Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами

Касаткина, Арина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами"

На правах рукописи

Касаткина Арина Николаевна

Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами

Специальность: 03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003452663

Москва-2008

003452663

Работа выполнена на кафедре биотехнологии инженерного экологического факультета Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна

доктор биологических наук Громовых Татьяна Ильинична доктор технических наук Иванова Людмила Афанасьевна

ОАО Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентства по управлению Федеральным имуществом (ФГУП ГОСНИИ Синтезбелок)

Защита состоится 2 декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного Совета ДМ 212.204.13 при Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, тел. (499) 978-74-66, факс (499) 97874-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева

Автореферат разослан «3/» ОКГьМ^Л- 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 ,[{ ¿¿/(¿¿к/ И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка способов получения биологически активных соединений и белково-углеводных кормовых продуктов из целлюлозосодержащих материалов является одним из актуальных направлений развития современной биотехнологии. Опыт, накопленный в России, показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза для решения проблемы обеспечения животноводства высокоценным белком при использовании в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и др. [Л.К. Эрнст, 1988].

К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофазным культивированием микроорганизмов [В.И. Шарков и др., 1973; В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985; Е.Г. Борисенко и др., 2003; В.И. Панфилов, 2004].

Широкое использование антибиотических и других фармацевтических средств в настоящий период развития человечества в условиях напряженного состояния окружающей среды обусловило важность использования пробиотических препаратов для сохранения здоровья человека. Большое внимание исследователей и практиков уделяется получению пробиотических продуктов для животноводства, что связано, в первую очередь, с проблемами отечественного кормопроизводства. В последние годы структура фуражных кормов в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в комбикорма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо, пивная дробина и др.). При этом отрицательное влияние на биологическую ценность фуражных кормов оказывает также использование в их составе белков, в основном, растительного происхождения (соевый, подсолнечный и рапсовый шроты, горох и др.), что приводит к увеличению доли трудно перевариваемых компонентов в кормах [Э.В. Удалова и др., 2004]. Разработка способов повышения степени усвояемости этих компонентов - одна из важных биотехнологических задач.

Одним из промышленных крупномасштабных трудноусвояемых целлюлозосодержащих отходов является зерновая дробина - отходы пивоваренного и спиртового производства (до 35 млн. т/год в РФ), которые в настоящее время направляются либо на очистные сооружения, либо сливаются на поля орошения и в водоемы, что наносит экологический ущерб окружающей среде.

Дробина в нагавном состоянии не является биологически ценным кормовым продуктом, так как в ее составе преобладают целлюлоза, гемицеллюлозы и трудноперевари-ваемый протеин. Она является источником лишь ряда питательных веществ, в частности, углеводов и минеральных веществ. Однако дробина не обладает токсичными свойствами, что, несмотря на ее низкую усвояемость и биологическую ценность, определяет возможность ее непосредственного использования в кормовых целях [И. Егоров и др., 2006; Е. Калошина и др., 2006; В. Двалишвили и др., 2007].

Анализ литературы, касающийся исследований и разработки способов повышения биологической ценности зерновой дробины, показывает, что эффективность биотехнологических способов получения биологически активных кормовых добавок на ее основе может быть повышена за счет совершенствования способов биоконверсии целлюлозосодержащих компонентов сырья и биосинтетической активности культивируемых на гидро-лизатах микроорганизмов.

Целью настоящей работы явилось исследование способов получения белково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами на основе зерновой дробины.

В задачи работы входило: - изучение гидролиза зерновой дробины при использовании нативных целлюлолитических ферментов микроорганизмов и промышленных мультиэнзимных композиций;

- разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментативных пщролизатах зерновой дробины с целью получения белково-углеводной кормовой добавки и добавки, обогащенной селеном и йодом;

1 - твердофазное культивирование бактерий рода Bacillus на зерновой дробине;

- культивирование молочнокислых бактерий и их ассоциаций на нативной дробине и ее ферментолизатах;

- исследование возможных способов получения БАД, обладающих пробиотическими свойствами.

Научная новизна результатов исследований. Исследована возможность получения БАД с различными функциональными свойствами (белково-углеводная добавка, белково-углеводная добавка, обогащенная селеном и йодом и белково-углеводная добавка, обладающая пробиотическими свойствами) на основе зерновой дробины при культивировании дрожжей и молочнокислых бактерий. Впервые изучено влияние культуральной жидкости гриба Trichoderma viride, целевых мультиэнзимных композиций и бактерий рода BactUus на ферментативную деструкцию зерновой дробины. Исследовано стабилизирующее действие химических аналогов факторов микробного анабиоза - алкилоксибензолов - на комплекс ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции. Исследован углеводный состав ферментативных гидролизатов дробины, показано, что наибольшую долю углеводов составляют пентозы. Впервые показан активный рост молочнокислых микроорганизмов на ферментолизатах дробины, обогащенных автолизатом предварительно культивируемых микроорганизмов (дрожжей, грибов и бактерий). Показана наибольшая активность инокулята ассоциативных культур кефирных грибков при культивировании на ферментативных пщролизатах зерновой дробины.

Практическая значимость. Разработаны технологические режимы переработки зерновой дробины - отходов пивоваренного производства - для получения белково-углеводной кормовой добавки, исследованы двухсгадийные процессы культивирования дрожжей и молочнокислых культур на ферментолизатах дробины, включающих стадию автолиза дрожжевых клеток, а также показана возможность переработки дробины в анаэробных условиях при использовании штамма бактерий Bacillus cereus БП-46, обладающего целлюлолитической активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство-технологии-экология» (Киров, 2006); на IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». (Москва, 2007.); и Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва - Пущино, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 48 таблиц и 33 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы и 4 глав экспериментальных исследований. Список литературы включает 168 источников, из них 38 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель и задачи исследований.

В первой главе представлен систематизированный обзор научно-технической, нормативной и патентной литературы, в котором представлена характеристика возможных способов переработки зерновой дробины, рассмотрены способы биодеградации цел-люлозосодержащего сырья и повышения биологической ценности.

Во второй главе описаны экспериментальные методы исследований и даны характеристики объектов исследований. Для выполнения экспериментальной части использовались стандартные методы испытания и современные приборы и оборудование.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали отходы пивоваренного производства - нативную зерновую дробину (влажность 80-90%) и измельченную воздушно-сухую (влажность < 10%), предоставленные, соответственно, Очаковским пивоваренным заводом и частной пивоварней «Wienen Bier».

В работе использовали штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставленный Звягильской Р.А., штамм гриба Trichoderma viride из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, штамм Bacillus cereus БП-46, выделенный Ушаковой Н.А. из слепой кишки большой полевки (институт проблем экологии и эволюции животных им. А.Н. Северцова РАН); штаммы молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus casei- В 7657, Lactobacillus acidophilus - АТ-41, Lactococcus lactis ТБ2 из коллекции института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского и из института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, кефирные грибки, используемые для приготовления заквасок на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, а также неидентифицированные молочнокислые бактерии, растущие на глюкозе, выделенные из кефирных грибков; штамм условно-патогенной культуры Staphylococcus aureus из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также культуру инфузории Tetrahymena pyrifor-mis, предоставленную Долговым В. А. (Институт ветеринарной санитарии).

Определение химического состава зерновой дробины и полученных на ее основе продуктов проводили по гостированным методикам: влажность [ГОСТ 1396.3-92(27548.97)]; «сырой» протеин [ГОСТ 1396.4(2874-89)]; «сырая» клетчатка [ГОСТ 1396.2-91]; «сырая» зола [ГОСТ 26226-95]; содержание безазотистых экстрактивных веществ - рхчетным методом. Для определения первоначальной влажности, сырого протеина и сырой клетчатки использовали также метод ИК-спектроскопии (ближняя область инфракрасного спектра). Определение проводили на ИК-анализаторе, модель 4500, Aptek, США-Россия.

Микотоксины в исходном сырье и конечных продуктах анализировали с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа RIDASCREEN® FAST, R-Biopharm, Германия.

Ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства ввиду гетерофазно-сти процесса осуществляли при перемешивании 80-100 об/мин, t - 50±0,5°С, рН среды -5,0-5,5, время экспозиции - 2 часа В качестве ферментных препаратов применяли культу-ральную жидкость гриба Trichoderma viride, а также мультиэнзимные композиции Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, разработанные НТЦ «Лекарства и биотехнология».

Ферментативную активность определяли согласно стандартным методикам: целлю-лолитическая активность [ГУ 9291-036-3458871-2001]; ксиланазная активность [ГУ 9291034-34588571 -2001]; |3-глюканззная активность [ТУ 9291-034-34588571-2001]; протеоли-тическая активность [ГОСТ 20264.2-88]; амилолитическая активность [ГОСТ 20264.4-89]; эндоглюканазная активность - вискозиметрический метод в модификации [А.П. Синицын и др., 1995].

При изучении стабилизации мультиэнзимных композиций использовали химические аналоги факторов микробного анабиоза - алкилоксибензолы (АОБ) -С7 и Си-соединения (Sigma), степень очистки С7- 0,8; С12- 0,9999, предоставленные институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Определение углеводного состава ферментолизатов пивной дробины проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» (РФ), ТУ 26-11-17-89. Количественный состав углеводов оценивали на денситометре «Sorbfil», (Россия), ТУ 4436003-16943778-99.

Грибы и дрожжи культивировали в глубинных гетерофазных условиях в колбах объемом 250 и 750 см3 при 100 и 500 СМ3 питательной среды при инкубировании на качалке (180-200'об/мин.) при 30-32°С и 28-30°С, соответственно; молочнокислые микроорганизмы - в анаэробных условиях при 37,5±0,2°С в пробирках объемом 30 см3 и в колбах объе-

мом 50 и 250 см3 при 20, 30, 100 и 150 см3 питательной среды, соответственно; бациллы -в колбах объемом 250 см3 при 100 и 150 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180-200 об./мин) при 29-30°С.

Твердофазное культивирование грибов осуществляли при температуре 30°С в течение 5-ти суток в лабораторном реакторе, оснащенном компрессором, обеспечивающим расход воздуха через стерильный воздушный фильтр до 2,4 л/мин. Твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 - в колбах объемом 500 и 750 см3 при 70-75%-ном заполнении в течение 48 часов при температуре 30±1°С в микроаэрофильных условиях.

Автолиз дрожжей проводили в течение 12 часов при 40°С в анаэробных условиях. Для автолиза грибов использовали модифицированный метод [Ападашвили Н.В. с соавт., 1991] с добавлением этилового спирта в концентрациях от 1,0 до 3,0%, при 55°С продолжительность экспозиции составляла 23 часа. Продукт после твердофазного культивирования бацилл на зерновой дробине в течение 24 часов выдерживали при температуре 55°С в анаэробных условиях, используя в качестве мембранотропнош индуктора автолиза олеиновую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Але-нова, 1990 г.].

Молочную кислоту определяли методом Баркера-Саммерсона [S.B. Barker and William H. Summerson, 1940]; восстанавливающие сахара - модифицированным методом Шомоди-Нельсона и фенол-сернокислым методом Дюбуа [А.П. Синицын и др., 1995].

Уровень содержания селена и йода в кормовых добавках определяли методом спек-трофотовольтометрии, Р.4.1.1672-03 «Руководство по методам и анализам БАВ в пище».

Острую токсичность полученных кормовых добавок определяли на тест-объекте инфузории Tetrahymenapyriformis [ГОСТ 28178-89].

Пробиотическую активность бацилл и молочнокислых культур характеризовали на основании их устойчивости к температуре 60-65°С, к желчи, ферментам пищеварительного тракта, поваренной соли (NaCl), фенолу, к щелочной реакции среды [JI.A. Банникова, 1975, Ж.К. Тулемисова, 2002].

Антагонистические свойства продуктов в отношении патогенных культур определяли методом диффузии в агаризованиые среды МПА, ГПС и MRS [Н.С. Егоров, 1986, Ж.К. Тулемисова, 2002].

Оценку симбиотических свойств штамма Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур проводили при их совместном культивировании на твердых питательных средах ГПС и MRS.

Идентификацию штамма Bacillus cereus БП-46 проводили методом мультисубстрат-ного тестирования (MCI) при использовании системы МСТ «ЭКОЛОГ» [М.В. Горленко, ПА. Кожевин, 2005]. Регистрацию данных МСТ при использовании программно-аппаратного комплекса ЭКОЛОГ (автор-М. В. Горленко). Для математической обработки данных МСТ использовали статистические пакеты STATISTICA.

Статическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета статистических программ Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе представлены результаты исследований ферментативных гидроли-загов зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных биологически активных кормовых добавок.

Зерновая дробина - отход пивоваренных и спиртовых производств - представляет собой нерастворимые оболочки зерна.

Химический состав исследованных образцов дробины Очаковского пивоваренного завода и частной пивоварни «Wienen Bier» показывает незначительное различие по содержанию «сырой» клетчатки и «сырого» протеина: 19,0 и 18,0% а.с.в. и 25,0 и 21,0% ас.в., соответственно (таблица 1). Высокое содержание клетчатки в дробине до 19,0% и лигнина до 10,0% обосновывает необходимость использования комплекса гидролигиче-

ских ферментов для ее деструкции и возможность использования данного сырья для получения белково-углеводных кормовых добавок с различными функциональными свойствами.

Таблица 1

Химический состав зерновой дробины (% ас.в.)

Партия дробины «Сырой» протеин «Сырая» клетчатка «Сырая» зола «Сырой» жир Лигнин БЭВ

Отходы Очаковского пивоваренного завода 25,0±0,25 19,0±0,22 3,9±0,11 5,3±0,12 10,0±0,19 36,8±0,35

Отходы частной пивоварни «Wienen Bier» 21,0t0,23 18,0±0,18 3,5±0,12 5,1±0,10 9,5±0,23 42,9±0,45

Предподготовка зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных кормовых БАД включала стадии ее сушки (до остаточной влажности 7-8%), измельчения (1,5-2,0 мм), суспендирования и ферментативной обработки. При изучении реологических свойств водной суспензии измельченной дробины было показано хорошее перемешивание суспензии при содержании сырья 10% (масс.). Все дальнейшие исследования проводили при 10%-ной концентрации зерновой дробины в суспензии, при этом в водной фазе определялось до 8,0 г/л легко экстрагируемых редуцирующих веществ (РВ).

Ферментативную деструкцию зерновой дробины изучали при использовании наггив-ных целлюлитических ферментов грибов рода Trichoderma и бактерий рода Bacillus, а также промышленных мультиэнзимных композиций.

Биодеградация дробины грибом Trichoderma viride

Было исследовано влияние характера посевного материала гриба Tr. viride (споры и вегетативные клетки) на его рост и целлюлолитическую активность при развитии на зерновой дробине в глубинной и поверхностной культуре. Показано, что на измельченной дробине (15,-2,0 мм) в качестве инокулята могут быть использованы обе формы посевного материала, на нативной дробине - только вегетативные клетки.

Поскольку ферменты целлюлазного комплекса являются индуцибельными, было изучено влияние различных индукторов на целлюлолитическую активность триба Tr. viride. Показано, что измельченная зерновая дробина наряду с такими известными индукторами, как свекловичный жом, пшеничные отруби, кристаллическая целлюлоза и лактоза, также является эффективным индуктором целлюлаз.

На третьи сутки культивирования в глубинной культуре целлюлазная активность гриба составляла около 25,0 ед./мл, при твердофазном культивировании - 19,0 ед./мл.

При исследовании ингибирования целлюлолитической активности Tr. viride продуктами гидролиза дробины установлено, что ферментативная активность гриба снижалась при дополнительном внесении глюкозы с систему в концентрациях выше 0,4%, что обосновывает целесообразность ассимилирования редуцирующих веществ, образующихся при гидролизе зерновой дробины, другими организмами для повышения активности роста гриба и его целлюлолитической активности на дробине.

Поскольку при культивировании грибов на целлюлозосодержащих субстратах цел-люлолитические ферменты секретируются ими непосредственно в культуральную жидкость (КЖ), была исследована возможность использования культуральной жидкости гриба Tr.viride в качестве ферментного препарата для гидролиза зерновой дробины.

Культуральная жидкость была получена при культивировании гриба на измельченной дробине Tr.viride, целлюлолитическая активность которой составляла около 25,0 ед./мл.

Для ферментативной обработки дробины культуральную жидкость стандартизовали, предварительно разбавляя ее таким образом, чтобы на 1 г дробины приходилось не более 10 единиц целлюлолитической активности. Клетки гриба от КЖ не отделяли.

Была изучена динамика накопления редуцирующих Сахаров в зависимости от соотношения «фермент-субстрат» (количество гидролизуемой дробины составило 1,0; 2,0; 3,0, 4,0; 5,0; 10,0; 15,0 и 20,0%) и продолжительность ферментолиза. Гидролиз проводили при 1=50°С, рН=5,0 и интенсивности перемешивания 80-100 об/мин.

Результаты исследований, представленные на рис.1 показали, что концентрация редуцирующих Сахаров в течение 120 мин. инкубирования увеличивалась при повышении содержания дробины в среде от 1,0 до 10,0% (масс.). При дальнейшем повышении концентрации сырья от 10,0 до 20,0% содержание РВ было практически одинаковым и составляло 16,-17,0 г/л. При концентрации дробины от 1,0 до 5,0% прирост РВ был ниже и составлял, соответственно, 1,40 и 9,25 г/л. Содержание «сырой» клетчатки в твердой фазе при этом снижалось, в среднем, на 6,0% (с 19,0 до 13,0% а.с.в.).

При экспозиции реакционной среды свыше 120 минут концентрация РВ оставалась на постоянном уровне во всех вариантах опыта.

Таким образом, в качестве оптимального режима ферментативного гидролиза дробины культуральной жидкостью гриба Тг.утск может быть рекомендован следующий: 10%-ная суспензия дробины, целлюлолитическая активность КЖ - 10 единиц на 1 г дробины, время экспозиции 120-150 минут, перемешивание 80-100 об/мин., рН 5,0 и 1=50°С.

Для повышенга степени конверсии зерновой дробины проводили твердофазное культивирование гриба ТгМгШе на измельченной дробине (размер частиц 4+5 мм) в лабораторном реакторе в стерильных условиях при высоте слоя дробины 60 мм, I = 30°С, рН 4,5, влажности среды 55-60% и аэрации. Каждые 12 часов субстрат увлажняли стерильным раствором минеральных солей, отводя тем самым и продукты гидролиза дробины, способных репрессировать активность целлюлолитических ферментов гриба. Культивирование проводили до начала споруляции культуры (до образования воздушного мицелия над поверхностью субстрата).

Для повышения содержания усвояемого белка в полученном продукте биомассу выросшего на дробине гриба Тг. \iride подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу выдерживали в течение 23 часов при 1=55°С, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза этиловый спирт в концентрации 1,0; 2,0 и 3,0%.

Полученные в результате исследований данные показали, что при поверхностном культивировании Тг. \iride на дробине и последующем автолизе содержание протеина в твердой фазе повышалось до 29,0%. По сравнению с контрольным образцом содержание «сырого» протеина при добавлении на стадии автолиза этилового спирта в концентрациях 1,0,2,0 и 3,0% (об.) повышалось, соответственно, с 25,0% до 25,5,27,0 и 29,0% а.с.в. Причем, дальнейшее повышение концентрации этанола в среде нецелесообразно, поскольку при выделении продуктов для использования их в качестве кормовых или пищевых добавок (с точки зрения их безвредности) предпочтительнее автолиз проводить в присутствии этанола в концентрации не более 3 %.

Таким образом, при поверхностном культивировании грибов на дробине возможно получение белково-углеводного продукта, содержащего не более 13,0% «сырой» клетчатки и не менее 29,0% «сырого» протеина.

Рис.1. Динамика накопления редуцирующих Сахаров при ферментолизе дробины кулыу-ральной жидкостью гриба Тгмпёе

Анализ содержания микотоксинов в полученных ферментолизатах показал, что концентрация афлатоксина В1 определялась на порядок ниже его ПДК.

Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus В работах Ушаковой H.A. [2004, 2006] была показана способность ферментативного расщепления целлюлозы бактериями, выделенными из слепой кишки травоядных животных, где они выполняют роль, аналогичную биоценозу рубца жвачных животных, то есть обладают целлюлолитической и пробиотической активностью.

Один из штаммов бактерий р. Bacillus БП-46 выделенных из слепой кишки большой полевки Microtus fortis, первично идентифицированный как Bacillus subtilis, был любезно предоставлен нам для исследований H.A. Ушаковой.

Методом мультисубстратного тестирования, основанном на анализе спектров потребляемых субстратов [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005], было показано, что Bacillus БП-46 является представителем вида B.cereus. Принадлежность данного штамма к виду cereus также была подтверждена данными филогенетического анализа.

Изучение физиолого-биохимических свойств B.cereus БП-46 показало, что для роста данного микроорганизма как в аэробных условиях, так и в анаэробных требуются источники органического азота. Штамм является спорулирующим. Исследования ферментативной активности бацилл показали, что Bacillus cereus БП-46 является активным продуцентом протеолитических (110 ед./мл) и целлюлолитических ферментов (18,9 ед./мл), что определяет потенциальную возможность его использования для деструкции зерновой дробины.

Учитывая условия природного местообитания бацилл, был разработан микроаэробный твердофазный способ культивирования бациллы, имитирующий природные условия ее жизнедеятельности (нейтральное значение pH, влажность 55-60%, размеры твердых частиц не более 1 мм, анаэробные условия). Для этого культуральную жидкость выращенной аэробно в жидкой питательной среде B.cereus БП-46 смешивали с равным количеством сухой стерильной дробины. Массу 55%-влажности помещали в микроаэрофильные условия и инкубировали 48 часов при 29-30°С.

По окончании ферментации клетки бацилл подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу, содержащую непрогидролизованную зерновую дробину и клетки В. cereus БП-46, выдерживали в течение 24 часов при температуре 55°С в условиях затрудненного доступа кислорода, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеиновую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова, 1990 г.].

Содержание «сырого» протеина в полученном продукте определялось на уровне 34,5% а.с.в., «сырая» клетчатка снижалась на 12,5% (с 18,0 до 7,5% а.с.в.)

Таким образом, была показана возможность твердофазного культивирования Bacillus cereus БП-46 на зерновой дробине, повышение ее биологической ценности и получения кормового продукта, содержащего «сырого» протеина не менее 34,0%, «сырой» клетчатки не более 8,0%.

Полученный продукт обладал основными пробиотическими свойствами: был устойчив к температуре в диапазоне 60-65°С, в щелочной среде до pH 9,6, к действию желчи и пищеварительных ферментов.

Деструкция зерновой дробины мультиэнзимными композициями

Для более эффективной конверсии дробины были проведены исследования по изучению ферментативного гидролиза указанного сырья с применением новых комплексных ферментных препаратов (Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3). Характеристика мультиэнзимных композиций (МЭК) представлена в таблице 2.

Выбор ферментов, входящих в состав мультиэнзимных композиций, был обусловлен присутствием в трудногидролизуемой зерновой дробине природных полимеров: целлюло-

зы, гемицеллюлоз типа ксилаиов, арабиноксиланов, прочно связанных с целлюлозой, нерастворимого протеина, а также следовых количеств непрогидролизованного Р-глюкана.

Таблица 2

Качественный и количественный состав Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3

Фермент, входящий в со- Ф-ПД-1 Ф-ПД-2 Ф-ПД-3

став мультисистемы Активность, ед./г

Целлюлаза 800 1000 1000

Ксиланаза 4000 4000 4000

р-глкжаназа 950 950 950

Протеаза (нейтральная) 50 - 100

При определении оптимальных условий ферментативной обработки исследуемого сырья показано, что оптимальными условиями ферментолиза дробины мультиэнзимными композициями являются: диапазон рН 5,0-5,5, температура - 50°С, интенсивность перемешивания 80-100 об./мин., время экспозиции 2 часа

Подбор фермент-субстратного соотношения проводили следующим образом: для ферментолиза были подготовлены водные суспензии дробины при гидромодуле от 1,0 до 15,0% при концентрациях мультиэнзимного препарата Ф-ПД-1 0,1 и 1,0% (масс.) (табл. 3).

Таблица 3

Прирост РВ* (г/л) при разных соотношениях дробины и препарата Ф-ПД-1

Концентрация дробины, % (масс.) Концентрация Ф-ПД-1, % (масс.)

0,1 % 1,0%

1,0 0,9±0,10 2,8±0,13

3,0 1,8±0,13 3,2±0,12

4,0 4,5±0,24 б,0±0,12

5,0 6,9±0,12 7,5±0,11

6,0 7,6±0,11 10,0±0,10

8,0 8,0±0,25 14,4±0,25

9,0 8,4±0,10 14,9±0,13

10,0 11,4±0,13 15,3±0,11

15,0 5,2±0,10 12,8±0,13

Показано, что максимальный выход редуцирующих Сахаров, 15,3 г/л наблюдался при обработке 10%-ной суспензии дробины 1%-ным раствором Ф-ПД-1. Отмечено, что при введении препарата в дозе 0,1% уровень прироста редуцирующих Сахаров (11,4 г/л) оказался достаточно высоким, и повышение дозы ферментного препарата до 1,0% не обеспечивало адекватного прироста Сахаров. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата до 15% и выше, приводило к зачетному снижению прироста Сахаров на 16,0-54,0%, что было связано с затруднением процесса перемешивания вследствие повышения вязкости среды и ухудшением массообменных характеристик в инкубируемой системе.

Все дальнейшие исследования ферментативного гидролиза препаратом Ф-ПД-1 проводили с использованием 10 %-ной суспензии дробины.

Также изучали влияние избыточных концентраций мультиэнзимного препарата на прирост редуцирующих Сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе дробины, и на содержание «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе прогидролизо-ванного сырья. Для этого были использованы следующие концентрации Ф-ПД-1: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 и 5,0%.

Эффективность гидролитического воздействия разных концентраций Ф-ПД-1 на дробину

Концентрация Ф-ПД-1, % (масс.) Содержание РВ* после гидролиза, г/л Прирост РВ, г/л «Сырая» клетчатка, % ас.в. «Сырой» протеин, % ас.в.

0,0 - - 19,0±0,49 25.0±0,25

0,05 9,5±0,25 ],5±0,09 18,б±0,25 24,5±0,20

0,075 10,5±0,13 2,5±0,10 18,0±0,16 24,0±0,19

0,1 12,3±0,11 4,3±0,12 16,0±0,22 23,0±0,24

0,5 13,9±0,12 5,9±0,12 15,9±0,20 22,8±0,25

1,0 15,3±0,13 7,3±0,15 15,8±0,19 22,4±0,25

2,0 15,4±0,15 8,4±0,12 15,7±0,25 22,1±0,20

4,0 15,8±0,20 8,1±0,10 15,7±0,22 22,0±0Д5

5,0 15,8±0,14 8,2±0,13 15,7±0,21 22,0±0,19

•Содержание легко экстрагируемых РВ до гидролиза (без ферментаЧ в 10%-ной суспензии дробины составляло 8,0 г/л

При введении в реакционную смесь как низких концентраций препарата Ф-ПД-1 (0,05-0,1%), так и избыточных (1,0-5,0%) в инкубируемой среде не отмечено существенного накопления РВ (табл. 4). «Сырая» клетчатка под воздействием ферментов гидролизо-валась лишь на 3,0% при введении 0,1% Ф-ПД-1, и степень ее конверсии не возрастала при введении повышенных концентраций фермента. Аналогичная тенденция наблюдалась и по содержанию нерастворимого «сырого» протеина - снижение на 2,0 - 3,0%.

Таким образом, было показано, что оптимальным фермент-субстратным соотношением является 0,1 % Ф-ПД-1 и 10%-ная суспензия зерновой дробины. При этом суммарная концентрация РВ в гидролизате определялась на уровне 12,3 г/л.

Для снижения расхода ферментов на единицу сырья при сохранении высокой степени биоконверсии зерновой дробины были испытаны мультиэнзимные препараты Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающиеся от Ф-ПД-1 более высоким уровнем содержания целлюлазы и протеазы в мультисистемах, соответственно (табл. 5). В связи с этим доза вводимых препаратов составляла 0,05; 0,075 и 0,1% (масс.).

Таблица 5

Показатели гидролитического воздействия мультиэнзимных композиций Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3

на зерновую дробину

Показатель Ф-ПД-2, % Ф-ПД-3, %

0,050 0,075 0,100 0,050 0,075 0,100

Прирост РВ*, г/л 27,0±0,15 30,0±0,25 33,5±0,22 28,5±0,26 30,5±0,25 35,0±0,28

«Сырая» клетчатка, % а с.в. 16,8±0,21 13,4±0,19 10,5±0,25 17,4±0,22 14,2±0,19 9,5±0,21

«Сырой» протеин, % ах.в. 23,0±0,16 19,8±0,24 18,0±0,25 21,8±0,23 18,6±0,20 15,0±0,22

♦Без учета начальной концентрации легко экстрагируемых редуцирующих веществ в 10%-ной суспензии дробины - 8 г/л.

Показано, что оптимальным соотношением фермент-субстратного комплекса для ферментативного гидролиза дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 также является 10%-ная суспензия зерновой дробины и 0,1%-ный раствор мультиэнзимной композиции. Прирост редуцирующих Сахаров при гидролизе дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 составил, соответственно, 25,5 и 27,0 г/л (табл. 5).

«Сырая» клетчатка при действии Ф-ПД-2 в дозе 0,05-0,1% уменьшалась с 19,0 до 16,8-10,5% ас.в. Также отмечено наибольшее снижение уровня «сырого» протеина с 25,0 до 15,0% при действии препарата Ф-ПД-3 в дозе 0,1%, содержащего в своем составе про-теазу.

Таким образом, первичная оценка мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 выявила преимущество Ф-ПД-3, под действием которого осуществлялся более эффективный гидролиз «сырого» протеина, и отмечена тенденция к повышению выхода РВ и разрушения «сырой» клетчатки по сравнению с другими МЭК.

Таблица 6

Сравнение эффективности гидролитического воздействия мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 на зерновую дробину

МЭК, 0,1% (масс.) Ферментолизат (жидкая фаза) Дробина после обработки Ф-ПД (твердая фаза)

Общее содержание РВ*, г/л Прирост РВ, г/л Растворимый белок,% «Сырая» клетчатка**, % а.с.в. «Сырой» протеин**, % а.с.в.

Ф-ПД-1 20,5±0,25 12,5±0,11 4,0±0,15 16,0±0,49 21,0±0,37

Ф-ПД-2 33,5±0,21 25,5±0,13 7,0±0,19 10,5±0,38 18,0±0,43

Ф-ПД-3 35,0±0,19 27,0±0,12 10,0±0,14 8,5±0,44 15,0±0,44

•Включая начальное содержание легко экстрагируемых РВ в 10%-ной суспензии дробины - 8,0 г/л *'Исходное содержание «сырой» клетчатки в дробине 19%, «сырого» протеина - 25%.

В результате проведенных исследований, было показано, что мультиэнзимные препараты по-разному воздействуют на структурные компоненты зерновой дробины (табл. 6). Так, прирост РВ составил от 12,5 до 27,6 г/л, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 3,0 -10,0%, «сырой» протеин - на 5,0 - 10,0%. При этом показано, что по сравнению с препаратами Ф-ПД-1 и Ф-ПД-2, более эффективным гидролизующим агентом являлся мульти-энзимный препарат Ф-ПД-3, поскольку он способствовал деградации целлюлозных компонентов дробины, в среднем, на 19,0-47,0% и белка - на 16,7-28,6%, присутствие про-теазы в составе Ф-ПД-3 обеспечивало более глубокую конверсию нерастворимого протеина зерновой дробины.

При изучении углеводного состава ферментолизатов дробины методом тонкослойной хроматографии показано, что в их состав входят пентозы, гексозы, дезоксигексозы, представленные Ь-рамнозой, и ряд олигосахаридов. Доля пентоз в гидролизатах составляла 45,0-47,0%, гексоз - 40,0-45,0% и 13,0-20,0% - смесь поли - и олигосахаридов (табл. 7).

Таблица 7

Фракционный состав углеводов в ферментолизатах дробины, % (масс.)

МЭК Пентозы Гексозы Смесь поли - и олигосахаридов

Арабино-за О-Ксилоза Б-Глюкоза Р-Галактоза О- Фруктоза 0- Манноза

Ф-ПД-2 20,0±0,49 25,0±0,38 10,0±0,25 5,0±0,11 5,0±0,13 15,0±0,31 20,0±0,49

Ф-ПД-3 22,0*0,51 25,0±0,44 12,0±0Д2 7,0±0,12 8,0±0,12 13,0±0,27, 13,0±0,44

Результаты определения углеводного состава показывали, что ферментолизаты зерновой дробины могут быть использованы в качестве питательной основы для культивирования дрожжей и молочнокислых микроорганизмов для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическимк свойствами, предназначенных для кормления сельскохозяйственных животных.

Известно, что одним из эффективных способов стабилизации ферментов является воздействие низкомолекулярных соединений фенольной природы - алкилоксибензолов, синтезирующихся в фазе роста развивающейся микробной культуры.

Исходя из литературных данных, исследовали влияние факторов микробного анабиоза на стабильность ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3, при ферментативном гидролизе зерновой дробины.

Для этого использовали химические аналоги факторов микробного анабиоза - алки-локсибензолы (АОБ): С?-АОБ и Сц-АОБ, предоставленные институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Изучение влияния АОБ на ферментативный гидролиз зерновой дробины мультиэн-зимной композицией Ф-ПД-3 проводили при следующих режимах:

- диапазон рабочих концентраций гомологов: для С7-АОБ - 0,05-4,6 мг/см3; для С12-АОБ -0,001-0,15 мг/см3.

- прединкубационный способ внесения АОБ в реакционную смесь, когда исследуемые гомологи - С7-АОБ в течение 30 минут и Сп-АОБ в течение 60 минут - раздельно выдерживали в растворе с ферментом или с субстратом и затем проводили ферментативный гидролиз.

I - ■ LtiA ■ KcA

.. ......... I 1 j 1 g?,?

- - I _|

1 1

___ЕГ 1 L

1 f: L s

HI HI L К ft. „

in n m DM

1 ill ill ill :

0,10 0.50 1,00 С,-АОЕ, мг/см'

■ ЦлА

■ КсА ар-Гл О ПС

0,10 0,50 1.00 С,-АОБ, мг/см1

Модификация структуры ферментов мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 гомологом - С7-АОБ во всем диапазоне применяемых концентраций (0,05-4,6 мг/см3) обуславливала повышение каталитической активности всех изучаемых ферментов. Для всех ферментов, кроме протеазы, изменения активности имели осциллаторный характер и зависели от концентрации вносимого Cj-АОБ (рис. 2).

Активность целлюлазы во всех вариантах прединкубации с С7-АОБ повышалась, в среднем, на 7,0-20,%, ксиланазы - на 2,-8,0%, |3-глюканазы - на 2,0-7,0%, на протеазную активность гомолог активирующего влияния практически не оказывал.

Анализ полученных данных показал, что при 30-ти минутной прединкубации С7-АОБ (0,5 мг/см3) с дробиной прирост РВ составил 24,5 г/л; с Ф-ПД-3 - 28,0 г/л (при дозе С7-АОБ - 1,0 мг/см3); с дробиной и Ф-ПД-3 -32,0 г/л - (при дозе С7-АОБ - 1,0 мг/см3)

Отмечено, что стабильность ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 в целом сохранялась, ее снижение на 20% определялось по истечении 180 минут ферменголиза дробины.

Рис. 2. Влияние на ферментативную активность мультиэнзимгой композиции Ф-ПД-3 раздельной прединкубации с С7-АОБ: 1- дробины, 2 - Ф-ПД-3, 3 -дробины и Ф-ПД-3.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано стимулирующее влияние фактора С7-АОБ на ферментативный гидролиз пивной дробины мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 при модификации указанным ауторегулятором гидролизуемого сырья и МЭК.

Исследования влияния на мультиэнзимные композиции другого гомолога - Сп-АОБ показали, что взаимодействие Сп-АОБ с целлюлолитическими и протеолитическими ферментами мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 не обуславливало стимуляцию их каталитической активности, при более высоких концентрациях гомолога (выше 0,05 мг/см3) -вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения активности, и степень гидролиза дробины не повышалась.

По результатам проведенных исследований в качестве лучшего стабилизатора ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 был выбран гомолог Cj-АОБ при дозе внесения 1,0 мг/см3 и времени прединкубации с Ф-ПД-3 30 минут.

Таким образом, на основании проведенных исследований была показана возможность биодеструкции зерновой дробины под действием ферментов, продуцируемых грибом Trichoderma viride, бактериями Bacillus cereus БП-46 и промышленными мультиэн-зимными композициями. Редуцирующие вещества, содержащиеся в гидролизатах дробины на уровне 35,0-40 г/л, могут быть использованы другими микроорганизмами, обеспечивающими получение БАД с функциональными свойствами, что и явилось целью исследований, проводимых на последующих этапах работы.

В четвертой главе представлены результаты гетерофазного культивирования микроорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Гетерофазное культивирование дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Получение белково-углеводного продукта и продукта, обогащенного микроэлементами селеном и йодом

Для обогащения ферментолизатов дробины микробным белком был исследован рост апатогенного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica, способного усваивать широкий спектр источников углерода, активность роста на гидролизатах растительного сырья которого была показана ранее [Е.Б. Цугкиева, 2007].

Дрожжи выращивали на ферментолизатах зерновой дробины в режиме глубинного гетерофазного культивирования. Для этого 10%-ная водная суспензия сырья обрабатывалась культуральной жидкостью гриба Trichoderma viride из расчета 10 ед. целлюлолитиче-ской активности на 1 г дробины, или мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при pH 5,0-5,5, t=50°C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата в результате ферментативного гидролиза в среде определялись РВ 16,5 и 35,0 г/л при обработке культуральной жидкостью Tr. viride и Ф-ПД-3, соответственно. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей Y. lipolytica в количестве 2,0x106 кл/мл.

Дрожжи культивировали в периодическом режиме до начала стационарной фазы в ферментере (V06la=2 л) при t = 30-32°С, pH 5,0, при перемешивании 500 об/мин и аэрации. Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментолизатах дробины представлены в таблице 8.

Твердая фаза после отстаивания отделялась методом декантации, промывалась и подвергалась термолизу (75°С, 30 мин.). Полученный продукт сушили при t=50°C до остаточной влажности 7-8%.

В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 85,0-87,0%, прирост дрожжевых клеток 2,5-4,0 хЮ8 кл/мл. Содержание «сырого» протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 8,0-11,0% и составило 29,0-32,0% а.с.в., а содержание «сырой» клетчатки снизилось на 4,0-9,5% и составило 9,515,0% а.с.в.

Таблица 8

Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей У.Иро1уПса на ферментативных гидролизатах зерновой дробины

Параметр Ферментолизат Ферментолизат

(КЖ гриба) (Ф-ПД-3)

Концентрация РВ, г/л:

- начальная 16,5 35,0

- конечная 2,5 4,5

Потребление РВ, % 84,8 87,1

Прирост дрожжевых клеток (N„„-N0), кл/мл х 10* 2,5 4,0

Удельная скорость роста, ч"' 0,09 0,16

Таким образом, при гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Y.hpolytica на ферментативных гидролизатах дробины, полученных как при использовании культу-ральной жидкости гриба Tr. viride, так и МЭК Ф-ПД-3, показана возможность получения белково-углеводного npojjiera.

Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продукта была исследована возможность его обогащения такими микроэлементами, как селен и йод.

Для обогащения селеном перед началом культивирования дрожжей в среду, содержащую ферментативный гидролизат дробины и минеральные соли, вносили диоксид селена в концентрации 20 мг/л, оптимальной для развития культуры У. lipolytica. Для йодирования в качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации 1 г/л [Е.Б. Цугкиева, 2007]. Йодирование продукта осуществляли в аэробных условиях после начала стационарной фазы роста дрожжей (16-18 часов) в течение 1 часа при 37°С в присутствии окислителя - 1%-ной перекиси водорода.

При культивировании дрожжей в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленной зерновой дробине и после осуществления постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоящий из биомассы дрожжей и твердой непрогидролизованной фазы дробины, который содержал 33,0% «сырого» протеина, «сырой» клетчатки - 9,5%, селена - 35,2 мг/кг и йода -32,7 мг/кг. В продукте, обогащенном селеном, включение йода происходило на 7,0% эффективнее, чем в продукте, не содержащем селен. Микотоксины в полученных белково-углеводных продуктах практически отсутствовали.

Гетерофазное культивирование молочнокислых культур на фгрментолизатах зерновой дробины

Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования на нативной дробине и ее ферментолизатах проводили среди штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus casei- В 7657, Lactobacillus acidophilus - АТ-41, Lactococcus lactis ТБ2, ассоциативных культур кефирного грибка G и S, используемых на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, и неидентифицируемых культур молочнокислых бактерий, выделенных из данных кефирных грибков и растущих на глюкозе.

Эксперименты показали, что все исследованные молочнокислых культуры способны активно расти на средах, содержащих как молочную сыворотку и глюкозу, так и на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Для исследований были отобраны бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, которые обладали наибольшей активностью молочнокислого брожения по показателю снижения рН и общей титруемой кислотности (таблица 9).

Активность роста молочнокислых бактерий на ферментолизатах зерновой дробины

Культура Время культивирования, сут.

1 3

рНясх/рНков Титруемая кислотность, °Т рНисх/рНкон Титруемая кислотность, °T

Lactobacillus casei 6,70/4,70 120,Oil,25 6,70/4,80 118,Oil,18

Lactococcus lactis 6,70/5,30 74,Oil,18 6,70/4,70 122,0il,28

Lactobacillus acidophilus 6,70/4,85 90,0±1,25 6,70/4,80 108,Oil,10

Ассоциативная культура кефирного грибка G 6,70/4,50 146,0±1,36 6,70/4,60 130,0iU5

Ассоциативная культура кефирного грибка S 6,70/4,60 130,0±1,28 6,70/4,60 128,Oil,30

Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка S 6,70/4,65 138,0±1,35 6,70/4,75 118,Oil,25

Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка G 6,70/5,0 96,0±1,25 6,70/4,85 120,Oil,25

Для глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых культур на ферментолизатах зерновой дробины 10%-ную водную суспензию сырья обрабатывали мультиэн-зимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=50°C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата концентрация РВ составила 35,0 г/л. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «MRS» и трехсуточный инокулят бактерий L.casei и ассоциативной культуры кефирного грибка G в количестве 5,0% по объему при плотности популяции не менее 106 КОЕ/мл.

Молочнокислые микроорганизмы культивировали в периодическом режиме в анаэробных условиях при t=37°C, рН 6,5-6,8 в течение 17-18 часов.

В процессе гетерофазного культивирования потребление молочнокислыми культурами редуцирующих Сахаров составило 45-48%, плотность популяции Lcasei — не менее 108 КОЕ/г, ассоциативной культуры кефирного грибка G - не менее 109 КОЕ/г. Титруемая кислотность продукта, содержащего бактерии L.casei, определялась на уровне 118-120°Т, продукта, содержащего ассоциативную культуру кефирного грибка G - 140-145°Т.

В результате проведенных опытов показано, что подобранные молочнокислые микроорганизмы - L. casei и ассоциативная культура кефирного грибка G - способны развиваться на ферментативных гидролизатах зерновой дробины, а продукт, получаемый при их культивировании на ферментолизатах, обладает всеми свойствами, определяющими его пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на обезжиренном молоке.

В пятой главе приведены способы получения биологически активных добавок, обладающих пробиотическими свойствами, на основе зерновой дробины и ее ферменто-лизатов.

Придание продукту пробиотических свойств возможно при культивировании на субстрате молочнокислых бактерий, которые для своего развития требуют сложных питательных сред и микроаэрофильных условий.

При разработке возможных способов получения пробиотических БАД была исследована возможность обогащения питательной среды продуктами автолиза продуцентов белка, предварительно культивируемых на ферментолизатах зерновой дробины, учитывали также такие техноэкономические показатели, как необходимость снижения энергоемкости, уменьшения количества технологических стадий и необходимости гарантий получе-

ния продукта требуемого качества, что возможно при замене аэробных процессов культивирования на анаэробные.

Исходя из этих положений, исследовали ряд способов получения белково-углеводной добавки, обладающей пробиотнческими свойствами'

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии гриб ТпсИоЛег-та \iride выращивали на измельченной стерильной дробине в условиях твердофазного культивирования. На второй стадии осуществляли автолиз грибной биомассы с добавлением этанола и на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10

Характеристика белково-углеводных продуктов на основе зерновой дробины, полученных при последовательном твердофазном культивировании гриба Тг. \iride и молочнокислых

микроорганизмов

Показатель L. casei Ассоциативная культура кефирного грибка G

«Сырой» протеин в твердой фазе после автолиза грибных клеток, % ас в. В том числе растворимый белок, г/л Концентрация этанола, %

1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3,0

25,б±0,49 4,5±0,21 27,2±0,25 8,5±0,25 29,3±0,28 10,8±0,19 25,6±0,44 4,5±0,21 27,2Я>,27 8,5±0,25 29,3±О,30 10,8±0,19

Потребление РВ*. % г/л 77,3±0,48 11,6±0,27 80,7±0,63 12,1±0,25 84,0±0,51 12,6±0,32 80,7±0,45 12,1±0,27 85,0±0,49 12,8±0,25 86,3±0,43 12,9±0,30

рН^/рН™ 6,8/5,7 6,8/5,5 6,8/5,1 6,8/5,5 6,8/4,7 6,8/4,1

Титруемая кислотность, °Т 140,Oil ,25 160,0±1,30 170,0±1,28 140,0±1,25 150,0±1,32 190,011,28

Молочная кислота, г/л 8,7±0,27 9,2±0,25 10,8±0,25 9,0±0,31 10,3±0,27 10,8±0,25

«Сырой» протеин в полученном продукте, % ас.в. 29Д±0,49 31,3±0,51 33,9±0,27 30,б±0,31 32,8±0,45 33,5±0,44

«Сырая» клетчатка в полученном продукте, % ас в. 13,2±0,25 13,0±{>,29 12,9±0,21 12,8±0,29 13,1±0,33 13,1*0,24

♦Начальная концентрация РВ -15,0 г/л

Результаты, представленные в таблице 10 показывают, что присутствие этилового спирта в среде до 3% стимулировало развитие молочнокислых организмов, причем, показатель ттруемой кислотности для обоих вариантов составил 14СИ-190°Т. При этом, в среде отмечено накопление молочной кислоты: при культивировании L. casei - 8,7+10,8 мг/л при потреблении 77,3+84,0% РВ, при культивировании ассоциативной культуры кефирного грибка G - 9,0+10,8 мг/л при потреблении 80,7+86,3% РВ, содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки составило 29,2+33,9% ас.в и 12,8+13,0% а.с.в., соответственно.

При исследовании биологической ценности полученных продуктов на тест-культуре Tetrahymena pyriformis было показано отсутствие острой токсичности, также были получены данные, подтверждающие их пробиотические свойства и антагонистические свойства по отношению к Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии дрожжи Yarro-wia lipolytica аэробно выращивали на ферментативных гидролизатах нативной и измельченной зерновой дробины в условиях глубинного гетерофазного культивирования до потребления примерно 50% редуцирующих веществ, содержащихся в ферментолизате. На

второй стадии после автолиза дрожжевых клеток на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11

Результаты аэробно-анаэробного способа получения белково-углеводного продукта, обладающего пробиотическими свойствами, и показатели его качества

Показатель Ферментативный гидролизат

Нагивная дробина | Измельченная дробина

Гетерофазное глубинное культивирование дрожжей Y.lipolytica

РВни/РВкон, г/л 16,8/9,0 30,5/15,0

Потребление РВ, % 46,0±0,49 51,0±0,63

«Сырой» протеин после автолиза, % ах.в. 24,0±0,20 26,0±0,19

Анаэробное культивирование молочнокислых микроорганизмов

РВ„ач/РВко,„ Г/Л 9,0/2,0 15,0/2,0

Потребление РВ, % 88,0±0,43 93,0t0,51

Молочная кислота, г/л 7,8±0,49 13,5±0,54

«Сырой протеин», % а.с.в.: -в продукте, содержащем ¿.сше/ -в продукте, содержащем ассоциативную культуру кефирного грибка в 22,9±0,25 23,0±0,23 28,8±0,28 30,0±0,25

«Сырая» клетчатка, % а.с.в. 15,2±0,19 10,2*0,22

Влажность, % а.с.в. 7,9±0,31 8,0±0,34

Данные, представленные в таблице11, показывают, что на ферментолизатах измельченной дробины дрожжи развивались более активно, потребляя до 51% редуцирующих веществ, что обеспечивало после автолиза дрожжевых клеток накопление «сырого» протеина в среде до 26,0% а.с.в., при этом содержание «сырой» клетчатки в твердой фазе уменьшалась с 18,0 до 10,2% а.с.в. При культивировании молочнокислых культур на такой среде потребление РВ составило около 93% при накоплении молочной кислоты до 13,5 г/л. Содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в полученном продукте определялось, соответственно, на уровне 30,0 и 10,2% а.с.в.

Показано, что полученные продукты обладали основными свойствами, определяющими их пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на молоке, а также проявляли антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной культуре Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный анаэробный процесс. На первой стадии в микроаэрофильных условиях проводили твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной стерильной дробине. На второй стадии после автолиза бактериальных клеток на полученном сырье в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 12.

При исследовании влияния штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 на развитие молочнокислых микроорганизмов было показано отсутствие антагонистических отношений между культурами.

Показатели процесса последовательного твердофазного культивирования на зерновой дробине Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур

Показатель Субстрат для культивирования молочнокислых микроорганизмов

После твердофазной ферментации бацилл на дробине После твердофазной ферментации бацилл на дробине с последующим автолизом

Lcasei Ассоциативная культура кефирного грибка G Lcasei Ассоциативная культура кефирного грибка G

Титруемая кислотность, "Т 80,0*1,25 70,0±1,25 120,0±1,30 150,0±1,28

рНвсх/рНкж. 6,9/5,0 6,9/5,3 6,9/4,3 6,9/4,0

Молочная кислота, г/л 4,0±0,12 3,4±0,11 6,2±0,10 7,5±0,12

Сырой протеин*, % а.с.в.: -после твердофазного культивирования бацилл -после молочнокислого брожения 24,9±0,44 26,1±0,49 24,9±0,39 25,6±0,45 34,8±0,49 28,5±0,38 34,8±0,45 29,8±0,47

Сырая клетчатка**, % а.с.в. 7,8±0,25 7,3±0,22 7,5±0,27 7,8±0,25

"Исходное содержание сырого протеина в дробине 21,0%.

"Исходное содержание сырой клетчатки в дробине 18,0%.

Результаты, представленные в таблице 12, показывают, что молочнокислые бактерии активно развивались на зерновой дробине, обогащенной продуктами автолиза бактерий Bacillus cereus БП-46, при этом содержание «сырого» протеина в продукте увеличивалось на 13,8%, «сырая» клетчатка гцдролизовалась на 10,5%, показатель титруемой кислотности повышался до 120-150°Т, pH снижался с 6,9 до 4,0-4,3, плотность популяции молочных микроорганизмов составляла не менее 10® КОЕ/г. Содержание молочной кислоты повышалось в среднем, в 1,5-2 раза.

Исследование свойств полученной кормовой белково-углеводной добавки показало, что все культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в полученных продуктах, обладали терморезистентносгью в диапазоне 60-65°С и устойчивостью к фенолу, поваренной соли; к действию пищеварительных ферментов и желчи.

Таким образом, на основании проведенных исследований показана возможность получения биологически активных кормовых добавок с различными функциональными свойствами на основе зерновой дробины (белково-углеводная биологически активная добавка, белково-углеводная биологически активная добавка, обогащенная микроэлементами селеном и йодом и белково-углеводная биологически активная добавка, обладающая пробиотнческими свойствами), при этом данные продукты могут бьггь получены на ферментативных гидролизатах зерновой дробины при культивировании дрожжей в аэробных условиях для обогащения белком, при твердофазном культивировании гриба рода Tricho-derma или бактерий рода Bacillus с последующим автолизом микробных клеток и культивированием молочнокислых микроорганизмов для придания продукту пробиотических свойств.

Общая схема переработки зерновой дробины в Б АД с функциональными свойствами представлена на рисунке 3.

Рис. 3. Схема возможных способов переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Исследован ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства - зерновой дробины - под действием целлюлолитнческого комплекса ферментов грибов Tri-choderma viride, бактерий Bacillus cereus БП-46 и технических мультиэнзимных композиций, включающих целлюлолитические и протеолитические ферменты;

- определены условия культивирования гриба Tr. viride на зерновой дробине в глубинной культуре, при накоплении целлюлолитических ферментов в среде до 25 ед./мл и снижении содержания «сырой» клетчатки в дробине с 19,0 до 15,0% а.с.в.; показана возможность использования посевного материала гриба в виде спор и вегетативных клеток;

- показана биодеструкция зерновой дробины как при твердофазном культивировании гриба Trichoderma viride, так и при использовании его культуралыюй жидкости, обеспечивающая снижение в дробине «сырой» клетчатки на 6%. и накопление в среде РВ до 16,0 г/л;

- методом мультисубстратного тестирования проведена таксономическая идентификация штамма бактерий Bacillus БП-46, показана его принадлежность к виду B.cereus. При твердофазном культивировании бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной дробине «сырая» клетчатка в субстрате снижалась на 11,5%.

- на основании сравнительной оценки эффективности воздействия на зерновую дробину трех мультиэнзимных композиций Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающихся составом и соотношением уровней активное™ в мультисистеыах, был отобран препарат Ф-ПД-3, определены условия его применения, обеспечивающие при 2-х часовой экспозиции накопление РВ в ферментолизате до 35,0 г/л, снижение «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе с 19,0 до 8,5% и с 25,0 до 15,0%, соответственно.

2. При исследовании влияния химических аналогов факторов микробного анабиоза -алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) на стабильность ферментативной активности мульти-энзимной композиции Ф-ПД-3 показано, что гомолог С7-АОБ в концентрации 1,0 мг/см3 стабилизировал активность ферментов, входящих в состав Ф-ПД-3 , при этом уровень продуктов гидролиза - редуцирующих Сахаров - повышался до 40,0 г/л. Препарат С12-АОБ практически не оказывал положительного влияния на ферментативную активность Ф-ПД-3.

3. Исследована активность роста семи молочнокислых бактерий на глюкозе и фер-ментолизатах зерновой дробины. Отобраны культуры, наиболее активно развивающиеся на ферментолизатах зерновой дробины - бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, при этом ассоциативная культура кефирного грибка G обладала большей активностью молочнокислого брожения.

4. Разработаны способы получения БАД с функциональными свойствами:

- белково-углеводной добавки, содержащей до 32,0% «сырого» протеина, а также белково-углеводной добавки, обогащенной микроэлементами: селеном (35,2 мг/кг) и йодом (32,7 мг/кг) при гетерофазном культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica на ферментолизатах дробины;

- белково-углеводных добавок с содержанием «сырого» протеина не менее 30,0%, «сырой» клетчатки не более 10,0%, обладающих пробиотическими свойствами, на основе двухсгадийного культивирования дрожжей У. lipolytica, или грибов 7>. viride, или бактерий В. cereus, автолиза их клеток и последующего выращивания молочнокислых бактерий;

6. По стандартным методикам определена пробиотическая активность полученных БАД на основе зерновой дробины, показано, что культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в продуктах были терморезистентны при t=60-65°C, устойчивы к действию поваренной соли, желчи и пищеварительных ферментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Касаткина, А.Н. Использование мультиэнзимных композиций для деструкции пивной дробины / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Э.В. Удалова // Биотехнология. - 2008. - № 2. -С. 59-65.

2. Касаткина, А.Н. Способы повышения биологической ценности дробины / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова //Комбикорма-2008. -№ 5 -С. 51-52.

3. Касаткина, А.Н. Разработка биотехнологических способов биодеградации дробины как основы для получения белково-углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова // Сб. мат. Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производсгво-технологии-экология». - Киров: Изд-во ВятГУ, 2006. - С. 179-180.

4. Касаткина, А.Н. Исследование пивной дробины как сырья для получения белково-углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 5-7 декабря 2006 г. - Пущино: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2006. -С. 118-119.

5. Касаткина, А.Н. Дробина как сырье для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами / А.Н. Касаткина, Г.А. Егерева // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 15-16 ноября 2007 г. - М: МГУПБ, 2007.-С.17-18.

6. Касаткина, А.Н. Практическое использование специфических микроорганизмов для трансформации целлюлозосодержащего сырья / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, H.A. Ушакова // Тез. докл. международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию института ГосНИИгенетика, 21-24 октября 2008 г. - Москва - Пущино, 2008 г. - С. 43.

7. Заявка на патент на изобретение № 2008119515. Способ получения белково-углеводной биологически активной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова. -заявл. 19.05.2008.

Подписано в печать 31.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1075 Тираж: 110 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Касаткина, Арина Николаевна

Введение.

Глава 1: Обзор литературы «Целлюлозосодержащие отходы как сырье для получения БАВ».

1.1. Биотехнология переработки целлюлозосодержащих материалов.

1.2. Характеристика зерновой дробины как сырья для получения кормовых белково-углеводных БАД.

1.3. Способы биодеградации целлюлозосодержащих отходов.

1.3.1.Грибы рода Trichoderma как биодеструкторы лигноцеллюлозных материалов.

1.3.2. Мультиэнзимные композиции. Область применения и перспективы использования в сельском хозяйстве.

1.3.3. Алкилоксибензолы как регуляторы активности ферментов.

1.4.1. Биологически активные добавки для кормления сельскохозяйственных животных.

1.4.2. Способы обогащения микробной биомассы селеном и йодом.

1.5. Пробиотики, роль в организме животных и людей и способы их получения

Глава 2. Экспериментальная часть.

Объекты и методы исследования.

Глава 3. Исследование ферментативных гидролизатов зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных кормовых добавок.

3.1. Исследование способов предподготовки зерновой дробины.

3.1.1. Биодеградация зерновой дробины грибом Trichoderma viride.

3.1.3. Ферментативный гидролиз зерновой дробины мультиэнзимными композициями.

3.1.5. Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus.

Глава 4. Гетерофазное культивирование микроорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Глава 5. Получение белково-углеводных кормовых добавок, обладающих пробиотическими свойствами.

5.2. Аэробно-анаэробный способ получения белково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами.

5.3. Двухстадийная последовательная твердофазная ферментация на дробине штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами"

Эффективность использования возобновляемых источников сырья — одна из важнейших глобальных экономических и экологических проблем современности.

Разработка способов получения биологически активных соединений и белково-углеводных кормовых продуктов из целлюлозосодержащих материалов является одним из актуальных направлений развития современной биотехнологии. Опыт, накопленный в России, показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза в решении проблемы обеспечения животноводства высокоценным белком при использовании в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и др. [JI.K. Эрнст, 1988].

Широкое использование антибиотических и других фармацевтических средств в настоящий период развития человечества в условиях напряженного состояния окружающей среды обусловило важность использования пробио-тических препаратов для сохранения здоровья человека и животных. Большое внимание исследователей и практиков уделяется получению пробиоти-ческих продуктов для животноводства, что связано, в первую очередь, с проблемами отечественного кормопроизводства. В последние годы структура фуражных кормов в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в комбикорма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо, пивная дробина и др.). При этом отрицательное влияние на биологическую ценность фуражных кормов оказывает также использование в их составе белков растительного происхождения (соевый, подсолнечный и рапсовый шроты, горох и др.), что приводит к увеличению доли трудно перевариваемых компонентов в кормах [Э.В. Удалова и др., 2004]. Разработка способов повышения степени усвояемости этих компонентов — одна из важных биотехнологических задач.

Одним из промышленных крупномасштабных трудноусвояемых целлю-лозосодержащих отходов является зерновая дробина — отходы пивоваренного и спиртового производства, которые в настоящее время направляются либо на очистные сооружения, либо сливаются на поля орошения и в водоемы, что наносит экологический ущерб окружающей среде.

Дробина в нативном состоянии не является биологически ценным кормовым продуктом, так как в ее составе преобладают целлюлоза, гемицеллюлозы и трудноперевариваемый протеин. Дробина является источником лишь ряда питательных веществ, в частности, углеводов и минеральных веществ, и очень важно, что она не обладает токсичностью. Это определяет возможность ее непосредственного использования в кормовых целях.

Повышение усвояемости и биологической ценности дробины как крупнотоннажного зернового отхода (до 35 млн. т/год в РФ) является значимым направлением исследований в решении кормовой проблемы при условии снижения себестоимости производства этих продуктов.

Повышение экономической эффективности производства БАД на основе целлюлозосодержащего сырья возможно за счет совершенствования технологии производства и повышения биологической ценности продукта.

Анализ литературы показывает, что повышение биологической ценности БАД возможно за счет увеличения содержания высокоценного белка в продукте, что зависит от степени гидролиза целлюлозных компонентов сырья, от культивируемого на гидролизатах штамма микроорганизмов, от разработки способов повышения содержания биологически активных компонентов в продукте и от биосинтетической активности культивируемых микроорганизмов.

Экономическая эффективность производства БАД может быть повышена за счет совершенствования способов гидролиза сырья, направленных на повышение степени конверсии субстрата; снижения расхода энергетических затрат на аэрирование среды культивирования микроорганизмов на гидролиза-тах, то есть при переходе от аэробных к микроаэрофильным условиям и др.

Целью настоящей работы явилось исследование способов получения бел-ково-углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами на основе зерновой дробины.

В задачи работы входило:

- изучение гидролиза зерновой дробины при использовании нативных целлю-лолитических ферментов микроорганизмов и промышленных мультиэнзимных композиций;

- разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины с целью получения белково-углеводной кормовой добавки и добавки, обогащенной селеном и йодом;

- твердофазное культивирование бактерий рода Bacillus на зерновой дробине;

- культивирование молочнокислых бактерий и их ассоциаций на нативной дробине и ее ферментолизатах;

- исследование возможных способов получения БАД, обладающих пробиотическими свойствами.

Научная новизна результатов исследований. Исследована возможность получения БАД с различными функциональными свойствами (белково-углеводная добавка, белково-углеводная добавка, обогащенная селеном и йодом и белково-углеводная добавка, обладающая пробиотическими свойствами) на основе зерновой дробины при культивировании дрожжей и молочнокислых бактерий. Впервые изучено влияние культуральной жидкости гриба Tricho-derma viride, целевых мультиэнзимных композиций и бактерий рода Bacillus на ферментативную деструкцию зерновой дробины. Исследовано стабилизирующее действие химических аналогов факторов микробного анабиоза — алки-локсибензолов — на комплекс ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции. Исследован углеводный состав ферментативных гидролизатов дробины, показано, что наибольшую долю углеводов составляют пентозы.

Впервые показан активный рост молочнокислых микроорганизмов на фермен-толизатах дробины, обогащенных автолизатом предварительно культивируемых микроорганизмов (дрожжей, грибов и бактерий). Показана наибольшая активность инокулята ассоциативных культур кефирных грибков при культивировании на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Практическая значимость. Разработаны технологические режимы переработки зерновой дробины - отходов пивоваренного производства — для получения белково-углеводной кормовой добавки, исследованы двухстадийные процессы культивирования дрожжей и молочнокислых культур на ферменто-лизатах дробины, включающих стадию автолиза дрожжевых клеток, а также показана возможность переработки дробины в анаэробных условиях при использовании штамма бактерий Bacillus cereus БП-46, обладающего целлюло-литической активностью.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Касаткина, Арина Николаевна

Выводы

1. Исследован ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства - зерновой дробины — под действием целлюлолитического комплекса ферментов грибов Trichoderma viride, бактерий Bacillus cereus БП-46 и технических мультиэнзимных композиций, включающих целлюлолитические и протеолити-ческие ферменты;

- определены условия культивирования гриба Tr. viride на зерновой дробине в глубинной культуре, при накоплении целлюлолитических ферментов в среде до 25 ед./см и снижении содержания «сырой» клетчатки в дробине с 19,0 до 15,0% а.с.в.; показана возможность использования посевного материала гриба в виде спор и вегетативных клеток;

- показана биодеструкция зерновой дробины как при твердофазном культивировании гриба Trichoderma viride, так и при использовании его культу-ральной жидкости, обеспечивающая снижение в дробине «сырой» клетчатки на о

6% и накопление в среде РВ до 16,0 г/дм ;

- методом мультисубстратного тестирования проведена таксономическая идентификация штамма бактерий Bacillus БП-46, показана его принадлежность к виду В.cereus. При твердофазном культивировании бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной дробине «сырая» клетчатка в субстрате снижалась на 11,5%.

- на основании сравнительной оценки эффективности воздействия на зерновую дробину трех мультиэнзимных композиций Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающихся составом и соотношением уровней активности в мультисисте-мах, был отобран препарат Ф-ПД-3, определены условия его применения, обеспечивающие при 2-х часовой экспозиции накопление РВ в ферментолизате до 35,0 г/дм3, снижение «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе с 19,0 до 8,5% и с 25,0 до 15,0%, соответственно.

2. При исследовании влияния химических аналогов факторов микробного анабиоза — алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) на стабильность ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 показано, что гомолог С7

АОБ в концентрации 1,0 мг/см стабилизировал активность ферментов, входящих в состав Ф-ПД-3 , при этом уровень продуктов гидролиза — редуцирующих о

Сахаров — повышался до 40,0 г/дм . Препарат С12-АОБ практически не оказывал положительного влияния на ферментативную активность Ф-ПД-3.

3. Исследована активность роста семи молочнокислых бактерий на глюкозе и ферментолизатах зерновой дробины. Отобраны культуры, наиболее активно развивающиеся на ферментолизатах зерновой дробины - бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, при этом ассоциативная культура кефирного грибка G обладала большей активностью молочнокислого брожения.

4. Разработаны способы получения БАД с функциональными свойствами:

- белково-углвводной добавки, содержащей до 32,0% «сырого» протеина, а также белково-углеводной добавки, обогащенной микроэлементами: селеном (35,2 мг/кг) и йодом (32,7 мг/кг) при гетерофазном культивировании дрожжей Yar-rowia lipolytica на ферментолизатах дробины;

- белково-углеводных добавок с содержанием «сырого» протеина не менее -30,0%, «сырой» клетчатки не более 10,0%, обладающих пробиотическими свойствами, на основе двухстадийного культивирования дрожжей Y. lipolytica, или грибов Tr. viride, или бактерий В. cereus, автолиза их клеток и последующего выращивания молочнокислых бактерий;

- белково-углеводной кормовой добавки при двухстадийном твердофазном процессе культивирования Bacillus cereus БП-46 на измельченной зерновой дробине в анаэробных условиях, автолизе клеток бактерий и последующем выращивании молочнокислых микроорганизмов. Получен продукт с содержанием «сырой» клетчатки не более 8,0% и «сырого» протеина не менее 34,0% при о плотности популяции молочнокислых культур не менее 10 КОЕ/г. 6. По стандартным методикам определена пробиотическая активность полученных БАД, показано, что культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в продуктах были терморезистентны при t=60-65°C, устойчивы к действию поваренной соли, желчи и пищеварительных ферментов.

Заключение

Сравнительная оценка возможных способов получения биологически активных добавок, обладающих пробиотическими свойствами, на основании системного подхода [В.А. Быков и др., 1985] показывает, что наименее затратным является третий способ (табл. 5.3.1.4.), основанный на последовательном твердофазном культивировании бацилл и молочнокислых бактерий.

Первый способ характеризуется наибольшей продуктивностью по образованию белка в продукте и по снижению содержания клетчатки (табл. 5.3.1.4.), однако он является более энергоемким по сравнению с другими способами. Наиболее энергоемкой является стадия глубинного аэробного культивирования о микроорганизмов (на 1 м жидкой фазы, в среднем, расходуется энергии 2,5-3,0 кВт).

Большой дефицит высокоценного белка в составе кормов, а также значимость проблемы утилизации отходов сельского хозяйства и обрабатывающей промышленности, потенциально не обладающих токсичностью для животных, определяет экономическую целесообразность и социальную значимость ис пользования зерновой дробины для получения белково-углеводных БАД, обладающих пробиотическими свойствами.

Высокая влажность зерновой дробины, образующейся как отход пивоваренного производства, затрудняет решение вопроса ее транспортировки. Экономически целесообразным является организация процесса сушки на пивоваренном производстве. Технология получения БАД на ее основе может быть реализована как у производителей пива, так и потребителей БАД — в животноводческих хозяйствах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Касаткина, Арина Николаевна, Москва

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш Ш.А., Строчкова JI.C. Микроэлеме-тозы человека. М.: Медицина. 1991. - С. 196-231.

2. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б. и др. Исследование мем-бранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий. // Усп. химии. 1991. - Вып. 11. - С.2362-2373.

3. Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. М.: Пищевая промышленность. - 1975. — 229 с.

4. Бекер М. Е., Швинка Ю. Э., Лука В. Т. и др.; под ред. Бекера М. Е. Трансформация продуктов фотосинтеза. — Рига: Зинатне, 1984. — 252 с.

5. Беспалов М. М., Колпаков А. И. И др. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке. -Микробиология. 2000. - 217-233 с.

6. Билай В. И., Билай Т. И., Мусич Е. Г. Трансформация целлюлозы грибами. Киев, 1982.-295 с.

7. Билай В.И. Микроскопические грибы продуценты антибиотиков. - Киев: Наука, 1961.- 145 с.

8. Билай В.И. Основы общей микробиологии. Киев: Высш. шк., 1987. -289 с.

9. Борисенко Е.Г., Солдатова С.Ю. Состояние и перспективы биоконверсии растительного сырья в продукты лечебно-профилактического назначения.//

10. Сборник докладов Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации». М.,2003. С.20-26.

11. Быков В.А., Манаков В.И. и др. Производство белковых веществ./ Москва. «Высшая школа» Т.5. - 1987 г. - 140с.

12. Быков В.А., Винаров А.Ю., Шерстобитов В.В. Расчет процессов микробиологических производств. К.: Технпса, 1985. - 245 с.

13. Вторичные материальные ресурсы пищевой промышленности. Справочник. М., 1984.

14. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов.: 2-е издание переработанное и дополненное: Учеб. пособие. М.: Колос., 1997. - 288 с.

15. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. Пер. с англ. Мирошниченко Г.П., Пе-реслени Т.Ю.; под ред. Кондратьевой Е.Н. — М.: Мир, 1982. — С. 131.

16. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. — 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во «Элевар», 2000. 512 с.

17. Громов И.М., Ербаева М.А. «Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий» (зайцеобразные и грызуны) (определитель) СПб., ЗИН РАН, 1995 г.

18. Дамберг Б.Э., Апсите М.Р. Получение селеносодержащих дрожжей Sac-charomyces cerevisiae и их биологическая ценность. // Сб.: «Микробиология и биотехнология производства кормов». Рига: Зинатне., 1990. С. 160.

19. Досон Р., Элиот Д., Элиот У. и Джонс К. Справочник биохимика. — М.: Мир, 1991.-С. 396-401.

20. Дудкин М.С., Сайгадак Т.В., Щелкунов Л.Ф. Комплексы белков и пищевых волокон, обогащенных йодом.// Известия вузов. Пищевая технология. -2001.-№2-3.-С.18-21.

21. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учеб. для студентов биолог. спец. ун-тов. 4-е изд., перераб и доп. — М.: Высш. шк., 1986. — с. 137-138.

22. Ермаков В.В., Ковальский В.В. Биологическое значение селена. М.: Наука, 1971.298 с.

23. Жильцова Т.С., Шолова М.Е., Голубкина Н.А. Исследование резистентности дрожжей p.Candida к соединениям селена // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т.32. - №5. - С. 567-570.

24. Жубанова А.А., Тулемисова Ж. К., Чижаева А.В. Пути использования молочнокислых бактерий в с.-х. биотехнологии // Материалы междун. н-п. конф. — Алматы, 2000. 93 с.

25. Калунянц К. А. Химия солода и пива. — М. «Агропромиздат», 1990. 176 с.

26. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Зайцева JI.B. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов // Итоги науки и техники. Сер. хим. и технол. пищ. прод. М., 1988. - Т.7. - 187 с.

27. Капрельянц А. С. и др. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов. Биологические мембраны, 1987. - 254-261 с.

28. Капрелянц А.С., Скрыпин В.И., Элъ-Регистан Г.И. и др. Изменениеструктурного состояния мембран A. lysodeikticus под влиянием ауторегулятор-ных факторов dj. // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. - Т.21. -№31.-С. 378-381.

29. Ким А.А. Производство глутамата натрия при использовании отходов пивной промышленности. — Докл. междунар. науч. -техн. конф. «Пищевой белок и экология». М., 2000. - С. 139-141.

30. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Аленова Д.Ж. Ферментативный лизис микроорганизмов. Учебное пособие: г. Алма-Ата, Изд-во «Руан», 1990 г. С. 56-127.

31. Клесов А.А., Григорян С.Ю. Микробиология и биохимия разложения растительных материалов. М.: Наука, 1988. - С. 110.

32. Коваленко Н.М., Коваленко Г.Д. Триходермин // Защита растений. -1993.-№6.-С.40-43.

33. Колпаков А. И., Ильинская, О. Н. и др. Стабилизация ферментов аутоин-дукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов. Микробиология, 2000. — с. 224-230.

34. Коновалов С.Б., Васильев С.А. Технико-экономические аспекты производства кормовых биодобавок из отходов пивоваренного производства // Сборник научных трудов. Выпуск 7. Воронежская государственная технологическая академия. Воронеж, 1977.

35. Кононова Н.М. Органическое вещество почвы.- М.: Наука, 1963.-186с.

36. Крашенинин П.Ф., Гаврилова Н.Б., Скрипникова JI.B. Ассоциация молочнокислых культур и бифидобактерий в кисломолочных продуктах // Молочная промышленность.—М.: Молочная промышленность, 1996. №7.-С. 25.

37. Крюков B.C. Популярно о кормовых ферментных препара-тах.//Ветеринарная газета — 1996.- №24 (112).

38. Ленкова Т.Н. Мультиэнзимные композиции в комбикормах, содержащих нетрадиционные компоненты.// Птица и птицеводство. — 2007. № 2. — С. 46-49.

39. Летунова С.В., Ковальский В.В., Алтынбаев Р.В.//С6.: «Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине». JL: Наука. 1979. С.409.

40. Лиепинып Г.К., Дунце М.Э. Сырье и питательные среды для промышленной биотехнологии. Рига: Зиматнэ, 1986. - 150 с.

41. Макарцев Н.Г. Кормление с/х животных.- К.:ГУП «Облиздат», 1999. -С.255-259.

42. Мануковский Н.С. Кинетика биоконверсии лигноцеллюлоз. Новосибирск: Наука, 1990.- 26 с.

43. Матасар И.Т., Салий Н.С., Ермолова Ю.В. Йодная недостаточность — причина многих заболеваний для настоящего и будущего поколений // Здоровье и питание. 1998. №3-4. С. 8-10.

44. Менх Л.В. Научные и практические основы производства плавленых сыров с зерновыми добавками: Автореф. дис. канд. техн. наук. Кемерово, 1996. — 15с.

45. Мирчник Т.Г. Почвенная микробиология. М.: МГУ, 1976.- 206 с.

46. Мохнач В.О. Иод и его связи с растениями и значение для медицины и сельского хозяйства. // Растительные ресурсы. 1967 г. Т. 3. - С. 157.

47. Мухина Н.В. и др. Корма и биологически активные кормовые добавки для животных / Н.В. Мухина, А.В. Смирнова, З.Н. Черкай, И.В. Талалаева; Под общей ред. Н.В. Мухиной. М.: КолосС, 2008. - 271 с.

48. Огарков В.И., Киселев О.И., Быков В.А. Биотехнологические направления использования растительного сырья// Биотехнология. 1985. - № 3. - С. 115.

49. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайде-ров А.А. Споровые пробиотики.//Ж. микробиол. — 2003. №3. — С. 113-119.

50. ОСТ 10-1-86 «Дробина пивная. Технические условия»

51. ОСТ 18-341-79 «Дробина пивная сырая»

52. Панфилов В.И. Биотехнологическая конверсия углеводсодержащего сырья для получения продуктов пищевого и кормового назначения. Автореферат на соискание ученой степени доктора технических наук. Москва. 2004. С. 19.

53. Патент РФ № 2002101208, А 21 D 8/02,2003.

54. Патент РФ № 2002101209, А 21 D 13/ 08, 2003.

55. Патент РФ № 2018534, С 12 N 9/42, 1994.

56. Патент РФ № 2046141, С 12 N 9/42, 1995.

57. Патент РФ № 2067994, С 12 N 1/20, 1996.

58. Патент РФ № 2087512, С 09 К 7/00, 1997.

59. Патент РФ № 2104302, С 12 N 1/18, 1998.

60. Патент РФ № 2109059, С 13 К 013/00, 1998.

61. Патент РФ № 210958, С 12 Р7/06, 1998.

62. Патент РФ №2119952, С 12 N 1/18, 1999.

63. Патент РФ № 2159047, А 23 К 1 /16, 2000.

64. Патент РФ № 2159549, А 21 D 8/ 02, 2000.

65. Патент РФ № 2165975, С 12 N 1/18, 2001.

66. Патент РФ № 2170522, А 23 L 1/ 314, 2001.

67. Патент РФ № 2175207, А 23 L 1/ 317, 2001.

68. Патент РФ №2191513, А 21 D 13/08,2002

69. Патент РФ № 2191522, А 23 К 1/16, 2000.

70. Патент РФ № 2202891, А 21 D 8/ 02, 2003.

71. Патент РФ № 2203941, С 12 N 1/18, 2003.

72. Патент РФ № 2204236, А 01 G 1/04, 2003.

73. Патент РФ № 2204263, А 23 К 1/ 06, 2001.

74. Патент РФ № 2213080, С 12 N 1/14, 2003.

75. Патент РФ № 2214723, А 23 К 1/16, 2001.

76. Патент РФ № 2222179, А 01 G 1/04, 2004.

77. Патент РФ № 2223327, С13 К1/02, 2004.

78. Патент РФ № 94039526, А 23 К 1/16, 1997.

79. Патент РФ № 98100002, А 23 К 1/16, 1999.

80. Передерий В.Г., Соловьева А.А. Йодная недостаточность — проблема государственная // Проблемы питания и здоровье. 1996. - № 3-4. - С. 4-5.

81. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразую-щих бактерий.//Химическая и биологическая безопасность. — 2007. № 2-3 (32-33).-С. 20-41.

82. Р.4.1.1672-03 «Руководство по методам и анализам БАВ в пище».

83. Работнова И.Л. Роль физико химических условий в жизнедеятельности микроорганизмов. -М.: Наука, 1990. - 25 с.

84. Раменский В.А. К пониманию действия мультиэнзимного комплекса на превращение питательных веществ и энергии корма в организме животных.// Вестник ОГУ. 2005. - № 12. - С. 162-164.

85. Рензяева Т.В., Назимова Г.И., Кудинова В.М., Рензяев О.П. Растительное сырьё с функциональными свойствами для производства вафель. — В кн.: Переработка сельскохозяйственного сырья. — Кемерово, 1999. — С.64-65.

86. Рипачек В. Биология дереворазрушающих грибов. М,: Наука, 1967.-186 с.

87. Рудак В.Ф. Биологические основы получения биомассы микроводорослей и перспективы ее применения. Автореферат докторской диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. М. 1986. 23 с.

88. Руденко Е.Ю. Современные тенденции переработки основных побочных продуктов пивоварения. // Пиво и напитки — 2007 № 2.

89. Санина Т.В., Лукина С.И., Черемушкина И.В., Пономарева Е.И. Комплексно обогащённый бисквит. //Кондитер, пр-во. — 2003. №2. — С. 16-17.

90. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике.-А- Ата: Наука, 1982.- 235 с.

91. Серебряный В.А. Ксиланаза Penicillum canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента. Автореферат кандидатской диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2006, 26 с.

92. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В. М. Биоконверсия лигноцел-люлозных материалов: Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

93. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сорокулова И.Б., Литвин В.П. Влияние комплексного пробиотика споролакта на микробиоценоз кишечника теплокровных. // Микробиол. ж. — 1995. — Т. 57. №4. — С. 42-49.

94. Смоляр В.И. Рациональное питание. Киев: Наукова Думка, 1991. 368 с.

95. Сницарь А., Кирилов М., Крохина А., Яхин А., Мурачев Д. Новая белко-во-минеральная добавка для поросят // «Свиноводство». 2000. - № 5.

96. Сницарь А.А., Сницарь А.И. Использование сухой пивной дробины при изготовлении хлеба, выпечки, колбасных изделий и полуфабрикатов. //Ж. «Практик экспертиза». — 2002. №3-4.

97. Сницарь А.И., Ващук Е.А., Минко Н.Д., Рыжов С.А., Траханова Е.М. Новая линия для производства муки из пивной дробины (к использованию в пищевых целях). //Мясная индустрия. — 2003. №4. — С. 16-17.

98. Сницарь А.И., Кирилов М., Анисимова Т.Н., Яхин А. Новая белково-минеральная добавка в состав стартерных комбикормов для телят // «Мясное и молочное скотоводство». 2000. - № 7.

99. Тулемисова Ж.К. Микробиологические основы создания и использования биопрепаратов пробиотического действия. Автореферат докторской диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. — Казахстан, Алматы, 2002.

100. Тюльпанова В.А. Особенности роста и конидиегенез продуцента трихо-дермина при различных условиях культивирования/ В. А. Тюльпанова, Г.И.Громовых, Г.Л.Козлова и др. Красноярск, 94.-51 е.- Деп. В ВИНИТИ 10.09.94, №34-37, В-94.

101. Увилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982. С.4-40.

102. Удалова Э.В. и др. Создание многокомпонентных ферментных систем для ряда отраслей агропромышленного комплекса. /Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. М., 2004. - С. 279-285.

103. Удалова Э.В. и др. Энзиматическая конверсия растительного сырья и отходов сельскохозяйственного производства. — М., 1990. 34 с.

104. Ушакова Н.А. Изучение мутуалистических взаимодействий микроорганизмов и животных и использование микросимбионтов в биотехнологических целях. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук — М., 2006.

105. Фаритов Т.А. Использование кормовых добавок в животноводстве.- Уфа.: БГАУ, 2002. С.84-105.

106. Фисинин В.И., Егоров И.А., Сницарь А.И., Мурачев Д.А. Белково-минеральная добавка на основе пивной дробины в рационах бройлеров // «Мясная индустрия». 2000. - № 8.

107. Цугкиева Е.Б. Разработка основ технологии комплексной переработки стевии. Автореферат кандидатской диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2007, 23 с.

108. Шарков В.И., Сапотницкий С.А., Дмитриева О.А., Туманов И.Ф. Технология гидролизных производств.- М.: Лесная промышленность, 1973. С. 12-20.

109. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — М.: Мир, 1987. — 567 с.

110. Эль-Регистан Г. И. Роль мембранных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов. Автореферат докторской диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук М., 1988.

111. Эрнст JI. К., Науменко 3. М., Ладинская С. И. Кормовые продукты из отходов леса. М.: Лесн. пром-сть, 1982. - С. 13-15.

112. Adrjanowicz Е., Janczar, Pietkiewicz J. Kierunki zagospodarowania odpadow przemyslu piwowarskiego. //Przem.ferment.owoc.-warz. 1999. - V.43. - №11. -P.13-16.

113. Arnow D., Olesson J.J. and Williams J.H. The effect arginine on the nutrition of Chlorella vulgaris. //American Journal of Botany. 1953. V. 407. P. 100-104.

114. Barker S.B., William H. Summerson. The colorimetric determination of lactic acid in biological material. — The Journal of Biological Chemistry, USA, 1940. — P. 535-555.

115. Carpenter J.F., Crowe J.H. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes.// Cryobiology, 1988, V. 25, P. 244 255.

116. Eriksson К. E. Advances in enzymatic degradation of lignocellulosic materials//Proc. Int. Symp. on Ethanol, Canada. Oct. 1982. P. 345-370.

117. Falcone G., Nickerson W. J. Identification of protein disulfide reductase as a cellular division enzyme in yeasts. //Science. 1956. V. 124. N. 3225. P. 722-723.

118. Fels I.G. and Cheldelin V. H. Methionine in selenium poisoning. //Journal of Biological Chemistry. 1948. V. 176. P. 819-828.

119. Fels I.G. and Cheldelin V. H. Selenite inhibition studies. IV. Biochemical basis of selenate toxicity in yeast. //Journal of Biological Chemistry. 1950. V. 185. P. 803811.

120. Gennity J.M., Bottino N.R. at all. A selenite-induced decrease in the lipid content of a red alga.//Phytochemistry. 1985. V.24. -N.12. P. 2823-2830.

121. Godic Torcar K., Matijasic B.B. Partial Characterisation of Bacteriocins Produced by Bacillus cereus Isolates from Milk and Milk Products. // Food Technol. and Biotechnol. 2003. - Vol. 41, №2. - P. 121-129.

122. Gutmanis Т. Selenium yeast production. Universal Food Corp. U.S. US 4.530. 846 [CL 426-62; A23L1/28], 23 Jul. 1985, Appl. 466, 398. 15 Feb. 1983.

123. Halliwell G., Griffin M. Affinity chromatography of the cellulase system of Trichoderma koningii II Biochem. J. 1978.Vol. 169. P. 713-715.

124. Hirs C.H.W., Timasheff S.N. Meths. Enzymol., Enzyme Structure part B, Academic Press, New York, 1972, V. 25, P. 387 644.

125. Hosoi Т., Ametani A., Kuichi K., Kaminogawa S. Changes in fecal microflora induced by intubation of mice with Bacillus subtilis (natto) spores are dependent upon dietary components // Can. J. Microbiol. 1999. — Vol. 45. - P. 59-66.

126. Hosoi Т., Ametani A., Kuichi K., Kaminogawa S. Improved growth and viability of lactobacilli in the presence of Bacillus subtilis (natto), catalase, or subtilisin // Can. J. Microbiol. 2000. - Vol. 46. - P. 892-897.

127. Hosoi Т., Kuichi K. Natto — A food made by fermenting cooked soybeans with Bacillus subtilis (natto) II Handbook of Fermented Functional Foods / Farnworth E.R. (editor). Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2003. - P. 227-245.

128. Hugo W.B., Newton J.M. The adsorbtion of iodine from salutation by microorganisms and by serum. // J. Pharm. Pharmachol. 1964. Vol. 16. P.49.

129. Jadamus A., Vahjen W., Simon O. Studies on the mode of action of probiotics: effects of the sporespecific dipicolinic acid on selected intestinal bacteria. // J. Agr. Sci. 2005. - Vol. 143. - P. 529-535.

130. Klibanov A.M. Enzyme stabilization: A review.// Anal. Biochem., 1979, T. 93, P. 1-25.

131. Korhonen H., Harri M. Growth, body composition and fur quality of farmed minks and polecats on brewers mash and basal diets. //J.Anim.Physiol. Anim.Nutrit. 1988. - V.59. - #2. - P. 107-112.

132. Liqi X., Zheng Q., Xiuzhen X. Assimilation of inorganic selenium by yeast. //Weishengwu Xuebao. 1990. V.30. N.l. P.30-33.

133. Martinek K., Mozhaev V.V. Immobilization of enzymes, an approach to fundamental studies in biochemistry.// hi: Advances hi Enzymology, New York, 1985, V. 57, P. 179-249.

134. Mosbach К. Immobilized enzymes and cells: Parts В, C.// Methods Enzymol, V. 135 and 136, Academic Press, New York, 1987,120 p.

135. Mozhaev V.V., Melik-Nubarov N.S., Siksnis V., Martinek K. Strategy for stabilizing enzymes. Part two: Increasing enzyme stability by selective chemical modification.// Biocataly-sis, 1990, V.3, P. 189-196.

136. Nosoh Y., Sekiguchi T. Protein engineering for thermostability.// Trends Bio-technol, 1990, T. 8, P. 16-20.

137. Nosoh Y., Sekiguchi T. Protein Stability and Stabilization Through Protein Engineering.// Ellis-Horwood, Chichester, UK, 1991 P. 89-102.

138. Pengra R.M., Berry E.C. Growth of Saccharomyces cerevisiae in the presence of selenium arsenic and selenium-arsenic mixtures. //Proceeding Sauce Dakota Academician Science. 1953. V.32. N.l. P.120-123.

139. Podgorska E., Bujak S. Effect of selenium on the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis. IIActa. Alimentary Polonica. 1985. V.57. N.3.P. 323-331.

140. Profy A.T., Schimmel P. Complementary use of chemical modification and site-directed mutagenesis to probe structure-activity relationships in enzymes.// Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 1988, T. 35, P. 1-26.

141. Schein C.H. Solubility as a function of protein structure and solvent components.// Biotechnology, 1990, V. 8, P. 308 317.

142. Sharp R.J., Scawen M.D., Atkinson T. Fermentation and downstream processing of Bacillus J'/Biotechnology Handbook: Bacillus / Harwood C.R. (editor). — New York: Plenum Press, 1989. P. 255-292.

143. Shrift A. Metabolism of selenium by plants and microorganisms. In D.L. Klayman and W.H.H. Gunther ed. Organic selenium compounds: their chemistry and biology. John Wiley. Sons. Inc. New-York. 1973. P. 760-814.

144. Technik der Weinbergsbegrunung. //Dt.Weinmag. 1998. - №15. - P.25-33.

145. Ushakova N.A., Kotenkova E.V., Kozlova A.A., and Nifatov A.V. A Study of the Mechanisms of Probiotic Effect Of Bacillus subtilis Strain 8130. Prikladnaya Bi-okhimiya i Mikrobiologiya, 2006, Vol. 42, No. 3, pp. 285-291.

146. Wells J.A., Estell D.A. Subtilisin: An enzyme designed to be engineered.// Trends Biochem. Sci. 1987 - T. 13. - P. 291-297.

147. Wong S.S. Wong L.C. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes.//Enzyme Microb. Technol. 1992. - V. 14. - P. 866-874.165. www.intercharm.ru166. www.sibbio.ru167. www.vostokbio.com

148. Zvyagilskaya R.A., Parkhomenko A.O., Gordeeva A.V. et al. Bioenergetics of Yarrowia lipolytica cells grown at alkaline conditions. // Bioscience reports. — 2004. -Vol. 24.-№2.-P. 117-118.

Информация о работе

Касаткина, Арина Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы