Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексная характеристика и селекция клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Комплексная характеристика и селекция клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae"



ВСЕРОССИИСКИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи

САФРОНОВА

Вера Игоревна

КОМПЛЕКСНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СЕЛЕКЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ КОЗЛЯТНИКА 1*Н120В11Ш САЬЕвАЕ

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биологического азота Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН,

Научный руководитель — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А. П. Кожемяков.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Б. В. Си-маров; доктор биологических наук Б. С. Курлович.

Ведущее учреждение — кафедра микробиологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

у Защита диссертации состоится «^¿Г» 1 1994 г. в

час. мин. на заседании Специализированного совета К.020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « > 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, .

кандидат биологических наук ' Ь 1 Марецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_щоблеш. Бобовое растение козлятник. (Galega) в последнее время относят к перспективным сельскохозяйственным культурам, пригодным для выращивания в умеренных и северных широтах. Козлятник восточный (G.orientaliB) используется кок кормовая культура. При этом он выгодно отличается от традиционных кормовых бобовых трав, таких как клевер и люцерна, долголетием травостоя (7-12 лет) и ранним весенним отрастанием (одновременно с озимой ролью) [Вавилов, Райг, 1982). Урожай зеленой массы козлятника восточного на 2-й и 3-й годы вегетации составляет 450-470 ц/га. Трава козлятника лекарственного (G.oííiclnalis).благодаря присутствию алкалоида галегина, способствует лечению сахарного диабета и находит все большее применение в медицине.

Микросимбионтом козлятника является пока малоизученная группа быстрорастущих клубеньковых бактерий (Rhizoblum).которая сравнительно недавно получила статус вида R.galegae [Lindstrom,1989). Предпосевная обработка семян козлятника ризоторфином (препаратом, производящимся на основе высокоэффективных штаммов R.galegae и стерильного торфа в качестве напс-?нителя) является важнейшим агротехническим мероприятием.Такал обработка способствует усилению роста растений в фазу цветения¡увеличению массы цветочных клетей, а также количества разеитых и плодоносящих побегов, что приводит к увеличению зеленой массы растений (до 6555),уровня азотонакопле- '» ния в них и уролайноста семян [Пыркова, 1989].

У§5!г_к_задата_исследоваН20.Для обеспечения сельского хозяйства эффективными препаратам под козлятник необходимо изучение физи-олого-Оиохшических свойств и генетической организации бактерий R.galegae, п также проведение селекции производственно-ценных штаммов и разработка методов их лабораторного хранения.

В связи с этим были определен!! следующие задачи исследований:

- изучить кулътуральные свойства 23 ¡голчег-вдонных штаммов R.galegae и специфичность их взаимодействия с бобовыми растениями; -осуществить конъюгатившй перенос плазмид R.galegae в авирулент-ные мутанты R.meliloti и штаммы Agrobacterlum, изучить симбиоти-ческие свойства получешых транечонгюгантоп;

- выявить оптимальней параметр для селекщш клубеньковых бактерий

козлятника в условиях стерильного микровегетационного опыта;

- проанализировать вффективность 10 штаммов R.galegae для козлятника восточного и лекарственного в условиях вегетационных опытов;

- изучить влияние кркоконсервации и лиофилизации на жизнеспособность и сиыбиотические свойства коллекционных штаммов R.galegae.

- осуществлена мобилизация симбиотических генов (Sym-генов) R.galegae в авирулентные мутанты R.raellloti, а также штаммы Agrobac-terium radlobacter и A.tumeíaclens.Показано,что в результате введения Sym-генов R.galegae в A.radlobacter, могут возникать транс-коныоганты, вступающие в эффективный симбиоз с Medlcago varia;

- оценен вклад генотипов симбиотических партнеров в изменчивость показателей симбиоза Galega orlentalle - R.galegae в условиях микровегетационного и вегетационного опытов. Показано,что генотип штамма вносит максимальный вклад в варьирование симбиотических показателей в условиях вегетационных опытов, но не оказывает достоверного влияния на изменчивость показателя массы растений козлятника в микровегетационном опыте;

Практическая_ценность.

- в качестве оптимального параметра для селекции штаммов R.galegae в условиях стерильного микровегетационного огшта предложено использовать интенсивность редукции ацетилена;

показано сохранение симбиотических свойств штаммов R.galegae в результате криоконсервации и лиофильного высушивания;

- отобраны высокоактивные штаммы R.galegae, которые могут быть использованы для изготовления ризоторфинв для козлятника восточного и лекарственного. Получено положительное решение на выдачу патента на штамм CIAM 0716 для козлятника лекарственного.

Апдобация_работы.Результаты работы докладывались на VII Всесоюзном симпозиуме"Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), Научной конференции ."Изучение и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1991), II Республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), VIII Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation NITROGENPIX-92 (Saratov, 1992).

Публикадии. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

25ъем_работы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, раздела "Объекты и метода исследований", четырех глав, со-, держащих результаты исследований и их обсуждение. Диссертация завершается заключением,выводами и списком литературы.Материял диссертации изложен на 154 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 4 рисунка. Список литературы■включает 241 название, из них 48 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ • Материал и методы исследований

Объектами изучения служили 23 штамма К^а1е§ае различного географического происхождения,образующие эффективный симбиоз с козлятником восточным и лекарственным. 15 штаммов - из Национальной коллекции■клубеньковых бактерий ВНИИСХМ.З штамма получены от д-ра . К.Линдстрем (Финляндия) и 5 - выделены нами из клубеньков на козлятнике в Алтайском экспер. хоз-ве ИЦИГ Сиб.Отд.РАН и на Полтавской опытной станции ВИЛР.

Антибиотикоустойчивие мутанты 2-х штаммов Я.£а1е£ае (07СЗ к 0711) были использованы в качестве доноров в скревдваниях. Реципиентами служили авирулентше мутанты клубеньковых бэктерт'й люцерны (Н.гсеШоН), а тгкге штаммы А§гоЬас1ег1ш гагИгЬас1;ег и А. Ши'Лас1епз. В к&честсе 1зехтора-"самоубийцы" была использована плазкидз р5ЦГ2111(произзодняя рВИ325).которая содергетТ трянспозон Ш5,опу-эделякйра'» устойчивость к канамицину и ген штрогсназы п1ХН.

Зпетер;!Елы:мо ытз1я:ц выращивали при 28°С па машгктно-дрохге-ВСМ ;:Ги рэ (МДЛ) ГЛпспП, НиврЬгеу, 15701. Скрещивание К. е;а1е§ае со штаммом Е.соП.нгсутрш векторную плазшду,осуществляли на ага-ризованкой среде ТУ П.ИНег, 19723. Скрещивание штаммов К.ца1е^ае с й.теЩоН и А£гоЬас*ег1т -на МДА'. Отбор трансконыогантов проводили ка МДА с ант.:б:'отикаки, которые добавляли в следующих концентрациях (мкг/мл срэд;*): стрептомицин (Б1г) - 1000; канамицин (Кт) - 200; ампициллин (Ар) - 250; рифампицин (Н1Г} - 40.

Изучение {изиолого-биохимических признаков (30 тестов) проводили традиционными методами [Справочник по микробиол.и вирусол. методам исследования, 1982; Методич. указания по идентификации

HbcuopoBux СактсршЛ, доминирующих в ризосфера, 198131.

Скроципакик осуществляли по методике, описанной ранее llllapu-1JOD3 и др.,19071.Частоту появления трансконъюгантов определяли по <vrHO!:ii";im;u количества Ктг-1слонсв к титру клеток реципиента. Плаз-шцдаД состав ктеыыов анализировали методом "мягкого" лизиса в агарозном геле [Eckhardt, 19'í8l, используя в качестве контроля ытамм АоЗЗ A.rhizogeneG с плаямидаыи известной молекулярной массы.

Ci.i.!0!t0TíiHdCK4e свойства штаммов изучали в условиях стерильного и;1кровеге.тацион1юго опыта в пробирках с агаризованной минеральной средой, а тылй в условиях вегетационного опыта в сосудах с 3 кг нестерильной дорново-подзолистой почва [Починок, 19761.

Лнофшшзадаи бактериальных ¡слеток в .сахарозо-калатиновом агаре (С2А) и крио.чонсервацию культур в СШ и 10%-ном растворе глицерина осуществляли по методике, описанной ранее [Сидякина,19881.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя t-критерий Стьюдента, однофакторный и двуфакторный дисперсионный анализ, а также корреляционный анализ [Доспехов,19851.

Результаты и обсуждение

I. Культуральные признаки клубеньковых бактерий козлятника и специфичность их взаимодействия с бобовыми растениями.

Некоторые физиолого-биохимические свойства 23-х коллекционных штаммов R.galegae были изучены в Сравнении с 68 штаммами других видов Rhlzobium.a также родов Bradyrhlzobium и Agrobacterim. Только 30% штаммов R.galegae обладали способностью расти, при 37°С; 35% штаммов росли на среде, содержащей 1,5% NaCl. Коллекционные штаммы R.galegae не развивались при 2% tJaCl в среде и 39°С. Таким образом, клубеньковые бактерии козлятника являются умеренно температуро- и солеустойчивыми. Для сравнения: штаммы R.meliloti способны расти при 40°С и 3%-ной концентрации NaCl в среде,напротив, для роста клубеньковых бактерий эспарцета температура 35°С и 1% NaCl в среде являются максимальными значениями.

Исследование способности штаммов R.galegae утилизировать различные источники ух'лерода и азота показало, что они хорошо разви-

ваются на средах с (Ш4)2БОд и (N11^ )г,МоОд в . качестве источника азота,а также на средах с глюкозой, лпхтозой,'граолкозой и рзмпо-зой в качестве источника углерода (с образование:.! кислых проектов). Как известно, подкисление среди при росте бактерий свойст-вето быстрорастущим видам клубеньковых бактерий [Jordan, 19841. Менее интенсивный рост наблюдался при использовании солей NH^Cl, (Ш4)3Р04, Ca(N03)2 и NalIOg а такке ксилозы, мальтозы, дульци-та и сорбита.

Лри изучении отношения ита\?мов R.galegae к антибиотикам, был отмечен высокий, по сравнении с медленнорастущими ризобиями, уровень их чувствительности к рифампицину (отсутствие роста при концентрации 5 иг/л среда) и, напротив, низкий уровень чувствительности к ампициллину (наличие роста при коиц. 10 иг/л среды), что тагасе характерно для других видов Rhizobium и агрсСзктерий.

При определении таксономического положения клубеньковых бактерий наряду с анализом физиолого-биохимических характеристик необходимо изучение спектра их хозяйской специфичности. Результаты анализа хозяйской специфичности цтешлов R.galegae при'инокуляции 2-х видов козлятника (G.orientalls и G.oííiclnalic), а также бобовых растений 7 различных родов'(Oxytropis, Hedycarun, iieaicago, Triíoliun, Astragalus, Lotus, Glycyrrhlza), отнсс.<летхся к различием трибам галегоидкего комплекса,показали,что бактерии R.gaiegae вступают в симбиоз только о растениями козлятника, причем штамш, образугедсе sí«¡»KTiít.;»iíM сюйисз с козлятником восточкж;, форккру«-т ныктздаге ллубош>ня на козлятами? лскэрсгг'сихон :г наоборот.

Представление результаты изучения лультуральшх и симбиоти-ческих свойств i:j;yOeHb¡:oEu::. бактерий козлятника согласуются с даши;?«!, полученный:! ранее другими авторами [UnciGtrom, Jarvls, Linar.trur., Le.t'.oi.-,aiíi, 1930; Llndsxrom, 1989J.

"itiiazi o^Jiib-jii, i.^obiAsimoe ясслодовагае показало, что кол-лекцшлыае ¿'.о^ы i;.¿jlé¿ae сучсстаонно отличаются по свошл физп-олох'й-СйО>.1г>.:-;сс:.»ал v.óc.íctbsh от медлешюрастуцн;; клуЛенькоЕГ.х бактерии, ¡ v ожьхл i- с-аглериям других видов Rhi^obium и агробак-тераям. спикер хоняиской специфичности цташов R.gaiegae

ограничь *ггс:-: р^дси Galega,что подтверждает обособленное положо-kií¿ im^C/üiu-^üi-u.-. ¿a.-^ep;^; козлятника среди быстрсрастугда ризбий.

2. Исследование роли плззмид R.galegae в симбиотической фиксации азота.

Известно, что сиибиотические гены у быстрорастущих клубеньковых бактерий располагаются,'как правило, на плазмидах [Kondoro-Bi et al., 1982; Ronson, Scott, 1983). При анализе плазмидного состава у штатов 0703 и 0711 R.galegae, была обнаружена гигантская плазмида (мегаплазмида), электрофоретическая подвижность которой близка к подвижности мегаплазмид R.meliloti (~I500 Mda).Наличие негаплазмид у штампов клубеньковых бактерий козлятника отмечалось и ранее [Selenska-Trajkowa et al.,1990).Однако, их участие в контролировании процессов нодуляции и азотфиксации изучено пока недостаточно. В связи с этим,цель данного раздела работы состояла в осуществлении конъюгативного переноса мегаплазмид .R.galegae в невирулентные мутанты R.meliloti и штаммы Agrobacterium, и изучении симбиотических свойств полученных трансконъюгантов.

Первый этап исследования состоял в маркировании мегаплазмид штампов 0703 и 0711 R.galegae'с помощью вектора pSUP2l11, несущего транспозон Тп5 (транспозоновый мутагенез). Для этого штамм E.coli, содержащий векторную плазыиду, был скрещен со Str- и Rli-устойчивыми мутантами R.galegae. Частота встраивания транспозона Тп5 в геном клубеньковых бактерий козлятника составляла 10-5-10~£ '73% рекомбинантных клонов были устойчивы к ампициллину (маркеру вектора), что является показателем частоты интеграции вектора в геном R.galegae. Частота возникновения спонтанных Кт-устойчивых мутантов среди бактерий R.galegae не превышала Ю-9. 10-15 рекомбинантных клонов каждого штамма с инсерцией pSUP2111 были объединены и использованы в качестве доноров в следующих скрещиваниях. Частота спонтанного (без участия плазмиды-"помощника") переноса метки Km-устойчивости в антибиотикоустойчивые штаммы R.meliloti и Agrobacterlum составляла Ю-®- Ю-6 в зависимости от реципиента. Все полученные трансконъюганты были устойчивы к ампициллину. Частота возникновения спонтанных мутантов по маркеру Km-устойчивости среди реципиентных клеток не превышала I0"9. Частота спонтанного мутирования доноркых штаммов по маркерам Str- и Rif-устойчивости была меньше, чем 10~®.

Шшзиидные профили полученных трансконъюгантов показали, что

при скрещивании,по-видимому,произошел перенос мегаплазмид R.galegae. Авирулентные мутанты R.melilotl и использованный штамм А.га-diobacter имеют собственные мегаплазмиды, однако, мобилизация мегаплазмид R.galegae в результате скрещивания была визуализирована при использовании в качестве реципиента бесплазмидного штамма UBAPF-2 A.tumeiaclene. ' •

Результаты изучения симбиотических свойств полученных транс-коныогантов в условиях микровегетационного опыта на" растениях люцерны изменчивой (Medicago varia) и козлятника восточного (G.ori-entalis) представлены в таблице I.Анализ свойств трансконыогантов R.melilotl в симбиозе с люцерной показал, что интродукция Sym-re-нов R.galegae восстановила вирулентность у 8 из 23 проверенных клонов. Однако, только I из 8 Nod^-трансконъюгантов индуцировали на корнях M.varia азотфиксирующие клубеньки.

Таблица I

Симбиотические свойства трансконыогантов R.melilotl и агробактерий

Донор (::pSUP2111) Реципиент Проверено KjfOHOB M.varia G.orientalic

Nod+ Fix"1 Nod+ Fix+

R.galegae R.melilotl

0703 Ril CXMI-46 Str 5 3 0 0 0

CXMI-62 Str 5 2 0 0 0

0711 Ril CXMI-46 Str 8 2 0 .0 0

CXMI-62 Str . 5 I I I I

A.radiobacter

0703 Ril 52 Str 6 0 0 2 0

0711 Ril 52 Str 10 5 5 I 0

A.tumeiacienB

0711 Str UBAPF-2 Rii 5 : 2 0 0 0

У одного трансконъюганта наблюдалось изменение спектра хозяйской специфичности: он имел фенотип Hod" на люцерне,но образовывал активные клубеньки на G.orientalis.

Как показывают данные табл.1, 3 трансконъюганта Agrobacteri-um имели фенотип Nod+ на козлятнике, хотя ни один из них не.образовывал активных клубеньков. Большее количество трансконыогантов

-8- ' (7 клонов из 21) вступало в симбиоз с M.varia. Кроме того, 5 трансконъюгантов формировали на люцерне активные клубеньки. Возникновение трансконыогантов агробактерий, способных вступать в симбиоз (в том числе и эффективный) с бобовыми растениями, наблюдалось ранее при интродукции в A.tmefacienB pSym R.leguminosarum [Hooykaas et al., 1981j Martinez et al., 19871.

Таким образом, проведенное исследование показало участие ыега-плазмид R.galegae в контроле за проявлением симбиотических функций у клубеньковых бактерий козлятника. Представленные данные демонстрируют возможность экспрессии Sym-генов R.galegae на новой генотипическом фоне. В результате интродукции симбиотических генов клубеньковых бактерий козлятника в A.radiobacter были получены трансконъюганты, формирующие эффективный симбиоз с Medicago varia. Вероятно.возникновение штаммов бактерий с новыми симбиоти-ческими свойствами при горизонтальном переносе Sym-генов от клетки к клетке может иметь место и в природных условиях.Этот процесс, по-видимому,является одной из движущих сил бактериальной эволюции.

3. Селекция высокоэффективных штаммов R.galegae.

Для обеспечения сельского хозяйства эффективными препаратами под козлятник необходима селекция производственно-ценных штаммов R.galegae, что и определило цель данного раздела работы. Широко распространенным методом предварительного отбора штаммов ризобий является, как известно,постановка стерильного микровегетационного опыта .'Поэтому другая задача исследования состояла в выявлении оптимального параметра для селекции ризобий козлятника в микровегетационном эксперименте.

Симбиотические свойства 4 штаммов R.galegae (0720,0721,0722 и G2), выделенных из клубеньков на козлятнике восточном, произрастающем на Алтее, были оценены в сравнении со штаммами 0702,' 0706 (производственные штаммы) и 0719 R.galegae из коллекции ВНИИСХМ. Эффективность бактерий в условиях ыикровегетационного опыта изу-' чали в симбиозе с четырьмя образцами козлятника восточного (33157, 33784, 39342 и- 44240). Данные по ацетиленредуктазной активности штаммов и эффективности симбиоза, образуемого ими с .растением-хозяином, представлены в таблице 2. Изучение уровня ре-

дукции ацетилена на корнях козлятника выявило, среди использованных штаммов 2 неактивных и 5, формирующих аёотфиксирующие клубеньки на О.оПе^аИв. Активные штаммы, в ряде случаев, достоверно различались между собой по уровню активности. Кроме того, активность каждого штамма в значительной степени зависела от образца козлятника.

Использованные образцы козлятника восточного различались по массе неинокулированных растений. На основании статистического анализа (НСР0 05=4,2) мы разделили их на 2 группы: I группа - образцы 33157 и 33784 с достоверно более мелкими растениями(их масса в контроле без инокуляции составляла 16,4 и 17,7 ыг/сосуд соответственно); 2 группа- образцы 44240 и 39342 с достоверно более

Таблица 2

Оценка активности и эффективности штаммов R.galegae . в симбиозе с С.ог1епга11в (микровегетационный опыт)

Вариант инокуляции Образец козлятника восточного " .

• 33157 33784 44240 39342

А . А М А лМ А дМ А дМ

0702 0 ,30Аа +1,2 0.85^ -0,4 0,45Аав -4,7 0,79АСв -6,4

0706 0 зо43 +1,3 О.бв^3 +1,5 0,54Аа -3,0 0,75АСа -4,1

0719 э 66Аа +1,8 0,42Аа +1,2 0,58Аа -3,7 2,06Вв -2,4

0720 I 24Ва +2,1 1,12ВаВ. +3,3 0,74Ав -3,7 1,04Аав -1,5

0721 I 19Ва +3,0 О.ЗЭ^30 +2,4 0,69^ -3,4 0,44Св -2,2

0722 0 -0,2 0 +0,4 0 -0,5 0 -0,6

02 0 -0,4 0 +0,5 0 -0,7 0 -0,7

Примечаниям- ацетилонредуктазная активность (мкМС2Н4/сосудхсут), а М - прибавка урожая зеленой массы (мг/сосуд); наличие общей прописной или строчной буквы указывает На отсутствие достоверных различий между значениями активности в разных вариантах инокуляции или на разных образцах козлятника соответственно, НСР0 0д =0,49-для сравнения частных средних по активности.

крупними растениями (21,9 и 24,4 мг/сосуд соответственно). Инокуляция растений I группы активными штаммами' R.galegae приводила к возрастанию массы козлятника. Напротив, масса растений 2 группы, ннокулированных азотфиксирующимл штаммами, была во всех случаях меньше по сравнению с контролем без инокуляции.

Для дальнейших исследований свойств штаммов были заложены вегетационные опыты с участием тех же штаммов R.galegae и контрастных образцов козлятника восточного (33784 и 44240).Показатели сим-биотической эффективности клубеньковых бактерий козлятника приведены в таблицах 3 и 4. Можно видеть, что образцы 33784 и 44240 в

Таблица 3

Масса сухих растений козлятника восточного (г/сосуд), инокулированного штаммами R.galegae (вегетационные опыты)

Вариант I опыт _ 2 ОПЫТ

инокуляции образец (фактор1) М (1) образец (Фактор I) М (2)

(фактор 2) 33784 4424Ü 33784 44240

без инокуляции 2,19Аа 1,84Аа 2 ,02 a I,64Аа I,37Аа 1,51a

0702 7,63Ва 7,28ВДа 7 ,46ВС 3,82ВСа 4,36Ва 4,09В

0706 7,33Ва 10,52Св 8 ,ЭЗВ 4,I5C«a 4>13ВСа 4,14В

0719 8,2ЭВа 8,83ВСа 8 ,56В 4>пСДа 3,66ВСа 3,89В

0720 9,12Ва 7i84BÄa 8 ,48В 4,26Са 4,31Ва 4,29В

0721 7,35Ва 6,51^ 6 ,93° 4,77Са 4,32Ва 4,55В

0722 2,12Аа 2,90a3 2 ,5IÄ 1,93АВа 2,18АСа 2,06А

G2 2,34Аа 2,34Аа 2 ,34Ä 2|„АВДа I,51Аа 1,81a

М (3) 5,80a 6,01a 3,35a 3,23a

НСР=2,19; НСР1^0,83;НСР2=1,55 НСР=2,12; НСР^О.8; НСР2=1,5

Примечания: М (I) и М_(2) - средние значения по фактору 2 (I и 2 опыт соответственно),М (3) - средние значения по фактору I;.наличие общей прописной или строчной буквы указывает на отсутствие достоверных различий между вариантами инокуляции или образцами соответственно (Р | 0,05); НСР - для сравнения частных средних, НСР-^ д ,НСР2 - для сравнения средних по факторам I и 2 соответственно.

условиях вегетационного опыта не различались по пассе неинокули-ровакных растений (табл.3).Инокуляция активными штаммами приводи-, ла к достоверному увеличению урожая растений и содержания в них азота у обоих образцов козлятника. Значения массы, а также содержания азота в растениях, инокулированных разными эффективными штаммами, в некоторых вариантах достоверно различались.

Сравнение результатов инокуляции козлятника восточного при различных условиях постановки опыта (таблица 5) показало, что при использовании образца 44240 корреляция между значениями прибавки урожая зеленой массы в микровегетационном опыте и показателями эффективности.симбиоза в вегетационных опытах достоверно отрицательна. Корреляция между этими параметрами для образца 33784 была недостоверно положительна. Достоверная положительная корреляция

Таблица 4

Содержание азота в растениях козлятника восточного {%), инокулированного штаммами R.galegae (вегетационные опыты)

Вариант инокуляции (фактор 2)

I опыт образец (фактор!) " 33784 14'----

Ш2ТГ

M (I)

2 опыт образец (фактор I)

M (2)

без

инокуляции

0702 0706

0719

0720 -

0721

0722

M (3)

1,52

з>

3,09' 2,64 2,68! 2.601 2,41С 1,50â

2,23

1,53

2,68В 2,77®

2,94'

В

2,73

2,75®

1,58*

2,33

1,53я

2,89Е 2,71Е 2,81Е 2,67Е 2,58Е I,5AÂ

2,26й

3,47® 3,47? 3,55®

3,54 3,33 2,04А

2,94

В

2,19

з,аав

3,64® 3,70® 3,64® 3,60® 2,20А

3,11

2,23й

3,68е 3,56Е 3,63Е 3,59е 3,47Е 2,12^

НСР=0,56; НСР1=0,21; НСР2=0,39 НСР=0,68;НСР1=0,26;НСР2=0,48

Примечания:аналогичны таковым к табл.3; достоверных различий между образцами при инокуляции одним и тем же штаммом не наблвдалось.

Таблица 5

Коэффициенты корреляции между различными симбиотическнми показателями в условиях,микровегетационного и вегетационных опытов

Образец козлятника Микровегетационный опыт Вегетационные опыты

Прибавка урожая зеленой массы, г Содержание азота, % Общее азото-накопление, мг

33784 Прибавка урожая зеленой массы,мг Ацетиленредуктаз-ная активность, мкМС^Н^/сут 0,55 0,90** 0,31 0,84* 0,47 0,88**

44240 Прибавка урожая зеленой массы,мг Ацетиленредуктаз-ная активность, мкМС2Н4/сут -0,85* 0,87** -0,96** 0,93** -0,90** 0,90**

Примечания: * - корреляционные отношения достоверны при Р ^ 0,О5, ** - корреляционные отношения достоверны при Р <; 0,01

наблюдалась мевду ацетиленредуктазной активностью бактерий в условиях микровегетационного опыта и симбиотическнми показателями, оцененными в вегетационных опытах на обоих образцах козлятника.

Результаты оценки вклада генотипов партнеров в функционирование симбиоза Й.еа1е§ае с растением-хозяином в условиях микровегетационного и вегетационного опытов представлены в таблице 6. Двуфакторный дисперсионный анализ полученных данных свидетельствует о том,что максимальный вклад в варьирование показателей симбиоза в вегетационных опытах вносит генотип штамма. Генотип сорта в этих условиях оказывает достоверное влияние только на значение общего азотонакопления. В условиях йикровегетационного опыта активность бактерий Н.§а1е^;яе также определяется в большей степе-'ни генотипом штамма,чем генотипом образца или взаимодействием генотипов партнеров.Напротив,в изменчивость показателя массы расте-

-13. Таблица б Относительная роль партнеров в функционировании симбиоза Rhizobium galegae - Galega orlentalls

Фактор

варьирования

Вклад факторов о общее варьирование признаков (%)

Микровегетац. опит

Масса растений

2н2~Ред"

активность

Вегетациошмй опыт

Масса растений

Содержание азота

Общее N-накопл.

Генотип штамма

Генотип сорта

взаимодействие

генотипов

партнеров

Неконтролир. факторы

О 25

О 75

41 3

3 53

78 J 46

О! О

7г 4

15; 50

77; 53 0; О

О; О

23; 47

84; 60 i; О

Ю; 6, 5; 34

■Примечания: 0 - дисперсионные отношения недостоверны, в остальных случаях дисперсионные отношения достоверны при Р^0,05 *- пара значений соответствует двум повторностям опыта

ний достоверный вклад вносят только генотип образца'козлятника и неконтролируемые факторы.Последние оказывают наибольшее влияние на оба параметра и обусловливают более 50% их варьирования.

Таким образом, в результате селекции, проведенной в условиях вегетационных опытов, отобраны 3 высокоэффективных штамма Й.яа1е-gae для козлятника восточного (0719, 0720 и.0721). Показано, что отбор штаммов R.galegaв в микровегетационном опыте не целесообразно проводить на основании данных учета массы инокулированных растений О.ог1епга11в, поскольку этот признак в большей степени определяется генотипом растения-хозяина. Оптимальным параметром для селекции ризобий козлятника в этих' условиях является интенсивность редукции ацетилена, которая находится под более жестким контролем генотипа штамма R.galegae и, как показали данные анализа, коррелирует с результатами оценки эффективности штаммов в вегетационных опытах независимо от выбранного образца С.ог1егиа11а.

Отбор высокоэффективных штаммов R.galegae для козлятника лекарственного проводился в условиях вегетационного опыта на сорте

Старт. Для испытания были отобраны 5 штаммов: 0717,0716, 0722, GI и G2 (четыре последних штамма были выделены из клубеньков на козлятнике, произрастающем в различных географических зонах - на Украине, в Крыму и на Алтае). Результаты изучения симбиотических свойств отобранных штаммов представлены в таблице 7. Поскольку производственных штаммов для G.oíílclnalis к моменту постановки эксперимента в коллекции ВНШСХМ не имелось,сравнение проводилось относительно контроля без инокуляции. Можно видеть, что все использованные штаммы R.galegae вызвали достоверное повышение содержания азота в растениях козлятника лекарственного. Однако, достоверное увеличение массы растений и общего азотонакопления наблюдалось при инокуляции лишь тремя штаммами:0716, 0717 и 0722.

Таблица 7

Оценка эффективности штаммов R.galegae в симбиозе с G.olíicinallB (вегетационный опыт)

Вариант инокуляции Масса сухих растений, г/сосуд Содержание азота, % Общее Ы-накопление, мг/сосуд

контроль без 3,64 . 67,2

инокуляции 1,86

07X6 5,12 4,63 238,3

0717 4,32 4,85 210,1

0722 4,56 4,92 224,6

GI 2,08- 4,74 98,7

G2 1,37 4,64 59,1

НСР0,05 0,52 0,68 35,4 ■

Масса растений козлятника в этих вариантах возрастала в 2,3 - 2,8 раза, общее азотонакопление - в 3,1 - 3,6 раза по сравнению с не-инокулированным контролем. Наиболее эффективным был штамм 0716. Следует отметить, что при оценке скыбиотических свойств штаммов в полевых экспериментах, которые были заложены на сорте Старт в условиях Московской экспер. базы НПО.БШ1АР,наиболее эффективным был таже штамм 0716. При его использовании прибавка урожая зеленой массы козлятника по сравнению с контролем без инокуляции составила для растения 1-го и 2-го года вегетации более 50%.

1'агаш обрззом, в результате сценки эффективности 5 штаммов R.galegae для козлятника лекарствсшюго в условиях вегетационного

опыта отобраны 3,образующие высокоэффективный симбиоз с С.о111с1-па11в (0716, 0717 и 0722). Два из них были выделены из природы.

4. Изучение влияния криоконсервации и лиофилизации на жизнеспособность и симбиотические свойства штаммов Л^а1е§ае.

Помимо селекции эффективных штаммов ризобий большое практическое значение имеет проблема их надежного хранения, обеспечивающего длительное сохранение жизнеспособности бактерий и стабильность симбйотических свойств. В настоящее врем,наиболее распространенными методами консервации микроорганизмов являются криоконсервз-ция (замораживание в шдком азоте) и лиофильное высушивание. Однако, возможность применения этих методов для хранения конкретного объекта необходимо оценивать в предварительных исследованиях.

Результаты определения выживаемости трех штаммов И.£а1е£ае и сохранности их сиыбиотических свойств после криоконсервации (КК) и лиофилизации (ЛВ) представлены в таблице 8. В качестве защитных

Таблица 8

Жизнеспособность и симбиотические свойства штампов R;•galegae после криоконсервации и лиофилизации

Вариант инокуляции Жизнеспособность шташов (%) Масса текий сухих рас-(г/сосуд) Общее М-накоп-ление (мг/сосуд

0702 Косяк 4,4 + 0,30 168 ± II

КК(Г) 107 - 15 4,6 + 0,14 172 ± 6

КК(СХА) 103- 7 4,5 + 0,12 157 ± 2

ЛВ(СЖА) 86 - 7 4,4 + 0,28 152 ± 10

0720 Косяк 4,3 + 0,18 157 ± 6

КК(Г) 58 - 5(-) 3,7 + 0,28 134 ± 12

КК(СХА) 73 - 8(-) 4,0 + 0,25 146 ± II

ЛВ(СЖА) 53 - 5(-) ' 4,0 + 0,28 138 ± 15

0716 КОСЯК 5,1 + 0,20 238 ± 17

КК(Г) 94 - 8 4,9 + '0,21 230 ± II

КК(СЖА) 100 - 12 5,4 + 0,14 256 ± 8

ЛВ(СХА) 53 - б(-) 4,4 + 0,33 206 ± 12

Примечание:(-) -достоверное снижение жизнеспособности при Р^ 0,05

сред были использованы сахарозо-желатиноЕый агар (СКА) и Юл-ннй раствор глицерина (Г) -наиболее часто употребляеше защитные среды. Можно видеть, что лиофилизация сопровождалась достоверном падением титра клеток двух из трех консервированных штаммов. Достоверное падение титра наблюдалось также после криоконсерващш штамма 0720. Криоконсервация штаммов 0702 и 0716 как в СЖА, .так и в глицерине не сопровождалась достоверным снижением жизнеспособности ¡слеток. Выживаемость бактерий R.galegae во всех консервирован-шх суспензиях сохранялась на достаточно высоком уровне (она была не ниже 53!?), хотя, в целом, криоконсервация в меньшей степени, чем лиофилизация, повлияла на жизнеспособность клеток.

Стабильность симбиотическлх свойств ризобий козлятника после консервации были проверены в условиях вегетационного опыта. В качестве эталона использовали штаммы,хранящиеся на косяках при 4°С. Из данных табл.8 следует, что mi криоконсервация ни лиофилизация не повлияли на симбиотическую эффективность R.galegae, даже при наличии достоверного снижения жизнеспособности клеток.Эти результаты позволяют сделать выеод об отсутствии корреляции между выживаемость» штаадлов R.galegae и стабильностью их симбиотических характеристик после консервации.

Таким образом,криоконсервация и лнофильное высушивание не вы-зквз&т массовой гибели клеток R.galegae и не поЕрсздают их семиотических-функций, что является необходимым условием дчя успотио-го хранения ризобий козлятника с помощью этих методов.

• ВЫВОДЫ

I. Изучены основные йизиолого-биохимччегипе свойства (тсрлпчратурочукствлтсльность, еоле- . и ппткгистггпоусто'^шпоеть, исполйзоьгзые рг.знич.'их источников углорс.Т! и тот,") птг!г:ое R.galegao из коллог.цни BIUüCaM, а так-;'1 специфичность их взаимодействия с бобовыми растениями. Показано, что клубеньковые бактерии козлятника близки по изученном культурзлыздл свойствам. г. бактериям других видов Rhizobitm, но отличаются _высс;;оспец11плкэирэваштм характером гзанугдойствия с растением-хозяином .

2.С помощью методов "транспозонового мутагенеза" к конъюгации осуществлен перенос симбнотических генов R.galegae в авирулентше. мутанты R.rneliloti. Показано, что у 12 из 36 проверенных трансконыогантов произошло восстановление вирулентности. 4 транскопъю-гапта изменили хозяйскую специфичность: они вступали в симбиоз только с растениями G.orientails.

3. При мобилизации Sym-генов R.galegae в агробактерии среди 39 проверенных штаммов были выделены следующие типы трансконъю-гантов: Г> трансконыогантов тлели фенотип Hod+Plx~ на G.orlenta-11s, 7 трансконыогантов били Nod+Fix~ в симбиозе с M.varii, 6 трансконъюгантов формировали на люцерне азотфиксирующие клубеньки.

4.С использованием метода двуфакторного дисперсионного анализа оценен вклад генотипов симбнотических партнеров в изменчивость показателей симбиоза R.galegae - G.orientalis в условиях микрове-гетзционного и вегетационного опытов. Показано, что генотип штамма вносит максимальный вклад в варьирование симбнотических показателей в условиях вегетационных опытов,но не оказывает достоверного влияния на изменчивость показателя массы' растений козлятника в микровегетационном опыте.

5. В качестве оптимального параметра для селекции клубеньковых бактерий козлятника в условиях микровегетационного опыта предложено использовать интенсивность редукции ацетилена, которая коррелирует с результатами оценки эффективности штаммов в вегетационных опытах независимо от выбранного образца G.orientalis.

6. Отобраны высокоактивные штаммы R.galegae, которые в условиях вегетационных опытов дают прибавку урожая зеленой массы растений от 200 до 400%. Эти штаммы могут быть использованы для изготовления ризоторфина под козлятник восточный и лекарственный.

7. Показано сохранение симбнотических свойств штаммов R.galegae в результате криоконсервации и лиофильного высушивания - перспективных методов лабораторного хранения микроорганизмов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. Новикова H.H., Павлова Е.А., Сафронова В.И., Кохемяков А.П. Селекция штаммов клубеньковых бактерий для инокуляции новых

кормовых и лекарственных бобовых растений // II Республиканская конференция "Микробиология в сельском хозяйстве" - Тезисы докл., Кишинев, 1991, с. 31.

2. Новикова Н.И., Сафронова В.И., Павлова Е.А. Взаимодействие клубеньковых бактерий козлятника Rhlzobium galegae с бобовыми растениями. - Бюллетень ВНШСХМ, 1991, No 54, с. 12-17.

3. Новикова В.И., Сафронова В.Й., Павлова Е.А. Систематика новых видов клубеньковых бактерий // IV Всесоюзная конференция "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" - Тезисы докл., Пущино, 1992, с. 152.

4. Сафронова В.И., Новикова Н.И. Перенос симбиотических генов клубеньковых бактерий козлятника в Agrobacterium radiobacter и Rhizoblum mel'lloti // V11 Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов" - Тезисы докл., Москва, 1990, с. 269.

,5. Сафронова В.И., Новикова Н.И. Спонтанная мобилизация симбиотических генов клубеньковых бактерий козлятшша восточного // Научная конференция "Изучениэ и рациональное использование природных ресурсов" - Тезисы докл., Уфа, 1991, с.101.

6. Saíronova V., Pavlova Е., Zabelina Y., Novikova N. Interactions between Rhizoblwn galegae-and Agrobacterium genomes // V111 Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen Fixation NITROGENFIX-92. - Pr.ogrom and Abstracts, Saratov, 1992, p. 20.

7. Novikova N., Saíronova V. Transconjuganto of Agrobacterium radiobactor harbouring sym g?nes oí Rhizoblum galegae can form an .effective Eyrcblosi3 with Medicago sativa. -FEMS lllcrob. letters, 1992, v.93, p.261 -269.

АВТОРСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО

Новикова Н.И., Сафронова В.П., Коженяков А.П., Читана И.К). Штамм Rhizoblum galegae для получения удобрении под козлятник лекарственный. - Заявка на авт. свид..No 5027659 / 13(000714); положит, решение от 24.06.9?.. ,