Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервирование и лиофилизация холерных фагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервирование и лиофилизация холерных фагов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САШГЕАРИО-ЭГОЩЕШОЛО-ГДОЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВО-' ' ЧУШЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

На правах рукописи КАДЕТОВ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ

КРГОКОНСЕРВИРОВАШЕ И ЖОФИЛИЗАЦИЙ ХОЛЕРНЫХ «АГОВ

03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ

\

диссертации.-на соийкаикв" ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1394

Работа выполнена в Ройговскш-на-Дрну научно-иоследова-• тельском противочумном щсгитуса Хоокрысац^пидаадзрЕа Российской Федерации

НАУЧНЫЕ РУШВОДИТШ:

„Доктор медицинских наук, А.Н.Терентьев

Кандидат медицинских наук,

с научны!! сотрудник В.В.Король

ОФИЦИАЛЬНЫЕ 0ПП0НЙ1Ш:

Доктор ыодццансккх наук.професоор' "....... Н.М.Остроуыовп

Кандидат медицинских наук,

старой научный сотрудник Г.В.Адамова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ставропольский научно-исследЬвателъздшЙ'противочумный институт

I

Автореферат разослан "/6 "СР^У/'^^/ 1994г. Задета состоится " 15 " шрта 1994г. в 93? часов на заседании Сяециализир.оваяного Совета Д 074.32.01 по забито диссертант на соискание ученой степени доктора • наук при Российском научно-исследовательском цротивочуы- •• ном институте "Микроб" Госкомсанэпиднадаора Российской Седорацди /4X0071, Саратов, ул.Университетская, 46/. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

Г.А.Корнеев

- 2 -

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

АкууалЕГРРТ^, проО^м, Бактериофаги широко пршленяытся в различных областях биологии и медицины. Их используют для профилактики и диагностики инфекционных заболеваний, при селекции штаммов микроорганизмов, в генной инженерии, в качестве модельной системы при изучении механизмов взаимодействия вирусов с клетками, в исследованиях по молекулярной и радиационной биологии /Акатов А.К.с соавт., 1974; Баев A.A. с соавт», 197а; Цоремиткна Д.Д.с соавт., 1981; Hu&R-R. ,1977; }Jiüo(JUr P.A., 1979 и др./. Решение зсех этих задач требует создания и поддержания коллекции бактериофагов. В связи с этим является актуальным вопрос разработки высокоэффективных методов сохранения биологических свойств фагов в течение длительного времени.

Наиболее эффективными методами консервации являются лио-филизация и криоконсорвирование бактериофагов в кидком азоте. Однако до настоящего времени недостаточно изучены многие вопросы, связанные с решением задач по разработке эффективного способа криоконсервирования бактериофагов и разработки оптимизированного технологического режима лиофшшзации бактериофагов.

В первую очередь это объясняется индивидуальной ксаро-и криорезистентностыз различных бактериофагов, заставляющей отрабатывать параметры криоконеервироваяия и лиофилизации практически для каждого бактериофага.

В кастоящео время отсутствуют системные исследования влияния на кизиеспособность и ультраструктуру холерных бактериофагов физико-химических (факторов, сопровождающих процео-сы криоконсервирования и лиофилизации. изучен вопрос эф-

фоктивности различных криоцротекторов для холерных бактериофагов. Но разработан метод криоксшсерьировшшл холерных бактериофагов, Существующие рехиш лиофилизвдяи недостаточно технологичны, т.к.разрабатываются без учета тепло-физических характеристик' сред высушивания. Отсутствуют данные о влиянии хранения при температуре хэдкого азота на сохранность биологических свойств..холерных бактериофагов.

наотрящай работа явились; разработка тохнологии криокоисерзированкя и усовершенствование ыэтода лиофилизации холерных бактериофагов, а такие изучение характера воздействия на них физико-химических факторов ультронизкотешора-турного консервирования.

Задачи исрдедорадоя, Для выполнения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние скоростей охлаздения до -196°С и отогрева на сохранность инфекционного титра бактериофагов в зависимости от их строения;

- изучить характер влияния основных физико-химических факторов, действующих в процесса низкотемпературного консервирования;

- исследовать сохранность биологических свойств бактериофагов после кратковременного и долговременного хранения в кздкоы азоте;

- изучить влияния скорости замораживания на сохранность инфекционного титра холерных фагов после сублимации;

- исследовать влияние защитных срод на выаиваоыость типирую-щнх холерных бактерио<£агов после лиофилизации;

- изучить теплофизические параметры защитной среды лиофнли-зации;

- исследовать влияние режимов сублимации с учетом теплофизи-ческих параметров защитной среда на сохранность холерных фагов после лиофилизации.

опасных инфекций /модель холерные бактериофага/ изучена взаимосвязь ыэвду криочузствительностьв и морфологией структурной организации корпускул.

' Впервые разработан метод криоконсерзированля холерных фагов, усовершенствован метод лиофилизации с учетом тепло-физических характеристик защитной среды.

Выявлено приоритетное значение режима заыораяивания для сохранности холерных фаговых корпускул при криоконсервирова-нии.

Определены значимые для холерных фагов физико-химические факторы криоповреждекия.

Установлена зависшость между чувствительностью фаговых корпускул в условиях нормометрии к позре;вдак:цему действию физико-химических факторов криоконсервирования и чувствительностью к поврездаыщему действию замораживания„ что позволяет прогнозировать по чувствительности к данным факторам степень криостабильности холерных бактериофагов.

Установлена индивидуальная чувствительность холерных бактериофагов к повревдацашм крио-я ксерофакторам лиофиль-ного высушивания. Выявлено групповое различие по чувствительности к-цоврокдаадим факторам лиофюшзадии умеренных и вирулентных холерных ..'«гов.

Впервые для бактериофагов особо

Определены оптимальные составы защитных сред и их соотношение для тишрующих холерных $агов при их лиофилизации.

Шацущ09кал ценрдд^ В результате исследовшшя влияния физико-химических факторов криоповровдения впервые разработана технологш криоконсарвирования холерных фагов, поэ-' волшэдая оптимально сохранять их биологические свойства длительное время.

Изучение с&ази теплофизических параметров защитной среды о кинетикой, сублимации позволило усовершенствовать технологш лиофилизации холерных фагов, сократив её время в 2 раза.

По результатам исследований поручено авторское свидетельство "Способ хранения холерных бактериофагов" Л 1296578 /Внодрен в Ростовской цротивочумном институте, 1986г./,'

Разработаны:

1. "Методические рекомендации по сохранению умеренных холерных фагов". Утверждены Ученым Советом РШИ, 1987г.

2. "Методические рекомендации со 1фиокойсервировашт . холерных бактериофагов". Утверждены Ученым Советом РДЧИ, 1991г./ Внедрены во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте "Микроб", Акт о внедрении от 29.05.ЭОг.и в Ростовсвом-на-Дону научно-исследовательском цротивочумном институте. Акт о внедрении от

II.03.91г.

3. "Методические рекомендации по лиофилизации холерных бактериофагов". Утверждены Ученым Советом РИЧИ, 1993г.

Создан гриобашс холерных фагов.

1. Сохранность холерных бактериофагов при кряовоксерви-ровании зависит от скорости охлаждения и комбинации определенных скороотей охлаадения и отогрева.

2. Криочузствитольность холерных бактериофагов связана с особенностями их морфологии и структурной организации.

3. Влияние на холерные фаги в условиях термометрии фи- . зико-химических факторов криоконсервирования позволяет прогнозировать значимые факторы 1фиоповреждения,

4. Учет теплофизических параметров задитной среды и ксероустойчивости фагов позволяют разработать оптимальный режим лиофилизации.

5. Уморенные и вирулентные холарныо бактериофаги имеют различную устойчивость к лиофилизации.

6. Защитные среды лиофилизации с добавкой бивалентных ионов ++, Са ** оказывают повышенное цротективное дейот-вие яа типирующпе холерные бактериофаги.

Арррбацдя ра^оуы. Основные положения и выводи диосерта-ционной работы были изложены я обсуждоны на общеинотитутсккх и междабораторних научных конференциях Ростовского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института, 1934-1Э93ГГ.; Всесоюзной научпой конференции "Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителей 00 И", ростов н/Д., 1984т,; Всесоюзной конференции "Вирусы микроорганизмов и растений", Ташкент, 1Э36г.; Облаотиой конференции "Проблемы медицинской и санитарной микробиологии", Ростов-на-Дону, 1987г.; Областной научной конференции, пос-

вяцэшюй Дню радио, Роотов-на-Дону, 1991г.; 71 Ыеадународ-ной конфоронции "Успехи современной криобиологии", Украина, Харьков, 1992г.

ваний опубликованы в 14 нечат:шх работах.

Структура Текст работы изложен на .146 страницах •

машинописи, иллюстрирован 29 Таблицами, 17 рисункаш. Рабо- -та состоит из введения, обзора литературы, описания ыатериа-лов и методов исследования, изложения, собственных исследований, заключения и выводов.

Библиографический указатель содержит 136 источников отечественной и 118 иностранной литературы.

- 8 -

'СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

Мау^риздц Р. мзт9№.исследований. Объектом исследования были бактериофаги 2044, 6932, М1, Ш, МЗ, 1Л, 3900 , 455, 7227, 3119, 8556, 9966.

В качестве индикаторных штаммов применяли V. е.&о*с. - 75, 208, У.еМо&иьае, 145. В опытах траясдукции црототрофяости донором олухилыгаым \J.etLc~c Р-5879, реципиентами были штаммы \J.eJbjcn. &73/67 Н(3 -673/67 /мутанты, полученные от Ы.И.БогдановоЁ, РПЧЦ/. Спектр литической активности фагоз .допытывали на 246 штаммах различных видов бактерий.

Для изучения серологических свойств фагов применяли ан-тифаговыо сыворотки, полученные путем, внутривенной иммуниза-. ции кролтсов холерными фагами 1-П типов по методу ¡Ларьиной Ю.Н. /1941/.

Концентрирование фагов производили высокоскоростным центрифугированием при 4°С на ультрацентрифугэ / 2-65В " ВесЬтапп.

Очистку фагов осуществляли высокоскоростным центрифугированием в градиенте Сд /£ »1,0117-1,7826 г/см3/о помощью ультрацентрифуги фирмы " Вгяктап *,

Выживаемость бактериофагов определяли по количеству жизнеспособных фаговых частиц на индикаторных штаммах стандартным методом агаровых слоев по Грациа Ддг^до, 1961/.

Исследование ыорфологил негативных колоний, окорооти адсорбции бактериофагов на бактериях, серотипнрованио ; В реакции* нейтрализации специфическими т.мунными сыворотками производили по методам, описанным и.Адшлсом /1961/.

Фаготипирование штатов холерных вибрионов проводили по методу ¡Л.С.ДрожеькиноЙ и ¡О.И.Арутюнова /1979/.

Спектр литического действия и специфичность фагов изучали на 101 штамме холерных вибрионов двух биоваров, 52 штаммах УкЖк&гш, не 01 груш /02-057/, а также на Аепото -• У)ал. - 13 штаммов, - 3 штамма, V. тттсиб -

3 птаыыа, Рзеис/отопаз ' - 5 штаммов, Р-бмютопа* - 2 штамма, V- - 7 штаммов, У.^агаЬаето^/аи^ - 12 штампов, Уа^пой^имл -И птамгоь, -23 шташа, СалюрцваЁасЛог- 14 штаммов. Определегае диапазона литической активности проводили иа агаре Мартена путам, нанэсения фаги на газон чувствительной культуры, который го-' товдли двухслойный методом. Исследуемые фаги в концентрации 1-6.10° БОЗ/мл наносили металлическим репликатором. После высыхания капель суспензии бактериофагов чашки инкубировали в тершотатв и учитывали наличие зон лизиса.

Ультраотруктуру фаговых частиц изучали на электронном шкросходо ЗЕМ -100В при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Трансдукцшэ дрототрофяости осуществляли по методу, предложенному. Кудряковой ТД.и Черкасовой Л.Р. /1987/.

Чувствительность бактериофагов к гипотоническому шоку определяли следующим образом: к 0,1 мл суспензии фагов до-ба2;.*„м 9,9. ыл 5М раствора хлористого натрия я через 30 ми-пут экспозиции 0,1 мл полученной смеси добавляли к 9,9 ил ■ дистиллированной воды. Затем общий объем раститровывался на 2 порядка добавлением по 0,5 мл вновь получаемого раствора в пробирки с 4,5 мл бульона Мартена, делалоя выоев по Гра-циа.

В качество контроля 0,1 мл фага добавляли к 9,9 ыл дистиллированной воды и раститровывали как описано вшю.

Чувствительность бактериофагов к гипертоническому шоку

исследовали следующим образом: к ОД мл суспензии фаговых частиц в мясо-пептонном бульоне ДЕВ/ быстро добавляли по 9,9 мл I; 2; 3; 4; 5М растворов хлористого натрия я затем определяли количество жизнеспособных фаговых частиц высевом по Грациа.ч

Чувствительность бактериофагов к температурному шоку определяли по методу, описанному Высеканцевым Л.Н. /1983/. •

Чувствительность бактериофагов к изменениям рН среды консервирования исследовали по количеству жизнеспособных фаговых частиц поело цробывания в течение 30 минут в ШБ, рН которого изменяли в интервале от 5,0 до 9,0 путем добавления соляной кислоты или едкого натра.

Теплофизические параметры защитной среды лиофшшзации определяли по методу Цветкова Ц.Д.и Меранзова Н.С. /1984/.

Скоростные градиенты контактных и бесконтактные режимов замораживания, как этапа лиофилизации, определяли при помощи самописца КСД4 и термодатчика ТС«14, фиксируемого в замораживаемой пробе.

Влияние длительности выкаливания, захороненного до -55^50С препарата, определяли по количеству жизнеспособных фаговых частиц после лиофилизации.

Лиофилизации проводили на лиофилизаторе /,/Г 9С /фирма Фригора, ЧССР/ и УЗБ-З /Опытное производство СКТБ при Институте проблем отиобиологил и криомедицшш АН Украины/.

Замораживание осуществляли на программном ааморажи-ватвло биопродуктов /Производство СКТБ при Институте проблем криобиологи)! и криомвдицшы АН Украины/.

Остаточную влажность лиофилиакрозаштх препаратов оп-ро.ллляли по метолу Долинова К.^'. /1971/.

- II -

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента-Фишера /Дакии Г,Ф., 1980/.

Р§ЗУЛШИ. и. Мятит?

• Для обоснования оптимального режима щжоконсервирова-ния холерных бактериофагов с различным строением фаговых частиц нами было изучено влияние различных скоростей охлаждения 0,1; I; 10; 40; 400°/мин. по одноэтадной программе от +20°С до -196°С и последующего отогрева на водяной бане при +4°С и при +37°С на сохранность холерных бактериофагов 3119 , 8556, 455. В качестве срода консервирования попользовали ШБ /ыя-со-пептонный бульон/.

Данныа этих исследований свидетельствуют о различной крпоустойчивости холерных бактериофагов 455, 3119, 8556 к изменению режимов охлаждения-отогрева.

Количество жизнеспособных частиц фага 3119 после охлаждения со скоростью 400°С/мин.достоверно не изменялось /цри любом отогреве/. Охлаждение со скоростями 10 и 40°С/мин.вы-зывало достоверное снижение количества жизнеспособных фа-' говых частиц /60$ и 76,соотвотственно/. Охлаждение со скоростями I и 0,1°С/мин. понижало количество жизнеспособных фаговых частиц на I и на 2 поредка/соответствонно/, цри этом выявляется достоверное преимущество оттаивания цри +4°С, дающое на 30-40$ больше жизнеспособных фаговых корпускул.

Цри замораживании холерного бактериофага 8556 сохранность количества жизнеспособных фаговых частиц на исходном уровне наблюдалось после охлаждения со скоростями 10, 40, 400°С/м1Ш.в независимости от режима последующего отогрева /Р-с 0,05/. Охлаждение со скорости.« I и особенно 0,1°С/мин.

- 12 -

приводило к значительному снижению количества жизнеспособных фаговых корпуокул. В образцах» замороженных со скоростью 0,1°С/мии., выживаемость бактериофага зависела от температуры отогрева. После отогрева при +4°С количество жизнеспособных частиц составляло 2,24$ от исходного числа, при 37°С-1,53$ /Р< 0,05/.

Холерный бактериофаг 455 независимо от скорости охлаж-' дения-отогрева сохранял практически одинаковый уровень инфекционного титра ~ 40% от исходного титра /Р<0,05/.

Таким образом, полученные результаты показывают, что чувствительность холерных бактериофагов, имеющих различия в строении вибрионов, к повреждающему действию низкихззмпера-тур и изменению режимов замораживания-оттаивания различна. Наименее зависимым от скоростей замораживания-оттаивания оказался короткоотросчатый холерный фаг 455.

На сохранность жизнеспособности криоконсэрвированных бактериофагов наиболее значимое злиянио^оказывает скорость охлаждения. Влияние режима отогрева менее выражено и проявляется при определенных для разных бактериофагов скоростях охлаждения. Наиболее оптимальным режимом криоконсервированкя, обеспечивающим максимальную выживаемость бактериофагов 3119, 455, 8556, является одноэ тайное замораживание от +25° до -19С°С со скоростью охлаждения 400°С/мин.и отогрев на водяной бане при +ЗУ°С.

Поскольку ЮО^нуга сохранность инфекционного титра фагов 3119 и (3556 удалось обеспечить подбором режима охлаждения, исследовании криопротективного действия защитных сред на фаги проводилось з опытах с бактериофагом 455. Было ус-

тановлэно, что ПЭ0-400 10%, ДМСО 75?» бульон Мартена, физ.раствор, а также комбинации ПЭО-400 и ДШО с* бульоном Мартена /ростовая среда/ не оказывали криозащитного действия цри замораживании бактериофага 455.

Установленная зависимость выживаемости холерных бактериофагов от скоростей охлаждения согласуется с классическими представлениями Маъиъ /1963, ГЭ65, 1970/ о взаимосвязи ыежду скоростью охлаждения и физико-химическими факторами, вызывающими гибель биологических объектов цри замораживании.

Имеющиеся данные по влиянию низких температур на бактериофаги, а также анализ их выживаемости после криоконсерв!фо-вания позволяет говорить о корреляции между их чувствительностью и характером изменения свойств под влиянием отдельных физгко-хкдотеоюгх факторов в условиях нормоыетрии и после ох-лагяения-оттаивания /Быстрый Н.й.с соавт., 1971; Высекаяцев И.П., 1983; Ломов Ю.М.о соавт,-, 1990; Стегний М.Ю., 1989; Цуцаева А.А.с соавт., 1987/.

3 этой связи нами проведены исследования по выяснению роли физико-химических факторов, сопровождающих процесс крио-консервирования /температурный шок, гипер- и гипотонические шокп, изменения рК суспензионной среды/ в .повреждении фаговых частиц.

Было установлено, что температурный шок не вызывал гибели холерных бактериофагов и не повышал чувствительность фаговых частиц к последующему замораживанию до -196°с с различными скоростями.

Холерные бактериофаги но погибали в гипертонических растворах с концентрацией хлористого натрия до 5..1 и при измене-

- 14 -

нии рН суспензионной среда от 5,0 до 9,0.

Гипо- и гипертонический шок в растворах хлористого натрия не вызнвал гибели холерних фагов 3119, 8556, 455.

Полученные данные свидетельствуют о том, что холерные бактериофаги 3119, 8556, 455, для которых была установлена различная чувствительность к действию^адараживавия, обладают одинаковой устойчивостью к изменениям рН суспензионной среды, гипо- и гипертоническим шокам. Это позволяет исключить роль данных факторов в повреждении фаговых корпускул при замораживании..

Таким образом, повреждение фаговых корпускул фагов ЗП9 и 8556 при медленных окоростях охлаждения /0,1 и 1°С/шш./ можно косвенно отнести на счет повышенного гидростатического давления и повреждения кристаллами льда как наиболее значимых факторов для данных объектов.

Подтверждением этому служат полученные данные об'изменении ультраструктуры холерного фага 3119 после ультрзяиз-котешературного замораживания до -196°С. Так, после замораживания со скоростью 0,1°С/мип.встречались корпускулы с поврежденным капсидом и вышедшим содержимым головки, частицы с неизменным капсидом, с сокращенным чохлом- отростка и без содержимого головки, головки без отростка и своего содержимого, оторванные отростки. Талсой характер повреждени. обычно характерен при воздействии па фаги повышенных гидростатических давлений, а также механических производных кристаллообразования /Адаме Ы., 1961; Андерсон Т.с соавт., 1956; Бронштейн В.Л.С соавт., 1988; Дудаева А.А. о соавт., 1983/.

Из полученных данных следует, что при низкотемператур-

- 15 -

ноы консервировании криолабильных холерных бактериофагов необходимо применять режим охлаждения позволяющий свести к минимуму неблагоприятный характер кристаллообразования и как следствие развитие повышенного гидростатического давления. Установленная корреляция между чувствительностью бактериофагов к повреждающему действию вамораживйшия и физико-химических факторов низкотемпературного консервирования дает возможность прогнозировать по чувствительности к данным факторам степень криолабильнооти и соответственно оптимальный режим криоконсервацди холерных фагов.

О целью изучения эффективности метода криоконсервирова-ния холерных бактериофагов было цроведено изучение сохранности биологических свойств холерных фагов 3119, 8556, 455 после различных сроков хранения в жидком азоте.

Изучена сохранность количества жизнеспособных фаговых частиц после криокопсарвирования по пяти режимам: I/ Одноэтайное охлаждение от +20°С - до -196°С со скоростью охлаждения 400°С/мин., хранение при -196°С в течение I часа и 1,2,3 лет, отогрев на водяной бане при +37°С; 2/ Одноэтапное охлаждение от +20°С до -196°С со скоростью охлаждения 40°С/мин..хранение при -196°С в течение I часа и 1,2,3 лет, отогров на водяной бане при +37°С; 3/ Одноэтапное охлаждение от +20иС до -196°С со скоростью охлаждения Ю°С/мин., хранение при -196°С в течение I часа и 1,2,3 лет, отогрев на водансй бане при +37°С; 4/ Одноэтапное охлаждение от +20°С до -196°0 со скоростью охлаадэния 1°С/мин., хранение при -1Уъ°С в течение I часа и 1,2,3 лот, отогрев на еодянон бане при +3,°0;

б/ Одноэтапное охлаждение) от +20°С до -196°С со скоростью охлаждения 0,1°С/мин., хранение при ~196°С в течение I часа и 1,2,Злот, отогрев на водяной бане при +37°С.

В результате этих исследований было установлено, что длительность хранения криоконсервированных образцов холерных фагов при температуре -196°С не влияет на количество их жизнеспособных частиц /Р> 0,05/, которое определяется на этапе охлаздения-отогрева.

Кратковременное криоконсервирование в течение I часа, а также хранения холерных фагов в жидком азоте в течение 3 лет не влияло на морфологии негативных колоний, спектр их литической активности, антигенные свойства, скорость адсорбции на бактериях, специфичность, трансдуцируидую антивнооть, ультраструктуру, чувствительность к гипо- и гипертоническому шокам, изменениям рН суспензионной среды.

Согласно существующим данным, значимым "для сохранения биологических свойств фаговых препаратов при лиофилизапии являются такие факторы, .как скорость замораживания, длительность выкаливания, соотношение вирионов к защитной среде, защитная среда и режим сублимации /Брандзкиевский Ю.В., 1976; Ганев В.с соавт., 1982; Ишонецкий А.А.0 соавт., 1970; Никитин •2.2,, Звягин И.В., 1971; У&и^. 1970; Щиганова Л.Б., 1982; Коровника Г.И.о соавт., 1986; и др./,

Поэтому при разработке оптимизированного режима лиофи-лизацпи нами были проведены исследования по изучению влияния значимых параметров лиофилизацпи на холерные фаги 2044, 6932, 8550, ¡Я, 1.12, г. 13, ш4 , 3900 , 455, 7227, 3119, 9966.

В опитах по нзуюшю влияния различных рекяиоа замора-

живания, как этапа лиофилизации, было установлено, что замораживание до температуры -50+5°С со скоростным градиентой 12°С/мин.является оптимальным для всех режимов последующей сублимации.

Следует отметить, что оптимальный режим замораживания, как этап лиофилизации не совпадает с оптимальным режимом замораживания при криоконсервировании. Это объясняется вероятно тем, что плотная кристаллическая упаковка или даже упаковка "стекловидного тела", получаемая при скоростном замораживании фагов в различных защитных средах вызывает значительные помехи удалению водяных паров цри сублимации, что в свою очередь значительно удлиняет время сушки и ведет к повреждению биообъокта.

Выкаливание в течение 60 минут оказалось достаточным для стабильного поддержания кристаллической структуры, предварительно замороженного материала, в процессе сублимации и позволяло сохранять высокий процент жизнеспособных фаговых корпускул.

Изучение влияния соотношения тияирующих фагов и защитной среды на сохранение фаговых корпускул при лиофилизации показали, что соотношение 2/1 /фаг/срод/ является оптимальным для большинства фагов.

Индивидуальная чувствительность холерных фагов к неблагоприятным факторам замораживания-высушиваиия подтверждена соответственно индивидуальными требованиями их к защитным средам. Опыты по оптимизации сред высушивания показали преимущество пэцтоно-желатиновой среды, как универсальной основы для сохранения большинства типирующих хсло^шгх фагов методом лиофилизации. Добавка в защитную среду двухвалентных

ионов'Са4* и особенно в концентрации 0,75£ оказывает выраженное цротективное дейотвиэ для фотов различных морфо-групп как'при лиофилиэации, так в последующем хранении. Добавка ионов Afg ++ цредоочтитольнэй при хранении зыоущен-ных фагов в условиях умеренно низких температур /4-10°С/, В тоже время, высокие концентрации гойов Са++ в защитной'среде лиофилиэации ояоообны вызывать ее оильное помутнение и образование нераотворимых агрегатов за счет полимеризации 'белков чехла фагов, что ухудшает качество готового продукта.

С целью обоснования оптимального режима оублиыации холерных фагов, .наш предварительно были изучены ташгофизи-Чбокив параметры среды вноугаиваиия, которые для цеотоно- . желатиновой среда составляли:

Tj - температура начала формирования отекловидного тела -40,2°С;

- температура эвтектики - 36,6°С; Тд - температура плавления жидкой фазы -23,1°С.

Проведенными исследованиями 5 различных режимов суб-димацид, о учетом тедлофизичэсках параметров защитной среда, было установлено, что режим П /скороотной градиент подогрева 3,03°С/мян. Подогрев - 60°С - 2 часа;' -50°С - 1,4 часа; -23°С -'3,4 часа» -17°С - 1,75 часа; -5°С - 2,7 часа? +25°С - 1,6 часа. Общая продолжительность 12,6 часа /является оптимальным практически для воех взятых в опыт вирулентных фагов /выживаемость фагов ох 22,3 до 60,&% активных кррпускуд/. Д»1 умеренных фотов 3119, 3556 , 9966 оптимальным является режим сублимации Ш /скоростной градиент подогрева 3,03°С/мин/. ■ Подогрев -50°С - 40 минут; -20°С - 0,75 часа^ -Ю°С - 0,45 часа} -5°С - 7,5 часов;

- 19 -

+250С - 1,5 часа. Продолжительность II часов/, что по-видимому обусловлено их болов высокой чувствительностью к • длительному воздействию на них физических факторов сублимации.

Из полученных данных следует, что применение режимов сублимации, проводимых при температуре нижа точки эвтектики высушиваемого материала практически до полного удаления из него основной влаги, а также увеличение скорости сублимации „обуславливаемой оверхнивкой температурой десублимаг-тора, позволило разработать оптимальные режимы сушки, сокращенные по сравнению с традиционными в 2 раза без ущерба для жизнеспособности фагов и на одной и той же защитной среде.

Ироведашше наследования показали индивидуальную устойчивость различных фагов к замораживанию-шоушиванию. Наблюдали также отличио умеренных и вирулентных фагов по устойчивости к диофилизации. ' .

В сравнительных опытах с исходными жидкими препаратами типирувдих фагов и лиофильно выоушенякх по оптимизированному режиму, показана полная сохраняемооть ими своих тили-рутадах овойотв.

- 20 -ВЫВОДЫ

1. Крио и ксерочувствитэльность холерных бактериофагов варьирует в зависимости от особенностей их структурной организации.

2. Приоритетное значоние для сохранности холерных бактериофагов при консервации методами лиофилизации или г^иокоп-

сервации имеет скорость охлаждения.

/

3. Впервые разработан метод крлоконсервации холерных, фагов. Оптимальными параметрами криоконсервироваяия для холерных бактериофагов являются одноэтапное охлаадение от +20ОС до -196°С со скоростью 400°С/мин., хранение при -196°С и отогрев на водяной бане цри+37°С.

4. Изучение действия физико-хишческих факторов' приопоэ-рсждения позволяет прогнозщювать степень вриочувствительности холерных бактериофагов и оптимизировать режимы их криоконс'р-вирезания. ■ •

5. Хранение холерных бактериофагов в течение 3 лет /срок наблюдения/ цр'и температуре"-195°С не влияет на их основные биологические свойства.

6. Разработанные оптимальные ренимы лзофилпзацги для холерных бактериофагов различных ыорфогр^пп, позволяют сощ>атить продолжительность цикла сублимации до сравнению с традиционными режимами в 2 раза без влияния их на биологи-чоскио свойства.'

7. Ушрошшэ и вирулентные холэрные фага игле ют различную чувствительность х лиофилизации.

В. Пептоно-жолатшопая. и сахарозо-желатиношз среда с добазкаьих дзухзалентннх нонав /Дз или Са"*"*"/ яалялтея

- 21 -

универсальными защитными оредами для сохранения большинства холерных фатов методом лиофилизации.

9. Криоконсервировалии являетоя оптимальным методом длительного сохранения биологических свойств холерных фагов.

. Диофшшзацкя позволяет консервировать фаги в форме,удобной для транспортировки и хранения, являясь наряду о кржо-консорвацией необходимым компонентом поддержания музейных коллекций.

<

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Македонова Л.Д., Кудрякова Т.А., Король В.В., Кадетов В.В, Влияние лиофильного высушивания на хизпоопособнооть холерных фзгов.-Молекул.биол., генетика и иммунология возбудителей 00И: Тез.докл. "Воесото ;научн.конф. и-Роо-

тов н/Д., I984.-C.I8I-I83.

2. Македонова Л.Д., Король В.В., Кудрякова ТД., Кадетов В.В. Сохранение умеренных фагов холерного вибриона методом дио<|илизации.-Тех.Всесоюз.научн.конф. ,поовящ.60-летию Тбилисского. НШВС.-Тбилиои,1984.-С.140-142.

3. Македонова Л.Д., Кудрякова Т.А., Кадетов В.В. Способ сохранения холерных бактериофагов. A.C. Je 1296578. Опубл. 15.II.86. //Открытия. Изобретения.-1987,- Л I0.-C.ÎI3.

4. Македонова Л.Д., Арутюнов В.И., Кудрякова TJL Наталич Л.А., Кадетов В.В. Подбор защитных сред* для лиофильного

высушивания холерных фагов. //Вируса микроорганизмов и растений: Тез.Всосоюз.конф., Ташкент, I986.-C.203-204.,

5. Кадетов В,В., Король В.В., Терентьев А.Н. Принципы лио-филязации вируоов. //Воцр.вирусологии.-1988.-й 4,-С.З-Э.

6. Македонова Л.Д., Арутюнов Ю.И., Кудрякова T.À., Натачгч Л.А., Кадетов В.В. Подбор защитных сред для лпофальцого высушивания холерного фага //Пробл.мед.и сан.микро-биологии: Тёз.докл.Обл.науч.конф.-Ростов н/Д., 1987.-C.P.0-9I. .

7. Кадетов В.З., Дудшша О.В., Кудрякова Т.А., Дегтярев S.U.,

Терентьев А.Н. Влияние режимов замораживания и зтио-

протектороз на со;грашгасть холерных фагов при крио-консервировашы //Эпидемиологии,шкробиол.и имму-юл.

- 23 -

бактер.и вирусн.инфекций: Твз.докл. Обл.научн.конф.- . Ростов н/Д., 1989.-С.27-29. 8. Дудкина О.В., Кадетов В.В., Кудрякова Т.А., Дегтярев Б.Ы., Македонова Л.Д., Терентьев А.Н. Биологические свойства криоконсервчрованных холерных фагов. Ростов н/Д. Противочумный ин-т.-Роотов н/Д., 1990.-Зо.-Дед.в ВИНИТИ, 10.10.90, № 5311-В90. 9. Кадетов В.В., Дегтярев Б.Ы. Влияние длительного криокон-сервирования на структуру и инфекционный титр холерных фагов //Обл.научн.-техн.конф.: Тех.докл.-Ростов н/Д, 1991.- С.45-46.

10. Дегтярев Б.М., Кадетов В.В. Изучение действия криопро-текторов на целостность холерных фагов при ультрозамора-живашш /Обл.научн.-техн.конф.: Тез.докл.-Ростов н/Д., 1991.- С.43-44.

11. Дегтярев Б.Ы., Кадетов В.В. Электронно-микроскопическое • изучение структуры холерных фагов 455, 8556, 3119, замороженных до -196°С с различными скоростями //Обл.научн.-техн.конф.-Тез.доклт Ростов н/Д., 1991.-С.44-45.

12. Кадетов В.В., Кудрякова ТД., Дудкина О.В., Терентьев А.Н., Дегтярев Б.М. Криоконсервация холерных фагов

//Успехи современной криобиологии: Тез.докл. Мездунар. конф.', Харьков, 1992,- С.75-Ш.

13. Ыакодонова Л.Д.,. Кудрякова Т.А., Наталич Л.Л., Кадетов В.В. Лиофидизация фагов холерных вибрионов 01 и не 01 групп //Пробл.криобиологии.-Киев: Наукова думка, 1991,- Вшт.2,-С.34-40.

14. Кадетов В.В., Шкодонова Л.Д., Кудрякова Т.Д., Дудкина О.В., Терентьов А.Н. Оптимизация лиофильного высушивания холерных фагов //Изв.Сев.Кавк.научн.центра Высш. шк. Ест.науки.-19Э4г.- » I. -С. 12-17.

Подписано к печа.ти Я5.01, 9*1 г

.Формат бумаги 60 х 84. 1/16* Бумага офсетная. Печать офсетная. Поч. лист - 4

Заказ -ВЦ тираж - 400 . Тип. ТМЦ.