зкая среда-м.л.с. (Серавева» 1958)* и» обйих сред 6,8-7,0.

Густота суспензий в названных средах равнялась 10-15 млрд шшробшх клеток з I мл. Концентрация клеток определялась па стандарту иутностя ГКИСТ общего вазвачеквя.

Сусливзня рэелявэлвсь по 0,2 «л в ампул« из неЯтрадьио-го стекла с внутренний диаметром 6-7 ш.

Лвофилдзация культур проводилась в центробежно-сублюи-цнонном аппарате фирмы " Bigarda и (тип 30 И), в досушивание в сублимационном аппарате ток хе фириы (lira 80 BI).

ВКЫ - Всесоюзная Коллекция Кшфооргаяяэиов;

В - бактерии, 851 - номер втациа. «) ПСЙ - Государственный Коягррпьный Институт нсдидмсппх биологических препаратов ииЛ.А.Тарасеича.

Использовались два метода лиофилизвции; а) с предварительным охлаяденкеи бактериальной суспензии ври атмосферном давлении и б) с одновременный охлаждением к высушиванием пол ввкууион (центроОакков охлаждений ргватав, I944j Fry, Graa-v»B, 1955).

Ампулы с л и ил и гиро в |нвш! материалом запаивались под вакуумом при давлении ЫСГ: »

Выживаемость бактеряд определялась путем высева иа твердые питательные среды суспензии до i после лвофидизации я подсчета выросших колоний.

Остаточная влажность материала после лиофялиэацнн определялась в процентах согласно Государственной Фармакопеи СССР (ИэдЛ. 1968).

Б процессе лмофилизацаи регулярно производилась намерения температуры опытного иетериала.

Проложенный к це нтробвжн о-суОдима цво н н ому аппарату фирменный термометр имеет слишком большую постоянную времена (порядка нескольких минут)> которая но позволяет учесть лстия-пие кзаеяеккя температуры суспенеак.

Для устранения этого недостатка наии совместно с инженером Ев еловым С,К. был ра а работай к изготовлен электрический терммстер, рас читанный на измерения температуры в малых объемах исследуемого материала и кие щи й постоянную времени порядка нескольких секунд.

Диагностические особенности бактерий определялись согласно определителем Крас ил макова (1949). Берджи ( Berga у, 1957), раоотам Силена и Стерка (Seiden, Stark, 1943) , Да се и ко ( Lysenito, 1%I. Ста H мера ( Stanier et al.,

1?6ь), а также рекомендациям Ызкдуиародаого Комитета по номенклатуре СактераЯ [ sbew>û, Mi^nes, 1967).

ВЫЖИВАЕМОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНА КУЛЬТУ? ПРИ РАЗНЫХ МЕТОДАХ ЛИОШИЗАЦИИ

Выживаемость баятернальнык нультур непосредственво

посла лиофклиэацик с предварительным охлаждение«.

Подготовленный материал в ампулах охлаждался при нормальной атмосферной давлении до разных температур {-20°» -24°; -35°» -38°; -48°; -6СР и -75* -80°) в течение 5 ик-

нут, а затем высушивался под вакуумом в центробехно суОлимациоя-вом аппарате* Во время процесса охлаждения и высушивания производилась регистрация температуры испытуемого материале через интервалы в I и 15 минут, соответственно.

Результаты проверки выживаемости бактерий непосредственно после ах высушивания повволили выявит» следуюцуо общую для всех опытных культур закономерность: степень жизнеспособности бактерий, лиофилизированных после охлаждение их в течение 5 «им. до температур -24°; -35°*- -38°) -48°. оказалась практически одинаково«, в то время как охлаждение ах до -55°» -6(Р и -75°«- ,-80° приводило к значительному увеличению процента жизнеспособных клеток (табл.!).

Теним образом, наилучшая выживаемость бактеркй непосредственно после лмобилизации с предварительным охлаждением была в опытах с охлаждением во -55°» -80°.

Выживаемость бактерий непосредственно после лвофилиаа- ■

ции с одновременным охдажд ниек и высушиванием в ввкуумг

Опыты проводились с темп же итакмамк бактерий я с той же подготовкой материала, как и при лно&клкэ&цик первый методом.

Различие заключалось лишь в том, что культуры предварительно не подвергались действие низких температур пр* атмосферном давлении, а охлаждались одновременно с висуииве-кием в вакууме. Крот г о го, охлаждена« мая ро организмов Сило

Выплавное» бактерии (в ÄÖ непосредственно посла мобилизация с првдварительаыи охлаждопавк

Вид бактерий отаин BKU В Выживаемость при температуре охлаждения

-20?« 4P* о о &

B»ct.prodlgloau а 851 87,3 84,1 78,0. 90,1 92,3

Saoberlobi* еоИ 125 -X) 86,5 87,8 91,4 92,6

I^Ctotia о • arAblaoBus 5 - te 78,9 79,5

Pe.«or«&tt»6& 875 66,8 65,8 67,1 77,8 79,1

Ps, fluor* «мне 541 74,0 77,3 75,6 96,2 93,8

5*2 50,0 52,3 68,0 66,2

561 72,3 69,9 71,S 83,9 85,0

pyooyaaee 527 te 56,2 61,4 70,5 74,0

St»ph.»ur»u» 128 - 86,4 83,5 91,0 94,2

Btrep«. Га» о»Ii• 6 - £9,8 66,9 76,5 76,4

х)

В дапяоа к последукцих таблицах auax - обозначает.что опыт ие проводился*

ограничено температура«: -6* -9°; -12* -16° я -20t -24°с, поскольку аппарат фирмы "Эдуарде" рассчитай только на определенный температурный режим. '

При дяофилизацив бактерий в таких усдовнях иаблвдаетоя та ха обдан закономерность мх выживаемости, как я оря первом методе: чек вике температура охлаждения бактерий, независимо от того» проводятся ли оно до или.одновременно с высуииванием, те« больший процент их непосредственно после лиофнднзация остается в жменеспособном состояния (ем. тебя. 2).'

¿налив температурных условий процесса лнофкяизащш показал; что во всех вариантах вышеприведенных опытов время высушивания материала в воне отрицательных температур било различным.

Тан, еря лнофилизашм с предварительным охлаждением до -36°, -48°,-56° я -76°, оно равнялось 135, 235«'275 ■ 295 минутам, а в опытах с одновременным выоуяязаннем я охлавде-гчем до-9°, -16°, оно завертелось ца 50, 60 и 90 минут, срртаетстмвно.

Чтобы выяснять влияет ля на жизнеспособность СпитервЯ продолжительность временя пребывания ях пр» отрицательных м*-перйтурахв" процессе высушивания (Шля проведены соответствуй» кие опиты.

Поскольку технические возможно«! аппарата "Эдварде" не позволили вам увеличивать вто время, мы реями, используя подогрев сублимационной канери до +^0°,сократить его. Так » опытах о охлаждением до -36°, -48°, -56° я -76° время высушивания материала при минус овы х т емп ера турах • сокращаюсь примерно ва 50, 90, 100 и 135 минут.

Однако i при этом жизнеспособность бактернЛ оставалась приблизительно такой ко, как я в опытах бев подогрева сублимационной камеры (табл.З). ■"-■*

Следовательно, разная продолжительность пребывания в области отрицательных температур во время высуяяваиад не отразилась на жизнеспособности бакгеряв непосредственно после ях лиофилиааци.

е

Выживаемость бахтарма (в %%) вепооредствевво после одновремеавого эаморажжванм н выоуш«-заимя под вакуумом

Вид бактерий Ста мм БКУ В Выживаемое«» прм температуре охлахденяя:

-6*-9° —12*—16е! -20*-24°

Б«с&.ргой1е1оеит- 651 35,3 48,0 33,4

£ясЬ«г1е111& с о!1 125 57,9 , 89,0

• «гаМооои ш 5 - - 72,9

РевиЛоаоожв *ихалС1ас* 675 47,8 52,0 72,2

ГХиогввсепв 5*1 65,3 76,8 87,9

5*2 - - 58,8

561 40,8 49,2 70,1

руосушлтл 527 32 Л 39,1 53*6

128 53,6 £2,1 88,1

3 ЬгерС»£«е с*11е б 18,9 49,0 69,7

ю

Табдида 8

Выживаемость бактерий (в täö вепосрвдственво после лвофыжввши « подогревом сублвиацвонноЯ жамеры я беs него

Ввд баятерМ Штамм BKIf в 1СЛ0В1Я яяо- филнзацяж Выживаемость при температуре охлаждения

-20t -24° -SS* -38°. -45* -48® -55» -6СР -75* -80°

Bact.prodiglo-«ua 851 баз подогрева о подогревом 83,4 80,7 84,1 81,3 78,0 82,9 90,1 86,9 92,3 90,6

В.оall 125 бе а подогрева о подогревом 89,0 91,4 85,5 80,3 87,8 84,8 91,4 ао,о 92,6 88,4

мш S без подогрева с подогревом 72,9 65,4 — • ТВ,9 83,1 79,5 73,0

fi. 875 бе а подогрева с подогревом 72,2 74,6 65,8 61,1 67,1 66,Г 77,8 79,1 79,0 82,3

F».ilnoxe»c®u» 541 бе в подогрева с подогревом 87,9 86,1 77,3 74,1 75,6 73,8 96,2 95,0 93,8 95,1

542 бев подогрева с подогревом 68,8 56,7 50,0 54,0 52,3 49,0 68,0 70,4 66,2 70,3

561 беа подогрева с подогревом 70, I 66,7 69,9 71,0 71,8 75,6 83,9 80,1 85,0 82,2

-Г- pjocy»n*8 527 беа подогрева о подогревом 56,3 59,1 56,2 53,4 61,4 59,7 70,5 74,7 74,0 71,2

Stkph.knreu« 128 баз подогрева с подогревом 88,1 85,8 86,4 83,1 83,5 81,3 91.0 88.1 94,2 96,4

Str «pt * ÎU etile 6 беа подогрева 69,7 63,8 66,9 76,5 78,4

с подогревом 71,5 59,5 63,2 71,8 75,4

п

В опытах о предварительным охлаждением была изучена выживаемость лиофияизированкых культур при разной вродолжа-теяъвостж пребывания их ъ охлажденном состоянии при атмосферном давлении.

Для этого бактериальные суспензии охлаждались до температур -35»-38°í -45+-a3°í -S5*-60° м -75»-8tP и затеи выдерживались в втях условиях в течение 5 ж 60 кинут. Посже-дуицая лвофкливация их проводилась при температуре сублиматора 20»2<t°, конденсатора -45t-6QP, вакуума I.I0"3» а течение 7 часов.

В результате было установлево, что продолжительность предварительного охлаждении при атмосферном давлении не вмяла на степень жианеспособности бактерий непосредственно после лиофндиэацжя (табл.4).

ВЫЖИВАЕМОСТЬ К ОСТАТОЧНАЯ ВЛАГИ ОСТЬ ЕАКТБРИАЛЫйОС КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ РАЗНОЙ ПР0Д0Л1ИТЕШ10СТИ ЛИОШИЭАЩШ

Ди^клцаация о рредваоитрльцым дддаждением

Ампулы с бактериальными оуспензиами охлаждались до -35*-38°í -45*-4S°i*-55*-eÖ° п -75»S0°. Через 5 мяяут после пребывания их при зтих температурах они переносились в центров екк о -сублимационный аппарат. Процесс высушивания продолжался в течение 7 чесов прк температуре сублиматора 20i 24°, конденсатора -45t-6GP и при вакууме порядка I-I0 ,

После этого ампулы переносились на гребенки сублкмацио«-ной установки я половина ях через час, по достижение вакуума порядка 1-Ю"8, отлаивались. Вторая половина продолжала высуживаться еще 17 часов.

Зги сроки лкофилжзацки били использованы по тер соображениям, что по литературным данным, препараты, высуиенаые s течение 24 часов■ удовлетворительно хранятся продолжительное время. В условиях.наиих опытов ва 7 часов ухе заканчивался процесс сублимации.

и

Выживаемость бактерий {в ЗЙ)т»ласфилизврованнмх после' предварительного охлаждения их в течение разног»1 вре-

> меаи - к-: . • -

_ ■ . ■ - : ■■'.■■.■■ ■■■ в* ■.■■ (,: ■■■,■■:■: .->. ■г,.-.,':1 ii

: ПроДОЛ-i гитель-кость охлаждения в минутах' Выживаемости ори температуре охлаждения. , L. - ,

Ввд бактерий " Iiauit BUM В

л'.:-. ^■35* —38° -45*' -46° -55» -60° -75t -80°'

Sa'Ct .prodi gicw. ' . Л. ■ - 651 ; , • t * 'f •г М" . :84,1 • , - • J С." t . - 90,Г 92,3''

"" 60 "её ,2 ?; ,з 87,6 88, 6 *

К.coll 125 5 86,5 6V.8 91,4 92,6

60 89,1 ' 84,6 93,0 90,5

bttctobac.aj-tbl-аовиа 5 5 , - - . 78,9 79,5

60 - - - 68,7 66,9

Рй .аигйлМле» 8? 5 5 60 65,8 69,5 67,1 61,8 77,8 79,3 79,1 77,4

Ре .fluoreecene MI 5 71,3 75,0 93,8

60 72,0 80,4 94,0 94,6

542 5 50.0 52,3 68,0 66,2

60 ft? ,2 54,6 70,2 63,9

•»_ 561 5 69,9 71,3 83,9 85,0

60 74,6 75,4 84,1 88,3

—pjoc7<uie» 527 5 56,2 61,4 .70,5 74,0:

60 60, 8 57,8 72,4 70,0

Staph.Pursue 128 5 86,4 83,5 91,0 94,2

60 82,8 79,3 94,0 88,1:

Strepfc*feeli» 6 5 63,8 66,9 ■ 76,5 78,4

60 68,5 63,6 73,7 81,5

Цы р«шжли сравнить выживаемость ■ остаточву® влакиость в тех к других условиях ляофилизацаи.

Проверка показала, что выживаемость культур после 24 часового высуаиванкя колебалась в шврокжх пределах (от 43,4Ï до 87,Si) в вависимости от вида культура и условий проведе- ' яия опытов (табл.5J. Яри совращении деятельности высумв&вяя до 7 «асов ваблвдалось значительное увеличение количества жизнеспособных микроорганизмов (табл.5).

Так, выживаемость культуры Fe.ouraatiaca ВКН В-875 посла 24 часового высушивания я опытах с охлаждением до -S5+-360; -45t-48°ï -55+-600 и -75#-80° равнялась 50,0*1 54,23!: 68,9J» ■ 70,53¿ соответственно, а при совращения срока высушивания до 7 чесов она возросла до 65,8 k 67,77,8Í ■ 79,I¿, соответственно (табл.5).

Что касается величины остаточной влажности лиофклшзм-руекого материала, го ж опытах с 24 часовым высушиванием оаа варьировала от 0,7 до Ztt$ вяе зависимости от температур! предварительного охлаждения материала. При 7 часовом высушивании она равнялась 3,736-5,9*.

Ли обили эацмя с одновременным охлаждением ■

В зтмх условиях набладмесь та же закономерность в изменения величин выживаемости ж остаточной влажности,каш я при лиофнлкэацми первым методом.

В условиях одновременного охлаждения х высуаавения в вакууме процесс сублимации заканчивался аа 5 часов, поэтому одна часть материала исследовалась через 5, а другая через 24 часа высузмвания.

В нервом случае величины остаточной влажности и выживаемости были значительно suae, чем во втором (таОл.6).

Таи например, остаточная влажнооть ﻫ*nx»ft*l*ca ВКН В-875 посла 5-ти часового высушивания с охлаждением до -12е—16е и

«-20»-24° была a +,I3£, а после 24 часового высушивания ори тех же условиях она била равна 0,85£ * I.OCÍ.

и

Выживаемость я остаточная влажность бектеркй (в ДО после 7 я 24 часов ляофиляаацяв с предварвтельвш охлаждением

Вал (taxtepxtt

Upö-1

дол-

Штаны жи-

ВПК тель-

аость

лио-

филя-

аациж

в ча-

сах

Выживаемость при температур»

охлаждения

-35+-380

Эиж.х)

Ост.

M.I

-45t-4B

;)Вн:

ж.

Ост. вл.

-55«—60° -VSf-BO0

Выя

Ост. вж.

But.

Ост. вл.

B*et.prodl-gleaua 85t 7 24 84,1 58*3 4,0 1.5 78,0 4,9 59,8 1,0 90,1 4,6 82,5 0,9 92.3 5.2 83.4 I.I

ï.eoU 125 7 2« 86,5 70,1 3,8 2,1 87,8 5,9 69,0 1,7. М.4 5,2 83,1 1.6 32,6 4.8 82,8 0,7

lActob*«. «mblAoaa* 5 7 24 * - - . - 78,9 4,8 68.7 0,9 79,5 4,5 66,9 1.4

e* 875 7 24 65,8 50,0 3,7 2,1 67.1 4,9 54.2 1,3 77,8 5,5 €8,9 Z.6 79,1 4,7 70,5 1,5

Pa.fluor«»- 541 7 24 77.3 69.4 4.6 1.7 75,6 5.2 66,8 I.4 96.2 5,7 87.3 0,8 93,8 3,8 85,2 1,8

542 7 24 50,0 43,7 3,9 1,9 52,3 4,3 89,2 2,1 68,0 3,9 61,4 1,1 66,2 4,1 59,5 0,9

561 7 24 69,9 54,7 3,7 1.5 71,3 5,4 50,0 1,2 83,9 4,7 71,1 1,0 85,0 5,0 74.0 0,6

руоеуме» 527 7 24 56,2 43,4 4,9 I »2 61,4 9,9 49,0 1,6 70,5 3,8 66,1 0,9 74,0 3.8 67,8 0,7

St*pb.Aurea« 128 7 24 86,4 70,9 5,6 2,0 83,5 4,7 68,7 1,6 91,0 3,9 79, ? 1,4 94,2 8,7 80,1 1,2

fi tr>£t |ÍMM* 6 7 24 63,8 50,5 5,8 I,S 52,^.4 76,5 3,8 78,4 4,0 67,8 2,0 63,0 2,1

^ Вых. - выживаемость

Ост.вл. - Остаточная ялахвостг

Вьигиваеж.оть и остаточная^ влакностьйаатериЗ ' '("в '¿¿У"воем 5 я '2* часов" васуяаваяйя с одновременна'заыораливением в вакууме

Вид бактерий ,"г<' . Шта'мы ВКМ В Длите ль- : НОСТЬ : лиофа-лиэт- ■ цяи.,в-. >часах-; Шкив а см ость при темае-

■; - - ■-■-■■* ..... \ -го* -24°

1 - ..-■■ 1 Ост. ■вл. ; Вы*. Ост. вл.

ЕасЪ, ргос11д1о вив * 851 " ....."" г-; 48.0' .....г- - - 3,9 Л83,1 ■5,1—

24 ' 40,0 1.7 67,9 1,7

К.соЦ. 125 5 57,9 «.3 89,0 3,9

21 51,0 1,1 72,8 1,8

5 5 - - 72,9 5,3

повие 21 - 49,5 1,7

Pa.nurttnti.ftoa 875 5 52,0 5,6 72,1

21 41,9 0,6 56,7 1,0

Ря.ПиОгввсвпл 5« 5 78,8 <М 87,9 5,2

21 69,1 2,03 74,2 2,2

512 5 - 1 - 58,8 5,7

24 - - 49,1 2,0

561 5 49,2 4,0 70,1 3,8

24 40,0 1,5 58,5 1,8

руОсу<ил=а 527 5 3,9 56,3 4,4

24 гг.о - 47,5 2,3

ЗСaph.au!«ив 128 5 62,1 5,2 88,1 1,1

24 50,7 0,9 73,9 М •

6 5 49,0 5,0 69,7 3,7

24 37,5 1,6 51,9 0,7

Выживаемость в первом случае равнялась 52,0% и 72,а во вюром - AI,я 56,7% (табл.6). ¿нелогичные данные получещ* в о другими культурами.

Следует отметать, что в наших опытах величина остаточ-воК влажности ее зависела о« температуры охлаждения, в то время каж жизнеспособность культур повидалась с её понижением.

Остаточная влажность в пределах 3,7-5,93« долее благоприятна для выживаемости бактериальных культур,' чеиостаточ-вая влажность равная 0,7-2,3i.

ВЫЖИВАЕНОСТЬ ЛИ0&ИЛИЗИР0ВЛЯНЫ1 БАКТЕРИЙ 6 процессе длительного ХРАНИЛИ

Сиво! из вадач настоящее работы было определить,!'какие уел олив опытов больше способствовали сохранеивю бактерия. Хржтерием служила выживаемость лиофилиажрованкых культур посла 1,3,6,9,12,10, 24 в 361 месяцев хранения жх в темноте при 4*6° в ампулах запаянных под вакуумом (I-IO-®).

В результате установлено, что наибольшая гибель культур во всех случаях наблюдалась в опытах с предварительным охлаждением мх до и -75+-8Св то время-как иепос-

редетвеиво после лиофилизашш в этих условиях жизнеспособность жх была санов высокой. Так, выживаемо et ь Bact,pro4igioeu* ВЕН B-85I (высушенной в указанных условиях) за три года хранения яри 4»б® снизилась на 67,8% (с 83,4 до 15,65t, табл.7)j J.cöli BKU B-I25 на 65,1* (с. 62.3 до 17,2%); Fe^riuor»ec*ua BJC* B-56I - ва 5Э,8£ (с 74,0 до 20,2%). Авалогичные данные иолучены и с другими культурами.

Весколько меньжая гибель микробных клеток ваблодажаоь в опытах о предварительным охлаждением до -35»-38°, -45»-48° и с центробежным до -6*~9СР щ -I2+-I60 (табЛ.7-9),

Наилучшие результаты были получены с культурвыж, высу-венаыми с одновременным охлаждением до -20*-24°. Так, шживае-

36 месяцев - срок хранения не предельные. • Исследования продолжается.

IT

ИЮИКК

Nfi

Л i

Выживаемое» B&ct.prodigioau» ВКУ B-85I (я $0 ' после хравеаия в знофшшзированвои состоянии при 4*6°С в течение трех лет

Длительность хранения я

Суспензионная вреда

Выживаемость

Метод i температура охлахденяя

Центробежное

Предварительное

пах -6* -12» -16° -20*1 -24o] -35* -38° -45» -48® -55» -60° -75»

Контроль MCx) (непосред-отвенно ежа*' после лшо-филнзацкн) 40,8 27.0 40,0 30,5 67,9 53,6 58.3 42.4 59,8 46,7 82,5 73,4 83,4 71,8

I НЛО 32,1 34,1 65,8 44,0 43,0 66,7 7М

en 22,1 20,4 33,7 31,5 64,1 63,8

Э млс 27,9 31,7 62,1 33,5 32,3 53,5 55,2

ежа 19,8 17,1 44,2 26,8 22,9 36,3 38,0

6 НЛО 26,0 29,1 59,2 22,1 23,8 86,1 41,8

ежа 15,2 14,8 39,8 17,9 18,0 21,S 26,7

9 НЛО 25,3 22,8 57,8 18,2 - 25,7 82,0

ежа 13,4 10,1 32,6 13,3 13,5 14,4 20,2

12 нло 24,8 21,0 54,8 15,0 11,7 19,6 25,5

ежа 12,1 8,2 80,0 И,2 8,8 12,1 14.2

18 нло 24,0 19,8 S3.6 13,3 9,8 17,1 21,0

ела 10,0 28,X 9,0 6,6 10,2 12,8

24 нло 23,1 17,4 52,2 И,0 6.5 14,0 ПД

ежа 8,5 5,8 26,4 6,1 4,8 8.1 10,0

86 НДС 10,0 15,8 51,0 7,1 3,8 10,4 15,6

сна - - 23,9 8,0 2,3 2,8 5,9

г)

нло - миочно-лактозо-сахарозяая среда ска - сахарозо-хелатнно-агаревая среда

iu

мое» ВаоЬ.рго<И£1осит ВКН В-851 в этом случае аа три года хранения яри 4*$° снизилась диаь па 16,8% (с €7,9% до 51,И£, табл.7), и.со 11 ВКМ В-125 па 17,6 (о 72,6 до' 55,2£). 'Аналогичные результаты получены и о другими культурами.

Различная длительность предварительного охлаждения (5 и £0 минут) бактерий перед диофииизацней не оказала существенного влияния на их выживаемость не только непосредственно после вмсуливаннн, но и после длительного хранения (табл.в).

Сокращение временя высушивания » воне минусовых температур (диофилнеация с подогревом сублимационной камеры), не повлияло на жизнеспособность бактерий яерчсредственяо посла их лиофклизадки, но приводило к значи* ильному снижение хнанеспособностн после трех лет хранения (табл.9),

От степени обезвоживания ляофилиаироваиного бактериального материала в значительной мере зависит его жизнеспособность во время хранения.

Наиболее быстрое и значительное уменьшение жизнеспособности культур наблюдалось при остаточной влажности 0,7-2,3*.

Лучше сохранялись культуры с остаточной влажность» 3,7-5,9&> Эта закономерность наблюдалась у культур, высушенных обоими методами при разных вариантах температур охлаждения (табл.10).

Состав суспензионных сред, использованных при лиофи-лизации, также оказывает заметное влияние не жизнеспособность культур при хранении. Во всех вариантах опытов выживаемость культур, лиофилизкрованных в молочно-лактозо-сахаровной среде, быде»-эыве, чем в сахарозо-хелатнно-агароьой.

Выживаемость лиофмлнэированных культур проверялась после длительного хранения их при температуре '»+6°С, комнатной (Ш24°) и 37°С.

Выбор последней температуры определялся тем, что в ряде районов страны комнатная температура летом досткгеет 35°*40° я выше, и л политизированный материал часто сохраняют при этих условиях.

Таблица 8

Выхпаекость деятегъно сохраняемых баатарвй (в ляофилнзвроваяви после предварительного охлааеввя в. течете' 5 ■ £0 whjt -

Длительность . , Температура * длительность ошахдевяя .

Вед бахтеряв хранения в месяцах -45*-4SP -554-60° -7St-8CP

J : ■ 5 мвв. |,60 мая. 5 мяв. |й0 ия. 5 ми. [бСшш. 5 мвв. 60 мвв

Ba«t .prodigieeaa Ш S-85I Контроль (сразу посла длофхдязащи). 84,1 86,2 / 78,0 , 72,3 90,1 87,6 93,6 88,6

" 36 нес. 61,8 : 63,5 : 57,0 58,2 55,4 54,2 44,3 49,3

Контрой (срезу после лхофшшавцяя)

85,5 89,1 87,8 84,6 91,4 93,0 92,6 90,5

s.eoii CÓ нес. 76,2 , 75,0 61,9 60,0 56,0 54,3 47,4 41,3

Ш B-I2S Pe.aurtatlac* Контроль (сразу после лиофнляздцая) 65,8 69,5 67,1 61,8 77,8 79,3 t 79,1 77,4

ОД £-875 36 «0. 40,1 «,6 42,0 39,6 44,1 43,6 42,8 46,9

Тебя Ида 9

Выживаемость бактерий (в ЙО, лиофынвкровашшх о подогревом и баа подогрева сублимационной камеры, пооде 3-х лет хранения при 4»6°С

Вид бактерий Температура и метод охлаждения Длитель- Лиофилизвция

веян» в месяцах оев подогрева о подогревом

Вас • рго<И£1 о воя. ВЕи В-Э51 Предварительное при контроль (сразу пос-. да лкофилв— зации) 92,3 90,6

86 55,4 34,2

Е.соИ ВКИ В-125 центробежное до „ -20*-24° контроль (сраву посла лиофили-вация) 83,4 80,7

36 72,0 В3,5

предвари-* тельное ^-80° контроль (сраэу после лнофмлж-аации) 92,6 88,4

36 48,4 29,2

центробе*- контроль (сразу после лнрфшш-защш) 89.0 91,4

36 77,8 48,7

ВКМ В-875 предварительное контроль (оразу после лиофила-ЗЗЦИй) •79,1 82,3

36 42,8 25,7

центробежное до „ контроль (сразу после лиофили-вацим) 72,2 • 74,6

36 59,2 36,8

Хианаспособность Весь .ргоа1г1вшт ВКМ Б-851 , (в ЙЬ) с раэличвоВ степенью обезвоживания их в процессе ляофилнзацка после длительного хранения при

Длитель- | Выживаемость при охлаждении до;

ность хранения я 1-204-24° -35»—33° -45т-48с -55*-60<| - 75^-80^

иесяпах *** К* ч '¡Выи 1 Ост. 1 вл>

Контроль (непосредственно после лво-филиав-ции^ 83,4 5,1 84,1 4,0 78,0 4,9 90,1 4,6 92,3 5,2

67,9 1,7 58,3 1,5 59,8 1,0 82,5 0,9 83,4 1,1

I 82,2 5,1 81,3 4,0 76,7 4,9 01,5 4,6 83,4 5.2

65,8 1,7 Ч\0 1,5 43,0 1,0 66,7 0,9 71,4 1,1

3 80,9 5,2 79,1 4,0 74,8 4,9 74,2 4,6 75,9 5,2

62,1 1,7 33,5 1,5 32,3 1,0 53,5 0,9 55,2 1,1

6 79,0 5,1 76,5 4,0 72,0 4,9 71,3 4,6 73,1 5,2

59,2 1,7 22,1 1,5 23,8 £,0 36,1 0,9 41,3 1,1

9 77,3 5,1 73,9 4,0 69,4 4,9 68,2 4,6 70,0 5,2

57.3 1,7 18,2 1,5 ■ ■ _ 25,7 0,9 32,0 1,1

гг 76,2 5,1 70,7 4,0 65,9 4,9 66,0 4,6 67,9 5,2

54,8 1,7 15,0 1,5 11,7 1,0 19,6 0,9 25,5 1,1

1в 75,3 5,1 63,4 4,0 63,6 4,9 62,0 4,6 61,1 5,2.

53,6 1,7 13,3 1,5 9,8 1,0 17,1 0,9 21,0 1,1

24 74,8 5,1 65,0 4,0 59,6 4,9 59,1 4,6 52,0 5,2

52,2 1,7 11,0 1,5 6,5 1,0 14,0 0,9 18,1 1.1

36 72,0 5,1 61,8 *,0 57,0 55,% 4,6 44,3 5,2

51,1 1,7 7,0 1,5 4(0 1,0 10,7 0,9 12,8 1.1

зз

Проверке выживаемости бактерий через 1,6,9, 18 месяцев хранения при указанных условиях, показала, что микроорганизмы сохранятся значительно лучше при температуре рефрижератора, чем при 37°С и комнатной температуре. (Табл.11).

Нашгучяиа результаты получены при хранении их в условиях рефрижератора с температурой 4+6°С. (Табл.II).

При этом наибольшее снижение выживаемости лмофилизк-ррванных культур наблюдалось в течение первых 9 месяцев хранения. Затек интенсивность отмирания постепенно снижалась, а начиная о 12 месяцев и до конца наблюдений (36 месяцев)имела место лияь незначительная гибель микробных клеток.

Полученные данные свидетельствует также о том, что бактерии разных видов и родов, а иногда даже разные птекмы одного вида обладают неодинаковой устойчив стьо к лвофилиэа-ции и дальнейшему хранена» {табл.1-Н ).

Поэтому при лиофжлизеции бактерий следует учитывать не только отмеченные выше обаке закономерности, но и индивидуальное отношение микроорганизмов к процессу лиофилизании.

ВЛИЯНИЕ ЛИСТИЛИЗАЦИИ И ПОСЛЕДУЮЩЕГО ХРАНЕНИЯ НА ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БШЕРВЙ РОДА РЗШ00ИШ43

Изучение диагностических особенностей бактерий проводилось непосредственно после лмобилизации и после хранения их в высушенном состоянии в течение 12-18 месяцев. Контролем служила суспензия этих же культур перед лнофилизацией. Были изучен» морфологические а кулътуральные особенности культур, отношение их к различи«« источникам углерода, возможность »спользования кви различных органических кислот в качестве езшетятшого источника углерода, способность воси'гэцавяитть ннтраты, образовывать индол, ацетоин, уреаэу. Определялась л ни оптическая я протеадитичесхая активности, паличио катала-за, »Сразиьание деайрбокенлазы , лизине, орцитааа и дагидро-.; .>?.:( - от^оиечйе культур к раалкч«;*« итенжяи рП

■ кини^И Те «пера* Л-*:» рОСГв,

Табяща II

Выживаемость бактерий (в ЙО после длительного хранения их при разных температурах

Наименование культуры Температура хранения Суспензионная среда Дяителы мае гость хранения в mar

кШПрйнГ (сразу после лаофиля- ваошО I 6 9 18

Staph. «шг«иа 446° млс 73,9 72,1 68,3 67,2 54,4

ежа 70,4 68,5 63,6 61,9 59,2

ВКИ B-I28 I&+240 мяо 73,9 56,8 39,6 21,5 7,4

ежа 70,4 34,5 17.1 8,7 0,9

37° млс 73,9 29,3 18,9 1,0 0

ежа 70,4 IS,4 7,5 0 0

Bact.proûl- glOBub 4*6°

ВШИ Б-851 млс 67,9 65,8 59,2 57,3 53,6

ежа 53,6 49,5 39,8 32,6 28,Г

I8í24° млс 67,9 43,4 29,2 17,4 8,7

ожа 53,6 15,8 8,6 2,5 0

37° млс 67,9 20,9 4,3 0 Л

- сха 53,6 9 ¡2 0 0 0

Ps.âuTN*- 4t6°

tl»ca млс 56,7 53,3 46,1 41,7 S3,4

ВКМ В-875 сха 54,4 52,0 42,8 37,1 33,4

13*24° млс 56,7 49,1 25,4 19,8 9,9

ежа* 54,4 43,2 24,0 7,0 Г. 2

37° млс 56,7 25,9 И,2 1,0 0

- ежа 54,4 21,7 5,2 0 0

з*

Проведенные исследовании показада< что лмофиливацвя трех видов роде ГвеиЛотопае , а также длительное хрваеяве мх в течение 12-18 месяцев не вызвала качественных язмвнвняй вх даагвоствчедкмх свойств.

выводи

Подученные данные позволили сделать следующее выводы;

I. Температура охлаждения хкофнднввруемого материала являлась одкш из важнейших факторов, влипших не сохранение жизнеспособности бактерий.

В условиях яавих опытов выживаемость культур непосредственно после лиофилизации повывелась по мере понижения температуры их охлаждения, независимо от того, проводилось ли оно до или одновременно с высушиванием.

Однако,. культуры высупенные после охл ¿ждення до более ннэкнх температур (-55«-б0° н -75*-8СР) оказывались менее устойчивыми к длительному хранение, чем культуры охлажденные до -20»-21°.

В первом случае выживаемость культур после трех лет хранения снижалась на 51,8-71,9^,3 то врешь как во втором - я* 13.7-23.13i.

2.' Величина остаточной влажности препаратов оказывала Заметное влияние на жизнеспособность культур хан непосредственно после лиофилизации, так и при их длительном хранении. Остаточная влажность в пределах 3,7-5,9^ значительно более благоприятна, чем 0,7-2,

3. Ори разной длительности предварительного охлаждения (5 и 60 минут) бактерий перед лио^клизацией выживаемость микроорганизмов суявственно не менялась не только непосредственно после высушнвачня, но и после их длительного хранения.

Сокращение времени высушивания в гоне минусовых температур (лмобилизация с подогревом сублимационной камеры) не влияло на жизнеспособность бактерия после их лиофилизации, но приводило к значительному снижении ей после трех лет хранения,

5. При использовании молочно-лакюзо-сахарозной среды были получены лучаие результаты, чем о сехэроэо-жедатияо-агйро-вой.

6. Наиболее интенсивное отмирание микробных клеток яри гранении происходит в точение первых девяти месяцев. При дальнейшей хранении до 36 месяцев наблюдалось лишь Ивана читальное снижение ях кизнвспособности.

7. Температура 4*6° более благоприятная для длительного хранения лиофилязареванных культур! чей температуры 18*25 в, особенно, 87°.

8. Ляофилизация и последующее длительное хранение на вызывали качественных изменений диагностических свойств культур.

9. Представители разных видов и дацсе отдельные ятамш одного вида обладали разной устойчивостью к хиофидязациж и дальнейшему хранению их. Поэтому при лиофилизацям бактерий необходимо учитывать не только выявленные общие закономерности, но и индивидуальное отновение микроорганизмов к процессу лмофилизации и посладуадему хранению.

10. На основании полученных давних рекомендуется следующий режим лиофклизацик;

охлаждение материала до -20»-2<»0 с одновременным высушиванием при температуре сублиматора 20+26°, рефрижератора --45»-6(Я, при вакууме порядна 1.ХСГ3 (0,1-0,07 мы рт.ст,).

'■ Длительность днофиякзацки 5-6 часов.

Концентрация яиофшшзируемых бактерий в молочно-лакто-ао-оахароаной среде-около 15,млрд микробных клеток в I мл суспензии (по стандарту мутности ГИИ общего назначения). При таком режиме лиофшшв&цнн высушенный материал имеет остаточную влажность ■ : д

Используя этот режим в ВКН было успешно дмофилиаярова-ио более 400 ятаыыов бактерий, представляющих 191 вид в 34 рода.

Ляофидмамроваяные яами жулмуры хорошо сохраняются ужа

б лет.

»

По >ouo диссертация опубликованы следующие работы:

I* Надирова H.U., Данилова U.B., 196?. Хранение бактериальных культур пол минеральным наслои. В сб.Методы хранения коллекционных культур мнкроорга-. ниамов. Наука, П.

2* Данилова М.В., Надирова U.U., Кудрявцев В.И., 1967.

Лиофиаизация бактерий* В сб.Методы хранения коллекционных культур михрооргеянамов. Наука, Ы.

S. Данилова М.В.» Кудрявцев В.И,, 1970. Влияние температуры замораживания на выживаемость бактерий при лио-филизации. Микробиология, т.ХДСХ, вып. 6.

4. Данилова М.В., Надирова И.К., 1970, Влияние лнофилнэацин

на днагностические особенности бактерий рода Peeudotttoime, Известия АН СССР, серия биологическая, 6.

5. Надирова И.М., Данилова Н.В.» Сорокина Е.И., 1972. Изуче-

ние жизнеспособности-и стабильности характерных свойств бактерий) длительное время сохраняемых под минеральным маслом. Краткие тевиоы докладов на первой конференции о задачах н методах работы микробных коллекций СССР, К.

6. Данилова М.В., Сорокина Б.И., Надирова И.И., 1972. Дли-

тельное сохранение фитопатогеиных бактерий без периодических пересевов. Доклад на Всесоязной конференции по бактериальным заболеваниям растений. Киев (в печати).

Т-17втв от 37/Х1-72г. Фермат 80*8« 1/1В д,л. Обмм 1,73 л.л. Энн Тираж 300

Фа&рн» К П Гляьдого /Еимменни вычислительны* ЦСУ СССР