Научное обоснование методов консервации практически ценных культур и ассоциаций почвенных микроорганизмов

Сидякина, Татьяна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Научное обоснование методов консервации практически ценных культур и ассоциаций почвенных микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Научное обоснование методов консервации практически ценных культур и ассоциаций почвенных микроорганизмов"

11АУЧН0-+!ССЛЕД0МТЕЛЬСКИЙ ШОЕКТНО-КЖСТРУКТОРСКИй

иютиг/т ершадюЯ шошш

На травах рукописи

СИДЯКИНА Татьяна Михайловна

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОВ ШЕЕРВАШ ПРАКТИЧВЗКИ ЦЕННЫХ КУЛЬТУР И АССОЦИАЦИЙ ' ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность Q3.pO.23 - биотехнология

^ССЕРТАЩЯ

на соискание ученой степени доктора технических наук в форме научного доклада

Москва - 1992 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор, д.б.н. В.Г.Дебабов профессор, д.б.н. В.Д.Кузнецов профессор, д.т •н. В.Е.Матвеев

Ведущая организация: Научно-исследовательский -технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения.

Зашита состоится фвгСС^с^^Л_1992г. в часов

на заседании Специализированного Сове'та Д 098.09.01 в Еаучно-иссле-довательсшл проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу: 125299, Ыосква, ул.Клары Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии .

диссертация разослана " " ^/Ссс^хСб^с.^ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И.И.Гусева

" * " 1 1 ! ' - ' '

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ютуальность проблемы Биотехнология, являющаяся приоритетным на-[равлением научно-технического прогресса, тт^ши^! основе исяоль-|ует штаммы микроорганизмов, обладавшие уникальной полезными тойствами, важными дая праяттеского использования в пищевой и юдицияской промышленности, сельскохозяйственной и почвенной ми-фобиологии, экологии и охрана окружаэдей срадьг. Актуаинэйшей [роблемой является обеспечение длительной консервация практически 19ННЫХ культур с сохранением юс исходных солэзннх свойств. Берс-[ектшзы развития биотехнологии теснейшим образом связаны о крио->иологиёй и кржшзнсэрвациея микроорганизмов с целью их гаранти-юванного хранения. Однако существующие методы консервации на [ерекрывают спектр особо нестабильных при длительном хранении фактически ценннх культур. До настоящего времени отсутствовали юстоверныэ данные по сравнительному изучении жизнеспособности, 1яохимическо2 активности и генетической стабильности микроорга-[измовпри консервации различными методами. Практически не были ¡зучены закономерности сохранения жизнеспособности почвенншя ¡актериями при криоконсервации в виде смешанных культур и ассо-сиаций в естественном почвенном микробном сообществе, имеющие ¡ольшое значение нэ только для практических задач сэльсхохоэяйст-¡енной и почвенной микробиологии, но и для решения фундаменталь-юй проблемы консервации почвенных микробных ресурсов биосферы ! целью воссоздания утраченных биоценозов и репенкя ряда практи-[еских вопросов экологии и охраны окружающей среды. В связи с »Тим особое значение приобретает научное обоснование оптимальных гетодов консервация наиболее нестабильных при длительном хранены культур и практически ценных штаммов-продуцентов, а также ¡мешанных культур и-ассоциаций микроорганизмов в образцах почвы. (ель и задачи исследования Основной целью исследования являлось сзучение особенностей и общих закономерностей реакции микроорга-газшв различных систематических групп на погружение в криобиоз I выход из этого состояния для обоснования оптимальных методов :онсервации нестабильных при длительном хранении практически цен-[ых культур с сохранением высокой жизнеспособности, биохимической ютивкости и стабильности исходных полезных свойств, а такие ассоциаций микроорганизмов в искусственно составленных парных :.\;эсях почвенных бактерий и почвенном образце.

.Для достикения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи :

1. Получить сравнительные даяше о яиэаэспособности, биохимической активности и генетической стабильности отдельных видов микроорганизмов и штампов-продуцентов при консервации различными методами. Определить основные факторы, влияхвде на жизнеспособность и стабильность свойств микроорганизмов при консервации методами высушивания, х, - высеивания /высушивания из жидкого состояния^ низкотемпературного закорахиваиия на обезволенных инертных носителях, криоконсервации ультрабыстрым способом и с использованием предварительного программного зш.юра-хиванкя в растворах крио-протекторов.

2. Исследовать возможности к разработать приемы повышения устойчивости микробных меток к действию сверхнизких температур.

3. Определить оптинааьнкэ режимные парапотри /скорости замораиива-ния, т'шш и концентрации криопротекторов/ при криоконсервации клеточных суспензий и обосновать использование многоступенчатых ре>:>:кмов охлаждения с цзльа повышения сохранности наиболее чувствительных к эамораяшзааию клеток микроорганизмов.

4. Разработать' эффективные методы консервации наиболее нестабильных при длительном храпеник культур и практически ценных штаммов-продуцентов, перспективных для использования в биотехнологии. Осуществить их надежную криоконсервацзм в низкотемпературном бачке.

5. Исследовать влияние криоконсервации на искусственно составленные парные смеси почвенных бактерий и естественное микробное сообщество в образцах дерново-подзолистой почвы.

6. Разработать биоиндикаторы на основе консервированных культур бактерий для контроля работы паровых и воздушных стерилизаторов изделий медицинского назначения и биоиндикаторы сверхмалых доз излучения с целью их практического использования.

Работа выполнялась в группе консервации и анабиоза отдела ВКМ ИЕФМ Р.Ш в соответствии с планаш HHP и в ходе исполнения Всесоюзной научно-технической программы ГКНТ и АН СССР до Криобиологии 0. 69. 14. " Разработать и внедрить в различные отрасли

народного хозяйства технические средства и новые технологические процессы холодового воздействия на биологические объекты на 1985-1990 г.г.", задание 03.06Т "Разработать и внедрить технологические процессы криоконсервироваяия и сублимации микроорганизмов, используемых в производстве биологически активных веществ, кормовых антибиотиков, а такхе штаымов, применяемых в пищевой и медицинской промышленности".

Научная новина В результате проведенных исследований получены новые экспериментальные данные, позволившие установить оптимальные скорости охлаждения, тшш и концентрации криопротекторов при криоконсервации микроорганизмов различных систематических груш, чувствительных к стрессам при замораживании и оттаивании. Впервые проведено сравнительное изучение жизнеспособности, биохимической активности и генетической стабильности микроорганизмов и штаммоа-продуцентов при консервации различными методами. Определены основные факторы, влиявшие на жизнеспособность и стабильность свойств микроорганизмов при консервации различными методами. Показано, что лиофилизация приводит к резкому снижению биохимической активности птаммов-продуцентов /гддроксюшрувщей активности по отношения к 2,6-даюетилпиргдану гриба Ъ»аиуег1а Ъаяв1апь БКМ Р-2533 /АТСС-7159/, активности к деградации 2,6-диметшширидина бактерии АгЧ11гоЪас1ет сгуя^аЛЛоро! е!ея ВКМ Ас-1098, активности к синтезу алкалоида злимокпавияа гриба С1ау1соря яр. ВКМ Р-2609, ацетилредук-тазной активности клубеньковых бактерий ЕМгсЬ1ит рЬааеоИ 2620, ВгааугМеоЪ1иш ;|вроп1сшп 2490 И В. яр. 1ир1пиг 1614 /.

Установлены эффекты стимуляции метаболической активности некоторых видов микроорганизмов и штаммов-продуцентов при выходе из состояния криобиоза /ацетилредуктазной активности клубеньковых бактерий БгааугМгоЫлцз Зароп1ст 2490 и 15 • ЯР» Яир1ииа 1б14,поражае-мости полимерных материалов грибом АврегеШиз из^ав ВШ р-2502 и актиномицетом зъгеръотуссз ер, 63, активности к синтезу антибиотика цефалоспорина С штаммами-продуцентами гриба Асг«поддан сгуяогепип ВЙИИА-281А и ВНИИА-305Л., активности штамма-продуцента антибиотика линкомицииа актшомицэта streptoByc.es гоее-о1ц8 7 _ 219 » активности к синтезу алкалоида элимоклавина гриба С1аг1ссрз ¡¡р.ВМА Р-2609/.Эти эффекты сохраняются при повторной . криоконсервации и свидетельствуют о том, что воздействие на клетки микроорганизмов сверхнизких томператур является своеобразным стимулятором их ферментативной активности.

Предложено теоретическое обоснование разработанного и защвденного Авторским свидетельством на изобретение Д.с. СССР № 1442544,1988/ метода низкотемпературного замора,швания микроорганизмов на обезвоженных инертных носителях. Установлено, что предварительное снижение метаболизма за счет понижения температуры, частичной дегидратации и иммобилизации клеток на обезвоженных инертных носителях в присутствии криопротекторов способствуют повышению устойчивости микробных клеток к последующей криоконсервации. Впервые исследовано влияние криоконсервацни ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения^ 400 °С/мин на ассоциации микроорганизмов в естественном почвенном сообществе и искусственно составленных парных смесях почвенных бактерий. Показано, что подвижные грамотрицательные почвенные бактерии, обитающие в водной фазе почвы / peeudomonao /• устойчивы к криоконсервацни ультрабыстрш способом в воде без криопротектора, в то время как неподвижные грашоложительные почвенные бактерии / Artiirobbcter /. принадлежащие к твердой фазе обитания в почве, лучше переносят криоконсервации в стерильной почве, что позволяет сделать вывод о том, что учет естественной среды обитания может играть существенную роль при консервации почвенных бактерий.

Показано, что. при совместно! криоконсервации граштрицатель-ных и грамположительных бактерий наблюдается достоверное повышение устойчивости клеток почвенных бактерий к действию сверхнизких температур. Продемонстрировано, что криоконсервация является наиболее эффективным методом консервации почвенных образцов для микробиологических исследований и воссоздания биоценозов с максимальным сохранением исходного естественного комплекса почвенных микробных сообществ.

Практическая ценность работы состоит в применении полученных результатов и представлений для повышения устойчивости микроорганизмов к действию сверхнизких температур и различных стрессовых воздействий при дегидратации и заыораживанш-от таив анил, связанных с консервацией различными методами. Подходы, разработанные на основе проведенных исследований по оптимизации условий и методов консервации культур фонда ВКМ, а также практически ценных штаммов-продуцентов, перспективны при консервации микроорганизмов в различных коллекциях культур, низкотемпературных генетических банках, а такяе для длительного хранения микроорганизмов, используемых в биотехнологии, микробиологической и лицевой промышленности, сельскохозяйственной и почвенной микробиологии и других областях. 4.

Разработанные эффективные методы консервации микроорганизмов нашли практическое применение во ВШИ антибиотиков, МГУ, МТИЛП, Институте ■ сельскохозяйственной микробиологии РАН, Научном Центре психического здоровья АМН И, Институте дезинфекции и стерилизации МЗ Р5, ШО "Мосмедпрепараты" им. Л.Я.Карпова и других организациях.

Совместно с отделом физико-химических и химических мэтодое исследований и отделом биосинтеза биологически активных соединений ИБФМ РАН выпущен "Лабораторный технологический регламент на производство цефалослорина С" с "Методикой криоконсервациа гриба viceps spJSKM ?-260Э /2-х-этапное программное замораживание/".

Совместно с коллекцией культур ВНИИА выпущен "Опытно-промюлен-ный регламент на производство цефалоспорина С" с "Методикой крио-гсонсервации гриба Лсгеше.л1шп chryaogenum /3-х-этапное программное замораживание/". Разработан эффективный способ длительного хранения культуры гриба Beeuveria bassiana ВКМ i-2533 /АТСС--7159/ с высокой гвдрокешгирувдей активностью, позволивший предложить микробиологический способ получения препаратных количеств 2,6-бис /о кс из:,е т кл/п иридии а- ключевого продукта в синтеза лекарственного антисклеротического препарата "Паряздин" /A.c. СССР Д10942£8/ Оптимальные релсимы консервации, разработачныа для длительного хранения бактерии Arthrobac-ter ciyatollopoietea ВКЫ ас-10Э8, oöoc-йечивают сохранение высокой активности к деградации 2,6-диметилпи-ридина и практическое использование данного штамма для очистки сточных вод на коксохимических предприятиях в Донецкой области.

Совместно с Институтом дезинфекции и стерилизации Ь'З РЬ разработаны биоиндикаторы для бактериологического контроля парового и . воздушного методов стерилизации изделий медицинского назначения на основе высушенных на инертных носителях культур бактерий. Выпущены "Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов", утвержденные ЫЗ Р2. Долучен Акт по результатам положительных испытаний 150 биотестов в условиях лечебно-профилактических учреждений г.Москвы.

На основе лиофялизированных препаратов Р*- варианта бактерии Bacillus trevis varCB совместно с кафедрой биофизики и лабораторией антибиотиков Биологического факультета МГУ разработаны биоиндикаторы сверхмалых доз излучения. Проведены успешные испытания макетов биоиндикаторов в условиях орбитального космического полета на борту биоспутника "Космос-188?", подтвердившие перспективность использования разработанных биоиндикаторов в радиобиологии, медицине и космических исследованиях. 5#

Апробация Работы Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 13-та Всесоюзных и 15-ти Международных конференциях : Зой Всесоюзно!; конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии /Харьков, 1Э84/, 2-ой Всесоюзной конференции по анабиозу /Рига, 1984/, 2-ой Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" /Лущино, 1984/, 7-ом Съезде Всесоюзного микробиологического общества /Алма-Ата, 1985/, Научно-технической конференции "Охрана лесных экосистем" /Львов, 1985/, 3-ей Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" Д!осква, 1983/, Научно-технической конференции "Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур" /Вильнюс, 1983/, 18-ой Научно-технической конференции "Проблемы современной биологии" /Москва, 1987/, Меадународной конференции ЮНЕСКО "Достижения и перспективы развития криобиологии и криоыедицины" /Харьков, 1988/, 4-ой Всесоюзной конференции "Изучение грибов в биогеоценозах" /Пермь, 1Э88/, 3-ем Всесоюзном симпозиуме "Биодинамика почв" /Харку, 1388/, 6-ом Иожду-народном конгрессе по коллекциям культур /США, Вашингтон, 1988/, 'Международном симпозиуме по подведению итогов экспериментальных исследований на биосдутнике "Космос-1887" /Москва, 1988/, 8-ом Международном совещании Европейской организации коллекций культур /Пущино, 1Э8Э/, 4-о,1 Международной школе "Криобиология и лиофилизация" /Болгария, Боровец, 1989/, 1-ок Всесоюзном радиобиологическом съезде Д.осква, 1989/, 10-ом Конгрессе европейских микологов /Таллинн, 1989/, Международной конференции "Низкие тешаратурн - 90" /ЧСФ?, Мариенсяе Лазне, 19Э0/, 7-ом и 8-ом Всесоюзных совещаниях "Консервация генетических ресурсов " /Лущино, 1990, 1991/, 4-ом Международном микологическом конгрессе /ФРГ, Регенббург, 1990/, 14-ом и 15-ом Международных специализированных симпозиумах по дрожжам /ЧС$Р, Сыоленице, 1990, Рига, 1991/, 28-ой и 29-ой Международных конференциях Общества криобиологов "Крио -91" /Бельгия, Леувен, 1991/ и "Крио-92" /США, Итака, 1992/, 2-ой Меадународной конференции ВДЕСКО "Проблемы современной криобиологии " /Харьков, 19Э2/, Международной конференции "Теоретические основы криоконсервации " /ЧСФР, Градец Кралове, 1ЭЭ2/, Меадународной конференции по слабым излучениям и механизмам биологической защиты / Япония, Киото, 1992/.

С.

публикации Основные научные положения, выводы и рекомендации диссертации опубликована в 56 научных работах, в том числе в виде отдельных глав в 3-х коллективных монографиях по проблемам криобио-за, 3-х Методических руководств по методам консервации и хранения микроорганизмов. При участии автора подготовлены 4 кандидатские диссертации. Полный перечень печатных работ о участием автора насчитывает более 90 наименований.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

дбъектами исследований в зависимости от задач в проводившихся экспериментах являлись : l/актиномицеты - 3tr«ptonyo»s roseolus 7-219, шташ-продуценг антибиотика линкомищша МШ "Ыосмедпрепараты" и Str, яр. й 83 аз коллекции бкодеструкторов Института Ботаники АН Литвы, 2/бактерии - грамотрицательная неспороойразувдап почвенная бактерия paeudomonas deaitriXleens 2КЫ Б-892, грамположительнач почвенная 6aKrep2EArtbrotacter.erystaIlopoietea ВКМ Ас-Ю98,р|-_ вариант бактерии Eecillun brevie тяг.С-В из коллекции антибиотиков Биологического факультета МГУ, в. at«aroUieraophilus ATCS-7953 и БКИ Б—71В и в. lichenifoa-miB штамм о, S штаммов промышленных культур клубеньковых бактерий из коллекции лаборатории биологического азота ВДИИСШ -Rhisobiua aeliloti 17?3, Kh. triioli 1326, Eh. leguralaosaruB 1024, Kh, phaseoli 2620, Bradyrhizobiusi japonicua 2490 и Б. ер. lupinue 1б14,свеж8вьщеленнка из почвы и определенные до рода 7 культур грамотрвдательных подвижных /Рвеисссопаз/ И 7 культур грамяоложительных неподвижных /Arthrobaeter/ почвенных бактерий для составления искусственных парных смесей, 3/грибы -Ac remold urn chryscgentm ВНИИА-281А и ВШ1ИА-305А, штаммы-продуценты антибиотика цефалоспорина С из коллекции ВНИИА, Aspergillus ustua ВКМ F-2502 - из коллекции биодеструкторов, Beauveria baasiana ВКМ F-2533 /А2СС-7159/, Clavie«pa ар. ВКМ Р-2609, штамм-проду-цзнт алкалоида элимоклавина, 4/дрохжи - 4 штамма неспорообразукцих винных дрожжей Saccharonyceo cerevisiae (vtni) - Массандра ВКМ-У-1842, .4 21 ВКМ У-552 Шампанская раса, В-41 Хересная раса и BS-76-12 - Беспенная раса - из коллекции кафедры виноградных производств MTliim, 5/генетически маркированные штамма и клоны из коллекции лаборатории молекулярной генетики ВЩ психического здоровья РАЖ, 5/свежеввделенные образцы дерново-подзолистой почвы с территории почвенного стационара факультета Почвоведения МГУ.

Методы исследований Микроорганизмы, исследованные в данной работе, выращивались как в условиях периодического, так и непрерывного культивирования. В качестве питательных сред использовались как полноценные естественные, так и синтетические среды с различными добавками. Конкретные условия культивирования и составы питательных сред указаны в публикациях. Для консервации использовали культуры в стационарной фазе роста, исходная концентрация клеток в суспензии составляла 108- 1010кл/¡.ш .Методы консервации подробно описаны в Методическом руководстве /21/.Програ1мное замораживание культур осуществляли на приборе ЗПБ /производства СКГБ с ОЛ ИШ и К АН Украины/ и R 201/200R фирмы "Планер" /Англия/.В качестве криопротекто-ров использовали 10^,20% и 40^-ные растворы глицерина, 125? и 24^-ныо растворы сахарозы, 5$ и 10^-чые растворы ДМСО, 5% раствор трегало-зы, лошадиную сызоротку с кезо-инозита, 5% ДМСО + глюкозы. Для крпоконсервации использовали металлические контейнеры,пластмассовые и стеклянные ампулы объемом 1,5-2 мл,куда вносили по 0,2 мя суспензии клеток.Замороженные культуры хранили в жидком азоте при -196°С. Размораживание осуществляли при 3?°С со скоростью отогрева ~1вО°С/мин.Низкотемпературное заморакквание микроорганизмов на носителях осуществляли путем нанесения густой /ЛО10 кл/мл/, охлазден-.ной до 4°С суспензии клеток в 10^-ном растворе глицерина на предварительно обезволенный силикareль.Ампулы с культурами хранили в парах азота при -150°С, в холодильнике при -70°С и 4°С/контроль/. Лиофилизацию осуцеттвляли на центробеяно-сублиыационной установке фирмы "Эдварде" /Англия/до остаточной влажности*/ 23.Определение остаточной влажности проводили на ИК-спекгрометре М-1106 фирмы "Диакон" /США/.Лиофилизированные препараты хранили при 4°С в темноте. Регидратацию лиофилизированных препаратов проводили путем добавления 0,2 мл стерильной водопроводной воды и выдерживания клеток в течение 30 кинут при комнатной температуре перед высевом на соответствующую питательную среду. Высушивание микроорганизмов достигалось в результата дегидратации клеток на различных инертных носителях /фильтровальной бумаге, стекловолокне, алюминиевой фольге, активированном утла, обезвоженном силикагеле/ при температуре 20°С. L - высушивание проводили в камере при 25°С и остаточном вакууме 0,1 мм рт.ст. в течение 16 часов. Для высушенных препаратов проводили "тест на ускоренное хранение" при повышенных температурах с целью определения эффективности защитных сред /Griffin et ai.,l98V.

В качестве защитных сред использовали 10% обезжиренное молоко, сахарозо-келатиновый агар /10% сахарозы, 1,5% желатины,0,1$ агар-агара в бидистиллированной воде/,12$ сахарозу, среду ГДИ /2% глю-тамата натрия,Ъ% декстрина,7,5;? инозита, рЛ 7,0/, среду ГД2 /5% глютамата натрия,5% декстрина,5% лактозы, рН 7,0/, 2% мальтозу, среду Ш глютамата натрия, 5% лактозы,полквишшгаролвдона, рН 7,0/,лошадиную сыворотку с 5% мезо-кнозята, бычьв сыворотку с Ъ% мезо-инозита, 5% трегалозу, таблетку сухого молока,10$ и 20;? растворы глицерина.

Определение жизнеспособности микроорганизмов после консервации осуществляли методом предельных разведений. Для контроля жизнеспособности ставили по три опыта в катсдой серии экспериментов, для каждого варианта опыта брали по три ампулы с культурой и проводили параллельный посев на три или пять чашек с твердой питательной средой для каадого из трех последующих разведений.Результаты обрабатывали методом Стьядента. Титр жизнеспособных клеток определяли как в %-аон отношении числа колониесбразутацлх едацин после воздействия режимов консервации к их числу до консервации, принятому за 100$, гак и в значениях десятичного логарифма числа жизнеспособных клеток iG у .в некоторых опытах определяли также доверительный интбрэал значений по специально разработанной программе для автоматизированной системы обработки данных на "ЕС 1010". Жизнеспособность ГркбаЕсаиум-ш bassiana ВКМ 5-2533 /АТСС-7159/ тосле криоконсервашш в ввде агаровнх дисков оценивали по диаметру макроколоний,выросших вокруг них /saitk,Onions, 1983 /.Жизнеспособность гриба ciavic eps 9КМ F-2S09 оценивали по 4-х балль-юй системе :1 балл-25^, 4 балла - 1001?. При низкотемпературном вамораживании культур на обезвоженных носителях жизнеспособность шределяли качественны;.! методом путем оценки роста на твердой гитательной среда.

'енетичвскую стабильность оценивали по сохранению селективных [ризнаков устойчивости к антибиотикам,обусловленных маркерными •внами в плазмидной ДНК /6hui-.arm,i9ao / и по сохранению нативной ¡труктурфекокбинантными молекулами. Выделение плазмидной ДНК, >асщеплзнке ее рестриктазами и электрофоретичесКий анализ рестрикт-ых фрагментов ДНК проводили по общеизвестным методам далекуляр-ой генетики / Маниатас с соавт.,1984/.

Одгадвлакке биохимической активности штамма-продуцента линкомищша Str. roscolus 7-219к синтезу антибиотика проводили методом диффузии в агар с использованием тест-культуры В.stills лтсс-6633. Определение активности бактерии Arthrobacter csystallopoiétes В1Ш Ае-10S8 к деградации 2,6-диметилш1ридина проводили спектрофотометри-чески в максимуме поглощения на длине волны X =268 ны на приборе n Hitachi - 200-20" /Япония/.Антибиотическую активность к синтезу грамицидина С Р^-варианта бактерии В. trevis СВ определяли методом дп!)фузки в агар, тест-культурой служила B.subtilis АТСС-720 /Кочет-кова,1932/.Содержание ATi в клетках определяли биолгоминесцэнтным методом с использованием иммобилизованной люцифоразы светлячков /Угарова с соавг.,1987/.Активность гриба ciarleops ВХМ F-2609 к синтезу элимоклавша определяли спектрофотоштрачоски методом /tíichclan,KoiiH«a-> 1363/,Антибиотическую активность гриба Асг. oh.rvi3ocenuia к синтезу цефалоспорина С определяли по методика /ciaridge et al.,lS7о/. cö уровне гцдрокедлирушэй активности гри-öaBcauveria b&ssituia B-v.! F-2533 /АТСС-715Э/ судили до количеству 2-мэтал-6-оксиштЕтирвдина, образующегося при трансформации 2,6-диметиллиридина в пересчете на г сухой биомассы/ Егоров с со-авт.,1985/. Сбраяизавщая способность винных дроктей определялась по сбраживанию виноградного сусла сахаристостью 18,5% в колбах с бродильными затворами по общепринятым в виноделии методам /¿пудель, Короткевич,1980/. Симбиотическуэ эффективность и азотфиксирувщую активность клубеньковых бактерий оценивали в условиях вегетационного опыта.Содержание азота определяли по методу Кьальдаяя /Яочи-нокД973/.Азотфиксирущую активность штаммов оценивали по уровню редукции ацетилена за 1 час корневыми системами пяти растений Алисова с соавт., 1932/.Статистическую обработку результатов проводили с помощью общепринятых критериев /Доспехов,1972/.Скорость выделения СО2 почвенными образцами до и посла воздействия режимов консервации оценивали методом газовой хроматографии /Цаников,1984/. Статистическую обработку полученных данных проводили по общепринятым в почвенной микробиологии методам с применением дисперсионного анализа /Дмитриев,1972/. В представленных иже Таблицах и рисунках указаны средние значения экспериментальных данных для трех независимых определений исследованных параметров. Среднеквадратичное отклонение во всех опытах не превышало - 5%.

3'.- РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЗЩШЕ Хизрэоцособяость и биохимическая активность микроорганизмов

шш консервация различными методами

Сведэния, касающиеся влияния различных методов консервации на сохранение кизнеспособности и биохимической активности микроорганизмов весьма ограничены и разноречивы /Рапопорт, 1988,ЦуцаеваДЭ87, К1гяор,Зпг11,4 984, ЕИагр,1984 /. Исследования, проведенные нами на представителях различных групп микроорганизмов - актинокицэтах, бактериях, грибах и дрожжах - позволяют сделать вывод о том, что выбор оптимального способа консервации, обеспечивающего сохранение высокой жизнеспособности и исходной биохго/лческой активности, индивидуален для кэадоц культуры и даже шта\ма, причем корреляция между сохранением жизнеспособности и метаболической активности при консервации некоторыми методами не наблюдается.

Бактерия АгЬЬгоЪасЪ ег сг-уй^аНороАсгез ВКК Ас-1098 обладает высокой активностью к деградации 2,б-диметялоиридила,однако для практического использования ее при очистке премнпленных сточных вод от токсичэских пиридиновых оснований необходимо было обеспечить сохранность полезных свойств в течение длительного времени. Нами было установлзно, что при лкофплизациц в 10$ обезжиренном молоке данная культура сохраняет высокий титр жизнеспособных клеток .близкий к 90/о, однако активность культуры резко падает и составляет менее 25% от исходного контроля до консервация. В Таблице 1 представлены результаты контролем жизнеспособности и биохимической активности культуры после лиофилизацик и криоконсервации в различных защитных средах сразу после консервации,через 6 и 9 месяцев хранения.

Хизиеспосслиоапь и ахгшЬдата к деградации 2.6-8цметидпириЗина

бактерии МЬгоЬайег сг^аНорсМез Шд Ас- Ш пси хранении

ТабпицаТ

Способ коисерЬации Защитная среда Титр жите способных клеток и охтиЬносто, Ь '/¿-ах

1 сутки 6 месяцеЬ ЗмгоцеЬ

юлкгепо• «Ймость акяАиошь хизиеспо-«Яиссгаь штйисть жюмеспо-ссби&спъ жтйность

шршодия 5Х«ч>«шива » И 95 Л й

лоиш5ина» СУЬо-ротка с 5хиншпа Н ?е и 55 95

та5пгтм <ч*ого мелом 50 96 » £5 95

1фиж(№серКация 102 мицерин АО 96 35 88 35 £3

Щ. ешцюм <0 9в ■ 0,75 59 0,« 59

«оша&дна» сыЬо-ронка I йиномяпа ?.о 100 10 <00 \ 20 100

551пц1еголоза 27 95 20 85 не опреЗ. неопрй.

(Ьимечомиб'. м Ш1. иую оклпиЬюспи. пришто утипизодая 2,6-<!иыетия>\ири-

Зина за М часа

Криоконсорвацяа культуры ультрабыстрым способом со скоростью ох-ла-вдения ~ 4СО°С/мин в лошадиной сыворотке с 5% мезо-идозита дает наиболее стабильные результаты по жизнеспособности и активности культурц-способность к деградации 2,6-дкматгшпиридияа сохранялась яа уровне 100% в течение всего времени наблюдений,что позволило рекомендовать данный штамм для практического использования в биотехнологии и охрана окружающей среды.

Грамотрицательная яеспорообразующая почвенная бактерия рвеи_ ¿оеоглш йсгШгХПсапд ВКИ Б-В92 является основным денитрификатороы почвы /Звягинцев,1987/ к широко используется в биотехнологии,почвенной и сельскохозяйственной мшгробиологии.Данный шташ обладает слабой устойчивостью при длительном хранении и при лиофилизации в 10/» обезжиренном молоке титр жизнеспособных клеток составляет лишь 2-6% и падает в 10 раз в течение 4-х месяцев хранения при 4°С. В Таблице 2 представлена результаты исследований жизнеспособности культуры при лиофилизации и криоконсервации суспензии клеток в водопроводной воде.Для всех вариантов защитных сред жизнеспособность культура после лиофилизации била в 4-5 раз ниже,чем после криоконрервации, и резко падала при хранении даже при 4°С. Нами было установлено, что криоконсервация и хранение в жидком азоте не только способствует полна:"/ сохранении сеойств штамма,но и обеспечивает максимальный титр жизнеспособных клеток,близкий к 100;?, и его стабильность при использовании как предварительного программного замораживания, тах и яри ультрабыстром режима охлавдешш.

I Жизиоспособиоста кцпьпцры 5октерии Р$еис1отопо5 бепМот ЬШ Ь-%9

_____ ________________ ., .„„л. «.„.О,,,............... „...... 1 1.5____I

поспг пиофитвацин и кршшшЬсмш (испеизш шток Ь ЫсгеюЬойной Ьойе

/штамм - осиоЬной йеиищшсрикатср псиЬы/ Таблица 2.

Способ юисерЬации Режим шсерЬацш Титр хи5н«спо«5ных клеток

хритротешор ¿окаир&иш < СНИЖИ (.^иеацо { 6 мвдчеЬ

% |та1 г

¡шришзздя )&м цеитрифд • кдоомиги ш1м»т«м с шамтсм 9,£7 (00 V Т.02 1-4 [мвфЬмиш

СЖА 8, ОТ юо 7,75 0.1-2.0 —'—

Н,0 8,» <00 8,65 (УИ 6,83 1М-ц|----

ЯижаигерЬоди 4% сакарма 9,7< <00 0.65 55-И0 9,7< 59-«I 9.И 66-85

Щ глицерин ЯП ш 8.05 Й-Й 9.65 Й- «0 9.3 ¡0-61

1У2 461 (00 Я« 9,6< и- ад а.ет «V1М

ггдагщмма! (Ц^/тГ) й'1 гагарою 9,71 ж 9,Г7 50-93 д.во 87- (00 5,15 м-100

Щ глицерин «,гг <00 «,<6 (4-Т6 8,55 Й-Й 1,75 К

М <00 8.51 Я- 81 9.51 61-12 491 59-И

п,>ащш 9 И'1 сахароза ш 9,(1 59 91 9, И 51-М 1.91 55-91

1<1'Ц »личерин 5,11 <00 5-22 9.05 5- 96 1.91 5-17

М. 0.6} ж •«.15 »■(00 9.61 Р.-Щ «(

Характерной особенностью данной культуры, являющейся представителем подвганых почвенных бактерии, связанных с водной фазой обитания в почве, 'является ее высокая устойчивость ¡с замораживанию уль-трабыстрим способом э воде без криопротектора, что .«дает Сыть связано с приспособленностью штамма к выживанию в естественной среде обитания - водной фаза почвы с наступлением заморозков.

Криоконсорвация обеспечивает высокую жизнеспособность и сохранение специфической агрессивности /поракаемости полимерных материалов/ микроорганизмами-чЗиодеструкторами з*гср1;оиуеся ср. й 83 и Д-зрегсШиз ив*из вш Р-2502. Наиболее интересным фактом, установленным нами, является увеличение биохимической активности обоих штаммов после криоконсервации в 1,5-3 раза, причем наблюдаемый эффект сохраняется при длительном хранении в жидком азоте.

С целью оптимизации и научного обоснования метода консервации гриба ВеаигеПа Ъаза1апа ВКМ Р-253Э /АТСС-7159/ С сохранением ГИ-дроксилирующей активности и способности к трансформации 2,6-димэ-тилпиридина нами были проведены исследования влияния различных способов хранения на жизнеспособность и гидроксилирующую активность по отношению к выход}' 2-метил-6-оксиметилпиридина при консервации культуры как в вида спор, так и вегетативного мицелия. Было установлено, что способ консервации оказывает сильное влияние на сохранение культурой ее полезных свойств. При хранении гриба методом субкультивирования выход 2-метил-6-оксимэтшширидина сильно падает и составляет лишь 14,4$ от исходного контроля, а при хранении спор в стерильной почве - 28,8%. После лиогёилизации суспензии спор в СНА и 105? обезжиренном молоке выход 2-мэтил-о-оксиметклпиридина составляет, соответственно, 36$ и 62,45?. Криоконсервация суспензии спор гриба в 20% глицерине также дает значительное снижение выхода 2-метил-6-о ксиметшщиридкна до 28,5%. Нами также установлено, что при криоконсервации спор гриба наблюдается изменение реакции окисления к образование ц - оксил- 2,6- диметилпиридина. Изменение гидроксилирующей активности отсутствует при криоконсервации мицелия гриба в виде агаровых дисков, замороженных ультрабыстрым способом. Криоконсервеция культуры в виде агаровых дисков, несущих на своей поверхности мицелий гриба, со скоростью охлаждения -V 400 °С/мин как в 10% растворе глицерина, так и без криопротектора обеспечивает выход 2-метил-б-оксиметилпирйдина на уровне, достоверно превышающем исходный контроль до консервации - 1,25 мг/г или 102,4$.

Хотя известно, что споры микроорганизмов гораздо более,чем вегетативные клетки .приспособлены к переживанию стрессов при дегидратации и замораживании-оттаивании, связанных с режимами консервации, однако в случае данной культуры оказалось,что для сохранения исходных полезных свойств наиболее целесообразно использовать криоконсервации мицелия гриба. Высокий уровень жизнеспособности ж стабиль-кость гидрокоилируицэй активности при длительном хранении, в жидко» азоте позволили рекомендовать этот метод для консервации штамма о цель» его проыыиленного использования в экологии,биотехнологии и. медицине.

Нами было изучено влияние режимов лиофшшзации и криоконсерва-цни на жизнеспособность и биохимическую активность 4-х неспорообра-зуюцдх штаммов винных дрожжей Заееьдготусез вегег1я1ао (у!п1) .обладающих пенными технологическими свойствами : Массандра ВХМ У--1842, Шампанская раса ВКМ У-562, Херзсная раса В—41 и Бесценная раса В^-76~12. Жизнеспособность дрожжей после лиофшшзации на трех исследованных защитных средах составляла от 4 до 3352 и падала при хранении при 4°С. "Тесты на ускоренное хранение",проведенные при 2б°С и 37°С, показали, что гарантированное время хранения дрожжей при 4°С не превышает трех лет. Дяя получения максимального титра

жизнеспособных клеток при криоконс ервации были проведены исследования оптимальных скоростей охлаздения а концентраций криопротекторов. На рис.1 представлены данные о зависимости жизнеспособности винных дрожжей /раса В-41/ от скоростей охлаждения в 105?, 2056 и 40&-ных растворах гли-церина.Для сравнения представлены также данные по криокон-сервации клеток дрожжей в дистиллированной воде.Оптимальным режимом криоконсервации клеток винных: дрожжей является медленное замораживание со скоростью охлаждения 1°С/ша в 205?-ном растворе глицерина.

(А ю и «о скорость охш&шв, 'С/им

Рис.1. Зависимость жизнеспособности винных дрожжей В-41 от скоростей охлаждения и концентрации криопротекторов: 1-105? глицерин, 2-20% глицерин, 3-40$ глицерин, 4-дистиллиро-ванная вода.

Жизнеспособность дрожжей при криоконсервации в этих условиях близка к 100$ и сохраняется на этом уровне при длительном хранении в жидком азоте /время наблюдений - 5 лет/. При использовании в качестве криопротекгора 10$-ного раствора глицерина оптимальная скорость охлаждения составляет 10°С/мин. Полученные нами экспериментальные данные хорошо согласуются с современными теоретическими представлениями / Раггвп1:, 1901 / о взаимосвязи оптимальных скоростей охлаждения и концентраций проникающего в клетки криопротектора : повышение концентрации проникающего криопротектора позволяет получить более высокий титр жизнеспособных клеток при уменьшении скорости охлаждения. Проведенные нами биохимические анализы основных продуктов брожения подтвердили сохранение важнейших технологических свойств й ферментативной активности винных дрожжей при консервации методами лиофилизации и крдаконсервации. В то же время полученные данные свидетельствуют о преимуществах криоконсервации для длительного хранения штаммов винных дрожжей.Криоконсервация и хранение в жидком азоте обеспечивают максимальную жизнеспособность клеток, близкую к 100$ в течение не менее пяти лет наблюдений, стабильность биохимической активности и технологических свойств, важных для промышленного использования изученных штаммов в виноделии.

Жизнеспособность и генетическая стабильность б акт вши кягьв-нгыа r-f.il ив ют р. ракомбинантннми плазмияами ПРИ консервации различными методами •

Все более широкое использование в биотехнологии культур микроорганизмов, созданных о применением генной и клеточной инженерии и не являющихся продуктами длительного естественного отбора и часто оказывающихся крайне нестабильными, способствует необходимости предельного сокращения сроков пребывания генетически маркированных штаммов, несущих рекомбинаятные ДНК и плазмвды, в активном вегетативном состоянии и быстрейшему переводу их в состояние анабиоза с целью надежного сохранения ценных свойств и признаков. В то же время данные о длительности и стабильности сохранения микроорганизмов, содержащих индивидуальные плазмиды и рекомбинантные ДНЕС, немногочисленны /вгеевв,311агр,19вО, Кап»ко е-1 а1.,1985/» Целью наших исследований являлось изучение влияния'различных условий длительного хранения рекомбинаятного клона рНЗ 35, включающего фрагменты генома человека, на его жизнеспособность и генетическую стабильность при консервации методами лиофилизации, низкотемпературного заморажива-

ния на обезвоженном силикагеле и криоконсервации улътрабыстрим способом и с использованием 2-х-этадного программного заморакива-ния. Генетическую стабильность клона при хранении различными методами определяли по двум показателям : сохранении селективного маркера устойчивости к тетрациклину - признаку, кодируемому геном в состава векторной плазмиды, и сохранению сайтов рестрикции в рекомбинантной ДНК и исходной длины клонированного в векторе РггЬ-1 фрагмента ДНК человека. Сравнительный анализ жизнеспособности культуры, законсервированной и хранящейся при разных условиях, показывает предпочтительность использования криоконсервации для длительного хранения. При криоконсервации ультрабыстрым способом и по 2-х-эталной программе охлаждения со скоростями 1 °С/мин и 10 °С/мкн число сохраняющих жизнеспособность клеток выше, чем при лиофклизации, примерно на порядок. Через два года хранения жизнеспособность лнофилизированной культуры снижается в 20-30 раз, в то время как для криоконсервированных клеток снижение жизнеспособности незначительно. Параллельное определение титра жизнеспособных клеток в каждом варианте опыта на питательных средах, содержащих' и не содержащие антибиотик, показало 100^-ное наличие маркера устойчивости к тетрациклину при всех исследованных методах хранения. С другой стороны, анализ длин рзстрпхтных фрагментов плазмйдной ДНК, выделенной из выросших после хранения колоний клона ркз 35 в агарозном геле,показал полную идентичность структуры рокомбинантной ДЖ во всех вариантах консервации.

■ Таким образом, все исследованные наш методы консервации могут быть рекомендован« для хранения рвкомбинактных клонов без потери ими маркерных свойств, однако при лиофилизации происходит сильное падение жизнеспособности. Наиболее простда и доступным способом хранения рзкомо'идантных клонов является разработанный нами метод низкотемпературного замораживания на обезвоженном силикагеле, причем наиболее надежным является хранение в парах азота при -150°С. В то же время следует подчеркнуть, что наилучшим методом длительного хранения ракомбинантных клонов с минимальным снижением их жизнеспособности к максимальной стабильностью свойств и признаков является криоконсервация и хранение в жидком азота при -1Э5°С. Для наиболее нестабильных клонов необходима разработка специальных многоступенчатых режимов криоконсервации в растворах криопро-текторов. Разработанные наш режимы криоконсервации показали высокую э.]зфективность и надежность при длительном хранении.

ктшгонпярвмшя ЯГГАЬМОВ-ПВРЯШИГОВ

Расширяющееся использование различных микроорганизмов в про-ышленных технологических процессах требует стандартизации штаммов искочения нежелательных вариантов, поэтому выяснение условий хра-ения без утраты или снижения биосинтетических свойств особенно ва-но для высокоактивных штаммов-продуцентов вторичных метаболитов-нтибиотиков, ферментов, стероидов и др. /Цуцаева, 1987/,

Высокоактивный продуцент алкалоида элимоклавина С1аг1оерз ер. КМ Р-2609 хранили методом отбора из популяции высокоактивных кло-эв, поскольку данная культура гриба при поддержании методом пере-эвов без отбора снижала активность к синтезу элимоклавина в два аза в течение месяца и после нескольких пересевов полностью утраивала своп полезные свойства.Послз лиофнлизации в 10$ обезжирен-эы молоке активность культуры снижалась в 4 раза по сравнению с зходным контролем до консервации. В Таблице 3 представлены резу-ьтаты проведенных нами исследований 27 вариантов криоконсервации риба, отличающиеся по условиям культивирования /три варианта/, юростям охлаждения /три варианта/ и криопротекторам /три вариан-1/. Было установлено, что оптимальными условиями криоконсервации зляется выращивание культуры в течение 17 суток при непрерывном гльтивировании с аэрацизй на среде с фумаровой кислотой / 3-ий

• вариант культивиро-

Ьцяние гехимоо ишадтогсуии на жияиспосебздочь и тиЬносшь К сиитш уцмоклаЫш культиоы гриба Псмсе^ ф №ДР-2609 поспе I дет хгошш Ь хи^том юоте.

юоте.

1а5пицй 3.

5сриаит ¡уишЬи- Реши криокоисерЬации

Криопрогштор УлылраВыстрый ^мрамма!!1» ПрмраымаЗ

«шместа- ГЙЦосгпь, октиЬ-иоегт. 7. жвиеш ейнкт, атЛ-иосто. жакета-сйносвь омпиЬ-

5/, АМСО И АО 15 100 И «0

I 107. материи 50 75 100 Т5 «0 15

Щ «тмерии 50 90 ТО 15 ад И

Я АМСО 25 90 15 «0 15 «0

а Щ мичерм 75 10 ЮО »5 1» 50

£($ глицерин 50 «0 100 75 10» 15

52 АМСО 15 100 15 во 15 »

ж 101 иыц«рии 15 15 №0 15 1» №0

Л /дат. 75 190 (И А. Ж Л,

Примечоци«: аитиЬцостъ культуры к синтезу зшмок«а(ина 3« ямодмчии рршивм м . №с«ц крамеш». гриба гересемии иа шЬерЗои с реве 5«! оп»о(а приЫил к. сиимим аамДмаш Ьо Щ. Срази «см тюрилшации дитДчкт гри5а сйяшлкь ¡)о

ваяия/ и проведение криоконсервации по 2-х-эгапным программам замораживания со скоростями охлаждения от 1 до 10°С в минуту в 20$-ном растворе глицерина. Наиболее интересным фактом, установленным нами, является то, что продуктивность элимоклавина при криоконсервации не только не снижается, но достоверно увеличивается в 1,5 раза при сохранении 17.

100^-ного титра жизнеспособных клеток. Эрфекг сохраняется при длительном хранении в жидком азоте/время наблюдений - более 3-х лет/. Действие сверхнизких температур на клетки гриба при крио-биозе,по-видимому, вызывает активацию мембраяно-с вязанных ферментов и повышение активности к синтезу злимоклавина. Возможность активации мембраняо-связаяных ферментов после крноконсврвации различных типов клеток обсуждалась в ряде работ /Аксенов.1985, Белоус, 2егуноэ,1987/.и заслуживает дальнейших исследований в йтой области.

Кая правило, направленная селекция под воздействием мутагенных факторов приводит к снижению жизнеспособности культур. В связи с этим возникла необходимость исследования наиболее эффективных методов консервации гриба Асгепоп1ит еЬгуаоеепит - продуцентов антибиотика цефалоспорина О ВШЙА-281А и ВШИА-305А. Штамм 281А,один из первых отечественных продуцентов цефалоспорина С, выдерживает до 4-х месяцев хранения на сусло-агаре при 4°С и до трех пассанэй на агаризованной среде без снижения антибиотической активности. В результате многоступенчатой селекции из штамма 281А был получен штамм 305А, превышалщий исходный по уровню активности более,чем в 1,5 раза. Штамм 305А, утративший способность к образованно воздушного мицелия и конидий, наиболее чувствителен к условиям культивирования и хранения. Работу с этим штаммом всегда проводили только с первым пасса'кем, поскольку

Ьлиямие омсобоЬ хранения ж жшиеспосоЕцосгсь и oumuSuo -тическию акгеиЬихппь гриба Atremonium thrvwenum ЫША - 2&1 А /ыяомм - продуцент цвцшоспорииа С / Ъ5л*«4.

Способ »ранения Р«ким онсерЬаиии Зсщит- CfSp* Жшиеспонйиостъ/геличитЬо нмоиий/ ипиЬиктьф). *4 гше iwta N4UU. I Jtm nwipwui

io uxciplo ции /Wl.t neue UXKSplwilUU iueienu )^wu< приЭТЧ

QSC wvb» '¿t Mump. atujA'bo X« ГОИПЩ

шришяда спрйЬадим» шм цвипри-ФЧГЦХАЛАКМ < • Q7TM' 0.И-<0' 5 UM 0.6 89,7

l • 0.50 40* t.M • w4 № 0 0 406.1

5 О.««' 1.70- « 0.«- <0' 05 «8.5

1 ш-w ЦЮЗ . ü« »' 0.0002 (01.7

L-Wywu-Ьв!Шв ммеро ь ОДО-tt' (,« 50 ця«' 9 4S.0

s А95-Ю' * ».«•»' i til.J

криоконсер-мция МЛцрИ/utt T A55W' fttO«' 56 — — 109,А

«мадл»! <ФаЭ/ши 6 455«' Q5T 10' <04 — — W.t

1 4 Защищав cpeäa: 1- •»*/, пмцсрин

1- Mutoäwta» сыЬерописо

n>uMtMonue •• юисмЬоции га%«рился 1«;етапиЬиьш ицце«ий и хи»*а1осо$ность шадолоо шк количестЬо »мониеоерадуккци» (ррагменпюЬ I 4 tu. гусптии.

уже во втором пассаже штамм 305А резко снижал свою активность к синтезу антибиотика. В Таблицах 4 и 5 представлены результаты исследований эффективности различных режимов лиофшшзации, ь - высушивания и криоконсервации для длительного хранения штаммов 201А и 305А. Нами установлено, что наиболее эффективным методом для сохранения активности к синтезу цефалоспорина С является медленное охлаждение со скоростыэ 1°С/мин по 3-х-этапной, специально разработанной программе замораживания / с вццерккой в течение 3-х минут, при -35°С/ суспензии мицелия гриба в 2055-ноы растворе глицерина и хранение в жидком азоте при -1Э6°С. Для обоих исследованных штаммов криоконсервация обеспечивает сохранение активности к синтезу цефалоспорина С на уровне 112$, достоверно превышающем исходный уровень активности до криоконсервации гриба. В то же время наш были установлены отличия штаммов 281А и 305А к стрессовым воздействиям при дегидратации и замораживании-оттаивании, связанными с консервацией различными методами. Как и следовало ожидать, штамм 305А, плохо 'сохраняющийся методом субкультивирования, оказался и наиболее чувствительным к режимам консервации. Следует подчеркнуть, что для оптимизации условий консервации штаммов-продуцентов с сохранением их специфической активности необходимо проводить исследования с индивидуальным штаммом.

Вшациа СПОСОБА лраненш ш хшмгсщхо&ап» и атбио-гтиестм оотиЫдшч» шиВа ficrgmonmrn chrusopcnum ЫМИА Mb А ." /иетамм-про^цент миралоспорино С / TcinuiioS

CnocoS храигш* Режим Зоиагы» среда* (ямш жшмеспосынктъ/киидеспЪо ыжоыий/ iHlutnttCKft.

Миксер werte Miictptauuu lt«tau фае** npiiTC

oie щ-to ûfiC UH-lo 2« пнпр ctc.u» 5» ÏKUMnp.

лиофили мци« 1 ban кии (.5 • »' 13 »* 0,1 1,1 «' Utos 107

тпимм 4W4UW 1 —— 5.1 Й* T>< Ю' 0.05 0 — m npWfUtj

i — иг J K 0' 0 01 iS 0.01T m

афоымр •UOU 1% «ем <пам**> J » MtM 0 - M nntejuu

L Ьыси-uiixme имеро Бпяш И«' il «' 0,5 a 105

% —г— Ml" (if SI a«' 0.1 75.5

криэксн-(?р1аци» ЧЮфЬЯ S Ьешпми. tr »* H «« 0.6 — — «5.1

6 ( 6 кюи IX «IQM 5.1 Ifu |M«M ИЩИ luWH ) амнии MfUl«.«*« — Ht rçtUfitw

IClfntMui W-tf 11 »' но — — Ut.t

tu»u yt. «ИМ il»' ÎMO* 10.5 — — H0

т>>ащиш* <р«4г l-CXUlUiàtuçeiu, цЩатяш, maç-awa)

î-UHUi иктишя wmpu«, «Jecmpuw. Ш ию*та, pU'7«J i-ШЫ iMmauno иопри». 5ÏЗешгр»«. ^«итйы, рИ'Тв) 4 • Ш ммлма, . „„ ...

J- ГАП (51 иитмото мири». Г/ «««дай, (I ПвП , рЧ1 И) в- Ш ниц«!««

В качестве штамма-продуцента антибиотика линкомидана нами была исследована культура актиномицета Б^ерготусез гозеоХив

7-219. Результаты определения жизнеспособности и активности данного штамма к синтезу линкбыицина после лиофшшзации и криокон-сервации ультрабыстрым способом в 10#-ном растворе глицерина и 12^-ном растворе сахарозы показывают, что после лиофилизации жизнеспособность и активность культуры имели тенденцию к снижению при хранении в течение 12 месяцев при 4°С, в то время как при криоконсврвации жизнеспособность клеток была близка к 100%, а активность к синтезу лкнкомжина возрастала и сохранялась на этом уровне в течение всего времени наблюдений. Интересно отметить, что при криоконсэрвации, как сразу после закладки на хранение в Ж1ш:кй азот, так и через 6 месяцев хранения при -196°С, было выявлено достоверное и существенное увеличение числа высокоактивных вариантов штамма-продуцента. На гистограмме /рис. 2 / приведены результаты изменчивости культуры по признаку образования линкомицина. Из рассевов спор культуры при определении жизнеспособности сразу шеле лиофилизации в 10$ обезжиренном молоке

КоявЧбстх»

ВЗДОШТрк, <

50 45

<0 15 30 25 20 15 W 5

XW 5000

ЗООО 5000

ЗООО

5К

и криоконсврвации в 12^-ном растворе сахарозы с агаровой среды было снято по 100 моноспоровых культур. После выдерживания косяков в течение 7 суток при 23°С была определена активность культуры к синтезу линкомицина для обоих вариантов консервации. За контроль были взяты

результаты по разбросу активностей культуры, полученные при рассеве с агарового косяка до консервации. Из представленных данных видно, что разброс активностей клонов, выделенных после рассева

5000 юау^ шспалооп

Рис.2. Изменчивость штамма-продуцента линкомицина по признаку образования антибиотика' : a-контроль до консервации, б-после лиофшшзации, в—после криоконсервации.

лиофилизированннх спор, получен на уровне исходного, в то время как разброс активностей культур, полученных из рассевов спор после криоконсервации, сильно сдвигается в сторону увеличения количества высокоактивных вариантов : число культур с активностью 45005000 мкг/мл составило 53%, в то время как в исходном контроле до криоконсервации оно составляло всего 26%,т.е. в два раза возросло число активных вариантов в результате воздействия на клетки сверхнизких температур. Из культур после криоконсервации с активностью 4500-5000 мкг/мл была составлена партия посевного материала и передана на производство в МШ "Мосмэдпрепараты". На этой партии штамма-продуцента лиыкошщина было проведено 42 ферментации, которые прошли на высоком уровне активности к синтезу антибиотика. Через 6 месяцев хранения в жидком азоте из вариантов криоконсервации культуры в 10!&-ном глицерине и 12%-аоИ сахарозе также бкло снято по 100 моноспоровых культур и проверена их активность.Полученные результаты подтвердили наличие в криоконсервировакных культурах большого количества высокоактивных вариантов : число вариантов с активностьа 4500-5000 мкг/мл в случао криоконсервации в 10%-юм глицерине составляло 60%, а в случае криоконсервации в 125?-ноа сахароза -55%.

Результаты проведенных исследований показываот, что в гетерогенной популяции клетки микроорганизмов могут отличаться различной устойчивостью к замораживанию и в результате криоконсервации может происходить селекция одной из популяций. После многократных процедур криоконсервации можно получить криоустойчивый штамм, а также культуру, обладающую повышенной активностью к синтезу вторичных метаболитов. Использование криоконсервации для длительного хранения штаммов-продуцентов обеспечивает стабильность и однородность популяции, стандартизацию посевного материала, обладающего высокой жизнеспособностью и повышенной активностью образования целевого продукта, что может быть использовано для позшэяпя эффективности всего технологического процесса, принося значительный экономический эффект. Полученные нами данные свидетельствуют о научной обоснованности рекомендаций к использованию криоконсервации как наиболее эффективного и надежного метода хранения фон-нов коллекций микроорганизмов и практически ценных штаъшюв-проду-дентов различных биологически активных соединений с сохранением юс исходных полезных свойств, важных для практического использо-зания в биотехнологии.

Низкотемпературный банк В КМ ИБФМ РАН, созданный иод руководством к при непосредственном участии автора, является в настоящее время крупнейшим собранием микробного генофонда и насчитывает около четырех тысяч штампов напатогенных культур микроорганизмов. Криобанк был оснащен кассетной системой для хранения штампов /Удостоверение на рационализаторское предложение № 193 от 15.03.84/ и автоматикой для поддержания .уровня жидкого азота в хранилищах ХБ-05 /Удостоверение на рационализаторское предложение # 218 от 05.03.85/, которые даст существенный экономический аффект, уменьшают затраты на хранение одного штамма х потери жидкого азота, повышают надежность хранения криоконсервированных культур. Многие культуры фонда ВКМ, утраченные при хранении другими методами, были восстановлены из крио-биоза после 10 лет хранения, что подтверждает высокую эффективность и надежность криоконсервации по сравнению о другими методами •

Разработанный и защищенный Авторским свидетельством на изобретение /А.с, СССР № 1442544/ метод низкотемпературного замораживания микроорганизмов на обезвоженном силикагеле опубликован в виде отдельной главы В -коллегаивной монографии "Maintenance of Microorganisms and Cultured Cells", Ede. В.Ktreop and A.Doyle, Academic Preoe, London,' 1994»' выпущенной в качестве методического руководства Всемирной Федерацией Коллекций Культур. Метод успешно используется при консервации генетически маркированных штаммов, несущих реком-' бинантные ДНК и шшзмады,7-ш промышленных культур актиномицетов, продуцентов антибиотиков карминомицина, линкомицина, гентомицина в рубомицина в МШ"Мосмадпропараты" им.JT.Я. Карпова, 6-ти промышленных культур клубеньковых бактерий из коллекции лаборатории биологического азота Института сельскохозяйственной микробиологии РАН, 4-х промышленных штаммов винных дрожжей из коллекции кафедры виноградных производств МТЖШ, всего более 800 штаммов /актиномицетов, бактерий, грибов и дрожжей/ из коллекции ВОД, а также генетически маркированных штаммов' и клонов, многие из которых не выдерживают непосредственного погружения суспензии клеток в жидкий азот.

8а В лет хранения на обезвоженном силикагеле при сверхнизких температурах клонотеки из 150 рекомбинантных клонов с плазмидами не было отмечено ни одного случая потери плазмид, что подтверждает высокую надежность и эффективность разработанного метода. Получены Акты об использовании разработанного метода в лаборатории молекулярной генетики и в лаборатории профилактической психиатрии Всесоюзного Центра психического здоровья АМН СССР.

Кшоконсэрвааия промышленных культур клубеньковых бактерий

Для клубеньковых бактерий,широко используемых в настоящее время в сельскохозяйственной микробиологии,важнейшим признаком является инфекционность и сохранение симбиотических свойств в процессе хранения. Целью наших исследований являлось получение количественных данных для сравнения лиофшшзации и криоконсер-вации как методов длительного хранения по показателям жизнеспособности и сохранности исходных полезных свойств. Были исследованы 4 быстрорастущие штамма рода ймиоМил и 2 медленно растущие штамма рода ВгайугМгоМип. Установлено, что лиофилизация в СХА и 10% обезжиренном молоке приводит к значительно^ снижению жизнеспособности и в некоторых случаях полной утрате вирулентности культур, в то время как при криоконсервации в 10#-ном глицерине и СЖА. ультрабыстрым способом со скоростью охлаждения 400 °С/мия и последующем хранении при -19б°С обеспечивается сохранение жизнеспособности и симбиотических свойств штаммов.

Жизнеспособность ■ ацетхлрэдуктазная активность 2-х штаннов клубеньковых бактернв Ьгайу г111гоЬ1шп после кряокопсервацяж ■ хранения в жндкон азоте в течение года

Таблица 6

1Т&КК Криопрогектор хаз неспособно« ь, * к контролю Актхвк. оти. ед.

1. japonic»™ 2490 10% гляцервн 93 1, 46

l.japonicun 2490 СХА 61 1, 95

.sp.lupinus 1614 10% глацерян 87 1, 27

.sp.luplnus 1614 СХА 21 2, 46

ракечаше: Жхз неспособность в «сходной контроле до крвоконсорва-цкж принята за loot, а ацетилредуктазная активность -за 1.0.

В Таблице 6 представлены данные о жизнеспособности и ацетил-цуктазной активности 2-х штаммов рода втеаугМаоЫит после риоконсервации и хранения в жидком азоте в течение одного года.

При криоконсервации было отмечено достоверное повышение активности штаммов ВгсЛугЬЛ.гоЪ1ша Зароп1с\ш 2490в 2 раза и В.зр. 1ир1-гма 1614 в 2,5 раза по сравнению с исходным контролем до консервации, которое сохранялось при длительном хранении при -196 °С. Полученные нами данные об изменчивости контролируемых свойств клубеньковых бактерий /жизнеспособность, масса инокулированных растений, ^-ное.содержание азота и общее азотонакопление/ свидетельствуют о том, что коэффициенты вариации симбиотических признаков после криоконсервации в 10%-нои растворе глицерина не превышают 20$, что соответствует невысокому уровню изменчивости и решает проблему сохранения производственно-ценных штаммов клубеньковых бактерий с сохранением их полезных свойств.

Ктооконсетеапия различных типов почвенных бактерий и юс смесей

В современной литературе практически отсутствуют сведения, касающиеся влияния криоконсервации на ассоциации микроорганизмов, обитдаоих в почве. В то же время проблема консервации почвенных микробных сообществ в интактиом виде с учетом степени сохранности численности,видового состава и соотношения отдельных компонентов почвенных сообществ в их естественной среде обитания - почве - имеет большое значение не только для практических задач сельскохозяйственной и почвенной микробиологии, биотехнологии и других применений почвенных микроорганизмов, но и для решения фундаментальной проблемы консервации генетических ресурсов биосферы /Вепринцев, Ротг, 1984/.Закономерности сохранения жизнеспособности почвенными бактериями при криоконсервации в виде смешанных культур или естественных ассоциаций не были исследованы. Задача криоконсервации естественного почвенного образца или сообщества микроорганизмов с сохранением структуры, • свойственной ему н 1п о1-Ьи » в ,Л0М9НТ взятия образца, весьма далека от решения. Неясными остаются ответы и на более частные'вбпросы - такие,например, как отношение к криоконсервации отдельных "экологических" групп бактерий, обитающих в почве, шш возможное влияние на результаты криоконсервации смешивания клеток различных видов почвенных бактерий.

Проведенные нами исследования устойчивости к замораживанию ультрабыстрым способом грамотрицательных и грамположительных почвенных бактерий, выделенных из почвы,показали, что все исследованные штаммы псевдомонац лучше переносили замораживание в воде, в то время как неподвижные бактерии - артробактеры - лучше выживали при 24.

криоконсервации в стерильной почва,что свидетельствует о том,что |гчет естественной среди обитания играет существенную роль при крио-мнсервации почвенных бактерий /Таблица 7/. Дальнейший этап работы 5ыл связан с изучением парных смесей бактерий,причем одна культура 5ралась из группы подвижных псевдомонад,принадлежащих к водной фа-ш обитания в почве,а другая-из группы неподвииных артробактеров, ¡вязанных с твердой фазой обитания в почве.Установлено.что при сов-юстной криоконсервации по сравнению с раздельной наблюдается договорное повышение устойчивости клеток почвенных бактерий к дейс-вию сверхнизких температур /Рис.З/.Яри смешивании культур Ряеийо-юпао и ЛхЧЬтоЪасгег с исходной концентрацией клеток^ 10®кое/мл еред замораживанием до температуры -193°С жизнеспособность артро-актеров.из замороженных водных суспензий достоверно увеличивается е менее,чем в 3 раза, а псевдомонад-не менее,чем в 2 раза из замороженной почвы.Добавление «я п убитых кипячением клеток

/убитых псевдомонад к ар-тробактерам или убитых клеток артробактеров к псевдомонадам/ перед замораживанием приводило к тому же эффекту-повышению титра жизнеспособных клеток после криоконсервации в виде смешанных культур. Изучение возможных механизмов криозащиты,однако, выходило за рамки наших исследований, и установленный нами феномен повышения жизнеспособности при совместной криоконсервации различных типов почвенных бактерий может служить основой для дальнейших поисков в этой области и изу. чения возможных механизмов криозащиты.

□

в»я pff 1*11 /60* ОВ/ /30i OB/ /извито* май /

:с.З. Процент жизнеспособных клеток ктерий Pseudomonns № 6 И thmbacter № 17 при криоконсервации отдельности и в парной смеси : - в водной суспензии, б - в почве.

Результаты краоконсервацха ультрабистрим способом частых культур грамотрацатеаыых я грани олоявтальньсх почвенных бактерк! ж ах смесвВ в водно» суспэюая в почве

Твблхца V

Культура аля смесь Процент иизнеспособных клеток посла кркококсер-вацяя а водной суспензия Процент жхз неспособных клеток после краоконсер-вацвя в стеряль-ной почве

Pseudononao denitriCleans ВКМ В-892 100 10

Pseudooonas ер. б 113* 44

brthrobactar вр. 11 23 96

torthrobacter вр. 17 16 91

PseudoBonaa denitritlcana ВХХ В-892 74 9

Urthrobacter вр. 11 »6 lit

Pseüdomonas danitrificans ВКМ В-892 75 14

brthrobactcr вр. 17 98 115

PsaudoBonas вр. б 98 88

fOrthrobacter вр. 11 101 74

Peeudoncnae ер. б 74 130

Vrthrobacter вр. 17 79 112

Примечание: Превышена« loot жхзнаспособноста в контроле после крхоконсервацха может бить связано с возможным слипа' нави клеток бвктераК в асходном контроле до консерва-цаа, которые, в склу указанных пркчан, мог бить нас колько занажен.

Кшоконсетадпйя почвенных мщробных сообществ

В практике микробиологических исследований и для воссоздания микробных биоценозов необходимо иметь эффективные методы консервации почвенных образцов с минимальным изменением состава естественного почвенного микробного сообщества /Звягинцев,1987/. Нами впервые проведены исследования влияния различных методов консервации свежих образцов дерново-подзолистой почвы на сохранение состава комплекса микроорганизмов.Сравнительное изучение эффективности высушивания яри комнатной и повышенной температуре /+68°С/, хранения при пониженной температуре /-12°С/, лиофилизации и хранения при 4°С/ криоконсервации и хранения в жидком азоте при -19о°С на состав комплекса микроорганизмов в образцах дерново-подзолистой почвы показало, что криоконсервация является наиболее эффективным методом консервации почвенных образцов для микробиологических исследований и воссоздания биоценозов с максимальным сохранением исходного естественного комплекса почвенных микробных сообществ.

Рис.4. Динамика выделения СС>2 образцами почвы после консервации различными методами : 1-свежий образец /срок отбора-август 1985 г./, 2- образец после хранения при комнатной температуре, 3- образец после хранения в эксикаторе о 3^=0,1, 4- образец после замораживания к хранения при -12°С, 5-свежий образец /срок отбора- сентябрь 1985 г./, 6- образец после криоконсервации и хранения при -196°С 7- образец после лиофилизации и хранения при 4°С, 8- образец после высушивания при 68°С.

Для оценки селектирующего действия криоконсервации на сохранение микробного сообщества почвы наиболее целесообразно использовать показатели численности грамотрицатальных бактерий,как наиболее чувствительных к стрессам при дегидратации и замораживании-оттаивании, связанным с состоянием криобиоза,а также интенсивность дыхания почвенного образца /рис.4/ как наиболее эффективный и чувствительный способ регистрации состояния комплекса.почвенных микроорганизмов.Лучшие результаты по сохранности комплекса почвенных микробных сообществ были получены после криоконсервации и хранения в жидком азоте при -196°С : характер выделения СО2 из размороженных после хранения в жидком азоте образцов почвы практически полностью соответствовал исходному образцу до консервации. Наибольшее ингибирукщее воздействие на почву оказывает высушивание при +68°С. Лиофшшзация и хранение при -12°С также приводят к значительному изменению состава комплекса микроорганизмов в почвенном образце : снижению относительного числа учитываемых грамотрицательных бактерий, неспорообразующих грибов и дрожжей, как наиболее чувствительных к стрессам при консервации различными методами. Анализ устойчивости к криоконсервации различных групп почвенных микроорганизмов и культур фонда ВКМ поз-

• воляет сделать вывод о том, что неспорообразуюцие грибы, дрожжи и грамотрицателышэ бактерии для надежной криоконсервации требуют разработки специальных режимов криоконсервации с использованием программного замораживания в растворах криопротекторов.

Перспективным подходом является криоконсервация ассоциаций микроорганизмов и смешанных культур почвенных бактерий для решения проблемы консервации генетических микроСпых ресурсов к воссоздания утраченных элементоз биосферы, в частности, микробных биоценозов. Проведенные, наш исследования показали,что криоконсервация ультрайыстрым способом со скоростью охлаждения* 400

- °С/мин и хранение в жидком азоте при -196°С является оптимальным и наиболее эффективным методом консервации почвенных образцов с максимальным сохранением исходного комплекса почвенных ыикроб-

• ных сообществ,, поскольку криоконсервация по сравнению со всеми другими исследованными способами хранения образцов почвы показала наиболее близкие соотношения между группами учитываемых на селвктивдйя питательных средах почвэннах микроорганизмов к исходно»^ еыеяпшсу образцу почвы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые проведено сравнительное изучение яизнеспособности, биохимической активности и стабильности свойств микроорганизмов различных систематических групп и практически денных штачмов-продуцентов при погружении в состояние криобиоза и после выхода из этого состояния с целью оптимизации условий криоконсервации. Определены основные факторы, влияющие на жизнеспособность и сохранность исходных полезных свойств наиболее нестабильных при длительном хранении культур, а именно : оптимальные условия культивирования, исходная концентрация клеток в суспензии, физиологический возраст, оптимальные типы и концентрации крполротек-торов, скорости замораяиванкя, оптимальные условия для восстановления и репарации повреждений, возникащих при криоконсервации. В результате сравнительного изучения эффективности традиционных способов долгосрочного хранения, высушивания, ь - высушивания, лиофилизации и криоконсервации ультрабыстрым способом и с использованием предварительного программного замораживания с медленными скоростями охлаздония в растворах кряопротекторов экспериментально продемонстрировано, что криоконсервация имеет существенные преимущества по уровню сохранения гизноспособнос-ти, биохимической активности п длительности хранения в стабильном, неизменном состоянии, что имеет первостепенное значение для обеспечения гарантированного хранения фондов коллекций ми-кроорганизиов и генетических банков штаммов-продуцентов, перспективных для использования в биотехнологии.

Впервые изучено влияние криобиоза на смешанные культуры /искусственно составленные парные смеси почвенных бактерий/ и ассоциации микроорганизмов в естественном сообществе /образцах дерново-подзолистой почвы/. Обнаружено, что учет естественной зроды обитания играет существенную роль при криоконсервации "экологических" групп почвенных бактерий. Установлено, что при ¡овместной криоконсервации наблюдается повышение устойчивости слеток х действию сверхнизких температур. На основании исследований эффективности криоконсервации ассоциаций микроорганиз-гав в образцах дерново-подзолистой почвы и традиционных способов хранения показано, что криоконсервация ультрабыстрым спо-обом и хранение в жидком азоте является наиболее эффективным надежным методом хранения образцов почвы о целью консервации енетических ресурсов биосферы и восстановления почвенных ыи-робных биоценозов. 29.

ВЫВОДУ

1. Установлены эффекты повышения биохимической активности некоторых видов микроорганизмов и практически ценных штаммов-продуцентов при крдоконсервации. Активирущий эффект холодового воздействия и его сохранность в течение многих лет криоконсерва-ции использованы для повыиэнкя эффективности ряда биотехнологий.

2. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция повышения устойчивости микроорганизмов к состоянию криобиоза за счет предварительного снижения метаболизма, частичкой дегидратации и ' иммобилизации клеток на обезвожонных инертных носителях в присутствии криопротекторов при субнулевых температурах.

3. Сравнительное изучение жизнеспособности п генетической стабильности бактерии Escherichia coll НВ 101, несущей рекомбшант-ную плазмиду с фрагментом ДНК человека, показало, что лшфили— зация, низкотемпературное замораживание на обезвоженных инертных носителях, ультрабыстрый и программный режимы криоконсер-вацки с медленными скоростями охлаждения в растворах криопро-

• текторов 'обеспечивают генетическую стабильность и сохранность плазмвд при длительном хранении.

4. Разработаны эффективные многоступенчатые режимы криоконсерва-цин с использованием предварительного программного охлаждения в растворах криопротекторов, позволившие осуществить надежную криоконсервации наиболее нестабильных и трудных для поддерка-

. ния культур фонда ВКМ /более 750 штаммов/, в том числе колпак-ции базидиальных грибов /около 160 штаммов/, практически ценных депонированных; штаммов, редких и исчезающих видов микроорганизмов, занесенных в Красную книгу СССР.

6. Создан низкотемпературный банк ВКМ, являющийся крупнейшим собранием микробного генофонда и насчитывающий около четырех ■ тысяч штаммов непатогенных культур микроорганизмов : актиноми-цетов, бактерий, грибов, дрожжей и генетически маркированных штаммов, несущих рекомбинантные ДНК и плазмиды.

6. Показано, что оптимальным режимом консервации культур винных нроажей является кргоконсервация с медленными скоростями охлаждения й растворах криопротекторов.1изнеспособность дрожвдй при кргскйнаервации в этих условиях близка к 100^ и сохраняется на атом уровне при длительном хранении в жидком азоте /вре- ' йЯ наблюдений - 5 лет/.В результате промышленных испытаний установлен-! что криоконсзрвация обеспечивает сохранение технологических саойств винных дрожжей, важных для их практического использс;,'««я в виноделии.

.Разработаны технологические процессы криокоысервации с использованием 2-х- и 3-х-этапных режимов охлаждения в растворах крио-вротекторов высокоактивных штаммов-продуцентов алкалоида злимо-кдавина и антибиотика цефалоспорина С, положенные в основу двух Регламентов, используемых в биотехнологичес.гах производствах.

. Впервые изучено влияние криоконсервации на смешанные культуры и ассоциации микроорганизмов в естественном сообщество почвы. Обнаружено, что грамотрвдатольвыэ подвишне почвенные бактерии, обитающие в водной фазе почвы, устойчивы к замораживанию уль-трабыстрш.1 способом в воде без крлонротектора, в.то врага как грашоложитзльные неподвижные почвенные бактерии, принадлежащие к твердой фазе обитания в почве, лучше переносят криокон-сарвациа в стерильной почва.

. Установлен эффект повышения устойчивости граыотрицателышх л гракполозительных почвенных бактерий к крноконсерзации в виде . смешанных культур.

). Показано, что криоконсервация улмрабыотр^м способом и хранение в жидком азота при -195°С обеспечивают максимальное сохранение исходного естественного комплекса почвенных микробных сообществ.

i. На ссново высушенных на инертных носителях культур бакторкй разработаны биоиндикаторы для бактериологического контроля парового и воздушного методов стерилизация изделий медицинского назначения, нашедшие широкое применение в медицина. Разработаны биоиндикаторы сверзмалнх доз излучения на основа лкофализяровалшых пропаратоз радиочувствительных бактерий, просздшпэ успешные испытания в условиях орбитального космического полета на борту бисспутника "Космос - 1SS7". Обосновано использование метода определения ATO в клетках в качестве наиболее чувствительного способа для быстрой регистрации действия сверхмалых доз излучения на разработанные биоиндикаторы.

Список работ. опубликованных по теме диссертации

1. Сидякина 7.К!. .Кузнецова S.5.,Чумакова Ю. Определение оптимальных скоростей охл&здеция и криопротехторов при криоконсерва-ции винных дрожжей. // В сб.: 2-ая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Тез.,Харьков, 1984, 208.

2. Чумакова Н.Ю..Сидякина Т.М..Тараканчиков А.К. .Ледаков B.C. Усовершенствование системы хранения микроорганизмов в жидко г: азоте в хранилищах ХВ-05. //В сб.: 2-ая Всесоюзная конференция

по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Тез.,Харьков, 1684, 237.

3. Калакуцкий Л.В.,Сддякина Т.М. Сохраноние жизнеспособности т-кроорганизмалш в дрярода и основные подходы к консервации коллекционных культур. // В сб.: Тез. 2-ой Всесоюзной конференции

по анабиозу, Рига, 1984, 19-20.

4. Бибикова И.И..Фатеева М.В..Никитина Т.И.,Одоевская Ц.С. .Сидяки-на Т.М. Выживаемость дрожжей разных систематических групп после длительного хранения в жидком азоте. // В сб.: Тез. 2-ой Всесоюзной конференции по анабиозу, Рига, 1934, 47-48.

5. Решетоза И.С..Сидяклла Т.М. Разработка способов длительного хранения почвенных лиюмицетов. //В сб.: Тез. 2-ой Всесоюзной конференции по анабиозу, Рига, 1984, 92-93.

о. Сидякша Т.К..Кузнецова Е.В..Ккпковский З.Н.,Сахарова Т.А. Сра~ внительнве данные о жизнеспособности и биохимической активности винных 'дрожжей при хранении методами лиофплизации к крнокон-сервации. // В сб.: Тез. 2-ой Всесоюзной конференции по анабиозу, Рига, 1984, 95.

7. Голимбет В.S..Сидякина Т.Н..Яковлев А.Г. Хранение культур Escherichia coli , несу:цих рекомбинантные плазмвды с фрагментами JCU1X человека. // В сб.: Новые яааравления биотехнологии, Тез.. Пущино, 1984, 68-5Э.

8. Надирова И.М.,Емцева Т.В..Данилова М. В.,Одоевская Н.С..Сидякина Т.Ы, Результаты длительного хранения бактерий в жидком азоте. // В сб.: Гез. У11 Съезд Всесоюзного микробиологического общества. Алма-Ата, 1Э85, т.1, 35.

9. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов. // В серии "Консервация генетических ресурсов", ОНТИ НЦ БИ АН СССР, Пущино, 1985,

33 с.

10. Сидякина Т.М.,£иаковский З.Н..Кузнецова £.В. .Сахарова Т.Д.. Применение лиофализации и криоконсервацот для длительного хранения культур винных дрожжей. // Прикладная биохимия и микробиология, 198S.T.22, вып.6, 840-843.

11. Сидякида Т.Н..Кузнецова S.B..Чумакова М.Ю. Жизнеспособность

и биохимическая активность дрожжей ЗасоЬдгопус»« Ylnl при сублимационном высушивании и криоконсервации. // . Криобиология, 1986, Л 1, 23-28.

12. Калакуцкий Л.В..Сидякина Т.М. Сохранение жизнеспособности микроорганизмами в природе и основные подходы к консорвацив лабораторных культур, // Б Кн.: Тормояение жизнедеятельности клеток. Рига, Зхн&гне, 1987, 1Э-31.

13. Сцдякина Т.М.,Тараканчиков А.И.,Чумакова М.Ю. Кассетная система для хранения микроорганизмов в аадхом азоте з хранилищах ХБ-05. // Криобиология, 19S6, $ 3, 42-43.

14. Ыацкавич Н.В. »Налешша Л.Н. ,Сидякина Т.М. Редкие и исчезаощие виды грибов лесных экосистем и пути их охрани. // В сб.: Охрана лесных экосистем. Тез., Львов, 1Э£3, 120-121.

15. Лозицкая Н.Д..Зонова Г.М.,Яан^иков Н.С..Сидякина Т.М..Калакуцкий Л.В. Влияние условий консервации почвенного образца на состав комплекса микроорганизмов.// В сб.: 3-я Всесоазная конференция "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Тез., Москва,

- МГУ, 1986, 140.

16. Репечкене Ю.Л. .Лугаускас А.Ю. .Сидякина Т..М. Применение криогенного метода для сохранения активности культур микроорганизмов при хранении. // В сб.: Микробиологические процессы в почвах

и урожайность сельскохозяйственных культур. Тез., Вильнюс, 1986^ 309-311.

17. Хасаава Ф.М..Сидякина Т.М. Разработка методов хранения культуры Artbrobaeter erystallppoieteo KM—4. // В сб.: Проблемы современной биологии, Москва, МГУ, 1987, 191-196.

13. Сщхякина Т.М.,Ледаков B.C.,Чумакова М.Ю. Система автоматического поддеряания уровня жидкого азота в хранилищах ХБ-05, // Криобиология, 1988, № 1, 46-47.

19. Калакуцкий Л.В..Свдякияа Т.М. Анабиоз и консервация микроорганизмов. // Криобиология, 1988, № 4, 1-9.

20. Калакуцкий Л.В.,Сидякина Т.М..Голимбег В.Е. Способ подготовки бактерий Escherichia coli , несущих рекомбинаятные плаз-миды, для низкотемпературной консервации. // Авт. свид. СССР, 1988, № 1442544. „_

21. Сицякина Т.М. Методы консервации микроорганизмов. // В серии "Консервация генетических ресурсов", ОНТИ ИЦ БИ АН СССР, Пу-щино, 1988, 58 с.

22. Сицякина Т.М..Кузнецова Е.В.,Кишсовскиа З.Н. Длительное хранение вшшых дрожжей методами лиофилизации к криоконсэрвации.

// В сб.: Достижения и перспективы развития криобиологии и крвдмедицины. Международная конференция ЮНЕСКО', Тез., Харьков, 1983, 82-83.

23. Семашко А.Ю..Мацкевич Н.З..Сицякина Т.М.,Налешша 1.Н.,0зерс-кая С.М. Возможности и перспективы сохранения редких видов микромицетов в коллекции чистых культур, // В сб.: Изучение грибов в биогеоценозах. Тез. 4-ой Всесоюзной конференции, Пермь, 1988, 144.

24. Лозицкая Н.Д..Сидякина Т.М..Зенова Г.М.,Калакуцкий Л.В. Динамика ввделения С02 почвой как показатель реакции почвенных микроорганизмов на стрессовые воздействия, связанные с консервацией.// В сб.:Биодинамика почв. Тез. 3-его Всесоюзного симпозиума, Харку, ЭССР, 1988, 101,

25. Пархоменко И.Ы.,Романова Н.А..Сидякина Т.М. .Бровко Л.Ю. „Зарубина Л.П. Влияние тяжелых заряженных частиц космического излучения яа вегетативные клетки и споры бактерии Baeillus brevia var.G.-B. . экспонированные на биоспутпюсв "Космос-188?". // В сб.: Труды Международного симпозиума по подведению итогов экспериментальных исследований на биоспутнике "Ко-

• скос - 1887", Москва, 1988, 33,

26. Sidyakina T.U.,Golimbet Y.E. Survival end genetic stability of Escherichia eoli KB 101 wltb recombinant planmid under preservation by different aethoda. // Int Prosecdlnge ol tU« 4tlx International Congress on Culture Collections. LUS.A., ^ Washington, 1938, 75.

27. Khasaeva P.M.,Sldyakina T .Ы. ,Taptikova S.D.,Modyanova L.V. Survival and biochemical activity of bacterium Arthrobacter crystallopoietes YKM Ac-1098 after freeze-drying and oryo-preservation. // In : Proceedings of the International Congress on Culture CollectioaS.U.S.A., Washington, 1988, 73.

28. Lozitskaya H.D. .Sidyakina T.M. .Kalakoutskii L.V. Differential survival following ultralow freezing in water and soil of some Pseudomonae and Arthrobacter strains and mixtures thereof. // In : Iroeeedi- of the 4**1 International Congress on Culture Collections. U.S.A.,Washington, 1988, 74.

29. Sharaya l.S.,Sidyakln* Т.М..Kuimova Г.Г. Viability of Prankia strains under preservation, by different methods« // In t Pro-eecdirea of the 4th International Ooagraao on Culture Collections. U.S.A., Wa.ihin^ton, 198S, 75.

30. Sidyakina Т.К. Cxyopreeervation and freebe-dryin3 of microorganisms. // In x Procecdingn of the 4th International Sehool "Oryobiology and Frecae-Drylng", Bulgaria, Borovota, 19S9 , 155-159.

31. Пархоменко И.М.,Романова H.А.,Сидякина Т.Ц.,Бровко Л.Ю..Зарубина А.П. Влияние космического излучения на вегетативные клетки и споры Р*"- варианта бактерии Etclllun Ъгеу1я таг. G.-3. // В сб. : 1-ый Всесоюзный радиобиологический.съезд. Тез. Москва, 1989, 1005-1006.

2. Sidyakina 5.И,.Santsevieh U.I.,Еаот V.A..KalaJcoiiteJcii I..V. Pre-eervation of elynoclavin producing strain C'layieeps species YKU P-2609. // In : Abstracts of the X Congress of European liycologiats. Tallinn, 19В9» 11213. Сидякина Т.Ы. .Довгилевич E.B. .Модянова Л.В.,Налепила Л.Н. Исследование СПОСОбОВ Хранения культуры Гриба Beauroria bassiana ВЛЛ F-2533 /АТСС-7159/. // В сб.: Передовой производственный опыт в медицинской и микробиологической промышленности, рекомендуемый для внедрения. Изд-во "Мадбиоэхономи-ка", М., 1383, * 12, 16-24.

I. Сафронова В.И.,Новикова Я.1Л. .Сидякина Т.М. .Божьева Л.Т. Жизнеспособность клубеньковых бактерий после криоконсерващш. // В сб.: Труды В:ПИ сельскохозяйственной шшробиологии, Ленинград, 1989, т.5Э, 101-108.. Сидякина Т.М.,Устюжанина С.В..Новикова Н.Д.,Тория С.Е.,Есипова

B.В.,Калакуцкий Л.В. Исследование оптимальных режимов консервации культуры гриба JUremoniua cbrysogenura - продуцента цефалоспорина С. // Антибиотики и химиотерапия, 19Э0, т.35, вып. 1, 11-14.

, Голимбет В.Е., Свдякияа Т.М. .Яковлев А.Г. Консервация культуры Escherichia eoli , несущей рекомбинантяуо плазмиду с фрагментом ДНХ человека. // Криобиология, 1990, * 2, 36-39. Sidyakina V.U. Methods of Microbiol Preservation. // In t Proceedings of the International Conference "bow Itaperature -90*

C.S.F.R., Jlarienske lasne, 1990,- 36,

Sidyakina T .U. Stability of characteristics during long-tera

preservation of fungi. // In t Proceedings of the 4 Interactional Uycologioal Congress, ?.H.G.,Regenab»rg, 1990, 341.

39'. Sidyalcinn Т.К. Cryonlcroscopy study with two- and three-at»p programmed cooling during cryopreaervation of yeasts. // la i Proceedings of the International Specialized Syapoeiua

on Yeasts. C.S.F.R., Smolexile», 1990, 76.

40. Сидякина Т.М. .Санцевич Н.И. .Ежов В.А..Калакуцкий Л.В. Оптимизация условий консервации штамма-продуцента элимоклавина cia-viceps зр.®*^' i-2603. // Прикладная биохимия и микробиология,

1990, т.25, вып. 5, 709-713.

41. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекции культур. // В кн. : "Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы." Кзд-ео ОгГГИ Щ Ш АН СССР, Пущино, 1991,81- 155.

42. Сидякина Т.М.,Лозицкая Н.Д. Лизнеспособность бактерии Рв»и-dononas deaitrificans ВШ В-8Э2 после лиофилизации и криокон-сервации в различных защитных средах. // Проблемы криобиологии,

1991, № 1, 33-39.

43. Sidyaklna !T.Ii.,Khasaeva P.K.,iaptilcova S.D..Uodyanova l.V. Viability and biochenical activity of bacterium Arthrobacter orys-tallopoietes YKU Ac-1098 after freeze-drying and cryopreserra-tion in various protective media. // Cryo- Letters, 1991, N. 12, 3-Ю.

44. Sidyailna Т.И..Goliiabet V.E. Viability and genetic stability of the bacterium E. coli KB 101 with recombinant plasmid during the preservation by various methods. // Cryobiology> 1991, v.28,11, 3, 251-254.

45. Сафронова В. И..Новикова Н.И.,Сидякина Т.М..Божьева Л.Т. Сравнение методов криоконсервацки и лиофилизации как способов длительного хранения клубеньковых бактерий. // Микробиология, 1991,т.60, вып. 2, 338-375.

46. Sidyaklna Т.Н. Low Temperature Freezing of Microorganisms oa Silica Gel. // In : "Mainttr.ance of Microorganisms and Cultured Cells", Eds. B.Kirsop and A. Doyle, Academic Press, Iondon, 1991, 65-70.

47. Тутерман Р.Л..Сидякина Т.К. Разработка биотестов на основе консервированных культур бактерий. //В сб.: Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения. Изд-во "Мэдбиоэкономика", М. .1991, № 2, 27-31.

48. Сидякина Т.М.,Романова Н.А..Пархоменко И.!.'. Разработка биоиндикаторов сверхмалых доз излучения. //В сб.: Передовой про-

нзводственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый дай внедрения. Мзд-во "Медб ио а ко ношка", Ы.,1ЭЭ1, >5 4. 47-53.

49» Sidyaklna Т .11. Cryopreservatlon and freeze-drying of aicroorga.-aime tor biotechnology. // Inj Proceedings of the 28tb International Meeting о £ the Society for О170М010ЕУ "Cryo - 91'*» Belgium; Leuven, 1991, 134.

50. Sidyaklna Г.Ы. Long-tern storage of yeaste by cryopreserva-tlon and freese-drylng. Л Abstracts of the 15th.Inte:rnatio-nal Specialised Syaposlua on yeaata. Riga, 1991, 129.

51. Рамкова H.B., Гутерман Р.Л.,Свдшсина Т.М. и др. Методические указания по контроля работы паровых и воздушных стерилизаторов. // Изд-во Экспериментально-производственного центра "Дезинфзк-ционист", КЗ СССР, 1991, 1-54.

52. Sidyaklna Т.Н..Lozitelcaya Ji.D. .lobrovolskaya T.O.,Kalakoutokil L.V. Cryopreservation of various types of soil bacteria and the mixtures thereof. // Oiyobiology, 1992, v. 29,11. 2,274-280.

53. Sidyaklna Т.Н..Safronova V.I..Kovikova H,I.,Boiheva L.T. Oxyo-preaervation and freeze-drylng of root nodule bacteria. // Ini iroceedinge of the 2-d International Conference "Cvrrcnt Progress In Cryoblology", Kharkov, 1992, 164.

54. Sidyaklna 2>.U.,Safronov3 V.I.,iIovikoYa U.J. Viability end nitrogen Fixation of root nodule bacteria Rhlzobiua and Brady-rhizoblum after oryopreservation end freeae-dxylng.' // In : Proceedings of the 29*^ International Conference "Cryo - 92", Abstracts of Papers Presented at the Тт/enty-IIlnth Annual Meeting of the Society for Cryoblology, Ithaca, iJtvr York,U.S.A., 1992, 50.

55. Zarufcino A.P. .Р'ггИтопепко I.U.,Roncnova Я.А.,Sidyaklna Т.И., BrovJco L.Yu. bow dose irradiation fiction on vegetative cells of Bacillus brevis vor. G.-B. pnd Vibrio fiohcri 6 1I0U and their possible use for low dose biodosemerty. // In : Proceedings of the International Conference on. Lovi Doso Irradiation and Biological Deftnoe Kechenlsms, Kyoto, Japan, 1992,14.

56. Sidynkina Cryonicroecopy anelyslo of Л cur. ago during two-and three-step progrenced cryopreBcrvation of Microorganisms. // la : Proceedings of the International Conference "Theoretical Basis of Cryopreservation", Hradec ZCralove, G.S.P.R., 1992.

При участки автора подготовлены :

Коллективные монографии

1. Торможение жизнедеятельности клеток. Под ред. академика М.Е.Бекера, Рига, Зкнатне, 1937, 237 с./Соавт.:Л.В.Калакуцкий/.

2. Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспектив Под рзд. профессора Б.К.Взпршцева. Изд-во ОНТИ Щ БИ АН СССР, Пущмяо, 1991, 173 с.

3. Uainteaans oí Jíicroorecuiicaa and Cultured Celia. Edo. Prof. E. Kirsop and A. Doyle. Academic Press, London, 1991» 216 p.

Методические руководства

1. Свдяюла Т.М. Консервация микроорганизмов. Изд-во ОНТК [Щ Ell АН СССР, 1985, 53 с.

2. Сдцякина Т.К. Методы консервации микроорганизмов. Кзд-во 01ГО1 НЦ БК АН СССР, 1938, 50 с.

3. Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов. Изд-во Экспериментально-производственного центр "Дезинфекционист" МЗ СССР, Г.'осква, 1990 , 50 с. /Соавторы: Н.В.Рамкова, Р.Л.Гутеркан и др./.

Регламенты

1. "Лабораторный технологический регламент на производство алкалоид

эли.:оклэвина"с "Методикой криогсонсервации гриба ciaviceps sp. Bíflí'F-2309 /2-х-этапноэ программное. закорахивание/ " - выпучен ЙШ АН СССР в 1984 году.

2."Опытно-промышленный регламент на производство цефалоспорина С" с "{¿атодикой криоконсерващп! грибатоп Тот■ ch /v в 0 s еnua ВНИКА-305А /3-х-этапное прогрешйсе з&юрежквэнт/ - выпущен ВШША и ВКМ КЕМ АН СССР в !985 год*

Информация о работе

Сидякина, Татьяна Михайловна
доктора технических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы