Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb)

Белоруссова, Алена Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb)
ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb)"

На правах рукописи

Белоруссова Алена Сергеевна

□0305Т334

¿ии/

ЗАКОНОМЕРНОСТИ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА И АНДРОКЛИНИИ У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ (ЬАШХБЮШСА ЬЕОЕВ.) (ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03.00.05-ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2007

Работа выполнена в лаборатории лесной генетики и селекции Институте леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения РАН, г. Красноярск

Научный Руководитель:

доктор биологических наук, профессор Третьякова Ираида Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Васильев Аркадий Николаевич

кандидат биологических наук, доцент Зобова Наталья Владимировна

Ведущая организация:

Институт биологии УНЦ РАН (г. Уфа)

Защита состоится « /6 ъ ¿¿¿¿¿¿Л- 2007 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 003.056.01 в Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск-36, Академгородок

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Автореферат разослан ¿£-^^^¿2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физ.-мат. наук А В. Шашкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Высшие растения обладают высоким потенциалом тотипотентности клеток [Бутенко, 1964]. Фактически, каждая дифференцированная клетка растения, имеющая ядро, способна переходить в эмбриогенное состояние и продуцировать новое растение. Это свойство наиболее ярко проявляется при культивировании клеток и тканей растений в условиях in vitro.

Тотипотентность клеток лежит в основе таких уникальных явлений в биотехнологии микроклонального размножения растений как соматический эмбриогенез и андроклиния, приводящих к возникновению нового растительного организма из соматической или спорогенной клетки в условиях культуры in vitro. Эти феномены открывают большие перспективы в познании процесса клеточной дедифференцировки и реализации морфогенетического потенциала растительного организма. Применение подобных инновационных технологий, в сочетании с криоконсервацией и различными селекционными программами дает возможность для получения, раннего отбора и испытания ценных генотипов, их быстрого распространения, что способствует массовому получению улучшенных высокопродуктивных клонов и чистых линий хвойных растений для клонального лесоводства [Klimaszewska, Суг, 2002; Park, 2002; Campbell et al., 2003].

Исследования по соматическому эмбриогенезу и андроклинии в культуре in vitro проводятся, как правило, на покрытосеменных растениях [Батыгина, 1978, 1994, 1999; Круглова, 1994; Batygina, 2005 и др.]. У хвойных растений семейства Pinaceae изучение соматического эмбриогенеза интенсивно ведется в течение последних двадцати лет за рубежом [Lelu et al, 1994; Klimaszewska, Суг, 2002; Stasolla, Yeung, 2003], однако, несмотря на активные исследования в данной области, регенерация растений путем соматического эмбриогенеза все еще остается проблематичной для ряда видов. Данные по андроклинии у этого семейства растений до сих пор отсутствуют.

Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвойных растений, в том числе и у лиственниц, до сих пор не проводились. Между тем лиственница сибирская является основным лесообразователем хвойных лесов Сибири. Однако во многих случаях она имеет низкое качество семян и подвержена сильному воздействию абиогенных и биогенных факторов, негативно сказывающихся на росте и семеношении данного вида, и порой практически полностью исключающих возможность целевого использования его лесосеменных участков [Исаев и др., 2001]. Разработка и применение современных биотехнологий, и особенно, таких как соматический и микроспориальный эмбриогенез, позволит выращивать быстрорастущие, высокопродуктивные, устойчивые к абиотическому и биотическому стрессу особи лиственницы сибирской.

Цели и задачи исследования. Цель работы - выявление эмбриолого-физиологических закономерностей соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), в том числе изучение процессов трансформации соматических и спорогенных клеток данного вида в эмбриональные структуры в контролируемых условиях культуры in vitro.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

- провести цитоэмбриологические исследования зиготического эмбриогенеза у лиственницы сибирской in vivo;

- разработать технологию получения эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ), способной пролиферировать и продуцировать соматические зародыши и растения-

регенераты из эксплантов лиственницы сибирской различного генетического и онтогенетического происхождения,

- разработать технологию получения андроклинных.культур лиственницы сибирской,

- выявить цитоэмбриологические сходства и различия в развитии половых (зиготических) зародышей лиственницы сибирской, и зародышей возникающих в культуре in vitro асексуально, из соматических и спорогенных клеток.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые для лиственницы сибирской различного генетического происхождения были разработаны современные методы микроклонального размножения, такие как соматический эмбриогенез и андроклиния в культуре in vitro Выявлены основные факторы, влияющие на процессы микроклонального размножения лиственницы сибирской. Изучены сходства и различия в развитии эмбриональных структур данного вида in vivo и в культуре in vitro.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов Полученные результаты по соматическому эмбриогенезу и андроклинии у лиственницы сибирской вносят вклад в познание клеточной дедифференцировки: способности диплоидных и гаплоидных клеток данного вида переходить в эмбриогенное состояние и формировать растения de novo. Настоящие исследования интересны еще и тем, что данные по микроспориальному эмбриогенезу в культуре т vitro у хвойных растений отсутствуют

На основании проведенных исследований созданы коллекции эмбриогенных культур, полученных из изолированных зиготических зародышей и микроспор лиственницы сибирской. Разработанные в ходе исследований методы соматического эмбриогенеза могут быть использованы для массового тиражирования ценных генотипов лиственницы сибирской, обладающих повышенным репродуктивным потенциалом, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу, и в частности к поражению насекомыми-галлообразователями.

Положения, выдвигаемые на защиту: 1 Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы и формирование зародышей de novo в культуре in vitro у лиственницы сибирской зависит от донорского растения, стадии развития экспланта и гормонального состава питательной среды.

2. Соматический эмбриогенез - асексуальный способ размножения лиственницы сибирской, повторяет основные этапы развития половых зародышей данного вида и приводит к формированию нового растительного организма de novo.

3. Использование ауксина при индукции андроклинии in vitro у лиственницы сибирской вызывает образование эмбриоидов микроспориального происхождения, имеющих сходство с зиготическими зародышами покрытосеменных растений.

Петербург, 2005г.), на Четвертой российской конференции «Чтения памяти J1.M. Черепнина» (Красноярск, 2006г.), на XV Конгрессе Союза Европейского общества по биологии растений (Лион, 2006г.), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 200бг.), на X Междунар. научной школе-конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006г.).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 23 печатных работах; три из них - в реферируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы и шесть приложений. Библиографический список включает 212 источников, в том числе 152 на иностранных языках. Текст иллюстрирован 47 рисунками и включает 7 таблиц. Общий объем диссертации составляет 165 страниц.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные данные получены непосредственно автором.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д б.н., профессору Третьяковой Ираиде Николаевне и научному консультанту к.б.н. Баранникову Юрию Николаевичу за всестороннюю помощь во время работы над диссертацией и ценные советы. Автор благодарит члена-корр. РАН. д.б н., профессора Татьяну Борисовну Батыгину (Ботанический институт РАН) и д.б.н. Наталью Николаевну Круглову (Институт биологии УНЦ РАН) за консультации в области андроклинии in vitro, а также Dr. Marie-Anne Lelu-Walter (INRA) и Dr. Claudio Stasolla (University of Manitoba) за рекомендации в области соматического эмбриогенеза хвойных растений. Отдельная благодарность Dr. Herve Van De Syp (INRA) за помощь в осуществлении стажировки в INRA.

ГЛАВА 1. ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ IN VIVO И СОЗДАНИЕ НОВОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА IN VITRO

В данной главе анализируются основные закономерности формирования мужского и женского гаметофитов [Eriksson et al., 1970; Круклис, 1971; Но, Owens, 1974; Козубов, 1974; Тренин, 1975; Круклис, Милютин, 1977; Третьякова, 1990; Романова, Третьякова, 2005; Третьякова и др., 2006], оплодотворения и развития зиготического зародыша хвойных растений в условиях in vivo [Schopf, 1943; Johansen, 1950; Круклис, 1978; Singh, 1978; Raghavan, 1986; Тренин, 1986; Третьякова, 1990; Von Aderkas et al., 1991; Misra, 1994; Schmidt et al., 1994; Gupta, Grob, 1995]. Рассматривается действие регуляторов роста растений in vivo и в культуре in vitro [Altman, Goren, 1971; Campbel, Durzan, 1976; Winton, Varhagen, 1977; Минина, Ларионова, 1979; Von Arnold, Eriksson, 1979; Bonga, Durzan, 1982; Mott, 1982; Zaerr, Mapes, 1982; Ammirato, 1983; Jansson, Bornman, 1983; Mott, Amerson, 1984; Minocha, 1987; Romani, 1987; Lilu, et al., 1994; Кулаева, 1995; Malabadi, Van Staden, 2005]. Анализируются современные достижения в области микроклоналыюго размножения растений - соматического эмбриогенеза [Rienert, 1958; Steward et al., 1958; Бутенко, 1964; Durzan, Chalupa, 1976; Durzan, 1980; Chalupa, 1985; Hakman et al., 1985; Батыгина, 1987; Bonga, 1987; Durzan, Gupta, 1987; Hakman, 1988; Kartha et al., 1988; Von Aderkas et al., 1991; Lilu et al., 1994; Батыгина, 1999; Филонова и др., 2000, 2002; Klimaszewska, Cyr, 2002; Bicknel!, Koltunow, 2004; Smertenko et al., 2003; Stasolla, Yeung. 2003; Von Arnold et al., 2002; Malabadi. Van Staden, 2005 и др.] и гаплоидного эмбриогенеза in vitro у представителей голосеменных и покрытосеменных растений, в том числе гиногенеза и микроспориального эмбриогенеза [Tulecke. 1953; Muraschige. Skoog. 1962; Bourgin. Nitsch, 1967; Nitsch. Nitsch 1969; Bonga. Fowlcr. 1970; Nitsch.

Norreel, 1973; Bonga, Molnnis, 1975; Keller et al, 1975; Crouch, 1982; Скрипаченко, 1982; Nagmani, Bonga, 1985; Батыгина, 1987; Bonga, 1988; Von Aderkas, Bonga, 1988; Von Aderkas et al., 1991; Lelu et al., 1994; Reynolds, 1997; Батыгина, 1999; Анапияев, 2001; Круглова, 2001; Круглова, Зайнутдинова, 2001; Круглова, 2003; Deutsch et al., 2004]. Доказывается актуальность проведения исследований по микроклональному размножению хвойных растений в целях углубления познаний в области тотипотентности клеток хвойных растений, и возможных путей ее реализации в >словиях культуры in vitro.

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВИЙ ПРОИЗРАСТАНИЯ ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объекты исследования и места их расположения

В южной части своего ареала лиственница сибирская сильно поражается большой лиственничной почковой галлицей Dasineura rozhkovi Mam. et Nik [Isaev et al., 1988]. При обильном заражении на деревьях практически не остается почек старше двух лет, и микро- и макростробилы не образуются [Баранчиков, 1995, 2002] Галлица является основным биогенным фактором, тормозящим развитие лесосеменного хозяйства лиственницы в Южной Сибири. Вместе с тем в лиственничных насаждениях встречается до 1-3% деревьев, генетически устойчивых к этому вредителю [Баранчиков, 1995]. Они могут служить основой для селекционных работ по выведению устойчивых к вредителю линий лиственницы сибирской

В работе использовали 9 особей лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), устойчивых к поражению лиственничной почковой галлицей (Днпь Днп2> Днпз> Днп4, Днт> Дбнп, Х47, У„п2, Унпз). и 23 особи, неустойчивых к данному энтомовредителю (Дп.1, Дп2, Ahl. Дбп2, ДбпЗ, Дб7, Дб12, ККП, Кп, Кп|, К.п, Бю, Бц, Б|4> КП2, Дсп, Упь Уп2, УпЗ> УП4, Апь Ап2).

Деревья лиственницы сибирской, использующиеся в настоящих исследованиях, произрастают в естественных условиях на территории Республики Хакасия (пос. Черное озеро, Ширинского района), Иркутской области (о. Ольхон на озере Байкал) и Красноярского края (окр. г. Ужур), а так же в зеленых насаждениях г. Красноярска (р-он Академгородка) и на прививочной плантации на территории Ужурского лесхоза Красноярского края. Характеристика местообитаний приведена в тексте диссертации. 2.2. Методы микроклонального размножения in vitro

Материалы исследований. В качестве эксплантов для индукции соматического эмбриогенеза использовались мегагаметофиты, изолированные зиготические зародыши на разных стадиях формирования, собранные со свободно-опыленных деревьев лиственницы сибирской, а также сегменты однолетних вегетативных побегов. Эксплантами для получения андроклиных культур служили микростробилы, микроспорангии и изолированные микроспоры.

Стерилизация помещений, посуды и эксплантов. Для стерилизации помещения использовалось ультрафиолетовое облучение в течение 30-40 мин. Посуда, дистиллированная вода и питательные среды стерилизовались в автоклаве под давлением 0,5-1 А0 и температуре 120°С в течение 20-30 мин. Мегагаметофиты стерилизовались раствором 5 % йода с 95 % этанолом (1:3) (3 мин), вегетативные побеги и микростробилы стерилизовались гипохлоритом натрия (3 мин ), пыльцевые зерна стерилизовались перекисью водорода (2 мин.). После стерилизации экспланты троекратно промывались в стерильной дистиллированной воде по 10-15 мин.

Методы соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей лиственницы сибирской. Для инициации ЭСМ из зиготических зародышей использовались базальные среды MS и MSG с добавлением мезоинозита (0,1 г/л), L-глютамина (1,45 г/л), фитогормонов: 2,4-Дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д, 2 мг/л) и 6-Бензиламинопурина (6-БАП, 1 мг/л), сахарозы (30 г/л), а также агара (7 г/л) или Gelrite (4 г/л) [Murashige, Skoog, 1962; Becwar et al„ 1990; Lelu et al., 1994, б]. Для пролиферации эмбриональной массы концентрация 6-БАП и сахарозы снижалась вдвое. Эксперименты по индукции и пролиферации ЭСМ проводились в темноте. Для перехода соматических зародышей к созреванию экспланты культивировались на безгормональной среде MSG с активированным углем (1 г/л) в течение 1 нед. Для созревания соматических зародышей использовалась среда MSG с добавлением мезоинозита (0,1 г/л), L-глютамина (1,45 г/л), 2,4-Д (0,2 мг/л), АБК (5,3-15 мг/л), сахарозы (30 г/л), а также агара (7 г/л). Проращивание соматических зародышей проводилось на безгормональной среде MS, содержащей 1 г/л активированного угля. Культивирование проводилось на свету, при 16-ти часовом фотопериоде и температуре 24 ± 1°С.

Методы получения соматического эмбриогенеза из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской. Для индукции каллуса из сегментов вегетативных побегов проводилась обработка эксплантов низкой температурой (+2-3° С в течении трех дней) на базальных средах DCR [Malabadi, Van Staden, 2005] и 'Л MS, содержащих 30 г/л сахарозы, 0,3 % активированного угля и 1,5 г/л Gelrite без гормонов. Через 3 сут. экспланты переносились на базальные среды DCR и Vi MS, с добавлением 1 г/л L-глютамина, 1 г/л гидролизата казеина, 1 г/л мезоинозита, 30 г/л сахарозы и 1,5 г/л Gelrite, а также 2,4-Д (4,42 мг/л), 6-БАП (2 мг/л) и индолилуксусной кислоты (ИУК, 2-4,4 мг/л). Экспланты выдерживались в темноте, при температуре 24 ±1° С. Пролиферация каллусных культур проводилась на базальных средах DCR и 'Л MS, содержащих 40 г/л сахарозы, 0,44 мг/л 2,4-Д и 0,225 мг/л БАП, а также 2 г/л Gelrite (в темноте, при температуре 24±1°С).

Методика получения андроклинных культур лиственницы сибирской in vitro. Для индукции андроклиных культур из микроспор лиственницы сибирской микростробилы, микроспорангии и изолированные микроспоры помещались на твердые и жидкие базальные среды MS, Vi MS, WPM, LV и K99, а также модифицированные по содержанию нитрата аммония среды MS (MSni, MSn2, MSn3> MSn4), содержащие 30 г/л сахарозы, а также различные концентрации витаминов, гормонов, L-глютамина и гидролизата казеина (табл.1). 2.6. Получение и обработка данных

Цитологический анализ эмбриональных процессов. Для цитологического анализа использовались давленые и постоянные препараты. Окраска давленых препаратов проводилась сафранином с добавлением метиленового синего. Окраска мужских гаметофитов и андроклинных каллусов осуществлялась гематоксилином по Гайденгайну [Паушева, 1980]. Постоянные препараты приготовлялись по стандартной методике, парафинированные образцы нарезались на ротационном микротоме, окраска проводилась гематоксилином по Гайденгайну [Паушева, 1980]. При изучении процессов морфогенеза для каждого срока фиксации производился просмотр 5-7 препаратов (выборка образцов осуществлялась из 40-200 эксплантов случайным образом по таблице случайных чисел), и замер 25-100 клеток. Просмотр микроскопических образцов осуществлялся на микроскопе МБИ-6 (СССР) и KS Imaging System (Германия). Измерение клеток и эмбриональных структур проводили

при помощи окуляр-микрометра с последующим переводом полученных единиц в м км

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных осуществлялась по стандартным методикам [Лакин, 1973, Рокицкий, 1973, Шмидт, 1984] при помощи программы Microsoft Excel и Statistica 6 0 [1999]. В результатах представлены средние арифметические из 2-3 независимых экспериментов (ш), каждый из которых проведен в 4-30 кратной биологической повторности (n), а также их стандартные ошибки. Ошибка общей средней рассчитывалась как корень квадратный из суммы квадратов частных ошибок, деленный на число независимых экспериментов. Достоверность полученных данных оценивалась при помощи однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа (в скобках приводится значение уровня значимости, Р).

Таблица 1. Состав питательных сред, использованных для индукции андроклинии у лиственницы сибирской (мг/л).

Питательные среды NH4N03 Гидролизат казеина L-Глютамин Гормоны

2,4-D 6-БАП ИУК

WPM 400 100 - 0,5 - -

LV 1650 100 - 0,5 - -

LV 1650 100 - 0,5 0,2 -

К99 80 100 - 0,5 - -

К99СТ 80 100 - 0,2 1

К991 80 - 1000 0,4 - -

К9911 80 - 1000 0,5 0,2 -

К99111 80 - 1000 - - 0,4

K991V 80 - 1000 - 0,5 0,2

'/2 M Sa 825 100 - 0,5 2 -

1/2 MSa, 825 100 - 0,5 0,2 -

'/2 MSa2 825 100 - 0,4 - -

MS„| 825 100 - 0,5 0,2 -

MSaj 825 100 - 0,4 - -

MS, 1650 - 1000 0,4 -

MS„ 1650 - 1000 - - 1

MS„, 1650 - 1000 - - 3,2

MSiv 1650 - 1000 - - 0,8

MSni 550 - 1000 - - 1

MSN2 1650 - 1000 - - 1

MSn3 200 - 1000 - - 1

MSn4 825 - 1000 - - 1

Для сравнения интенсивности прироста каллуса и ЭСМ размеры эксплантов измерялись еженедельно. Вычисление объема эксплантов проводилось по формуле:

где V - объем экспланта, мм3; к- 3.14;

5 - ширина экспланта, мм; Ь - длина экспланта, мм, Ь - высота экспланта. мм.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ЗИГОТИЧЕСКОГО И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ

ЗЛ. Эмбриогенез лиственницы сибирской in vivo

Эмбриональные процессы у лиственницы сибирской включают три последовательные стадии развития: й ¡»эмбриогенез, ранний и поздний эмбриогенез.

В процессе проэмбриогенеза у лиственницы сибирской (III дек. июня) 4 свободных ядра, образовавшиеся после деления зиготы, двигаются к основанию архегония. делятся и формируют 8 ядер. Они располагаются в два слоя - «первичный верхний слой» и «первичный эмбриональный слой». Первичный верхний слой клеток формирует верхний и суспензорный слои клеток, которые позже деградируют. Первичный эмбриональный слой продуцирует два эмбриональных слоя. Клетки, берущие свое начало от верхнего эмбрионального слоя, слагают первый ряд эмбрионального суспензора, их удлинение вызывает продвижение эмбриональных клеток зародыша в коррозийную полость мегагаметофита.

Ii процессе раннего эмбриогенеза (I дек, июля) у лиственницы сибирской происходит активное деление клеток эмбриона,! ьиого слоя и первичного суспензора, которые формируют эмбриональные трубки, а затем вторичный еуспензор. Клетки вторичного суспензора интенсивно растягиваются и продвигают эмбриональную глобулу в центр женского гамет офит а.

В процессе позднего эмбриогенеза происходит образование меристемы корня и побега. В этот период на поверхности формирующегося зародыша могут наблюдаться выпячивания, из которых возникают новые зародыши. Таким образом, проявляется явление замедленной кливаж ной пол и эмбрион ии [Schopf, 1943]. К концу позднего эмбриогенеза (I дек. августа) зрелый зародыш лиственницы сибирской имеет семядоли, апекс побега, первичную кору, центральный цилиндр, апекс корпя и корневой чехлик, внутри которого сформирована колонка корневого чехлика. В целом процессы зиготического эмбриогенеза лиственницы сибирской совпадают с описанными ранее аналогичными процессами у данного вида, а также у других видов лиственниц [Schopf, 1943; Круклис, 1978; Круклис, Милютин, ¡978; Von Aderkas et al, 1990].

3.2. Соматический эмбриогенез из знготических зародышей лиственницы сибирской

Влияние стадии развития экеппйнта на индукцию сомами чес кого ш бриогенеза.

Показано, что образование эмбриогенного каллуса (эмбрио-налыш-суспензорной массы, ЭСМ) у лиственницы сибирской зависит от стадии развития зиготическнх зародышей, вводимых в культуру in vitro.

Наиболее перспективными при введении в культуру оказались незрелые зиготические зародыши, находящиеся на стадии позднего эмбриогенеза: зародыши на стадии инициации Семядолей Ш дек, июля)

П p^Jñ.'omif е.1ьно С1 Ь h,y .1 L.T 11 н;ш и к, сут

□ гло0\.'1нриля стадия О стадия шшцизиин ссмя.ю/рсЕЗ

□ стадия Г Л Ml IfThl \ ССМНД'.М'П ш -фС-'ПЛС jap Cub1.11

Рис. 1. Формирование ЭСМ из зиготических зародышей Лиственницы сибирской на разных стадиях развития

формировали ЭСМ в 66,7 % случаев; зародыши, у которых семядоли полностью сформированы (III дек. июля), продуцировали ЭСМ в 98 % случаев (рис. 1).

Культивирование зрелых зиготических зародышей лиственницы сибирской на среде MSGi индуцировало активный рост семядолей и формирование неэмбриогенного каллуса на гипокотиле у 30 % зародышей.

Заложение очагов эмбриогенного и неэмбриогенного каллуса на одном и том же экспланте происходило у 40 % зрелых зиготических зародышей. В дальнейшем отдельные участки ЭСМ продуцировали единичные соматические зародыши.

Пролиферация эмбриогенных культур лиственницы сибирской. Полученная ЭСМ могла долгое время (1-2 года) поддерживаться на среде MSGn без потери пролиферационной активности На протяжении всего срока культивирования происходил интенсивный прирост ЭСМ (рис. 2). Пролиферирующая ЭСМ при регулярном субкультивировании (через 10-14 сут.) способна продуцировать соматические зародыши.

Продолжительность культивирования, мес

Рис. 2. Изменение объема ЭСМ, полученной из зиготических зародышей лиственницы сибирской на стадии позднего эмбриогенеза в зависимости от времени культивирования.

Влияние состава питательной среды на формирование соматических зародышей лиственницы сибирской. Состав базовых сред не оказал заметного влияния на формирование ЭСМ, тогда как введение L-глютамина в среду значительно стимулировало образование ЭСМ и развитие соматических зародышей.

Культивирование эксплантов на базальной среде MS с L-глютамином, приводило к формированию аномально развитых соматических зародышей, превышающих по размерам нормальные соматические зародыши в 2-3 раза. Они имели массивный суспензор (ширина 230,0 ±3,6 мкм) и крупное тело зародыша (ширина 470,0 ± 12,5 мкм; ш = 2; п = 8)

Культивирование зиготических зародышей на среде MSG, содержащей L-глютамин, приводило к нормальному развитию соматических зародышей, их строение было аналогичным строению зиготических зародышей (рис. 3 г).

Влияние растения-донора на соматический эмбриогенез лиственницы сибирской. На формирование ЭСМ у лиственницы сибирской достоверное влияние оказывало используемое растение-донор. Из общего числа исследованных растений 13.3 % (Дбпь Дбпз- Дб7* До 12) были не способны формировать каллус. Большая часть деревьев (66,7 %) формирован! ЭСМ, наряду с каллусом неэмбриогеного типа. Лишь

20 % исследуемых деревьев были способны формировать только ЭСМ (Дши. Д,шз. Дмт. Д,т4). ¡¡аиболес интенсивное формирование ЭСМ из зародышей, находящихся на стадии инициации семядолей, было отмечено у растения-донора Д„2, наименьшее - у Унпз (m = 3;n = 30).

ЦитозмбриолсгическШ характеристика протекания соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской. Процесс соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской начинался па 5-6-е сут. культивирования с растяжения клеток зародыша в области перикрлюмна (62.5 ± 6,5 мкм длиной), которые достигали 193,3 ± 4,5 мкм в длину (т = 3; п = 10) (рис. 3 а, б). Такие удлиненные клетки были названы «эмбриональными трубками» [Von Arnold et al., 2002]. Эти метки подвергались неравному делению, в результате которого на одном из полюсов формировались небольшие клетки диаметром 39,2 ± 1.2 мкм (т = 3; п = 10). В течение следующих 5-7 сут. клетки эмбриональных инициален продолжали делиться и образовывали кластеры эмбриональных клеток (эмбриональные глобулы), к которым примыкала эмбриональная трубка (рис. 3. в). Клетки эмбриональных трубок также продолжали делиться и формировали дополнительные эмбриональные трубки и эмбриональные инициали, таким образом, происходило формирование ЭСМ,

Перенос эксплантрв через I мес. на среду с пониженным содержанием цитокинннов и сахарозы (MSGn) вызывал активную пролиферацию ЭСМ, выражавшуюся в увеличении размеров эмбриональных глобул и числа эмбриональных трубок.

Рис. 3. Формирование ЭСМ и развитие соматического зародыша лиственницы

сибирской: а - эмбриональные трубки (эт); б - эмбриональные трубки и эмбриональные глобулы (эг); в- клеточные конгломераты; г - соматический зародыш (э - эмбриональная масса; с - суспензорная система).

На 1 мм3 ЭСМ насчитывались до 75,0 ±4,6 эмбриональных глобул (т = 3; п = 10). Через I мес. ку.чътнвчровшшя на среде из ЭСМ возникали глобулярные

соматические зародыши (рис. 3. г)

При последовательном переносе эксплантов на среды МБвш (на 1 нед.) и М80(у, содержащую АБК (15 мг/л) (на 1-2 мес. культивирования) соматические зародыши переходили к созреванию: на одном из полюсов формировались примордии семядолей, на другом - зародышевый корешок и хорошо развитый суспензор. Растения-регенеранты прорастали на 10-14 сут. на безгормональной среде МБ с активированным углем.

3.2. Соматический эмбриогенез из сегментов вегетативных побегов

Влияние состава питательных сред на индукцию каллусогенеза из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской. Формирование ЭСМ из сегментов вегетативных побегов начиналось на 8-12-е сут. культивирования, после переноса эксплантов с безгормональной среды, на которой они подвергались холодовой обработке, на индукционную среду ('А М8| или ВСЯ,).

Выявлено, что гормональный состав среды оказывал значительное влияние на процессы каллусогенеза. При использовании гормонов 2,4-Д (4-4,5 мг/л) и 6-БАП (2 мг/л) на 14 сут. начиналось формирование каллуса При добавлении в среду ИУК (2 - 4,4 мг/л) каллусная масса формировалась лишь на 40 сут., имела низкие показатели прироста и подвергалась некрозу.

Роль растения-донора в формировании ЭСМ из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской. Формирование ЭСМ различалось у сегментов побегов полученных с разных деревьев. Наиболее активное формирование ЭСМ наблюдалось у растения-донора Д„п>, у которого к концу инициации (28 сут.) количество эксплантов, формирующих ЭСМ, достигало 78,3 %. Дерево Дп.| имело наименьший процент формирования ЭСМ (7,5 %) на протяжении всего срока культивирования. Остальные особи имели близкие показатели формирования ЭСМ (табл. 2).

Таблица 2. Формирование ЭСМ из вегетативных побегов разных особей лиственницы сибирской на среде 'Л М81 (28 сут. культивирования)

Растение-донор Общее число эксплантов, шт. Формирование ЭСМ

шт. %

Дни, 40 20 50

Днп2 40 22 55

ДнпЗ 59 20 33,8

Днпу 60 47 78,3

Дп-1 40 3 7,5

Дп2 40 20 50

Пролиферация и увеличение объема ЭСМ у разных деревьев также происходили по-разному. Объем ЭСМ у эксплантов дерева ДНП2 на 35 сут. достоверно превышал объем ЭСМ у эксплантов других деревьев, в то время как различия между материнскими растениями Д„„з, ДНП1 и ДН1т4 были незначительными (ш = 2; п = 4; Р < 0,05).

Различия в способности формировать каллус у эксплантов с пораженных и устойчивых к почковой галлице деревьев лиственницы сибирской оказались не достоверными (ш = 2; п = 6; Р > 0.05).

Цитологическая характеристика формирования каллуса из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской. ЭСМ, полученная из сегментов вегетативных побегов представляла собой суспензию из отдельных клеточных скоплений (число клеточных конгломератов достигало 1000,0 ±24,3 шт. на 1 см3). Число клеток, составляющих конгломерат, варьировало от 3 до 40 шт. Цитологическое анализ показал, что ЭСМ включает клетки двух типов: прозенхимные, достигающие в длину 106,0 ± 5,8 мкм и изодиаметрические, 60,0 ± 3,5 мкм в диаметре. Через 20 сут. культивирования в ЭСМ были обнаружены зародышеподобные структуры, содержащие 2-12 клеток округлой формы, 1-2 клетки типа эмбриональных трубок, а также 1-6 удлиненных клеток суспензорного типа (ш = 2; п = 7). Полученные эмбриоиды обнаруживали строение, характерное для зиготических и соматических зародышей хвойных растений на стадии проэмбриогенеза.

ГЛАВА 4. АНДРОКЛИННЫЕ КУЛЬТУРЫ У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ 4.1. Индукция и поддержание андроклинных культур лиственницы сибирской

Влияние стадии развития эксплантов на индукцию андроклинных культур у лиственницы сибирской. Микростробилы лиственницы сибирской представляют собой идеальный материал для введения в культуру in vitro. В отличие от других видов хвойных микроспороциты лиственницы осенью (октябрь) вступают в мейоз, и зимуют на стадии профазы I. Ранней весной (III дек. марта) микроспороциты переходят ко второму мейотическому делению и формируют микроспоры. В этот период микроспоры подвергаются естественной обработке низкими температурами способствующей их переходу на спорофитный путь развития. В I дек. мая в развивающемся мужском гаметофите идут проталлиальные деления и происходит пыление.

Использование для андроклинии пыльцевых зерен лиственницы сибирской оказалось нецелесообразным, поскольку даже при их искусственной обработке низкими положительными температурами переход на спорофитный путь развития не происходил. Наиболее активно индукция андроклиннии происходила при культивировании микроспорангиев весной (апрель) на стадии формирования микроспор (у 63,2 % и 85 % эксплантов на средах MSa2 и М8а|Соответственно).

Влияние состава питательных сред и условий культивирования на индукцию андроклинных культур. Состав питательной среды оказал заметное влияние на индукцию андроклинии у лиственницы сибирской. Среды WPM и LV оказались не пригодными для культивирования микроспороцитов и микроспор (100% эксплантов подверглось некрозу). Индукция андроклинии активно шла на средах К99, MS и lA MS.

Особое влияние на андроклинные культуры оказала концентрация ионов NH4 (входящих в состав нитрата аммония). Использование сред MS, модифицированных по содержанию NH4NO3 (MSN), MSN2, MSN3, MSN4), с добавлением ИУК 1 мг/л (табл. 1) показало, что уже на 14 сут. культивирования число микростробилов с положительным откликом было различным, и составило 78.6, 76.3, 75.0 и 56.6% соответственно. Прирост андроклинного каллуса также зависел от содержания NH4NO3 в среде. На среде MSni средний объем эксплантов через 1 мес. культивирования составил 99,8 ± 7,4 мм . На средах MSN2, MSN3 и MSN4 показатели объема эксплантов были близки и варьировали от 73,6 ± 7,8 до 78,3 ± 5,1 мм3 (ш = 2;

п = 5) (рис. 4). ДЩхфакторный дисперсионный анализ подтвердил достоверность влияния состава питательной среды (Р < 0,01), доля влияния фактора составила 44 %.

Гормональный состав сред также оказывал достоверное влияние па процессы авдроклинии. Культивирование микростробйлов на среде содержащей только ауксин (Уз М5а1) вызываю активное разрастание микроспорофиллов у 85 % эксплантов и прямую акдроклинию (т.е. формирование Эмбрион дов непосредственно из микроспор); формирование каллуса происходило лишь у 9 % эксплантов. Действие низких концентраций ИУК (0,4-1 мг/л) было подобным действию 2,4-Д, На средах, содержащих ауксины н цитокиншш, происходило активное формирование андроклипного каллуса (31.6 %). Его объем на среде '/з в течение 2-х мес. достигал 423.5 ± 63,5 мм', по сравнению с 188,9 ± 28,7 мм'1 па среде 'А содержащей только ауксин (ш = 2; п = 6: Р <0.01).

Влияние растения-донора на формирование андроклинных культур лиственницы сибирской. На средах К^щ, М5а!, ££ обнаруживались

достоверные различия в способности отдельных деревьев формировать андроклинный каллус. При культивировании микростробилов на среде М8„], дерево Ди;|.1 имело наибольшие показатели прироста каллуспой ткани (т = 2; п = 2: Р < 0.05).

На среде К^щ андроклинный каллус наиболее активно формировался из эксплантов непораженных галлицей деревьев Дчп1 и Дип2, и его объем на 65 сут. культивирования достигал 1808,6 ± 42,8 мм" и 1639,1 ± 53,4 мм соответственно. Наименьший прирост каллуса имело дерево объем которого достигал

672,6 ± 59,0 мм3 (ш = 2; п = б; Р < 0,01) (рис. 5, а).

На среде 'Л М8В] особь Д]1пу имела наибольший прирост андроклиииого каллуса на протяжении всего срока культивирования и на 65 сут. культивирования составил 610.4 ¿35.9 мм . Остальные деревья имели близкие показатели прироста каллуса, которые варьировали от 332,1 ± 22,5 мм3 до 395,6 ± 47,5 мм3 (т = 2; п = 4; Р < 0,01) (рис. 5, б).

На начальных этапах андроклинии наблюдалось расхождение в сроках развития генеративных и вегетативных органов у пораженных и непораженных галл иней деревьев. При введении в культуру 1п \ч!го микростробилов с непораженных деревьев мейоз завершался за 4,4 ± 0,2 сут, культивирования (ш = 3; п = 5), в то время как микроспороциты пораженных лиственничной почковой галл иней деревьев формировали микроспоры лишь за 7,0 ± 0,5 сут, (гп = 3; п = 5), Однако достоверных различий в способности формировать каллус эксплантами с пораженных и устойчивых к лиственничной почковой галлице особей лиственницы сибирской обнаружено не было (Р > 0,05),

120 100 ао 60 40 20 с

1 11 ---

5-' 4 ___

1 1

Питательная среда

□ М5)М1 □ ОМЗЫЗ ОМ5М4

Рис. 4. Объем аидроклннных каллусов на средах с различным содержанием №^N,03 на 30 сут. культивирования

2000

1800 —ДгИ

5 1600 J—Днп1

s щ" 1400 Днпг

s 1200 -w-ДнпЗ

g 1000 -*-Днп4 -------/ ifr

i f-i 800 —о—Дсп

5 rS 600

8 400

200

О 20 43 60 80

ПрОДОЛЖИ1£ЛЬИОСТЬ культи с кропания, сут а

700 ,---—

| -■•-■Дину ш ■ —^-ДнлТ 1 500 ■ --*--Днп2 /

О 32 41 50 57 64

Продолжительное™ культивирования, сут О

Рис. 5. Прирост anдроклникого каллуса па средах К^щ (а) и 'Л MS) (б) у различный деревьев лиственницы сибирской

Цитологически» характеристика андроклинии у лиственницы сибирской. Цитологический анализ выявил различия в протекании андроклинии на средах с различным содержалисм гормонов.

Рис. 6. Формирование эмбриовда из микроспоры лиственницы сибирской: выпячивание цитоплазмы и миграция ядра (а); 3-х клеточный эмбриоид (б); многоклеточный эмбриоид (в). Через 2 нед. культивирования микростробилов на средах содержащих только ауксин происходило равное; митотическое деление ядра микроспоры на два. выпячивание цитоплазмы, мшрация одного из ядер и формирование перегородки

между клетками. Далее следовал ряд делений образовавшихся клеток. При этом клетка, ядро которой оставалось па месте, давала начало эмбрпойду, а вторая, сформировавшаяся после миграции ядра, - суспензору (рис. 6, а, б). Полученные микроспориальные зародыши лиственницы сибирской морфологически были схожи с зи готически ми зародышами покрытосеменных растений и имели менее развитую суслензорную систему, чем з И готические зародыши голосеменных (рис. 6, в).

При культивировании микростробилов на средах, содержащих ауксины и цитокшины, развитие андроктннык культур происходило двумя путями. Ц первом случае формирование эмбриоидов шло непосредственно из микроспоры как описано выше. Во втором случае, происходило равное деление микроспоры (или ее ядра), в результате которого формировались многоклеточные структуры или многоядерные ценоциты, заключенные внутри оболочки микроспоры, т.о. происходило формирование каллуса.

Рис, 7. Эмбриоиды и андроклинном каллусе лиственницы сибирской, получении на среде содержащей ауксины и цитокинииы.

Через 2-3 нёд. культивирования на поверхности андроклннногЬ каллуса формировали^ зароды шеподобные структуры (эмбриоиды). Они имели 1-4 изодиаметрические клетки эмбрионального типа, а также 3-13 клеток суспензорного типа, выполняющих, вероятно, гаусториальную функцию (ш = 3; и = 10).

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Предпосылки появления бесполою размножения у голосеменных растений

У представителей хвойных растений потенциально заложены множественные пути реализации их репродуктивного потенциала: возможность асексуального возникновения зародыша [Третьякова, 1990], наличие простой и кл и важной полиэмбрион и и [Круклис, 1978; Singh, 1978]. Реализация этого репродуктивного потенциала широко проявляется в экспериментальных условиях культуры in vitro.

5.2. Формирование морфогенных каллусов и развитие соматических зародышей и зародышей микроспориального происхождения у лиственницы сибирской

Процессы соматического эмбриогенеза и андроьелинни у лиственницы сибирской в культуре in vitro, так же как и зиготический эмбриогенез включают ряд последовательных стадий. Соматические зародыши в своем развитии проходят стадии нроэмбриогенеза, раннего и позднего эмбриогенеза, заканчивающиеся формированием биполярной структуры зародыша, аналогичного з и готическим зародышам данного вида. Зародыши ми крое пори ал ьного происхождения отличаются

друг от друга по морфологии и этапам формирования. Эмбриоиды, формирующиеся в результате прямой андроклинии, достигают глобулярной стадии, которая соответствует глобулярной стадии зародышей покрытосеменных растений. Появление второго типа эмбриоидов микроспориального происхождения является результатом непрямой андроклинии. Такие эмбриоиды имеют хорошо развитый суспензор и схожи с зиготическими зародышами лиственницы на стадии проэмбриогенеза [Круклис, 1978; Singh, 1978].

5.3. Роль компонентов питательной среды в микроклональном размножении лиственницы сибирской

В процессе соматического и микроспориального эмбриогенеза, особое значение играла концентрация NH4NO3, входящего в состав макроэлементов. Снижение исходной концентрации NH4NO3 с 1690 мг/л до 550 мг/л, или исключение ионов NH4+ из среды способствовало более интенсивному формированию андроклинного каллуса и ЭСМ.

Введение L-глютамина в состав питательной среды являлось необходимым условием формирования эмбриональной массы из зиготических зародышей и сегментов вегетативных побегов, а также морфогенных каллусов микроспориального происхождения у лиственницы сибирской.

Во всех наших экспериментах по микроклональному размножению лиственницы сибирской использовались ауксины (2,4-Д и ИУК), а также их сочетание с цитокининами (6-БАП). Обнаружено, что низкие концентрации смеси ауксина (0,22 мг/л) и цитокинина (0,2-1 мг/л) способствовали повышению частоты формирования ЭСМ и интенсивности ее прироста, а также вызывали непрямую андроклинию при культивировании микростробилов лиственницы сибирской.

5.4. Влияние растения-донора на протекание соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской

Успешность соматического эмбриогенеза и андроклинии связана с донорским растением. Экспланты, с одних деревьев, более активно формируют ЭСМ и соматические зародыши или андроклинный каллус и зародыши микроспориального происхождения, в то время как экспланты других деревьев не способны формировать подобные структуры в культуре in vitro, что согласуется с литературными данными [Klimaszewska, Суг, 2002; Stasolla, Yeung, 2003]. Различия в способности продуцировать ЭСМ и андроклинный каллус между эксплантами с деревьев лиственницы сибирской пораженных и непораженных лиственничной почковой галлицей оказались недостоверны. Разработанная на основе соматического эмбриогенеза и андроклинии методика размножения энтомоустойчивых особей может быть использована для создания чистых линий растений лиственницы сибирской.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Помимо решения фундаментальных задач, исследования в области культуры клеток и тканей растений вносят большой вклад в практику лесного и сельского хозяйства, особенно за рубежом [Klimaszewska, Суг, 2002; Campbell et al., 2003]. Использование современных методов микроклонирования in vitro особенно важно для представителей рода Larix, поскольку, обладая высокими показателями прироста и качества деловой древесины, они, как правило, имеют низкий урожай семян [Owens, Molder, 1979; Park, Fowler, 1987]. В условиях Сибири на рост и семеношение лиственницы сильное влияние оказывают как насекомые-дефолиаторы, так и

насекомые, повреждающие почки и женские шишки на всех стадиях их развития [Исаев и др., 2001]

Проведенные исследования касаются двух важных направлений в биотехнологии микроклонального размножения растений: соматического эмбриогенеза и андроклинии. Соматический эмбриогенез из клеток ювенильных тканей зародышей лиственницы сибирской индуцируется наиболее легко. Этот метод обеспечивает получение свободного от патогенов, генетически однородного посадочного материала. Он также может быть использован для размножения гибридного потомства лиственницы сибирской. Технология соматического эмбриогенеза, в сочетании с криоконсервацией поможет сохранить генофонд хвойных растений. Использование в качестве источника соматических клеток вегетативных побегов лиственницы сибирской приводило к формированию эмбриогенного каллуса, обладающего большим потенциалом роста, что может сложить для получения традиционных продуктов вторичного метаболизма используемых в некоторых областях медицины и промышленности [Кузнецов и др, 2003]. Использование различных частей зрелых растений для микроклонального размножения дает возможность экспресс-оценки наличия у растения необходимых генетических признаков [Bonga, 1977; Bonga, Durzan, 1982; Путенихин, 1993 и др.]. Этот метод особенно привлекателен при работе с древесными организмами, у которых период репродукции наступает сравнительно поздно. Андроклиния -уникальное явление, которое позволяет получать гаплоидные или дигаплоидные растения, абсолютно идентичные исходному, создавать чистые линии растений, и сокращать сроки селекции [Круглова и др., 2006].

ВЫВОДЫ

1. Получена эмбрионально-суспензорная масса (ЭСМ) из зиготических зародышей лиственницы сибирской, которая способна пролиферировать в течение 1-2 лет и продуцировать соматические зародыши.

2. Наиболее активная индукция ЭСМ происходила у зиготических зародышей на предсемядольной стадии развития в области периколюмна зародышевого корешка на среде MSG с гормонами 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л). ЭСМ лиственницы сибирской представлена двумя типами клеток: удлиненными эмбриональными трубками и изодиаметрическими эмбриональными инициалями.

3. Пролиферация ЭСМ и появление соматических зародышей лиственницы сибирской происходит на среде MSG с пониженной в два раза концентрацией цитокинина 6-БАП (0,5 мг/л).

4. Для перехода соматических зародышей к вызреванию необходим их перенос на безгормональную среду MSGm на 1 нед., а затем на 1-2 мес. на среду MSGIV, содержащую АБК и 2,4-Д. Развитие соматических зародышей лиственницы сибирской идет аналогично развитию зиготических зародышей данного вида.

5. Индуцирована ЭСМ из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской, содержащая зародышеподобные структуры, обнаруживающие черты организации ранних зиготических зародышей лиственницы сибирской. Интенсивность формирования ЭСМ зависит от используемого растения-донора, однако не связана с устойчивостью дерева к поражению насекомыми-галлообразователями.

6. Изучено влияние состава питательных сред на индукцию и протекание андроклинии т vitro у лиственницы сибирской. Выявлено, что наиболее

важными компонентами среды, влияющими на данный процесс является концентрация NH4NO3, баланс экзогенных гормонов и содержание L-глютамина в среде. Снижение концентрации NH4NO3 в два раза по отношению к исходной среде MS, а также использование сред Vi MS и К99 благоприятно сказывалось на формировании андроклинного каллуса.

7. Рост андроклиных культур и формирование эмбриоидов наиболее успешно происходили на средах, содержащих ауксины (0,2-1 мг/л) в сочетании с цитокининами (0,1-0,5 мг/л). Гормональный состав сред определял пути морфогенеза: наличие ауксина вызывало эмбриоидогенез, тогда как сочетание ауксина и цитокинина - каллусогенез в культуре in vitro.

8. Андроклинные зародыши формировались путем непосредственного деления морфогенных микроспор или посредством формирования андроклинного каллуса, возникая в нем. Эмбриоиды, полученные путем прямой андроклинии, по морфологическим признакам близки к зародышам покрытосеменных растений, что создает широкий спектр проблем для дальнейших эмбриологических исследований.

9. Проведенные эксперименты по микроклональному размножению лиственницы сибирской показали высокую способность ее диплоидных (соматических) и гаплоидных (микроспора) клеток к дедифференцировке и формированию морфогенных каллусов и эмбриоидов в культуре in vitro.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Третьякова, И.Н. Особенности развития мужских генеративных почек Lara sibirica и способность их к андрогенезу in vitro / И.Н.Третьякова, А.Н. Иванова, Н.Е. Носкова, Л.И. Романова, A.C. Вязовецкова // Материалы V Съезда общества физиологов растений России. - Пенза, 2003. - С. 528-529.

2. Третьякова, И Н. Сибирские виды хвойных в культуре in vitro / И.Н. Третьякова, Н.В. Новоселова, А.Н. Иванова, Н.Е. Носкова, A.C. Вязовецкова // Материалы Всероссийской конференции «Структурно-функциональная организация и динамика лесов». - Красноярск, 2004. - С. 473-474.

3. Иванова, А.Н. Индукция андрогенных культур лиственницы сибирской / А.Н. Иванова, И.Н. Третьякова, A.C. Вязовецкова. // Матер, годичного собрания общества физиологов растений России и Международная научная конференция проблемы физиологии растений севера. - Петрозаводск, 2004. - С. 73.

4. Третьякова, И.Н. Инициация андрогенеза in vitro у сибирских видов хвойных и его цитологические особенности / И.Н. Третьякова, А.Н. Иванова, A.C. Вязовецкова, Н.Е. Носкова. // Материалы ВОГиС III «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - Москва, 2004. - С. 422.

5. Ivanova, A.N. Induction of androgenous cultures of Siberian larch / A.N. Ivanova, I.N. Tretyakova, A.S. Vyazovetskova. // Abstract of IUFRO international symposium «Larix 2004». - Kyoto, 2004. - P. 22.

6. Белоруссова, A.C. Особенности андрогенеза in vitro у деревьев лиственницы сибирской с разной степенью устойчивости к поражению лиственничной почковой галлицей (Dasineura rozhkovi Mam. et Nik.) / A.C. Белоруссова // Энтомологические исследования в Сибири. Вып. 3. Под ред. Е.С. Петренко. - Красноярск, 2004. - С. 104108.

7. Belorussova, A.S. Modern methods of coniferous plant regeneration in culture in vitro: androgenesis in vitro and somatic embryogenesis of Siberian larch / A.S. Belorussova

/<' Proceedings of Young Scientists Conference «Studies on Components of Siberian Forest Ecos\ stem». - Krasnoyarsk, 2005. - P. 63-64.

8. Белоруссова, A.C. Современные методы регенерации хвойных растений в культуре in vitro: андрогенез in vitro и соматический эмбриогенез лиственницы сибирской / А.С. Белоруссова // Тезисы XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», секция «Биология». - Москва, 2005.-С. 29.

9. Белоруссова А.С. Андрогенез in vitro и соматический эмбриогенез у лиственницы сибирской / А.С. Белоруссова // Тезисы конф. молодых ученых КНЦ СО РАН. - Красноярск, 2005. - С. 5-7.

10. Tratyakova, I. Structural and functional changing in generative organs of Siberian coniferous spesies under ecological stress and there biotechnology in culture in vitro / I. Tratyakova, N. Noskova, A. Ivanova, N. Novoselova, A. Vyazovetskova. // Abstracts of XVII International Botanical Congress. - Vienna, 2005. - P. 331.

11. Ivanova, A.N. Androgenesis in vitro of Siberian larch (Larix sibirica Ledeb.) / A.N. Ivanova, A. Vyazovetskova, I. Tratyakova. // Abstracts of XVII International Botanical Congress. - Vienna, 2005. - P. 277.

12. Белоруссова, А.С. Способность зародышей лиственницы сибирской к соматическому эмбриогенезу / Белоруссова А.С. // Тезисы I Международной Школы-конференции для Молодых Ученых «Эмбриология и биотехнология». - СПб., 2005. -С. 32-33.

13. Третьякова, И.Н. Половая репродукция хвойных в Сибири и их биотехнология / Третьякова И.Н., Белоруссова А.С., Иванова А.Н. и др. // Тезисы международной научной конференции «Наука о лесе история, современное состояние и перспективы развития (посвященная 75-летию института НАН Белоруссии)». - Гомель, 2005. - С. 244-246.

14. Иванова, А.Н. Индукция андрогенных культур у лиственницы сибирской / А.Н. Иванова, И.Н. Третьякова, А.С. Вязовецкова // Онтогенез. - 2006. - Т. 37. № 1. -С. 32-42.

16. Belorussova, A. Peculiarities of Siberian larch somatic embryos formation / A. Belorussova // Abstract of XV Congress of the Federation of European Societies in Plant Biology. - Lyon, 2006. - P. 100.

17. Tretyakova, I.N. Induction of Androgenic Cultures of Siberian Larch (Larix sibirica Ledeb.) / I.N. Tretyakova, A.S. Vyazovetskova, A.N. Ivanova // Eurasian J. For. Res. - 2006. - V. 9-1. - P. 37-44.

18. Третьякова, И.Н. Особенности формирования эмбриональных клеток и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro / Третьякова И.Н., Белоруссова А.С., Савельев С.С., Новоселова Н.В., Лукина А.В. // Чтения памяти Л.М. Черепнина: мат. четвертой Российской конф. «Флора и растительность Сибири и дальнего Востока». Красноярск, 2006. - Т.2. - С. 259-263.

19. Третьякова, И.Н. Особенности формирования генеративных органов лиственницы сибирской и их морфогенетический потенциал / Третьякова И.Н., Баранчиков Ю.Н., Буглова Л.В., Белоруссова А.С., Романова Л И. // Успехи современной биологии. - 2006. - Т. 126. № 5. - С. 472-480.

20. Третьякова И.Н. Цитоэмбриологическое исследование эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей у сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И Н. Третьякова, А.С. Белоруссова, С.С.Савельев, А В. Лукина // Современные микроскопические исследования в биологии и медицине Сб. на>чн.-поп. статей. М.: Лабора, 2006. - С. 31-33.

21. Третьякова, И.Н. Биотехнология получения эмбрионально-суспензорной массы и соматических зародышей лиственницы сибирской и сосны сибирской в культуре in vitro / И Н. Третьякова, A.C. Белоруссова, С.С. Савельев, A.B. Лукина, М Е. Ижболдина // Матер. IV Съезда Общества Биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова. - Пущино, 2006. - С. 264-266.

22. Барсукова A.B. Закономерности микроспориального эмбриогенеза (андроклинии) у лиственницы сибирской в зависимости от состава питательных сред / A.B. Барсукова, A.C. Белоруссова // Матер. X Междунар. научн. школы-конф. студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2006. - Т. 1. - С. 10.

23. Шалаев Е.А. Особенности формирования срматических зародышей лиственницы сибирской в культуре in vitro / Е.А Шалаев, A.C. Белоруссова // Матер. X Междунар. научн. школы-конф. студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2006. - Т. 1. - С. 57

УОП ИЛ СО РАН Заказ № 87, тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белоруссова, Алена Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЭМБРИОГЕНЕЗ ХВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ IN VIVO И СОЗДАНИЕ НОВОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА IN VITRO.

1.1. Процессы формирования гаметофита и спорофита хвойных растений in vivo.

1.1.1. Микроспорогенез у хвойных растений.

1.1.2. Зиготический эмбриогенез хвойных растений на примере рода Larix

1.2. Регуляторы роста растений.

1.2.1. Фитогормоны: история открытия, механизмы действия и физиологическая роль.

1.2.2. Действие регуляторов роста в культуре клеток и тканей древесных организмов.

1.3. Микроклональное размножение растений.

1.3.1. Соматический эмбриогенез хвойных растений.

1.3.2. Гаплоидный эмбриогенез покрытосеменных и голосеменных растений

ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВИЙ ПРОИЗРАСТАНИЯ

ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объекты исследования и места их расположения.

2.1.1. Общая характеристика лиственницы сибирской.

2.1.2.Характеристика исследуемых деревьев.

2.1.3 Характеристика условий произрастания объектов исследования.

2.2. Методы микроклонального размножения in vitro.

2.2.1. Материалы исследований.

2.2.2. Стерилизация помещений, посуды иэксплантов.

2.2.3. Получение соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей лиственницы сибирской.

2.2.4. Получение соматического эмбриогенеза из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской.

2.2.5. Получения андроклинных культур лиственницы сибирской in vitro .57 2.3. Получение и обработка данных.

2.3.1. Цитологический анализ эмбриональных процессов.

2.3.2. Морфометрический анализ.

2.3.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ЗИГОТИЧЕСКОГО И СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА У ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ.

3.1. Эмбриогенез лиственницы сибирской in vivo.

3.2. Соматический эмбриогенез из зиготических зародышей лиственницы сибирской.

3.2.1. Влияние стадии развития экспланта на индукцию соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской.

3.2.2. Пролиферация эмбриогенных культур лиственницы сибирской.

3.2.3. Влияние состава питательной среды на формирование ЭСМи соматических зародышей лиственницы сибирской.

3.2.4. Влияние донорного растения на протекание соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской.

3.2.5. Цитоэмбриологическая характеристика протекания соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской.

3.2.6. Созревание соматических зародышей и получение растений-регенерантов.

3.2. Соматический эмбриогенез из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской.

3.3.1. Влияние состава питательных сред на индукцию эмбрионально-суспензорной массы из сегментов вегетативных побегов.

3.3.2. Влияние растения-донора на формирование эмбриональной массы из сегментов вегетативных побегов.

3.3.3. Цитоэмбриологическая характеристика эмбрионалъно-суспензорной массы полученной из сегментов вегетативных побегов.

ГЛАВА 4. АНДРОКЛИННЫЕ КУЛЬТУРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ.

4.1. Влияние стадии развития эксплантов на индукцию андроклинных культур.

4.2. Влияние состава питательных сред и условий культивирования на андроклинныию лиственницы сибирской.

4.3. Влияние растения-донора на формирование андроклинных культур лиственницы сибирской.

4.4. Цитологическая характеристика андроклинии у лиственницы сибирской.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Предпосылки появления бесполого размножения у голосеменных растений.

5.2. Формирование морфогенных каллусов и развитие зародышей лиственницы сибирской de novo.

5.3. Роль компонентов питательной среды в микроклональном размножении лиственницы сибирской.

5.4. Влияние растения-донора на протекание соматического эмбриогенеза и андроклинии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb)"

Актуальность темы диссертации. Высшие растения обладают высоким потенциалом тотипотентности (многовариантности развития) клеток. Фактически, каждая дифференцированная клетка растения, имеющая ядро, способна переходить в эмбриогенное состояние и продуцировать новое растение. Это свойство наиболее ярко проявляется при культивировании клеток и тканей растений в условиях in vitro.

Тотипотентность клеток лежит в основе таких уникальных явлений в биотехнологии микроклонального размножения растений как соматический эмбриогенез и андроклиния, приводящих к возникновению нового растительного организма из соматической или спорогенной клетки в условиях культуры in vitro. Эти феномены открывают большие перспективы в познании процесса клеточной дифференцировки и реализации морфогенетического потенциала растительного организма. Применение подобных инновационных технологий, в сочетании с криоконсервацией и различными селекционными программами, дает возможность для получения, раннего отбора и испытания ценных генотипов, их быстрого распространения, что способствует массовому получению улучшенных высокопродуктивных клонов и чистых линий хвойных растений для клонального лесоводства [Hogberg, et al., 1998; Klimaszewska, Суг, 2002; Campbell et al., 2003].

Исследования по соматическому эмбриогенезу и андроклинии в культуре in vitro проводятся, как правило, на покрытосеменных растениях [Батыгина, 1978; 1994; 1999; Круглова, Горбунова, 1997; Batygina, 2005 и др.]. У хвойных растений семейства Pinaceae изучение соматического эмбриогенеза интенсивно проводится в течение последних двадцати лет за рубежом [Lelu et al., 1994; Klimaszewska, Суг, 2002; Stasolla, Yeung, 2003], однако, несмотря на активные исследования в данной области, регенерация растений путем соматического эмбриогенеза все еще остается проблематичной для ряда видов. Данные по андроклинии у этого семейства растений до сих пор отсутствуют.

Исследования соматического эмбриогенеза у сибирских видов хвойных растений, в том числе и у лиственниц, до сих пор не проводились. Между тем, лиственница сибирская является основным лесообразователем хвойных лесов Сибири. Однако во многих случаях она имеет низкое качество семян и подвержена сильному воздействию биогенных факторов, негативно сказывающихся на росте и семеношении данного вида, и практически полностью исключающих возможность целевого использования его лесосеменных участков [Исаев и др., 2001]. Применение и разработка современных биотехнологий, и особенно, таких как соматический и микроспориальный эмбриогенез, позволит выращивать быстрорастущие, высокопродуктивные, устойчивые к абиотическому и биотическому стрессу особи лиственницы сибирской.

Цели и задачи исследования. Цель работы - выявление эмбриолого-физиологических закономерностей соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (.Larix sibirica Ledeb.), в том числе изучение процессов трансформации соматических и спорогенных клеток данного вида в эмбриональные структуры в контролируемых условиях культуры in vitro.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

- провести цитоэмбриологические исследования зиготического эмбриогенеза у лиственницы сибирской in vivo; разработать технологию получения эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ), способной пролиферировать и продуцировать соматические зародыши и растения-регенеранты из эксплантов лиственницы сибирской различного генетического и онтогенетического происхождения;

- разработать технологию получения андроклинных культур лиственницы сибирской;

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые для лиственницы сибирской различного генетического происхождения были разработаны современные методы микроклонального размножения, такие как соматический эмбриогенез и андроклиния в культуре in vitro. Выявлены основные факторы, влияющие на процессы микроклонального размножения лиственницы сибирской. Изучены сходства и различия эмбриональных процессов данного вида in vivo и в культуре in vitro.

Теоретическая и практическая ценность полученных результатов. Полученные результаты по соматическому эмбриогенезу и андроклинии у лиственницы сибирской вносят вклад в познание клеточной дедифференцировки: способности диплоидных и гаплоидных клеток данного вида переходить в эмбриогенное состояние и формировать растения de novo. Настоящие исследования интересны еще и тем, что данные по микроспориальному эмбриогенезу в культуре in vitro у хвойных растений отсутствуют.

На основании проведенных исследований созданы коллекции эмбриогенных культур, полученных из изолированных зиготических зародышей и микроспор лиственницы сибирской. Разработанные в ходе исследований методы соматического эмбриогенеза могут быть использованы для массового тиражирования ценных генотипов лиственницы сибирской, обладающих повышенным репродуктивным потенциалом, устойчивых к абиотическому и биотическому стрессу, и в частности к поражению лиственничной почковой галлицей.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Пролиферация эмбрионально-суспензорной массы и формирование зародышей de novo в культуре in vitro зависит от растения-донора, стадии развития экспланта и гормонального состава питательной среды.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X Всероссийской студенческой конференции «Экология и проблемы окружающей среды» (Красноярск, 2003г.), на V Съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003г.), на Всероссийской конференции «Структурно-функциональная организация и динамика лесов» (Красноярск, 2004г.), на Всероссийской конференции ВОГиС III «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004г.), на Международном симпозиуме IUFRO «Larix 2004» (Киото, 2004г.), на Конференции молодых ученых «Studies on components of Siberian forest ecosystem» (Красноярск, 2005г.), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва), на Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2005г.), на I Международной школе-конференции для молодых учёных «Эмбриология и биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005г.), на Четвертой российской конференции «Чтения памяти JI.M. Черепнина» (Красноярск, 2006г.), на XV Конгрессе Союза Европейского общества по биологии растений (Лион, 2006г.), на IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006г.), на X Междунар. научной школе-конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2006г.).

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Белоруссова, Алена Сергеевна

выводы

4. Для перехода соматических зародышей к вызреванию необходим их перенос на безгормональную среду MSGm на 1 нед., а затем на 1-2 мес. на среду MSGiv, содержащую АБК и 2,4-Д. Развитие соматических зародышей лиственницы сибирской идет аналогично развитию зиготических зародышей данного вида.

5. Индуцирована ЭСМ из сегментов вегетативных побегов лиственницы сибирской, содержащая зародышеподобные структуры, обнаруживающие черты организации ранних зиготических зародышей лиственницы сибирской. Интенсивность формирования ЭСМ зависит от генотипа растения-донора, однако не связана с устойчивостью дерева к поражению насекомыми-галлообразователями.

6. Изучено влияние состава питательных сред на индукцию и протекание андроклинии in vitro у лиственницы сибирской. Выявлено, что наиболее важными компонентами среды, влияющими на данный процесс, является концентрация NH4N03, баланс экзогенных гормонов и содержание L-глютамина в среде. Снижение концентрации NH4NO3 в два раза по отношению к исходной среде MS, а также использование сред '/г MS и К99 благоприятно сказывалось на формировании андроклинного каллуса.

7. Рост андроклиных культур и формирование эмбриоидов наиболее успешно происходило на средах, содержащих ауксины (0,2-1 мг/л) в сочетании с цитокининами (0,1-0,5 мг/л). Гормональный состав сред определял пути морфогенеза: наличие ауксина вызывало эмбриоидогенез, тогда как сочетание ауксина и цитокинина - каллусогенез в культуре in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возможность изучения биологии клетки, существующей вне организма в искусственных условиях культуры in vitro, обуславливает ведущую роль экспериментов по культуре тканей в фундаментальных исследованиях в области генетики и физиологии, а также молекулярной биологии и цитологии растений. Культура клеток и тканей может также служить моделью при изучении метаболизма и его регуляции у растений. Однако, помимо решения фундаментальных задач, исследования в области культуры клеток и тканей растений вносят большой вклад в практику лесного и сельского хозяйства, особенно за рубежом [Rao, 1993; Timmis, 1998; Klimaszewska, Cyr, 2002; Park, 2002; Campbell et al., 2003].

Использование современных методов микроклонирования in vitro особенно важно для представителей рода Larix, поскольку, обладая высокими показателями прироста и качества деловой древесины, а также устойчивостью к различным абиотическим факторам они редко начинают плодоносить в возрасте до 15-20 лет. Семенные годы у лиственниц наблюдаются раз в 4-5 лет, в остальное время деревья, как правило, имеют низкий урожай семян [Klimaszewska, 1989; Owens, Molder, 1979; Park, Fowler, 1987]. К тому же в условиях Сибири на семеношение лиственницы сильное влияние оказывают насекомые, повреждающие как почки, так и женские шишки на всех стадиях их развития (лиственничная почковая галлица, листовертки и цветочные мухи) [Исаев и др., 2001].

Проведенные нами исследования на примере лиственницы сибирской касаются двух важных направлений в биотехнологии микроклонального размножения растений: соматического эмбриогенеза, дающего возможность получения эмбриоидов из соматических клеток ювинильной ткани зиготического зародыша и клеток зрелого растения (вегетативных побегов); и андроклинии, способствующей получению эмбриоидов из гаплоидных клеток (микроспор). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки.

Так, индукция развития эмбриоида из соматических клеток ювенильных тканей зародышей лиственницы сибирской индуцируется наиболее легко, и может способствовать массовому тиражированию особей данного вида. Этот метод обеспечивает получение свободного от патогенов, генетически однородного посадочного материала. Однако его использование необходимо сочетать с контролируемым опылением, для получения потомства с ожидаемыми генетическими свойствами. Метод соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей может быть использован и для размножения гибридного потомства лиственницы сибирской. Технология соматического эмбриогенеза, в сочетании с криоконсервацией (сохранением эмбриогенных культур или соматических зародышей в жидком азоте) поможет сохранить генофонд растений, поскольку длительное хранение семян приводит к падению их всхожести.

Использование в качестве источника соматических клеток вегетативных побегов зрелых деревьев лиственницы сибирской приводило к формированию эмбриогенного каллуса, обладающего огромным потенциалом роста. Использование этого свойства может служить для получения традиционных продуктов вторичного метаболизма (полисахаридов, фенолов, ароматических соединений, терпенов, порфиринов и восков, дигидрокверцетина) используемых в некоторых областях медицины и промышленности [Кузнецов и др., 2003]. Необходимо отметить, что использование различных частей зрелых растений для микроклонального размножения уже давно привлекает исследователей, поскольку дает возможность экспресс-оценки наличия у растения необходимых генетических признаков [Bonga 1977; Bonga, Durzan, 1982, 1987; Westcott, 1992; Путенихин, 1993; Bonga, 2004 и др.]. Этот метод особенно привлекателен при работе с древесными организмами, у которых период репродукции наступает сравнительно поздно. Микроклональное размножение зрелых деревьев затруднено снижением способности их клеток к дедифференцировке в культуре in vitro.

Андроклиния - уникальное явление, которое позволяет получать гаплоидные или дигаплоидные растения, абсолютно идентичные исходному генотипу, и формировать чистые линии растений. Отмечается, что в настоящее время метод культуры in vitro незрелых пыльников является единственным способом закрепления гетерозисного эффекта у гибридов первого поколения. Использование этого метода у покрытосеменных растений позволяет получать гомозиготные константные линии гибридов за сравнительно короткое время, что сокращает сроки селекции [Nitzche, Wenzel, 1977; Круглова и др., 2006]. Гаплоидные растения могут способствовать селекции высокопродуктивных, устойчивых к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам внешней среды линий растений [Chen, 1987]. Можно ожидать, что дигаплоидные растения лиственницы сибирской окажутся конкурентоспособными [Pattanavibool et al. 1995; Baldursson, Ahuja, 1996 a, b; Von Aderkas et al., 2003].

Кроме того, разработанные методы микроклонального размножения создают базу для проведения экспериментальных работ по генной трансформации растений, например, с целью повышения их устойчивости к абиотическим и биотическим факторам среды [Klimaszewska et al., 1997]. И хотя, в настоящее время трансгенные растения среди представителей голосеменных еще достаточно редки [Ellis et al., 1993; Lelu, Pilate, 2004; Walter, Grace, 2004; Clapham et al., 2004], можно предположить, что это направление будет активно развиваться. Генная модификация древесных растений (например, введение генома Cry-белков Bacillus thuringiensis) может привести к возникновению сверхустойчивых к этомовредителям особей, появление которых в лесных сообществах по воздействию на аборигенные геномы может приравниваться к экологической катастрофе [Гниненко, 2006]. В подобном случае необходимо будет препятствовать естественному размножению трансгенных растений, например, выводить их стерильные клоны. Тогда единственным средством для их размножения будет использование культуры клеток и тканей in vitro.

Таким образом, соматический эмбриогенез и андроклиния могут быть востребованными в современных рыночных условиях. В результате наших исследований предлагаются методики, способствующие массовому тиражированию ценных генотипов хвойных растений, и, в частности, лиственницы сибирской.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белоруссова, Алена Сергеевна, Красноярск

1. Банникова, В. П. Основы эмбриогенеза злаков / В. П. Банникова, О. А. Хведынич, Е. А. Кравец и др. Киев: Наукова думка, 1991. - 176 с.

2. Баранчиков, Ю. Н. Этапы морфогенеза вегетативных почек лиственницы сибирской и его модификация насекомыми-галлообразователями / Ю. Н. Баранчиков // Ботанические исследования в Сибири. Красноярск, 1995. -Вып. 4.-С. 12-18.

3. Баранчиков, Ю. Н. Насекомые-галлообразователи / Ю.Н. Баранчиков // Популяционная динамика лесных насекомых. М.: Наука, 2001. - С. 172-181.

4. Баранчиков, Ю.Н. Природа устойчивости лиственниц к воздействию личинок галлицы Dasineura rozhkovi Mam. et Nik. (Díptera, Cecidomyiidae) / Ю.Н. Баранчиков // Экология. 2006. - Вып. 4. - С. 318-320.

5. Баранчиков, Ю. Н. Рост почек и устойчивость лиственниц к поражению галлицей / Ю. Н. Баранчиков, В. С. Малютина // Лесоведение. 1987. - № 3. -С. 39-45.

6. Батыгина, Т. Б. Хлебное зерно / Т. Б. Батыгина. Л.: Наука, 1987. - 103с.

7. Батыгина, Т.Б. Пыльник как модель изучения морфогенетических потенций и путей морфогенеза / Т.Б. Батыгина // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 1. Генеративные органы цветка. СПб.: Мир и семья, 1994.-С. 120-121.

8. Батыгина, Т. Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей / Т. Б. Батыгина // Физиология растений. 1999. - Т. 46. № 6. - С. 884-898.

9. Батыгина, Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro (эмбриоидогенез у покрытосеменных) / Т.Б. Батыгина, В.Е. Васильева, Т.Б. Маметьева // Ботан. журн. 1978. - Т. 63. № 1.-С. 87-111.

10. Батыгина, Т. Б. Культура изолированных пыльников злаков с позиции эксперементальной эмбриологии растений (методологические аспекты). / Т. Б. Батыгина, Н. Н. Круглова, В. Ю. Горбунова. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. -332 с.

11. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 146 с.

12. Горбунова, В. Ю. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. - 20 с.

13. Горбунова, В. Ю. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова, Т. Б. Батыгина//Успехи соврем, биологии. 1993.-Т. 113.-№ 1.-С. 19-35.

14. Горбунова, В. Ю. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты / В. Ю. Горбунова, Н. Н. Круглова, Н. Н. Потапова. Ч. I. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. - 63 с.

15. Жизнь растений: в 6-ти т. Т.4. / М.: Просвещение, 1978. 447 с.

16. Ирошников, А. И. Лиственницы России. Биоразнообразие и селекция / А. И. Ирошников. -М.: ВНИИЛМ, 2004. 182 с.

17. Исаев, A.C. Биология и экология лиственничной почковой галлицы в лесах Средней Сибири / A.C. Исаев, В.И. Никольский, P.M. Матренина // Лесная энтомология (Труды ВЭО). Л.: Наука, 1983. - Т. 24. - С. 108-122.

18. Исаев, A.C. Поггуляционная динамика лесных насекомых / A.C. Исаев, Р.Г. Хлебопрос, JT.B. Недорезов и др. М.: Наука, 2001.- 374 с.

19. Козубов Г.М. Биология плодоношения хвойных на Севере / Козубов Г.М. -Л.: Наука, 1974.- 136 с.

20. Коропачинский, И. Ю. Интрогрессивная гибридизация лиственниц сибирской и даурской в южной части их ареалов / И. Ю. Коропачинский, Л. И. Милютин // Селекция древесных пород в Восточной Сибири. М.: Наука, 1964.-С. 20-31.

21. Круглова, Н. Н. Андроклиния с позиции экспериментальной эмбриологии растений: унификация терминологии / Н. Н. Круглова // Вестник Башкирского Университета. 2001. - № 2 (I). - С. 135-137.

22. Круглова, Н. Н. Каллусогенез как путь морфогенеза в культуре пыльников злаков / Н. Н. Куглова, В. Ю. Горбунова // Успехи современной биологии. 1997. - Вып. 1. Т .117. - С. 83-94.

23. Круглова, Н. Н. Андроклинный каллус пшеницы в динамике развития: цитолого-гистологический анализ / Н. Н. Круглова, Э. М. Зайнутдинова // Вестник Башкирского Университета. 2001. - № 2 (I). - С. 137-140.

24. Круглова, Н. Н. Стрессовая индукция андроклинии / Н. Н. Круглова, П.А. Куксо // Успехи современной биологии. 2006. - Т. 126. № 3. - С. 256272.

25. Круклис, М.В. Мейоз у лиственницы Чекановского (Larix czekanowsckii Sz.) / M.B. Круклис // Матер. V Всесоюз. совещания по эмбриологии растений. Кишинев, 1971. С. 91-93.

26. Круклис, M.B. Развитие репродуктивных структур Larix Mill. / M.B. Круклис // Половая репродукция хвойных. Новосибирск: Наука, 1973. С. 70-81.

27. Круклис, М. В. Заложение женских стробилов и макроспорогенез у лиственниц в Сибири / М. В. Круклис // Селекция хвойных пород Сибири. Красноярск, 1978. С. 22-34.

28. Круклис, М. В. Лиственница Чекановского / М. В. Круклис, Л. И. Милютин.-М.: Наука, 1977.-211с.

29. Кулаева, О. Н. Восприятие и преобразование гормонального сигнала у растений / О. Н. Кулаева // Физиология растений. 1995. - Т. 42. - С. 661-671. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1973.343 с.

30. Матренина, Р. М. Роль индольных соединений в патологическом новообразовании у лиственницы сибирской под влиянием почковой галлицы / Р. М. Матренина // Консортивные связи дерева и дендрофильных насекомых. Новоибирск: Наука, 1982. С. 27-31.

31. Медведев, С. С. Физиология растений / С. С. Медведев // Изд-во Санкт-Петербургского университета. 2004. - 336 с.

32. Милютин, JI. И. Биоразнообразие лиственниц России / Л. И. Милютин // Хвойные бореальной зоны. Вып.1. СибГТУ. 2003. - С. 6-9.

33. Милютин, Л.И. Естественная гибридизация лиственниц сибирской и даурской на территории МНР / Л.И. Милютин // Тез. докл. Междунар. конф. «Природные условия и биологические ресурсы Монгольской Народной Республики. -М.: Наука, 1986. С. 93-94.

34. Минина, Е. Г. Морфогенез и проявление пола у хвойных / Е. Г. Минина, Н. А. Ларионова. М.: Наука, 1979. - 216 с.

35. Минина, Е.Г. Геотропизм и пол у хвойных / Е.Г. Минина, И.Н. Третьякова. Новосибирск: СО АН СССР, 1983.- 199 с.

36. Молчанов, A.A. Методика изучения прироста древесных растений / A.A. Молчанов, В.В. Смирнов. М.: Наука, 1967. - 100 с.

37. Никольский, В. И. Влияние лиственничной почковой галлицы на плодоношение лиственницы / В. И. Никольский // Изв. СО АН СССР, Сер. биол. наук. 1977. - № 15 (3). - С. 49-51.

38. Носкова, Н. Е. Особенности генеративных процессов у сибирских видов хвойных в связи с климатическими изменениями / Н. Е. Носкова, JI. И. Романова, И. Н. Третьякова // Вестник ТГУ. 2004. - № 10. Приложение. -С. 78-81.

39. Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений / 3. П. Паушева. М.: Колос, 1980.-340 с.

40. Полевой, В. В. Фитогормоны / В. В. Полевой. JI.: Изд-во Ленинградского Университета, 1982. - 356 с.

41. Прозин, М. Н. Ботаническая микротехника / М. Н. Прозин. М.: Высшая школа, 1960. - 206 с.

42. Путенихин, В.П. Культура тканей лиственницы Сукачева / В.П. Путенихин, М.П. Аверкина, П.Д. Андрианов, И.В. Пряхина // Генетика, селекция и биотехнология лесных древесных и травянистых растений. Уфа, 1993.-С. 77-85.

43. Рокицкий, П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф. Рокицкий. Минск: Высшая школа, 1993. - 320 с.

44. Романова, Л. И. Особенности микроспорогенеза у лиственницы сибирской, растущей в условиях техногенной нагрузки / Л. И. Романова, И. Н. Третьякова // Онтогенез. 2005. - Т. 36, № 2. - С. 128-133.

45. Скрипаченко, В. В. Выращивание in vitro проростков сосны / В. В. Скрипаченко // Физиология растений. 1982. - Т. 29. №1. - С. 205-211.142

46. Скрипаченко, Г. А. Использование методов геносистематики для исследования лиственницы Сибири: Автореф. дис. . канд. биологич. наук. / Г. А. Скрипаченко. Красноярск, 1985. - 21 с.

47. Сукачев, В. Н. Дендрология / В. Н. Сукачев. Л.: Гослестехиздат., 1938. -610с.

48. Тренин, В. В. Цитоэмбриология лиственницы / В. В. Тренин. Л.: Наука. - 1986.-88 с.

49. Третьякова, И. Н. Эмбриология хвойных: физиологические аспекты. / И. Н. Третьякова. Новосибирск: Наука, 1990. - 157 с.

50. Уоринг, Ф. Рост растений и дифференцировка / Ф. Уоринг, И. Филипс. -М.: Мир, 1984.-343 с.

51. Хохлов, С. С. Эволюционно-генетические проблемы апомиксиса у покрытосеменных растений / С. С. Хохлов // Апомиксис и селекция. М.: Наука, 1970.-С. 7-21.

52. Чайлахян, М. X. Регуляция цветения высших растений / М. X. Чайлахян. -М: Наука, 1988.-230 с.

53. Шмидт, В.М. Математические методы в ботанике / В.М. Шмидт. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1984. - 288 с.

54. Altaian, A. Promotion of callus formation by acetic acid in citrus bud cultures / A. Altman, R. Goren // Plant physiology. 1971. - V. 20. - P. 139-169.

55. Amerson, H. Improved rooting of western white pine tissue culture produced shoots / H. Amerson, R. Mott // For. Sci. 1982. - V. 28. - P. 822-825.

56. Ammirato, P. The regulation of somatic embryo development in plant cell cultures: suspension culture techniques and hormone requirements / P. Ammirato // Biotechnology. 1983. - V. 3. - P. 68-74.

57. Attree, S. M. Embryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology of conifers / S. M. Attree, L. C. Fowke // Plant Cell Tiss. Org. Cult. -1993.-V. 35.-P. 1-35.

58. Baldurssoii, S. Cytogenetics and potential of haploidy in forest tree genetics / S. Baldursson, M. Ahuja // In vitro haploid production in higher plants. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1996 a. -V. 1. P. 49-66.

59. Baldursson, S. Haploidy in forest trees / S. Baldursson, M. Ahuja // In vitro haploid production in higher plants. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht/Boston/London, 1996 b. V . 3. - P. 297-336.

60. Barrett, J. D. The effectiveness of various nitrogen sources in white spruce (Picea glauca Moench Voss) somatic embryogenesis / J. D. Barrett, Y. S. Park, J. M.Bonga//Plant Cell Rep. -1997.-V. 16.-P. 411-415.

61. Batygina, T.B. Sexual and asexual growths in reproductive systems of flowering plants / T.B. Batygina // Acta Biol. Cracow. Ser. Botanica. 2005. - V. 47. № 1. - P. 51-60.

62. Becwar, M. R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda) / M. R. Becwar, R. Nagmani, S. R. Wann // Can. J. For. Res. 1990. - V. 20. - P. 810-817.

63. Becwar, M. R. Development and characterization of in vitro embryogenic systems in conifers / M. R. Becwar, S. R. Wann, M. A. Johnson et al. // Somatic Cell Genetics of Woody Plants. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1988. - P. 118.

64. Berleth, T. Embryogenesis: pattern formation from a single cell / T. Berleth, S. Chatfield // The Arabidopsis Book. Amer. Society of Plant Biol. 2002. - P. 2-27.

65. Bicknell, R. A. Understanding Apomixis: Recent Advances and Remaining Conundrums / R. A. Bicknell, A. M. Koltunow // The Plant Cell. 2004. - V. 16. -P. 228-245.

66. Bonga, J.M. Organogenesis in vitro cultures of embryogenic shoots of Abies balsamea (balsam fir) / J.M. Bonga // In vitro. 1977. - V. 13. - P. 41-48.

67. Bonga, J.M. The effect of various culture media on the formation of embryolike structures in cultures derived from explants taken from mature Larix decidua / Bonga, J.M. // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2004. - V. 77. P. 43-48.

68. Bonga, J. The huge / J. Bonga, D. Durzan // Tissue culture in forestry. 1982. -P. 1-420.

69. Bonga, J. M. Cell and tissue culture in forestry / J. M. Bonga, D. J. Durzan. -Dordrecht: Martinus Nijhoff Publishers, 1987. 422 p.

70. Bonga, J. W. Growth and differentiation in gametophytes of Pinus resinosa cultured in vitro / J. W. Bonga, D. P. Fowler // Can. J. Bot. 1970. - V. 48. № 12. -P. 2205-2207.

71. Bonga, J. W. Stimulation of callus development from immature pollen of Pinus resinosa by centrifugation / J. W. Bonga, A. H. Molnnis // Plant Sci. Lett. -1975.-V. 4. № 3. P. 199-203.

72. Bourgin, J.-P. Production of haploid Nicotiana from excised stamens / J.-P. Bourgin, J.-P. Nitsch // Ann. Physiol. Veg. 1967. - V. 9 (4). - P. 377-382.

73. Campbell, M. M. Forestry's fertile recent: the application of biotechnology to forest trees / M. M. Campbell, A. M. Brunner, H. M. Jones, S. H. Strauss // Plant Biotechnology Journal.-2003.-V. 1.-P. 141-154.

74. Campbel, R. Vegetative propagation of Picea glauca by tissue culture / R. Campbel, D. Durzan // Can. J. For. Res. 1976. - V. 6. - P. 240-243.

75. Chalupa, W. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured immature and mature embryos of Picea abies (L.) / W. Chalupa // Karst. Communi. Inst. For. Cech. 1985. - V. 14. - P. 57-63.

76. Cheliak, W. M. Genetic variation in somatic embryogenic response in open-pollinated families of black spruce / W. M. Cheliak, K. Klimazsewska // Theor. Appl. Genet. 1991,-V. 82.-P. 185-190.

77. Chen, Z. Induction of androgenesis in hardwood trees / Z. Chen // Cell and tissue culture in forest trees. Martinus-Nijhoff Publishers. Dordrecht, 1987. - V. 2. -P. 247-268.

78. Clapham, D. Transformation of Picea species / D. Clapham, R.J. Newton, S. Sen, S. Von Arnold // In: Molecular Biology and Woody Plants (Forestry Science). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 2004. - P. 105-118.

79. Crouch, M.L. Non-zygotic embryos of Brassica napus L. contain embryo-specific storage proteins / M.L. Crouch // Planta. 1982. - V. 156. - P. 520-524.

80. Deutsch, F. Stable haploid poplar callus lines from immature pollen culture / F. Deutsch, J. Kumlehn, B. Zeigenhagen, M. Fladung // Physiologia plantarum. 2004. -V. 120.-P. 613-622.

81. Dogra, P. D. Observation on Abies pindrow with a discussion on the question of occurrence of apomixes in Gymnosperm / P. D. Dogra // Silvae genet. 1966. - V. 15. № l.-P. 11-20.

82. Dronne, S. Desiccation decreases abscisic acid content in hybrid larch (Larix x leptoeuropeae) somatic embryos / S. Dronne, P. Label, M.-A. Lelu I I Physiol. Plant. -1997.-V. 199.-P. 469-476.

83. Durzan, D.J. Progress and promise in forest genetics / D.J. Durzan // In: Paper Science and Technology: The Cutting Edge, 50th Anniversary. Appleton: The Institute of Paper Chemistry, 1980. P. 31-60.

84. Durzan, D. J. Growth and metabolism of cells and tissue of jack pine (Pinus banksiana). III. Growth of cells in liquid suspension cultures in light and darkness / D.J. Durzan, V. Chalupa // Can. J. Bot. 1976. - V. 54. - P. 456-467.

85. Durzan, D. J. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in Douglas-fir cell suspension cultures / D. J. Durzan, P. K. Gupta // Plant Science. 1987. - V. 52. P. 229-235.

86. Ekberg, I. Meiosis and pollen formation in Larix II I. Ekberg, G. Eriksson, Z. Sulikova // Ibid. 1968. - V. 59. -№ 2/3. - P. 427-138.

87. Ellis, D.D. Stable transformation of Picea glauca by particle acceleration / D.D. Ellis, D.E. McCabe, S. Mclnnis, et al. // Bio-Technology. 1993. - V. 11. - P. 84-89.

88. Eriksson, G. Temperature response of pollen mother cells Larix, and its importance for pollen formation / G. Eriksson // Studia Forest. Suecica. 1968. - V . 63.-P. 171.

89. Eriksson, G. Meiosis investigation pollen mother cell of Norwayspruce cultivated in a plast greenhouse / G. Eriksson, I. Ekberg, A. Jonsson // Hereditas. -1970.-V. 66.-№ l.-P. 1-20.

90. Feirer, R. P. The biochemistry of conifer embryo development: amino acids, polyamines and storage proteins / R. P. Feirer // Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 1995. - V. 1. - P. 317-336.

91. Filonova, L. H. Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking / L. H. Filonova, P. V. Bozhkov, S. Von Arnold // J. Exp. Bot. 2000a. - V. 51. - P. 249-264.

92. Filonova, L. H. Two waves of programmed cell death occur during formation and development of somatic embryos in the gymnosperm, Norway spruce / L. H. Filonova, P. V. Bozhkov, V. B. Brukhin et al. // J. Cell Sci. 2000b. - V. 113. - P. 4399-4411.

93. Gane, R. Production of ethylene by some ripening fruits / R. Gane // Nature. -1934.-V. 134.-P. 1008.

94. Gorbatenko, O. Desiccation-tolerant somatic spruce somatic embryos of Norway spruce (Picea abies) can be produced in liquid cultures and regenerated into plantlets / O. Gorbatenko, I. Hakman // Int. J. Plant Sci. 2001. - V. 162. - P. 12111218.

95. Grove, M. D. Brassionlide, a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen / M. D. Grove, G. F. Spencer, W. K. Rohwedder, N. B. Mandava, J.F. Worley // Nature. 1979. - V. 281. - P. 216-217.

96. Gupta, P. K. Somatic embryogenesis in conifers / P. K. Gupta, J. A. Grob // Somatic Embryogenesis in Woody Plants. 1995. - V. 1. - P. 81 -98.

97. Gupta, P. K. Method for Reproducing Coniferous Plants by Somatic Embryogenesis / P.K. Gupta, G.S. Pullman // U.S. Patent No. 4,957,866. 1990. - 201. P

98. Gupta, P. K. Conifer embryo production from liquid medium / P. K. Gupta, R. Timmis // Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21 st Century. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999. P. 49-52.

99. Gutmann, M. Effects of abscisic acid on somatic embryo maturation of hybrid larch / M. Gutmann, P. Von Aderkas, P. Label, M. Lelu // J. Exp. Bot. 1996. - V. 47.-P. 1905-1917.

100. Hakman, I. The development of somatic embryos in tissue cultures initiated from immature embryos of Picea abies (Norway spruce) /1. Hakman, L. C. Fowke, S. Von Arnold, T. Eriksson // Plant Sci. 1985. - V. 38. - P. 53-59.

101. Hakman, I. Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of Picea glauca (white spruce) /1. Hakman, S. Von Arnold // Physiol. Plant. 1988.-V. 72. - P. 579-587.

102. Hakman, I. Storage protein accumulation during zygotic and somatic embryo development in Picea abies (Norway spruce) / I. Hakman, P. Stabel, P. Engstrom, T. Eriksson // Physiol. Plant. 1990. - V. 80. - P. 441-445.

103. Harry, I.S. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from mature zygotic embryos of red spruce /1. S. Harry, T. A. Thorpe // Bot. Gaz. 1991. - V. 152.-P. 446-452.

104. Hay, E. I. Somatic embryo germination and desiccation tolerance in conifers / E. I. Hay, P. J. Charest // Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1999. - V. - 4. - P. 61-69.

105. Ho, R. H. Microstrobilate Morphology, Microsporogenesis, and Pollen Formation in Western Hemlock / R. H. Ho, J. N. Owens // Can. J. For. Res. Rev. can. rech. for. 1974. № 4. - V. 4. - P. 509-517.

106. Ho, R. H. Haploid plant production through anther culture in poplars / R. H. Ho, Y. Raj//For. Ecol. Manag. 1985. - V. 13.-P. 133-142.

107. Jahne, A. Cereal microspore culture. / A. Jahne, H. Lorz // Plant sci. 1995. -V. 109.-P. 1-12.

108. Jain, S. M. Somatic embryogenesis in slash pine {Pinus elliottii) from immature embryos cultured in vitro / S. M. Jain, N. Dong, R. J. Newton // Plant Sci. -1989.-V. 65.-P. 233-241.

109. Jalonen, P. Characterization of embryogenic cell lines of Picea abies in relation to their competence for maturation / P. Jalonen, S. Von Arnold // Plant Cell Rep. 1991. - V. 10. - P. 384-387.

110. Jansson, E. Morphogenesis in dormant embryonic shoots of Picea abies: Influence of the crown and cold treatment / E. Jansson, Ch. Bornman 11 Pisiol. Plant. 1983.-V. 59.-P. 1-8.

111. Joharisen, D. A. Plant Embryology / D. A. Johansen // Embryogeny of the Spermatophyta. Waltham: Cronica Botanica Company, 1950. - P. 35-42.

112. Kartha, K. K. Induction of somatic embryos and plantlets from cryopreserved cell cultures of white spruce {Picea glaucd) / K. K. Kartha, L. C. Fowke, N. L. Leung, K. L. Caswell, I. Hakman 11 J. Plant Physiol. 1988. - V. 132. - P. 529-539.

113. Keller, W. A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campestris / W. A. Keller, T. Rajhathy, J. Lacapra // Can. J. Genet. Cytol. 1975. - V. 17. - P. 655-666.

114. Kermode, A. R. Regulatory mechanisms involved in the transition from seed development to germination / A. R. Kermode // CRC Crit. Rev. Plant Sci. 1990. -V. 9.-P. 155-195.

115. Khlifi, S. Maturation of black spruce somatic embryos. Part I. Effect of L-glutamine on the number and germinability of somatic embryos / S. Khlifi, F. M. Tremblay // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1995. - V. 41. - P. 23-32.

116. Klimaszewska, K. Plant development from immature zygotic embryos of hybrid larch through somatic embryogenesis / K. Klimaszewska // Plant Sci. 1989. -V. 63.-P. 95-103.

117. Klimaszewska, K. Conifer somatic embryogenesis: I. Development / K. Klimaszewska, D. R. Cyr // Dendrobiology. 2002. - V. 48. - P. 31 -39.

118. Klimaszewska, K. Larix laricina (tamarack): somatic embryogenesis and genetic transformation / K. Klimaszewska, Y. Devantier, D. Lachance, M.-A. Lelu, P. J. Charest // Can J. For. Res. 1997. - V. 27. - P. 538-555.

119. Klimaszewska, K. Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by a high concentration of gellan gum / K. Klimaszewska, D. R. Smith // Physiol. Plant. 1997. - V. 100. - P. 949-957.

120. Kong, L. Changes in endogenous hormone levels in developing seeds, zygotic embryos, and megagametophyte in Picea glauca (Moench) Voss. / L. Kong, S. M. Attree, L. C. Fowke//Physiol. Plant. 1997. - V. 101. -P. 23-30.

121. Mac Millan, J. The occurrence of gibberellin A1 in higher plants: isolation from the seed of runner bean (Phaseolus multiflorus) / J. MacMillan, P. J. Suter // Naturwissenschaften. 1958. - P. 45-46.

122. Malabadi, R. B. Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula / R. B. Malabadi, J.Van Staden // Tree Physiology.2005.-V. 25.-P. 11-16.

123. Mehra, P. N. Embryogeny of Pinaceae I. Proembryogeny / P. N. Mehra, P.D. Dorga // Proc. Indian. Nat. Sci. Acad. 1975. - V. 41. № 5. - P. 486-497.

124. Minocha, C. H. Plant growth regulators and morphogenesis in cell and tissue culture of forest trees / C. H. Minocha // Tissue culture in forestry. 1987. - P. 5066.

125. Misra, S. Conifer zygotic embryogenesis, somatic embryogenesis, and seed germination: biochemical and molecular advances / S. Misra // Seed Sci. Res. 1994. -V. 4.-P. 357-384.

126. Mott, R. Role of tissue culture in loblolly pine improvement / R. Mott, H. Amerson // Proc. Int. Symp. Recent Adv. For. Biotechnol. 1984. - P. 24-36.

127. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - №4. - P. 473-497.

128. Nagmani, R. Single cell origin and development of somatic embryos of Picea abies (L.) Karst. (Norway spruce) and P. glauca (Moench) Voss (white spruce) / R. Nagmani, M. R. Becwar, S. R. Wann // Plant Cell Rep. 1987. - V. 6. - P. 157159.

129. Nagmani, R. Embryogenesis in subcultured callus of Larix decidua / R. Nagmani, J. M. Bonga//Can. J. For. Res. 1985. - V. 15.-P. 1088-1091.

130. Nitsch, J. P. Haploid plants from pollen grains / J. P. Nitsch, C. Nitsch // Science. 1969. - V. 163. - P. 85-87.

131. Nitsch, C. Effet d'un choc thermique sur le pouvoir embryogène du pollen de Datura innoxia cultivé dans l'anthère ou isolé de l'anthère / C. Nitsch, B. Norreel // C. R. Acad. Sci. 1973. - V. 276-D. - P. 303-306.

132. Nitzche, W. Haploids in plant breeding / W. Nitzche, G.Wenzel. Berlin: Verlag Paul Parey, 1977. - 101 p.

133. Norstog, K. Experimental embryology in gymnosperms / K. Norstog // Experimental Embryology in Vascular Plants. Springer-Verlag. Berlin, 1982. - P. 25-51.

134. Orr-Ewing, A. L. Possible occurrence of viable unfertilized seeds in Douglas-fir / A. L. Orr-Ewing // Forest sci. 1957. - V. 3. № 3. - P. 243-248.

135. Owens, J. N. Bud development in Larix occidentalis. II. Cone differentiation and early development / J. N. Owens M. Molder // Canadian Journal of Botany. -1979.-V. 57.-P. 1557-1572.

136. Park, Y-S. Implementation in conifers somatic embryogenesis in clonal forestry: technical requirement and development considerations / Park Y-S. // Ann. For. Sci. 2002. - V. 59. - P. 651-656.

137. Park, Y.S. Genetic variances among clonally propagated populations of tamarack and the implications for clonal forestry / Y.S. Park, D.P. Fowler // Can. J. of For. Res. 1987. - V. 17. - P. 1175-1180.

138. Pattanavibool, R. Diploidization in megagametophyte-derived cultures of the gymnosperm Larix decidua / R. Pattanavibool, P. Von Aderkas, A. Hanhijarvi, L.K. Simola, J.M. Bonga // Theor. Appl. Genet. 1995. - V. 90. - P. 671 -674.

139. Plant cell, tissue and organ culture: fundamental methods / Eds. O.L. Gamborg, G.C. Phillips. Berlin: Springer-Velag, 1995. - 358 p.

140. Raghavan, V. Origin and development of pollen embryoids and pollen calluses in cultured anther segments of Hyoscyamus niger (henbane) / V. Raghavan // Amer. J. Bot. 1978. - V. 65 (9). - P. 984-1002.

141. Raghavan, V. Embryogenesis in Angiosperms / Raghavan V. // Cambridge University Press, U.K. ISBN 0-521-26771-4. 1986. P. 56-62.

142. Rao, A. N. Recent researches on propagation of tropical forest trees / A. N. Rao // Proc. Inter. Workshop BIO-REFOR, Yogyakarta. 1993. - P. 21-30.

143. Reynolds, T.L. Pollen embryogenesis / Reynolds T.L. // Plant molecular Biology. 1997. - V. 33. - P. 1 -10.

144. Reinert, J. Untersuchungen iiber die Morphogenese an Gewebenkulturen / J. Reinert // Ber. Dtsch. Bot. Ges. 1958. - V. 71. - P. 15.

145. Ruaud, J. N. First evidence of somatic embryogenesis from needles of 1-year-old Picea abies / J. N. Ruaud, J. Bercetche, M. Paques // Plant Cell Rep. 1992. - V. 11.-P. 563-566.

146. Romani, R.J. Cell suspension cultures for the study of plant senescence / R.J Romani // In: J.M. Bonga and D.J. Durzan (eds.). Cell and tissue culture in forestry. Vol. 2. Dordrecht: Martinus Nijhoff, 1987. - P. 390-404.

147. Saxton, W.T. Partenogenesis in Pinus pinaster / W. T. Saxton // Bot. Gaz. -1909.-V. 47.-P. 406-409.

148. Schmidt, D.L. Signal molecules involved in plant embryogenesis / D.L. Schmidt, A.J. de Jong, S.C. de Vries // Plant Mol. Biol. 1994 . - V. 26. - P. 13051313.

149. Schopf, J. M. The embryology of Larix / J.M. Schopf // Illinois Biol. Monogr. 1943.-V.19.-P. 1-97.

150. Simola, L. K. Improvement of nutrient medium for growth and embryogenesis of megagametophyte and embryo callus lines of Picea abies / L. K. Simola, A. Santanen 11 Physiol. Plant. 1990. - V. 80. - P. 27-35.

151. Singh, H. Embryology of gymnosperms / H. Singh. Berlin-Stuttgart: Gebrüder Borntraeger, 1978. - P. 187-241.

152. Smertenko, A. P. Re-organization of the cytoskeleton during developmental programmed cell death in Picea abies embryos / A. P. Smertenko, P. V. Bozhkov, L. H. Filonova, S. Von Arnold, P. Hussey // Plant J. 2003. - V. 33. - P. 813-824.

153. Stasolla, C. Maturation of somatic embryos in conifers: morphogenesis, physiology, biochemistry and molecular biology / C. Stasolla, L. Kong, E. C. Yeung, T. A. Thorpe // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 2002. - V. 38. - P. 93-105.

154. Stasolla, C. The effects of polyethylene glycol (PEG) on gene expression of developing white spruce somatic embryos / C. Stasolla, L. Van Zyl, U. Egertsdotter, D. Craig, W. Liu, R. Sederoff// Plant Physiol. 2003. - V. 131. - P. 49-60.

155. Stasolla, C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo quality / C. Stasolla, E. C. Yeung // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. -2003.-V. 74.-P. 15-35.

156. Statistica for windows Computer program manual. Tulsa, OK: StatSoft, Jnc., 1999.

157. Stattler, R.F. Experimental induction of haploid parthenogenesis in forest trees / R, F. Stattler, K, S. Bawa, G. K. Livingston // Induced maturations of plants. Intern. Atomic Energy Agency. Vienna, 1969. - P. 611-619.

158. Steward, F. C. Growth and organized development of cultured cells. II. Growth and division of freely suspended cells / F. C. Steward, M. O. Mapes, K. Hears // Am. J. Bot. 1958. - V. 45. - P. 705-708.

159. Stuard, W. N. Applied aspects of the gibberellius / W. N. Stuard, H. M. Cathey // Annu. Rev. Plant. Physyol. 1961. - V. 12. - P. 369-394.

160. Tautorus, T. E. Somatic embryogenesis in conifers / T. E. Tautorus, L. C. Fowke, D. I. Dunstan // Can. J. Bot. 1991. - V. 69. - P. 1873-1899.

161. Thorpe, T. A. Somatic embryogenesis / T. A. Thorpe, C. Stasolla // Current Trends in the Embryology of Angiosperms. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2001.-P. 279-336.

162. Timmis, R. Bioprocessing for tree production in the forest industry: conifer somatic embryogenesis / R. Timmis // Biotechnol. Prog. 1998. - V. 14. - P. 156166.

163. Tulecke, W. A tissue derived from the pollen of Gingko biloba L. / W. Tulecke // Science. 1953. -V. 117. № 3048. - P. 599-600.

164. Von Aderkas, P. Formation of haploid embryoids of Larix deciduas: early embryogenesis / P. Von Aderkas, J. Bonga // Am. J. Bot. 1988 a. - V. 75. - P. 690700.

165. Von Aderkas, P. Morphological definition of phenocritical period for initiation haploid embryogenic tissue / P. Von Aderkas, J. Bonga // Somatic cell genetics of woody plants. Dordrecht: Kluwer Academic, 1988 a. - P. 29-38.

166. Von Aderkas, P. Comparison of larch embryogeny in vivo and in vitro / P. Von Aderkas, J. Bonga, K. Klimaszewska, J. Owens // Woody plant biotechnology. New York: Plenum press, 1991.-P. 139-155.

167. Von Aderkas, P. Diploid and haploid embryogenesis in Larix leptolepis, L. decidua, and their reciprocal hybrids / P. Von Aderkas, K. Klimaszewska, J. Bonga I I Can. J. For. Res. 1990. - V. 20. - P. 9-14.

168. Von Arnold, S. Bud induction on isolated needles of Norway spruce {Picea abies L. Karsh) grown in vitro / S. Arnold, T. Eriksson // Plant Sci. Lett. 1979. - V. 15.-P. 363-372.

169. Von Arnold, S. Regulation of somatic embryo development in Picea abies by abscisic acid (ABA) / S. Von Arnold, I. Hakman // J. Plant Physiol. 1988. - V. 132. -P. 164-169.

170. Von Arnold, S. Developmental pathways of somatic embryogenesis / S. Von Arnold, I. Sabala, Bozhkov P. et al. // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2002. -V. 69. - P. 233-249.

171. Walter, C. Genetic engineering of conifer for plantation forestry. Pinus radiata transformation / C. Walter, L.J. Grace // In: Molecular Biology and Woody Plants (Forestry Science). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2004. - P. 79-104.

172. Webster, F. B. Propagation of interior spruce by somatic embryogenesis / F. B. Webster, D. R. Roberts, S. M. Mclnnis, B. C. S. Sutton // Can. J. For. Res. -1990.-V. 20.-P. 1759-1765.

173. Westcott, R.J. Embryogenesis from non-juvenile Norway Spruce (Picea abies) / R. J. Westcott // Abstr. In Vitro II. 1992. - V. 28. - P. 101a.

174. Winton, L.L. Utilization of haploidy in tree breeding / L.L.Winton, R.F. Stettler // Procc. of the First International Symposium on Haploids in Higher Plants. -Ontario: University of Guelph, 1974. P. 259-273.

175. Winton, L. Shoots from Douglas-fir cultures / L. Winton, S. Varhagen // Can. J. Bot. 1977. - V. 55. - P. 1246-1250.

176. Wu, K. Induction of maternal haploids plants from unpollinated ovaries of poplar in vitro / K. Wu, M. Xu // Acta. Genet. Sin. 1984. - V. 11. - P. 47-51.

177. Yabuta, T. On the crystal of gibberellin, a substance to promote plant growth / T. Yabuta, Y. Sumiki // J. Agric. Chem. Soc. Japan. 1938. - V. 14. - P. 1526.

178. Yeung, E. C. Structural and developmental patterns in somatic embryogenesis / E. C. Yeung // In Vitro Embryogenesis in Plants. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 205-249.

179. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems -some practical comments / E. C. Yeung // In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant. 1999. -V. 35.-P. 137-143.

180. Yeung, E. C. Somatic embryogenesis apical meristem formation and conversion / E. C. Yeung, C. Stasolla // Korean J. Plant Tiss. Cult. - 2000. - V. 27. -P. 253-258.

181. Yeung, E. C. Apical meristem formation during zygotic embryo development of white spruce / E. C. Yeung, C. Stasolla, L. Kong // Can. J. Bot. 1998. - V. 76. -P. 751-761.

182. Zaerr, J. Action of growth regulators / J. Zaerr, M. Mapes // Tissue culture in forestry. 1982. - P. 231 -255.

183. Zamani, I. Regeneration of fertile doubled haploid plants from colchicines-supplemented media in wheat anther culture / I. Zamani, G. Kovacs, E. Gouli-Vavdinoudi, D. G. Roupakias, B. Barnabas // Plant breeding. 2000. - V. 119. - P. 461-465.

Информация о работе

Белоруссова, Алена Сергеевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2007
ВАК 03.00.05

Диссертация

Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы